9 TÉCNICA DE SEPARACIÓN CELULAR

Una de las aplicaciones de citometría de flujo es la separación celular. El sorting se denomina a la

separación celular por citometría de flujo. Los criterios que rigen la citometría analítica son los mismos que
los que rigen al sorting, pero el sorting permite además de poder analizar poblaciones celulares, aislarlas
con más del 95% de pureza en un tubo para después hacer lo que se desee (cultivo, análisis de biología
molecular/genómica…).

A SEPARACIÓN CELULAR POR CITOMETRÍA DE FLUJO

La citometría de flujo es una tecnología que permite determinar las características de partículas o células
suspendidas en un líquido que pasan gran velocidad a través de la luz de un láser. Vamos a poder
identificar/determinar:

 Parámetros físicos como el tamaño o la complejidad celular interna.

 Cualquier componente o función celular que pueda ser detectado mediante un compuesto
fluorescente.  Múltiples parámetros simultáneamente de manera rápida y cuantitativa en células
individuales.

Los componentes de un sorter son los mismos de un citómetro de flujo, además de un bloque de sorting
que permite separar las células. Entre ellos destacan: los láseres (determinar qué fluorocromos podemos
medir en el sorter), óptica de detección (detectores: qué fluorocromos podemos medir junto con los
láseres), en función de los filtros habrá que compensar o no (interacción fluorocromos, ej. FITC y PE) y un
sistema electrónico que es más robusto que el de citómetros convencionales (detectar señales y separar
esas células, es decir, tomar decisiones).

Detección de fluorocromos:

 Los fluorocromos son moléculas fluorescentes

susceptibles de ser excitadas con una luz
monocromática (luz de un láser) y absorben
energía
de la fuente de luz (láser de determinada longitud
de
onda), excitan sus electrones y cuando vuelven a
sus
niveles energéticos anteriores, liberan luz.

 Liberan la energía absorbida mediante la emisión de fotones de menor energía (mayor longitud de
onda).

 Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión de luz característico que ayuda a saber detectar la
luz proveniente de cada fluorocromo.

 La señal de fluorescencia medida es proporcional a la cantidad de moléculas de fluorocromo unidas a

las células. Este es el principio de citometría de flujo. Podremos identificar poblaciones positivas
para determinados marcadores, doble negativas o doble positivas.

Selección de poblaciones celulares:

 En el sorting determinamos cuáles son las poblaciones que queremos aislar; la combinación de
anticuerpos monoclonales diseñados para determinar distintos tipos de células presentes en una
mezcla, dependerá de la célula que queramos aislar. No solo que identifiquen de manera positiva,
sino que eliminen “contaminantes”.

 El objetivo aquí es purificar las células; si hay marcadores compartidos entre varios tipos de células,
no podremos purificar (habrá contaminación).
Separación celular por citometría de flujo:

La separación celular por citometría de flujo o “cell sorting” permite aislar poblaciones puras de los
diferentes tipos celulares que pueden estar presentes en una muestra.

 Se utilizan anticuerpos fluorescentes frente a marcadores específicos de poblaciones celulares o

proteínas fluorescentes sintetizadas por las células (GFP, RFP, etc.) producto de genes reporteros.

 Se pueden aislar poblaciones con un fenotipo complejo (9 marcadores fluorescentes a la vez) con
más de un 95% de pureza.

 Permite separar hasta 6 poblaciones diferentes simultáneamente; cada uno en un tubo

distinto.  Las células se obtienen viables y en condiciones de esterilidad.

Separador celular: FACS Arial (BD Biosciences)

 Características:

o Separador celular de alta velocidad.

o 4 Láseres (375, 405, 488 y 633 nm),

o 11 Parámetros simultáneamente (9 fluorescencias, FSC y SSC).

o Se pueden separar hasta 4 poblaciones simultáneamente.

o Permite separar 1 célula/pocillo (clonaje).

 Partes:

o Cámara de flujo: impactan los láseres y donde se ve qué fluorescencia tiene unida cada
célula. Hasta aquí funciona como un citómetro de flujo normal.

o Zona Nozzle (pieza).

o Unas placas deflectoras que forman un campo eléctrico de hasta 4500 V de diferencia (una
positiva y otra negativa).

o Tubos de recolección (de 4 a 6 posiciones, luego aislar hasta cuatro poblaciones

diferentes).  Proceso de separación celular por citometría de flujo:

o En la cámara de flujo hay un fluido envolvente (en este caso PBS estéril y filtrado) y por el
centro va un flujo central de muestra. Como las presiones entre ambos son diferentes, se
forma un flujo laminar, no se mezclan entre sí. El buffer de arrastre hace que las células
pasen de una en una frente de cada láser (rojo>azul>violeta). El citómetro sabe qué
separación hay entre cada láser y sabe a qué tiempo tiene que recoger las señales. Hasta
aquí como un citómetro normal.

o Una vez las células pasan por la cámara de flujo, pasan por la pieza Nozzle que tiene un
orificio muy pequeño que puede ser de tamaño variable (por lo general se usa 70 o 100
micras, y varía en función del tipo de celular a separar).

 Tamaño orificio:
  70 µm (linfocitos, células pequeñas): para células más pequeñas y mayor
sorter (mayor velocidad).

 85 µm (células dendríticas, células frágiles).

 100 µm (líneas celulares): para sortear a menor presión preservando la

viabilidad de las células, luego es para células más frágiles y de mayor
tamaño.
 El Nozzle forma un chorro continuo, el que tenía la muestra, y se empieza a romper en
gota (podemos llegar a tener hasta 90 mil gotas por segundo). Se trabaja con
presión y vibración, lo que hace que se produzcan gotas.

 El objetivo de estas gotas: dentro de estas gotas vamos a encapsular células. Si

llegamos a 90 mil gotas por segundo y tenemos 20 mil células en el láser, tendremos
1 célula funciona por cada 4 células/gota. Si ponemos menos células por segundo
mejor porque las células estarán más separadas en el chorro y se identificarán
mejor.

o El chorro pasa por medio de las placas deflectoras. Hay que lograr que el chorro se corte
siempre en el mismo punto (se puede calibrar, la máquina puede hacerlo). Esto es para que
exista un tiempo constante entre los láseres y la primera gota.

 Drop delay: el tiempo que hay entre láser, punto de interrogación, y primera gota que
rompe el chorro. Tiene que ser constante para que el citómetro sepa el tiempo que
tarda una célula en ser identificada en el punto de interrogación y encontrarse en la
primera gota que separa el chorro, para poder aislarla.

o Estrategia de selección (gating) de poblaciones para separación celular. Hay que decir al
citómetro las células qué queremos aislar. La máquina interroga cada célula
(20mil/segundo) e identifica si alguna de esas células cumple los criterios de selección
establecidos.

 La máquina sabe a qué población se

corresponde la célula y dónde lo tiene que
recoger.

 Si las células cumplen

algunos de esos criterios
de selección, da un pulso
de carga eléctrica
(positivo o negativo, de
mayor o menor
intensidad) corto que solo
se lo lleva la primera
gota que está cortando el
chorro. En función
de eso el aparato
reconocerá a qué
población
celular se corresponde y
dónde la tiene que
recoger.

Como sabe cuánto es el tiempo, estará seguro

que, si identifica una célula de interés, esperará
x microsegundos y le dará una carga eléctrica a
la primera gota que contiene la célula que yo
quería separar. Esa célula luego pasa por un
campo eléctrico y por el aire irá hacia un lado o
 hacia el otro, cayendo dentro del tubo.

 Para aislar una única célula, se pone una placa p96 con un brazo robótico acoplado
que va poniendo una única célula por pocillo. Pocillo > célula > se mueve > pocillo >
célula….

 Para asegurarse que las células son puras, identifica qué hay alrededor de la gota que
contiene la célula que a mí me interesa. Si hay algo que no me interesa, no la
separa. Es muy importante la calidad de la muestra. Mucho debris afectará mucho a
la separación.

Resultado de la separación celular: ¡calibrar bien el sorter!

 La correcta preparación de las muestras es fundamental para una separación eficiente (suspensiones
celulares sin agregados). DNAasas para evitar que las células se agreguen entre sí y afecte el sorting.

 Cualquier factor que altere la suspensión celular (células adherentes, muerte celular, muestras mal
disgregadas) alterará la pureza y el rendimiento de la separación.

 La velocidad de separación depende de factores como el tamaño, la morfología, la fragilidad y la

concentración celular.
Soportes en los que se pueden recoger las células:

En tubos de 15 ml, en eppendorfs, en tubos de 5 ml o incluso en portas (en caso de querer hacer inmunos;
y en diferentes posiciones).

 0,5 ml de medio de recogida en tubos de 5ml.

 1 ml de medio de recogida en tubos de 15ml.

 20-100 μl de medio de recogida en cada pocillo de placas de 96-pocillos.

B SEPARACIÓN CELULAR INMUNOMAGNÉTICA > “método de enriquecimiento”

La separación celular inmunomagnética utiliza anticuerpos conjugados a esferas con propiedades

magnéticas y permite enriquecer o aislar poblaciones puras a partir de una muestra heterogénea.

 Se utilizan marcadores de superficie específicos de cada población celular.

 Sólo se puede aislar una población a la vez por selección positiva o una mezcla de varios
marcadores para selección negativa de la población de interés.

 Permite procesar un gran número de células (>108) en muy poco tiempo (15 minutos) y aislar
poblaciones con más de un 95% de pureza.

 Las células se obtienen viables y en condiciones de esterilidad (no se utiliza presión, luego las células
no sufren).

 Es posible aislar o enriquecer poblaciones celulares raras, presentes en bajos porcentajes en la

muestra original.

Sirve como alternativa o como complemento de la separación celular por citometría de flujo; se utilizan
anticuerpos marcados con esferas inmunomagnéticas.

Dispositivos utilizados:

 Gradilla que tiene un imán, se colocan los eppendorf con Ac pegados a una bolita magnética que se
pega a la pared del tubo del imán y se retira todo lo que no se ha pegado/teñido.

 Hay columnas que se meten dentro de un iman y una vez pasada la muestra, se pega a la columna.
Lo que no se ha pegado/marcado se retira.
  De manera automatizada: separador AutoMACS Pro: robot con una jeringa y brazo
robótico. Protocolo de marcaje (selección positiva): similar al de citometría de flujo

 Se recogen las células en un tubo y se incuban con anticuerpos durante 15 minutos. Se lava para
eliminar el exceso de anticuerpos.

 Una vez eliminado el exceso de anticuerpos, se pueden sortear para selección positiva (importa aislar
las células teñidas con el Ac). Se pasa por una columna magnetizada (dentro de un imán), las
células con Ac quedan pegadas y el resto eluyen y se recogen en un tubo. Esta es la fracción
negativa.

 Se quita la columna fuera del imán y se eluyen las células pegadas con ayuda de PBS. Esta es

fracción positiva.
Fracción (-) Fracción (+)
Elección del programa adecuado: ¿pureza o rendimiento?

Hay diferentes protocolos de separación dependiendo de qué tipo de célula vamos a

marcar:  Protocolos para selección positiva.

 Para selección negativa. La selección negativa es la inversa.

o Tiño todo lo que no quiero recuperar. Hay veces que no me interesa poner un Ac para células
que quiero retirar. Puedo teñir todas las células que no me interesan, y dejar sin teñir las
que me interesan.

o El protocolo de purificación es igual, pero lo que se hace es una selección negativa porque
nos quedamos en la fracción negativa lo que me interesaría.

En función de cuanto representen las células en la mezcla y cuánto exprese el antígeno que utilizo para
separarlas, utilizo un programa u otro, logrando mayor o menor sensibilidad, logrando mayor rendimiento o
mayor pureza.

 ¿Qué programa voy a usar? ¿Quiero recuperar el máximo posible o tener una mayor pureza? Por lo
general no van de la mano: mayor pureza, menor rendimiento; y viceversa. En el sorter pasa lo
mismo.