Bacteriología

UD2- UF1 (MP05)

Microbiología clínica
Termino taxonomía

- Taxos (griego):
Estructuración/orden
- Nomos (griego): Ley o norma
Taxonomía bacteriana

Clasifica las bacterias según sus características

fenotípicas y genotípicas.

Permite intercambio de información entre

profesionales.

- Manual de sistemática bacteriana: Manual

de Bergey.
Tabla de criterios

Criterio Posibilidades

Morfológico Aspecto macroscópico colonia

Aspecto microscópico bacteria
Movilidad
Componentes estructurales
Propiedades tintoriales

Genético Composición genómica

Expresión genética

Metabólico Requerimientos nutricionales

Metabolismo aeróbico o anaeróbico
Tabla de orden taxonómico

Rango Taxonómico Nombre

Dominio Bacteria

Filo Proteobacteria

Clase Gammaproteobacteria

Orden Enterobacteriales

Família Enterobacteraceae

Género Escherichia

Especie E. coli
Siempre cursiva o subrayado.
Primera letra espécie Mayúscula.

Escherichia coli / Escherichia coli

E. coli / E. coli
Conceptos

Cepa bacteriana: Especie bacteriana:

Se puede definir como una población de Una especie bacteriana está integrada por
bacterias que descienden de una única una colección de cepas que comparten
célula o de un aislamiento en un cultivo muchas características morfológicas,
axénico (cultivo puro). metabólicas, genéticas y ecológicas entre
sí, y diferentes de las que presentan otras
especies del mismo género.
Nomenclatura de Primera palabra: Género.

las bacterias Acostumbra a ser nombre del descubridor, o

de otro científico relacionado. A veces
designa aspecto morfológico o característica
microorganismo.

Sistema binomial desarrollado por Segunda palabra: Especie.

Linneo.
Característica específica bacteria.
Ejemplos

Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae

- Staphylé (racimo) y coccus - Klebsiella (Klebs→ microbiólogo)

(grano) - Pneumoniae (pneumonia)
- Aureus (dorado)
Morfologia bacterias

❖ Importantes para su clasificación.

❖ Morfología microscópica

➢ Individual
➢ Agrupaciones
Morfología bacterias

❖ Importantes para su clasificación. Diplococos (a)

Tétradas
Cadenas (c)
Sarcinas
❖ Morfología microscópica Cocos Racimos (b)

➢ Individual Caña de bambú

➢ Agrupaciones Empalizadas
Letras chinas (d)
Bacilos Ramificados
Morfología bacterias

❖ Morfología macroscópica
➢ UFC: Bacteria o agrupamiento de
➢ Colonias: Conjunto o agrupación de bacterias, que inoculadas sobre
bacterias crecidas sobre un medio de un medio de cultivo sólido son
cultivo sólido, procedentes de una capaces de producir una colonia.
UFC.
Morfología bacterias

Para unas condiciones de cultivo…:

● Morfología característica de cada especie.
● Se puede hacer tras 24h de incubación.
(Especies con crecimiento lento tras algunos días (como los micoplasmas)).
● La morfología de las colonias varía en función del medio, las condiciones
del cultivo y evoluciona con el tiempo. Hay que analizarlas siempre en las
mismas condiciones.
Características
a analizar
Estructura bacteriana
Organismos unicelulares procariotas
Material genético citoplasma

- Componentes comunes: Pared, membrana citoplasmática, material

genético y ribosomas.
- Componentes específicos: cápsula, flagelos, fimbrias, pili, endosporas.
 3 tipos de pared:
- Gram positivas:
- Pared gruesa y compacta.
La pared - Múltiples capas de
peptidoglucano.
bacteriana - Tetrapéptido se une entre
sí mediante puentes de
Estructura rígida presente en todas pentaglicina (estabiliza la
las bacterias menos los micoplasmas.
membrana).
Protege de osmosis y funciona como - Ácidos teicoicos con
barrera de protección a sustancias función:
tóxicas. - Membrana carga -
- Anclar
Componente principal pared-membrana
peptidoglucano (CO-POLÍMERO:
NAM i NAG, NAG con tetrapéptido).
NAM: N-acetil-muránico i NAG: N-acetil-glucosamina
Gram positivas:
 Gram negativas:

La pared
bacteriana
- Pared más fina.
- Una sola capa de
peptidoglucano.
- No ácidos teicoicos.
- Membrana externa de
fosfolípidos, con lipoproteïnas
internas que se unen con los
peptidoglucanos como anclaje.
 Gram negativas:

La pared
bacteriana
- Cara externa de la membrana:
Lipopolisacáridos.
- Son específicos de especie.
- Propiedades antigénicas.
- Parte más externa del
polisacárido: Antígeno O
(permite diferenciar cepas de
una misma especie
clasificándolas por serogrupos.
 Gram negativas:

La pared
bacteriana
- Membrana externa contiene
Porinas que son canales para el
transporte pasivo de iones y
moléculas pequeñas.
- Espacio periplásmico:
peptidoglucanos y enzimas para
transporte de sustratos y
transmisión de señales.
 Bacterias ácido-alcohol
resistentes

La pared
bacteriana
- Peptidoglucano unido a ácidos
micólicos, glucolípidos y ceras
mediante arabinogalactanos y
arabinomananos.
- Pared de carácter hidrófobo
composición tipo cera.
Resistencia a la desecación y a
agentes químicos.
La membrana citoplasmática
● Modelo de Mosaico fluido: bicapa fosfolipídica en la que se integran proteínas.
○ Bacterias tiene más proporción de proteínas en comparación con la célula
eucariota.
○ Multifuncionalidad:
■ Barrera osmótica: Impermeable a iones y moléculas cargadas y permeable
a compuestos orgánicos y moléculas neutras. Mantiene equilibrio entre
interior y exterior.
■ Biosíntesis de componentes (Secreción de proteínas)
■ Metabolismo energético (Cadena respiratoria)
■ Recepción de señales
■ Sistema de transporte
■ Anclaje al cromosoma bacteriano y a los flagelos.
La membrana citoplasmática
Genoma bacteriano
- Cromosoma
bacteriano
- Plásmidos
Cromosoma bacteriano Plásmidos
● Gran molécula de DNA bicatenario ● Moléculas circulares de DNA
que se encuentra en el seno del bicatenario extracromosómico.
citoplasma con un elevado grado de ● Pocos miles de pares de bases sin
empaquetamiento gracias a la proteínas asociadas.
asociación con proteínas. Forma una ● Tienen una replicación
estructura llamada nucleoide. independiente al cromosoma.
● El cromosoma bacteriano contiene ● No son indispensables para la vida
toda la información genética para el pero confieren ventajas adaptativas.
ciclo vital de la bacteria. ● Existen 3 tipos según los genes que
aportan.
Plásmidos
● Plásmidos de resistencia a antibióticos.
● Plásmidos de virulencia. Transferencia por conjugación
● Plásmidos degradativos.

Ribosomas
● Estructuras donde se sintetizan proteínas.
● Entre 5.000-50.000 libres por el citoplasma.
● Dos subunidades:
○ Subunidad grande: 50S formado por RNAr y 34 proteínas.
○ Subunidad pequeña: 30S formado por RNAr y 21 proteínas.
La síntesis proteica se
inicia directamente sobre
las cadenas de RNAm en
formación. Se pueden
observar largas cadenas
de RNAm con ribosomas
formando los llamados
polirribosomas.
Otros componentes estructurales

Cápsula: Flagelos: (>50 proteínas)

Algunas especies bacterianas la poseen. Apéndices filamentosos extracelulares y
helicoidales que permiten movimiento en fluidos.
Recubre la pared y les sirve de protección frente a
la desecación y la fagocitosis. Pueden ser:
Mejora la colonización porque permite mejor
- Monotricos: Flagelo único y posición polar.
adhesión.
- Lofotricos: Dos o más en posición polar en
Formada por polipéptidos o polisacáridos. el mismo extremo.
- Anfitricos: Varios en posición polar pero en
ambos extremos.
- Peritricos: Múltiples por toda la superfície.
FLAGELO
3 PARTES:

- Filamento: Parte visible.

Tiene propiedades
antigénicas (antígeno H).
- Cuerpo o corpúsculo basal:
Anclaje flagelo-célula.
- Codo: Estructura proteica
curvada que conecta eje del
cuerpo basal con filamento.
Otros componentes estructurales

Fimbrias y pili: Endosporas

- Estructuras filamentosas más cortas y - Formas de resistencia que producen en
finas que los flagelos. el interior algunas especies frente a
- Inserción a nivel membrana.
condiciones desfavorables (ausencia de
- Funciones de:
- Adhesión a superfícies. nutriente).
- De conjugación (pilis sexuales): - Células en reposo.
son más gruesos. Codificados - Formadas por varias cubiertas
por plásmidos y permiten impermeables que encierran un
intercambio genètico. protoplasto.
Técnicas de observación
bacteriana con M. óptica:
● Mediante microscopía (puede ser útil: fluorescencia, contraste de fases,
interferencia, confocal, electrónica de transmisión y electrónica de
barrido).
● puede realizarse en fresco pero la información obtenida es escasa→
SON INCOLORAS SE REQUIEREN TINCIONES.
 [Link]
[Link]

Método de la gota pendiente:

OBSERVACIÓN EN FRESCO
Técnica muy rápida que permite visualizar
microorganismos vivos sin el uso de
colorantes.

Útil para observar movimiento de las

bacterias.

La visualización se debe hacer rápido, porque

la evaporación del medio puede alterar el
movimiento, Gota en el cubre y porta
Se puede considerar la visualización con excavado.
Permite ver movimiento
colorantes vitales (Tinta china) para
browniano, o lineal o anárquico
observación de estructuras.
Preparaciones fijadas [Link]

- Práctica rutinaria para la observación e identificación de las estructuras morfológicas

de las bacterias crecidas en medio líquido, de colonias en medios sólidos o de la
propia muestra biológica.
Pasos:
1- Extensión de la muestra en el portaobjetos (REGIÓN CENTRAL)
- Medio de cultivo líquido crecido. (Se carga el asa estéril introduciendola en el medio
de cultivo y se descarga en el portaobjetos extendiendo el material por su superfície).
- Colonia sobre medio de cultivo sólido. (Se carga una asa estéril con el material de la
colonia o bien se extiende directamente sobre la zona central del porta, o se deposita
una gota de solución salina en la que se emulsiona la toma y se extiende.
- Muestra biológica (Si es fluido se procesa igual que un cultivo).
Preparaciones fijadas
2- Fijación de la muestra:
Doble función:
- Preservar morfología.
- Conseguir una buena adherencia.
Se consigue mediante desnaturalización y precipitación de las proteínas por calor o
mediante fijadores químicos:
- Calor: Pasar la muestra por una flama de mechero. La muestra se calienta un poco.
Método más común.
- Fijadores químicos: Alcoholes y cetonas. Secado a Tº Ambiente y se sumerge al
fijador y se vuelve a dejar a Tº Ambiente.
Preparaciones fijadas
3 - Tinción:
Colorantes adecuados y siguiendo el protocolo específico en cada caso.
4- Lavado y secado:
La tinción finaliza con un lavado para eliminar los restos de colorante usado. Se puede
hacer con agua destilada o con agua corriente.
Se deja secar a Tº Ambiente en posición vertical.
5- Observación microscópica:
Se realiza en el microscopio óptico empezando por 10x terminando a 100x (aceite de
inmersión.
Tinciones cromogénicas Colorantes:

- Ácidos o aniónicos: Carga negativa se

Uso de colorantes que se unen a unen a cargas positivas (proteínas o
componentes bacterianos incrementando citoplasma). No tiñen bien la pared ya
contraste entre bacteria y entorno. que es de carga negativa.
Distinguimos tinciones: - Básicos o catiónicos: Tiñen
componentes y estructuras ácidas o de
- Simples carga negativa (ácidos nucleicos y
- Diferenciales
pared).
- Neutros o anfóteros: Sales de
colorantes ácidos o básicos que tiñen
cualquier estructura, predominando
uno u otro dependiendo del pH.
Busqueu 3 exemples de cada
colorant
 Se parte directamente del cultivo sin extensión
previa. Pasos:

1- Colocar gota de nigrosina en un extremo del porta.

Tinción con nigrosina 2- Cargar un asa de siembra con la muestra que se va

a teñir.

3- Emulsionar la muestra con el tinte.

● Tinte aniónico (tinción simple
negativa) 4- Realizar extensión a modo de película fina con otro
portaobjetos para extender la muestra.
● Observación de bacterias con
cápsula, espora, flageles o difíciles de 5- Dejar secar a Tª ambiente.
teñir por otros medios como algunos
espirilos.
● La forma se observa por contraste
sobre algún fondo teñido.
Tinciones diferenciales

O también llamadas compuestas utilizan dos colorantes que contrastan en intensidad o color,
en combinación con un tratamiento que provoca una respuesta diferente a la tinción entre
distintos microorganismos.
Permite distinguir entre bacterias de igual morfología por sus distintas propiedades
tintoriales.
- TINCIÓN DE GRAM
- TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
 TINCIÓN DE GRAM colorante catiónico

estabilizante
complejo soluble

Complejo se
retiene en la colorante
pared gruesa contraste
de las gram + y
se pierde en las
gram -

Tinción ampliamente usada en laboratorios de microbiología

clínica.
Pone de manifiesto la diferente composición y estructura de la
pared, clave para la identificación.
Puede hacer sospechar de microorganismo y permite empezar
tratamiento a la espera de resultados.
[Link]
Procedimiento
1- Cubrir extensión cristal violeta (1min)
(2- Lavar brevemente con agua destilada
y escurrir.)
3- Cubrir porta con lugol e incubar (1min Tª)
4- Lavar con agua destilada y escurrir porta.
5- Cubrir porta con mezla alcohol-acetona
(30seg)
6- Lavar con agua destilada y escurrir porta
7- Cubrir con safranina e incubar (2min)
8- Lavar con abundante agua destilada y
dejar secar a Tª.
9-Visualizar microscopio óptico
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

Tinción diferencial que permite distinguir un grupo especial de bacterias cuya

pared presenta resistencia a la decoloración por una mezcla de ácido y alcohol:
BAAR.

Dentro de las BAAR se encuentran micobacterias (causantes de tuberculosis y

lepra).

Una prueba muy común en la práctica clínica es la baciloscopia, una prueba

diagnóstica para la tuberculosis pulmonar que consiste en aplicar tinción de
Ziehl-Neelsen a extensiones de esputo para descartar la presencia de
micobacterias.

[Link]
3 fases:
1- Tinción en caliente con 2- Decoloración en frío 3- Coloración de
un colorante básico con una mezcla contraste
ácido-alcohol
Fuscina fenicada
Con el frío las paredes En las BAAR no penetra
Al tener ácido micólico y
ceras les confiere carácter vuelven a solidificar y el azul de metileno pero
hidrófobo. atrapan el colorante e sí que penetra en las
impidiendo su arrastre
Al calentar fluidifica la con la solución demás permitiendo así
pared y permite el paso del agua-alcohol que limpia el contraste.
colorante. las demás.

Tinción roja todas Tinción roja solo Tinción roja solo las BAAR
las bacterias las BAAR y azul las demás
Procedimiento
1- Cubrir extensión fuscina fenicada y calentar
hasta evaporar, sin hervir.
2- Dejar que enfríe y repetir calentamiento
2-3 veces, (10-15min)
3- Lavar con agua destilada y escurrir porta.
4- Decolorar con alcohol-clorhídrico al 3-5%
durante 2 min a Tª.
5- Lavar con agua destilada y escurrir porta
6- Cubrir con azul de metileno e incubar (1-3min, Tª)
7- Lavar con abundante agua destilada y
dejar secar a Tª.
8-Visualizar microscopio óptico
Tinciones estructurales
Cápsulas:

Difíciles de teñir, solo permiten contraste.

- Nigrosina
- Tinta china: Mezclando suspensión bacteriana con tinta china y visualizando muestra entre tinte y
cubre. La cápsula impide el paso de la tinta china, se ven como esferas brillantes en un fondo oscuro.
- Tinción de Hiss: Sobre extensiones secadas a Tª.

1- Teñir la extensión con solución acuosa de cristal violeta 1%.

2- Tratar la extensión con una solución acuosa de sulfato de cobre 2%, que colorea la cápsula
pero no el cuerpo bacteriano.

Bacterias: color violáceo Cápsulas: azul pálido.

 Mordiente: sustancia que incrementa la
afinidad entre la célula y el tinte

Tinciones estructurales
Flagelos

Son tan pequeñas y delgadas que no se pueden observar y requieren compuestos que
se depositen encima y aumenten su tamaño.

- Tinción de Leifson: ácido tánico para recubrir flagelo y rosailina para teñir el
conjunto. Se observan tonos rosáceos azulones.
- Tinción de Rhodes: nitrato de plata amoniacal y un mordiente. Los flagelos se
ven negros.
Tinciones estructurales
Esporas

Es complejo ya que se encuentra en el interior del cuerpo celular y posee varias cubiertas impermeables.
Tinciones con calor.

- Tinción de Wirtz-Conklin (extensiones fijadas con calor):

1- Cubrir extensión con verde malaquita al 5%. Calentar durante 5 min sin ebullición ni secado.

2- Lavar con agua el exceso.

3- Cubrir extensión con solución safranina al 0,5%. Colorante de contraste.

4- Lavar con abundante agua y dejar secar.

5- Visualizar al microscopio óptico. Se ven verdes las esporas y rojas las formas vegetativas.
 Directas: colorantes que pueden emitir luz a longitudes
Tinciones de onda visibles cuando son excitadas con luz
ultravioleta (fluorescentes) que se unen a determinados
fluorescentes componentes celulares.

Alternativa a las cromogénicas para Ej. Naranja de acridina y auramina-rodamina

conseguir mayor sensibilidad en
muestras biológicas muy Indirectas: Uso de anticuerpos marcados con
contaminadas. fluorocromos y permiten detectar antígenos concretos
en las bacterias.
Microscopio de fluorescencia para
visualizar resultado. Tipo de tinciones en forma de kit comercial.
Tinción de naranja de acridina

- Colorante se une inespecíficamente a Procedimiento:

todos los ácidos nucléicos.
- Doble cadena: Vede.
1- Cubrir extendido con naranja de
acridina e incubar 2 min a Tª.
- Senzilla: Roja
2- Lavar con agua destilada y dejar secar
- Se usa en micoplasmas y algunas a Tª
muestras biológicas con poca carga 3- Visualizar con microscopio de
bacteriana. fluorescencia.

LIMITACIÓN: pueden aparecer grupos o

artefactos que harán repetir la tinción.
 Procedimiento:

Tinción de auramina-rodamina 1- Inundar preparación con solución

auramina-rodamina 12-15 min a Tª.
2- Lavar con agua destilada.
- Colorante se une a ácidos micólicos y
resiste a la decoloración de 3- Decolorar con ácido-alcohol 3min.
ácido-alcohol. 4- Lavar con agua destilada.
- Permite distinguir BAAR. 5- Cubrir con solución de contraste e
- No hace falta calentar la preparación.
incubar durante 2-3 min a Tª.

Técnica más sensible que la de Ziehl-Neelsen. Solución contraste: permanganato

Para resultado -: visualizar mín 30 campos potásico al 0,5%. (fondo oscuro, casi
consecutivos.
Para resultado +: semicuantificación contando negro).
campos a 20x. 6- Lavar y dejar secar al aire.
Técnicas de tinción bacteriana con M.E

- Técnicas largas y laboriosas.

- Información morfológica y estructural.
- Casos puntuales, ahora más pruebas bioquímicas o moleculares.
- Procedimientos más usados:
- Tinción negativa: Estudiar morfología externa. Diagnóstico virológico.
- Tinción con tetróxido y acetato de uranilo: Visualizar estructuras internas. La
más usada.
- Microscopía de barrido: Observación tridimensional de bacterias enteras.