Experiencia de Laboratorio Nro°5:
ENZIMAS 1 CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Integrantes:
Amelia Fernanda Ramirez
Angel Patricio Ulloa
Carrera: Licenciatura en Biología
Profesor de laboratorio:
Andrea Poch
Exequiel Medina
Fecha de realización: 10/10/2023
Fecha de entrega: 17/10/2023
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Introducción
Los enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica, presentes en los sistemas biológicos que
aceleran la velocidad de una reacción hasta alcanzar un equilibrio, 'Al disminuir la energía de
activación necesaria para una reacción, porque forma una asociación pasajera con las moléculas que
reaccionan' (4 LEHNINGER, A., NELSON, D., COX, M., Principios de Bioquímica). Es posible
identificar la presencia de un enzima en particular si se conoce la reacción catalítica que este lleva a
cabo cuantificando por métodos analíticos adecuados a la sensibilidad de este, la velocidad de
formación de producto o bien la desaparición de el/los sustrato/s. Para lo cual se diseña
especialmente un ensayo para cuantificar la actividad enzimática y más adelante, la especifica. Para
el estudio enzimático in vitro es necesario purificar y aislar el enzima y contemplar factores como el
tipo de enzima, su concentración y la reacción que cataliza, el o los sustrato/s y su concentración,
el/los producto/s formados, el pH, la temperatura, tiempo de incubación, el requerimiento de
cofactores e inhibidores para poder manipularlos a voluntad y adecuar las condiciones
experimentales. en ocasiones 'se comparó la especificidad de la enzima con una llave y su cerradura'
(ALDABE, J., HUETO, A., JUNI, J., LÓPEZ, P., Biología). Se deben realizar soluciones control cuya
composición únicamente difiere en la variable cuyo comportamiento interfiere con el método
empleado, que nos permitan descartar su influencia no deseada, tales como la solución blanco de
sustrato, empleada cuando se sospecha que los componentes del sistema, con excepción del
sustrato, interfieren con el método para medir el sustrato o los productos, la solución blanco de
enzima, empleada cuando el sustrato es inestable y da producto en ausencia de la enzima y solución
tiempo cero empleado para detectar interferencias debidas a cualquiera de los componentes,
cuantificado inmediatamente después de detener la reacción a segundos de iniciar la reacción.
Para efectos de este práctico se trabajó con el enzima lactasa la cual hidroliza los b-galactósidos
tales como lactosa u otros rompiendo el enlace o'glucosídico, 'La acción específica de estas enzimas
es degradar moléculas catalizando la hidrólisis de uniones de éteres, ésteres y aminoácidos'
(CREMONESI, P., L’uso degli enzimi nella pulitura di opere policrome), sin embargo utilizaremos un
sustrato sintético cuya estructura es análoga al sustrato natural. Fue necesario hacer diluciones de
las soluciones empleando la siguiente ecuación:
(1) FD= Vt/Va
Se cuantificó la velocidad de formación del producto liberado el cual es el o-nitrofenol (ONF), ya que
en un medio alcalino se tautomeriza, adquiriendo una tonalidad amarilla, y esto permite la
determinación de su concentración por medio de absorbancia por espectrofotometría a 420 nm donde
es directamente proporcional a su concentración en base a la sensibilidad del método comprendida
en un rango de 0,02 a 0,30 µmoles/mL, mediante la construcción de una curva de calibración. En
adición se empleó el Método de Bradford 1x para medir absorbancia del enzima y se midió la
absorbancia a 595 nm, de esta forma se logró relacionar y a su vez calcular con la curva de
calibración de Bradford del Práctico 3, la concentración de la lactasa durante el práctico. De acuerdo
con lo anterior se logró definir y expresar la actividad total enzimática, descrita por la ecuación:
C de ONF en [µg /mL ]⋅mL de Solución
(2) U =
Tiempo transcurrido(Min .)
Donde C es la concentración de (ONF) en los mL de la solución entre los minutos transcurridos en la
reacción. En base a lo anterior se calculó la actividad específica empleando la siguiente ecuación:
C de ONF en [µg /mL]⋅mL de Solución
(3) U =
Tiempo transcurrido(Min .)⋅Cantidad de lactasa [mg]
2
La cual ajusta el valor de la actividad enzimática total a una específica al multiplicarla por los mg de
lactosa empleados en la preparación.
Materiales y métodos
Construcción de una curva de calibración para la determinación de la concentración del producto de
la reacción enzimática catalizada lactasa.
Se dispuso de una gradilla con diez tubos de ensayo (TE) todos identificados de acuerdo a su
contenido, de los cuales cuatro contenían las soluciones a diluir (SD) de Amortiguador fosfato de
sodio (BU) a pH 6,0 [0,1 M], o-nitrofenol (ONF) [0,5 mM], Carbonato de sodio (CA) [1,0 M] y Agua
Destilada (DA), los seis restantes para generar soluciones para Absorbancia (SA) y cuatro pipetas de
vidrio (PV). Se posicionaron las cuatro (PV), identificadas respecto a la sustancia extraída, sobre
papel absorbente previamente adherido al mesón. A partir de las (SD) se extrajeron volúmenes de
3ml para las (SA) cuyas composiciones se visualizan en la Tabla I.
Tabla I. Volúmenes individuales de las sustancias constituyentes de cada solución para Absorbancia de 3 ml, notar que las
soluciones simulan a cabalidad la solución con producto obtenida luego de la catálisis enzimática.
Sustancia v/s (SA1) (mL) (SA2) (mL) (SA3) (mL) (SA4) (mL) (SA5) (mL) (SA6) (mL)
Número de (SA)
Amortiguador 0,9 mL 0,9 mL 0,9 mL 0,9 mL 0,9 mL 0,9 mL
fosfato de sodio
o-nitrofenol 0 mL 0,12 mL 0,48 mL 0,9 mL 1,38 mL 1,8 mL
Carbonato de 0,3 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,3 mL 0,3 mL
sodio
Agua Destilada 1,82 mL 1,68 mL 1,32 mL 0,9 mL 0,42 mL 0 mL
Empleando un Espectrofotómetro (EF), una solución de calibración (SC) de un volumen de 1ml de
(DA) e introduciendo la solución en una cubeta de plástico (K), se calibró el equipo para cuantificar
absorbancia a 420nm.
Para cada (SA) se siguió el mismo procedimiento, donde se extrajo un 1 ml, se introdujo dentro de
una (K) y está a su vez en un (EF).
Determinación de la actividad enzimática.
Se dispuso de seis (PV) y una gradilla con nueve (TE) todos identificados de acuerdo a su contenido,
de los cuales cinco contenían las soluciones de Catálisis (SC) de Amortiguador fosfato de sodio (BU)
a pH 6,0 [0,1 M], o-nitrofenil-b-galactósido (ONFG) [30 mM], Lactasa (LA) [Desconocida], Carbonato
de sodio (CA) [1,0 M] y Agua Destilada (DA), los cuatro restantes para generar soluciones de
incubación (SI), en particular dos soluciones blanco, cuyos sustancias fueron reemplazadas por
volúmenes equivalentes de (DA), de sustrato (SBs) y de enzima (SBe), solución tiempo cero (ST0) y
solución tiempo cinco (ST5). Se posicionaron las seis (PV), identificadas respecto a la sustancia
extraída, sobre papel absorbente previamente adherido al mesón. A partir de las (SD) se sacaron
distintos volúmenes para generar 1,5 ml de (SI) sin volumen de sustrato, a las cuales posteriormente
se les adicionó un volumen de 1,5ml de inhibición (VI), cuya composición se visualizan en la Tabla II.
Tabla II. Volúmenes individuales de las sustancias constituyentes de cada solución para incubación de 3 ml, notar que las
soluciones blanco de sustrato y enzima son las únicas hipotetizadas con la nula obtención de producto a partir de la catálisis
enzimática.
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Sustancia v/s Lactasa Amortiguador Carbonato de o-nitrofenil- Agua Destilada
Número de (SI) fosfato de sodio b-
sodio galactósido
(SBs) (mL) 0,1 mL 0,45 mL 0,3 mL 0 mL 2,15 mL
(SBe) (mL) 0 mL 0,45 mL 0,3 mL 0,5 mL 1,75 mL
(ST0) (mL) 0,1 mL 0,45 mL 0,3 mL 0,5 mL 1,65 mL
(ST5) (mL) 0,1 mL 0,45 mL 0,3 mL 0,5 mL 1,65 mL
Haciendo uso de una incubadora (I) cuya temperatura era de 23 °C se introdujeron todas las (SI) por
tres minutos, para luego añadir volúmenes de (DA) para (SBs) y (ONFG) para (SBe), (ST0) y (ST5)
respectivamente para comenzar la reacción enzimática. Para completar la reacción enzimática se
adicionó (VI) de esta forma inmediatamente se retiró de la (I) la (ST0), mientras que las (SBs), (SBe)
y (ST5), al cabo de cinco minutos. de esta forma se obtuvieron volumen es de 3 ml en los (TE) del
sistema enzimático (SE).
Empleando un (EF), una solución de calibración (SC) de un volumen de 1ml de (DA) e introduciendo
la solución en una cubeta de plástico (K), se calibró el equipo para cuantificar absorbancia a 420nm.
Para cada (SE) se siguió el mismo procedimiento, donde se extrajo un 1 ml, se introdujo dentro de
una (K) y está a su vez en un (EF).
Posteriormente se dispuso de tres (PV), una gradilla con un (TE) que contenía (DA) y cuatro tubos
Eppendorf (TP) todos identificados de acuerdo a su contenido, de los cuales dos contenían las
soluciones patrón (SP) de Amortiguador fosfato de sodio (BU) a pH 6,0 [0,1 M], Lactasa (LA)
[Desconocida] y Reactivo de Bradford (RB) [5x], los dos restantes para generar soluciones del
método de Bradford (SR), en particular la solución blanco del reactivo de Bradford (SBR) y la solución
del Método de Bradford (SM). Se posicionaron las tres (PV), identificadas respecto a la sustancia
extraída, sobre papel absorbente previamente adherido al mesón. A partir de las (SP) se emplearon
volúmenes de 0,8 ml de (DA) y 0,2 ml de (RB) para generar 1ml de (SBB) y para generar 1ml de la
(SM) se emplearon distintos volúmenes de 0,7ml (DA) y 0,2 ml de (RB) y 0,1ml de (LA), ambas
soluciones fueron depositadas en sus respectivos (TP), se agitaron y se dejó reposar durante tres
minutos.
Empleando un (EF), una solución de calibración (SC) de un volumen de 1ml de (DA) e introduciendo
la solución en una cubeta de plástico (K), se calibró el equipo para cuantificar absorbancia a 595 nm.
Para ambas soluciones se siguió el mismo procedimiento, donde se depositó el volumen total dentro
de una (K) y está a su vez en un (EF).
Resultados brutos
Construcción de una curva de calibración para la determinación de la concentración del producto de
la reacción enzimática catalizada lactasa.
4
Las cuantificaciones de absorbancia obtenidas del (EF) de las (SA) fueron relacionadas con las
concentraciones de (ONF) y los factores de Dilución (FD) utilizados respectivamente, empleando la
ecuación (1) y tabulados en la Tabla III.
Tabla III. Notar a simple vista la ascendencia proporcional de la relación entre las concentraciones y absorbancias de las
(SI). Es importante enfatizar que la (SA1) a pesar de no contener (ONF) se cuantificó un valor de absorbancia a 420 nm.
En adición solo (SA5) y (SA6) fueron diluidas de sus soluciones originales.
Característica (SA1) (SA2) (SA3) (SA4) (SA5) (SA6)
Analita v/s
Número de (SA)
FD 0 0 0 0 2 5
[ONF] [μg/mL] 0 0,02 0,08 0,15 0,23 0,3
Absorbancia 0,040 0,103 0,324 0,538 0,557 0,289
[U.A]
Determinación de la actividad enzimática.
Las cuantificaciones de absorbancia obtenidas del (EF) de las (SI) y (SR) fueron organizadas y
tabuladas en la Tabla IV. De manera que quellos valores destacados de color color amarillo fueron
cuantificados a 420 nm, mientras que los valores de color azul fueron cuantificadas a longitudes de
onda de 595 nm.
Tabla IV. Importante resaltar que todas las soluciones analitas poseían un volumen de 0,1 mL de Lactasa a excepción de la
(SBe), a la cual de todas maneras se le cuantificó un valor de absorbancia a 420 nm. En contraste el valor obtenido para
(ST0) refleja la cantidad de (ONF) formado, al detener la reacción inmediatamente después de completar el sistema
enzimático al añadir sustrato. (SBR) Siendo la absorbancia de la enzima lactasa con reactivo de bradford y (SbBR) siendo el
blanco de bradford de esta misma, ambas a 595 nm.
Absorbancia (SBs) (SBe) (ST0) (ST5) (SBR) (SbBR)
v/s Número
de (SI) y (SR)
Absorbancia 0 0,156 0,017 0,213 0,373 0,306
[U.A]
Análisis y tratamiento de resultados
Construcción de una curva de calibración para la determinación de la concentración del producto de
la reacción enzimática catalizada lactasa.
Utilizando los datos tabulados en la Tabla III y la ecuación (2) se procedió a restar a todas las (SA)
el valor (SA1), correspondiente la absorbancia de todas las otras sustancias presentes en la muestra
que también absorbieron a 420 nm, se pudo obtener la razón entre la concentración del compuesto
en estudio y su absorbancia (c/A) es constante, de esta manera se generaron los datos de la Tabla
V.
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Tabla V. Relación de los volúmenes de las sumas de (F) y su separación en la (CE) con sus respectivos PM, notar las
variaciones debido al ajuste de la solución buffer.
Característi (SA1) (SA2) (SA3) (SA4) (SA5) (SA6)
ca Analita
v/s Número
de (SA)
Absorbanci 0,040 0,103 0,324 0,538 1,114 1,405
a [U.A]
[μg/mL] 0 0,02 0,08 0,15 0,23 0,3
A partir de lo anterior se generó una Gráfica de calibración a 420 nm de Absorbancia v/s
Concentración de las (SA), siguiendo la linealidad de la ley de Beer–Lambert. Visualizado en la
Figura 1.
Fig 1. Curva de calibración derivada de las diluciones de ONF. Las concentraciones del compuesto se expresan en [µg/mL]
y las absorbancias en [U.A]. Sin embargo, con un valor de R^2 de 0,977, la gráfica podría no ser totalmente representativa.
La curva de calibración presenta la
ecuación (4) Adjunta en el anexo.
Como se mencionó anteriormente,
esta misma ecuación fue útil para
calcular la concentración aproximada
de ONF extrapolando su absorbancia.
Experimento 1.2) Determinación de la
actividad enzimática de una
preparación de lactasa
Con la curva de calibración de ONF
ya establecida, se avanzó hacia el
análisis de los resultados derivados de las mediciones de SBs, SBe, SBT0, y de la muestra
correspondiente a la reacción, denotada como ST5 (ver Tabla IV). Es esencial restar las
absorbancias obtenidas de las muestras blanco a la de la muestra de reacción. Este ajuste permite
eliminar la influencia de otros componentes y retener una absorbancia que corresponde
exclusivamente al ONF, sin embargo, el valor de absorbancia correspondiente a SBe muestra un
valor extrañamente alto según lo comentado en la experiencia misma por lo que se procederán a
hacer dos mediciones, una descontando el mismo (representada en azul), y otra obviandolo (rojo).
Como se destacó en el experimento 1.1, estas absorbancias son además indicativas de la
concentración de galactosa que ha sido hidrolizada. Los valores de absorbancia, y de concentración
obtenidos a través de la ecuación (2) están dispuestos en la Tabla VI.
Tabla VI. Concentración de ONF en [µg/mL] obtenida a partir de la absorbancia tratada. Gracias a la curva de calibración de
ONF (Fig.1).
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Absorbanc Concentra Cantidad de Absorbancia Concentr Cantidad de
ia tratada ción ONF tratada (U.A) ación ONF (µmoles)
(U.A) [µg/mL] (µmoles) [µg/mL]
Muestra 0,057 0,0738 0,053 0,213 0,106 0,762
SCs
La concentración obtenidas de ONF resulta ser 0,0738 [µg/mL] y de 0,106 [µg/mL] con una
absorbancia de 0,057 y 0,213 a 420 nm.
Una vez determinada la concentración total de ONF generada durante la reacción, es posible calcular
el coeficiente de actividad enzimática para dicha reacción. Para ello, se emplea la fórmula (2).
Tomando el volumen total de la dilución, que es de 3 mL, y en el tiempo que duró la reacción,
aproximadamente 5 minutos. Finalmente se obtienen los siguientes resultados.
Tabla VII. Actividad enzimática perteneciente a la reacción de hidrólisis de ONPG en unidades arbitrarias de actividad
Concentración Actividad total Concentración Actividad total
[µg/mL] ([Link]) [µg/mL] ([Link])
Muestra SCs 0,0738 0,0442 0,106 0,064
[[Link]].
Para determinar la actividad específica de la lactasa, es necesario utilizar la ecuación (3). Esta
ecuación implica dividir la actividad enzimática (U) (Tabla VII.) en la cantidad de proteína en
miligramos (mg) presentes en el sistema de reacción. No obstante, antes es esencial determinar los
microgramos (µg) de proteína contenidos en la muestra. Esto se logra a partir de la absorbancia de la
lactasa medida con el reactivo de Bradford (ver Tabla IV.), corrigiendo por la muestra blanco. Luego,
se utiliza la curva de calibración de BSA (Fig. 2 dispuesta en el anexo), elaborada en el laboratorio
número 3, para deducir la cantidad de proteína presente en la disolución (µg).
Tabla VIII. Cantidad de lactasa expresada en µg y mg, junto con su actividad enzimática específica ([Link]/mg), determinada
a partir de la absorbancia (U.A) sin la influencia del reactivo de Bradford.
Absorbancia Cantidad de Cantidad de Actividad Actividad
(U.A) proteína (µg) proteína (mg) enzimática enzimática
específica específica
([Link]/mg) ([Link]/mg)
0,067 2,30 0,0023 4,61 66,26
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La actividad enzimática específica experimental de la enzima lactasa en la hidrólisis de ONFG es de
4,61 ([Link]/mg) y 66,26 ([Link]/mg) sin restar el blanco de enzima.
Discusión
Para determinar la representatividad de los resultados obtenidos, es crucial analizar la precisión de
nuestras mediciones. La absorbancia del ONF parece confiable, ya que el gráfico muestra un
coeficiente de determinación (r^2) de 0,977. Aunque las mediciones de absorbancia parecen
consistentes, hay una anomalía en la primera muestra SA1 que registró una absorbancia de 0,04
(U.A) (Tabla V.), a pesar de no contener ONF. Este desajuste podría atribuirse a errores de medición,
o más probablemente, a una posible contaminación del instrumento con trazas de ONF. Esta
contaminación podría haber reaccionado en el ambiente alcalino, llevando a un valor atípico en la
medición. Otra posibilidad es que la sustancia añadida no fuera del todo pura y tuviera compuestos
que absorbieran luz a la longitud de onda seleccionada. A pesar de este valor inusual, fue restado de
las demás mediciones para generar una curva de calibración más precisa.
En el análisis de las actividades enzimáticas obtenidas experimentalmente, se percibe una
incertidumbre respecto a la exactitud de los resultados, dado que no se ha encontrado literatura que
se base en experimentos similares. Las mediciones manifiestan anomalías significativas. En
particular, la absorbancia medida para el blanco enzimático es sorprendentemente alta, llegando a
0,156 unidades de absorbancia (U.A). Este resultado es desconcertante, ya que, al carecer de
colorante, se esperaría que el blanco mostrara una absorbancia sustancialmente más baja, similar a
la del blanco de "Tiempo cero". Tal inconsistencia sugiere posibles interferencias en el proceso de
medición o dificultades en la calibración del espectrofotómetro.
Además, las absorbancias derivadas de la reacción no parecen alinearse de manera coherente con la
curva de calibración de ONFG, generando incertidumbre sobre las concentraciones deducidas. Estas
discrepancias podrían atribuirse a errores en las mediciones o a posibles contaminaciones cruzadas
entre las muestras. Estos factores cobran relevancia crítica considerando que las enzimas son
maquinarias biológicas sumamente eficientes; por ende, mínimas variaciones en sus concentraciones
o en las condiciones de reacción pueden traducirse en alteraciones significativas en los resultados.
En resumen, varias anomalías e incertidumbres subrayan la necesidad de un procedimiento más
meticuloso, la confirmación a través de experimentos repetidos y, posiblemente, la revisión de los
protocolos de medición y calibración.
Cuestionario
1. Como se señala en Cox y Nelson (página 213, capítulo 6), “todas las enzimas tienen un
intervalo de pH óptimo, en las que presentan la actividad máxima”. Y en particular, según
Pérez Escobar, “las condiciones óptimas para la lactasa son de pH de 6,1”. Esto sugiere que
la lactasa se activa de manera óptima en entornos ligeramente ácidos. La adición de
carbonato de sodio altera el pH de la muestra, rompiendo el tampón en este contexto y
elevando el pH de la solución, lo que resulta en la detención de la catálisis. Además, según la
guía de laboratorio, el ONF adquiere una tonalidad amarillenta en un entorno alcalino de
acuerdo con lo que se especifica en la guía de laboratorio del curso de Bioquímica 2023.
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2. Para determinar si una reacción química está catalizada por una enzima, es esencial evaluar
cómo la velocidad de la reacción se ve afectada al modificar ciertas condiciones ambientales,
como la temperatura y el pH. Si la reacción es más rápida o lenta debido a estos cambios, es
indicativo de la acción enzimática. Además, si se somete la reacción a condiciones extremas,
como temperaturas muy altas o un pH muy ácido o básico, y la reacción se detiene o
disminuye significativamente su velocidad, puede ser una señal de que la enzima se
encuentra también en su forma desnaturalizada y, por lo tanto, ha perdido parte de su
capacidad catalítica. Esta desnaturalización es característica de las proteínas, como las
enzimas, al exponerlas a condiciones fuera de su rango óptimo de funcionamiento. Cox y
Nelson (2006) hacen alusión a esto proponiendo el caso de una enzima en un ambiente a pH
básico. “La eliminación de un protón de un residuo de histidina podría, por ejemplo, eliminar
una interacción iónica esencial para la estabilidad de la conformación activa de la enzima”.
3. Se deberían tomar controles parecidos a los de este laboratorio. La creación de blancos es
extremadamente importante para las mediciones de absorbancia, mediante la cual se obtiene
la concentración de producto creado por la enzima en un lapso, y así finalmente obtener una
actividad en unidades arbitrarias (Ecuación (3)). Además la previa construcción de una curva
de calibración para la cuantificación de enzima presente en la reacción es de vital importancia.
Sin embargo, la pregunta presenta el caso de un extracto de tejido. Si fuese así, las células de
este deberían romperse para posteriormente ser separadas a través de una centrifugación a
distintas velocidades. Ya obteniendo las proteínas de este tejido se deberían ocupar métodos
de purificación de proteínas, como cromatografías de exclusión molecular y/o una
cromatografía de intercambio iónico, para así aislar la enzima de interés de otras proteínas y
compuestos presentes en el extracto de tejido. Cabe recalcar que cada enzima tiene
propiedades únicas que pueden requerir ajustes o modificaciones en los procedimientos de
purificación y análisis.
Las mismas consideraciones mencionadas en la pregunta número 2. Aspectos como el pH, la
temperatura y la concentración enzimática son esenciales, ya que cada enzima tiene
condiciones óptimas donde su actividad es máxima. Por ejemplo, al conocer los valores
óptimos de pH y temperatura de catálisis, se podría deducir el tiempo necesario de
incubación. Y, si estos mismos variarán, el tiempo de reacción se vería afectado directamente.
Además la sensibilidad del método de detección, como la absorbancia, es crucial. En caso de
que la enzima no libere una cantidad de producto lo suficientemente significativa para ser
cuantificada por el método, puede ser necesario ajustar el tiempo de incubación hasta
alcanzar una concentración del producto que sea cuantificable de manera precisa. También se
recalca la importancia de la calibración de instrumentos para la determinación de parámetros
en la reacción. Se visualiza la figura 5 en el anexo.
Conclusión
Los resultados derivados de la experimentación plantean ambigüedades, principalmente debido a los
valores de absorbancia inusualmente elevados observados en la muestra blanco de la enzima. Esta
anomalía ha provocado una considerable variación en los valores de actividad y actividad específica,
complicando la tarea de determinar qué resultados reflejan con precisión la realidad. La ausencia de
9
referencias bibliográficas comparables producen incertidumbre, impidiendo conclusiones claras y
definitivas.
En cuanto a la ejecución del experimento, se llevó a cabo sin grandes contratiempos. La única
desviación notable con respecto al protocolo teórico fue la incorporación de diluciones adicionales
indicadas en la tabla III; no obstante, se considera que estas modificaciones no deberían afectar
significativamente los resultados finales.
A pesar de las incertidumbres, se reconoce que los objetivos del experimento se cumplieron en
términos generales. Sin embargo, es importante señalar que los resultados podrían estar sesgados
debido a ciertos factores de error. Uno de estos factores incluye el uso de pipetas de vidrio, que,
aunque funcionales, no garantizan la máxima precisión en comparación con otras herramientas de
medición más avanzadas. Además, es imperativo reconocer que el error humano y las variaciones en
las mediciones son variables omnipresentes en cualquier procedimiento experimental.
Por lo tanto, aunque se alcanzaron los objetivos propuestos, la interpretación de los resultados debe
hacerse con cautela. Las inconsistencias observadas sugieren la necesidad de un análisis más
detenido y, posiblemente, la repetición de ciertos aspectos del experimento para validar los hallazgos.
La precisión en la experimentación científica es fundamental, y los pasos adicionales podrían
proporcionar una mayor claridad y fiabilidad a estos resultados preliminares.
Bibliografía
- Cox Michael & L. Nelson David (2006). Lehninger Principios Bioquímica (4ta Edición).
Ediciones Omega.
- Peréz Escobar, L. (2018). Obtención de un concentrado hidrolizado de lactosa por
nanofiltración. [Tesis de magíster, Universidad Nacional de Colombia].
[Link]
sequence=5&isAllowed=y
10
Anexo
Fig 2. Curva de calibración de BSA. El eje y presenta las Fig 3. Tabla utilizada para responder el cuestionario.
absorbancias en (U.A) obtenidas a 595 nm, y el eje x siendo
la cantidad de proteína en µg. Además de su ecuación de la
recta.
Fig 4. Curva de calibración experimental de ONF obtenida en el laboratorio.
Midiendo absorbancias en (U.A) a 420 nm y concentración de ONF en [µg/ml].
Ecuación (4)
y=4 , 79∗x+−0,0619 (4)
Fig 5.
Cálculos posterior
es
Rendimiento Actividad Grado de
porcentual específic purificación
a
% U / mg
100 0,672 1,0
86 3,08 4,58
54,5 41,66 13,5