Universidad de Chile
Facultad de Ciencias Químicas y farmacéuticas
Diplomado de Análisis Instrumental Orgánico
Modulo Nº4: Cromatografía Liquida de Alta Resolución
Informe Laboratorio Nº 2
Determinación de Cafeína en Bebidas
Agosto 2011
1
Objetivos
Construir una curva de calibración con y sin estándar interno
Determinar el contenido de cafeína en bebidas y café
Materiales
Cromatografo liquido de alta eficiencia HP serie 1050 con detector de arreglo de
diodos Waters 996
Columna C-18 (5µm), 4,6 mm x 150 mm
Fase móvil: CH3OH / H2O : 50/50
Flujo entre 0,8 y 1 ml/min
Detección UV a 270 nm
Jeringa de vidrio para inyección
Solución de cafeína 0,2 mg/mL
Solución de fenol 2 mg/mL (estándar interno)
2
Resultados
A partir de la solución de cafeína 0,2 mg/ml se prepara una batería de soluciones de
concentración desde 0,01 mg/mL a 0,1 mg/mL en 5 ml usando 500 µl de fenol 2 mg/mL
como estándar interno.
Preparación de las muestras:
café: de 100 ml de café preparado tomar 300µl, agregar 500 µl de fenol y se lleva a
5 ml con la mezcla de la fase móvil, filtrar
coca cola: a 4 ml de bebida sonicada agregar 500 µl de fenol y se enraza a 5 ml,
filtrar
Concentració A caf /
A cafeína A fenol
n cafeína A fen
0,01 1733533 18240532 0,0950374
1
0,02 4685371 17036851 0,2750139
1
0,04 11198043 18884483 0,5929758
8
0,06 17130849 18787168 0,9118377
5
0,08 20373582 17175815 1,1861784
7
0,10 20923662 14334818 1,4596391
8
Curva de calibración de razones de áreas
1.6
1.4
1.2
f(x) = 15.6129287847784 x − 0.0435343228487589
R² = 0.998487920628699
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
3
Y =15,1511−0,02936 × X
Donde:
Y: área cafeína/ área fenol
X: concentración cafeína
Curva de calibración absoluta
25000000
f(x) = 226861551.232877 x + 952993.186301369
R² = 0.940495787856749
20000000
15000000
10000000
5000000
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
Y =952993,2+ 226961551× X
Donde:
Y: área cafeína
X: concentración cafeína
Dado que el coeficiente de regresión no es bueno se elimina el ultimo punto (0,1 mg/ml) y
se obtiene una nueva curva de calibración:
25000000
20000000 f(x) = 274879296.95122 x − 520654.871951222
R² = 0.986477411825778
15000000
10000000
5000000
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
A partir de la nueva curva de calibración absoluta se determina el limite de detección (LD)
y el limite de cuantificación (LQ)
4
LD=3 ×
√
S y/ x N −2
m N −1
LQ=10 ×
√
S y / x N −2
m N −1
Donde:
m: pendiente
N: numero de puntos de la curva de calibración
Sy/x: desviación estándar de la ecuación de la recta
√∑ 2
( y i− ^y i )
S y / x=
N−2
Sy/x= 2225343,90
LD = 0,026 mg /ml
LQ =0,087 mg / ml
Sy/x= 1064154,44
LD = 0,010 mg /ml
LQ =0,033mg / ml
Luego de inyectar las muestras, se calcula el area de cafeína, fenol y se interpolan los datos
en la curva de calibración usando el estándar interno
Muestra A Cafeína A Fenol A Caf / Concentración
A fenol mg / mL
cafe 9378964 16928423 0,55403649 0,03850526
Coca cola 17726630 16359513 1,0835671 0,0734551
Finalmente la concentración de cafeína para cada muestra es:
Taza de café = 0,0385 mg /ml x 5 ml x 100 ml / 0,3 ml
= 64,18 mg de cafeína
Coca cola = 0,073455 mg / ml x 5 ml x 350 ml (lata de bebida) / 4 ml
= 32,14 mg de cafeina
5
Discusión
Al observar las curva de calibración con y sin estándar interno se observa que al utilizar el estándar
interno se obtiene un mejor coeficiente de correlación ya que se están minimizando los errores
que puedan ocurrir en la preparación de las muestras y los entandares y también durante la
inyección. Como estándar interno se utiliza un compuesto de características similares y que se
comporte de la misma forma que el analito de interés a los condiciones de trabajo