DECODIFICANDO LOS

CAMBIOS CUANTITATIVOS EN

EL PROTEOMA SÉRICO
DE PACIENTES CON
ARTRITIS
REUMATOIDE

Sara Vázquez Rodríguez

Dpto. de Bioquímica y Biología Molecular
Santiago de Compostela 2014
DÑA MONTSERRAT NOGUEIRA ÁLVAREZ Y DON FRANCISCO JAVIER SALGADO CASTRO, CATEDRÁTICA
Y PROFESOR CONTRATADO DOCTOR RESPECTIVAMENTE DEL DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y
BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA

CERTIFICAN:

Que la memoria presentada por Sara Vázquez Rodríguez y que lleva por título “Decodificando los
cambios cuantitativos en el proteoma sérico de pacientes con Artritis reumatoide”, ha sido realizada
bajo su dirección dentro del grupo “Biología del Linfocito”, del Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, y que dicho trabajo reúne, a
nuestro juicio, los requisitos necesarios para optar al grado de Doctor.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos el presente informe a 28 de marzo de 2014.

Fdo. Dra. Montserrat Nogueira Álvarez Fdo. Dr. Francisco Javier Salgado Castro
DIRECTORA DE TESIS CODIRECTOR DE TESIS

I
II
A Rodrigo, por ser el responsable de que este trabajo no se finalizase
mucho antes, te quiere
Mamá.

A Tejo, por creer siempre en mí.

A mis padres, por quererme tanto.

III
IV
 “He aquí mi secreto, que no puede ser más simple: sólo con el
corazón se puede ver bien; lo esencial es invisible para los ojos”
Le Petit Prince*

“No se sale adelante celebrando éxitos sino superando fracasos”

Orison Swett Marden

“Ciencia sin conciencia no es más que ruina del alma”

François Rabelais

“Atreveos: el progreso se logra así”

Víctor Hugo

“La mayor sabiduría que existe es conocerse uno mismo”

Galileo Galilei

“Se triunfa con lo que se aprende”

Coco Chanel

“Un puzzle o rompecabezas, es en definitiva, un entretenimiento. Un embrollo, que consistente

en recomponer una figura combinando trozos de madera o cartón, regulares o no, cada uno de
los cuales forma parte de un dibujo o grabado.”

Así entiendo yo la PROTEOMICA como un “juego”, un “acertijo” donde es preciso juntar todas las
piezas (PROTEINAS) en las que está dividido, para poder formar y entender la figura final (RA).

GRACIAS a José Manuel Tejo por entender de una forma asombrosa, lo que un día imagine en mi
cabeza.

V
VI
 AGRADECIMIENTOS

Después de mucho trabajo, una boda, un parto, esfuerzo y dedicación ha llegado el

momento de escribir las que tal vez sean las páginas más emocionantes de esta tesis, y
seguramente las que se lean con mayor interés. Llegados a este punto, una intenta no
dejarse a nadie en el tintero pero después de tanto tiempo, la verdad es que casi cuesta hasta
recordar.

En primer lugar y para no perder la tradición quiero dar las gracias a mis directores
de Tesis, Montse y Fran, por que sin ellos esto jamás hubiese llegado a su fin. GRACIAS
Montse por creer en mí siempre, incluso cuando ni yo misma lo hacía, GRACIAS por esa
llamada que hizo que hoy este escribiendo estas palabras, GRACIAS por confiar en mí.
Fran, no tengo palabras… no sé cómo voy a agradecerte todo lo que me has ayudado, lo que
me has enseñado. Esta tesis no tendría ningún sentido sin ti. GRACIAS por haberme
acompañado en esta experiencia tan dura y a la vez tan gratificante de mi vida, por
haberme enseñado a pensar y a relacionar, por tu esfuerzo, tu empeño y tu ilusión. A Pilar
por esas charlas siempre entretenidas, por el optimismo y “buen rollo” que desprende,
también por el apoyo y los piropos (que siempre alegran a una). Gracias al Dr. Antonio
Mera Varela responsable del servicio de reumatología, del Hospital clínico Universitario de
Santiago, y a todo el personal que lo conforma; y finalmente GRACIAS a la Dra. Rosa
maría Crujeiras Casais, del Departamento de Estadística e Investigación Operativa, por
dar “sentido” a los datos de esta tesis.

Cuando llegue a la USC, a finales de 2007 no sabía que conocería algunas de las
personas más importantes de mi vida [mundo-piruleta], compañeros que hoy son amigos,
AMIGOS DE VERDAD con los que he vivido momentos inolvidables…

JOSI, FEN, FENCHi, tú me has enseñado todo lo que sé, GRACIAS por
ayudarme a entender el mundo BI-dimensional, por aguantar mis risas y también mis
lagrimas, por los temazos, planazos, las fotos, los abrazos, por esa “energía” que te hace
único, por ser como eres, y por estar SIEMPRE ahí en los momentos importantes. A mi
otra mitad JENN, mi compañera de “aventuras-proteomicas”, porque parte de esta Tesis
también es tuya, por las horas de electroforesis, tinciones, PD-Wi, clases de CAP, cursos…

VII
por todas y cada una de las horas que hemos compartido dentro y fuera de este laboratorio.
A mi amiga MÓNICA a la que admiro, no solo por ese carácter alegre que siempre la
acompaña, sino por esa capacidad que tiene para sacar fuerzas de donde sea y seguir hacia
delante a pesar de sus despistes monumentales que son, sin lugar a dudas, el “sello de la
casa”. Te costó pero… ¿ahora qué, AMPE JAI WEI? Si hace 6 años te dicen que tu y yo
íbamos a ser amigas, te caes” pa-tras”. En serio “AMPEripedia”, eres increíble, por tus
salidas & ocurrencias, por ser única e irrepetible, por las metidas de “pila” que tanta falta
me hicieron en determinados momentos, por hacerte pasar por mí, por llevarme al límite
haciendo que me metiera en un avión sin maleta, por entender que a mí lo único que
realmente me quita la sed es un martini y por respetar que me va el melodrama, solo puedo
decir una cosa, GRACIAS por aparecer.

No quiero olvidarme de todos aquellos que en algún momento han sido partícipes de
esta experiencia, Carla, AnaCanda, Alex, Ana, Paula&Noe, PedroPortu, Eva Xwzwx…
pienso en vosotros y me sale una sonrisa enorme, SUERTE chicos!

En todo este tiempo, he vivido entre dos mundos, la USC y El Dolores Ramos, allí
esta “mi otra familia”, GRACIAS niñas por todos los buenos momentos vividos, por los
ánimos, el apoyo, las risas, por hacer que durante 3 h pudiera desconectar de mi otro
mundo, por los “gabinetes de crisis” en el almacén de la limpieza, los cafés de 5 min que se
hacen interminables y por todas y cada una de las anécdotas que vivimos día tras día. Lore
“la buena”, Leti, Adri, Rita, Bea, Carmen, Nati, Laura, Sandra, Itiña, Mari, Marité y
nuestra “suprema” Chusiña, GRACIAS!

Antes de llegar aquí, pase una temporada larga en un lugar mágico, a esa ciudad
que me hizo tan feliz durante casi 7 años, le doy las GRACIAS, allí deje unas amigas
maravillosas Pauli, Ana-Alóndiga… LO CONSEGUÍ NIÑAS! no sé lo que daría por
teneros más cerca “miss You”.

A todos los amigos (Eli, Angeles, Yu, Anita “segunda mamá de Rodri”; Mapi,
Noe) y familia (hermanas Alperi alias “primis”, Marina, Marisol, Leo&César,
Katti&Tania, Mansi) que habéis estado ahí, al pie del cañón… mi más sentido
GRACIAS.

VIII
 Sr. Tejo, que le voy a decir a usted, podría resumirlo rápidamente pero
sinceramente creo que se merece unas líneas… GRACIAS no solo por haber “editado” el
índice-maldito de esta tesis (Jejeje…) sino por ser mi compañero de viaje, por hacerme la
persona más feliz de la Tierra, por haberme hecho el regalo más maravilloso de este mundo,
por hacer que cada día sea distinto, a pesar de los casi 11 años que llevamos juntos, por ser
el responsable de que me ponga ÑOÑA y escriba esto públicamente ¡ya te vale! Venga
resumo: TE QUIERO!

Las últimas palabras son para la familia, esa que ha estado ahí siempre desde el
principio hasta el final, GRACIAS papá&mamá por todo lo que me habéis dado, por
hacerme la vida más fácil, por estar aquí… porque lo que soy y lo que tengo, ha sido siempre
GRACIAS a vosotros.

Y aquí termina esta aventura… atrás quedan muchos sentimientos, emociones que
ya forman parte del recuerdo, el futuro está por llegar, no sé qué pasará ni lo que me
deparará lo que si se, es que espero no perderos de vista a ninguno de vosotros.

Una y mil veces más, GRACIAS_

IX
X
 RESUMEN

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune que afecta

simétricamente a las articulaciones y en cuyo desarrollo influyen factores medioambientales y
personales (sexo, edad, perfil genético). Cursa con inflamación sinovial y daño en
cartílago/hueso, pero presenta además repercusiones sistémicas, como las cardiovasculares. Los
estudios de asociación han destacado un posible papel de ciertos genes (e.j., HLA, TLR2 y TLR4).
Sin embargo, su impacto en el fenotipo es difícil de inferir debido a fenómenos epigenéticos, el
papel de microRNAs, el procesamiento alternativo del mRNA, las modificaciones
postraduccionales o las interacciones entre proteínas. Los estudios proteómicos permiten
abordar toda esta complejidad producida en respuesta a enfermedades como la RA y perseverar
así en la búsqueda de nuevos biomarcadores séricos que permitan un diagnóstico más temprano
y simple. Dicho diagnóstico está actualmente basado en criterios complejos (2010 ACR/EULAR)
de aceptable sensibilidad (79-84 %) pero baja especificidad (59-64 %). En el presente estudio
hemos analizado mediante 2-DE muestras de suero procedentes de 8 individuos control y 8
pacientes con RA recién diagnosticados (o no tratados) cuya complejidad fue reducida mediante
cromatografía tiofílica/inmunodepleción o librerías peptídicas. El análisis uni- y multivariante
puso de relieve cambios en los niveles de ciertas proteínas (albúmina, apoA1, apoA4 apoH,
antitrombina III, transtirretina, factores de complemento, hemopexina, glicoproteína α2 rica en
leucina, y haptoglobina) y aportó indicios que apuntan hacia una mayor frecuencia de los alelos
APOE*4 (que podría favorecer la citrulinización de la apolipoproteína E) y HP*1 en RA que
podrían funcionar como determinantes importantes de riesgo cardiovascular en RA.

XI
XII
ABREVIATURAS
A1AT Alpha-1-antitrypsin Alpha-1-antitripsina
A1BG Alpha-1-B glycoprotein Alpha-1-B glicoproteína
A2M Alpha-2-Macroglobulin Alpha-2-macroglobulina
ACN Acetonitrile Acetonitrilo
Anticuerpos anti péptidos/proteínas
ACPA Anti-Citrullinated Peptide Antibodies
citrulinados/as
ACR American College of Rheumatology
AFA Anti Filaggrin Antibodies Anticuerpos anti-filagrina
AFM Afamin/alpha-albumin Afamina/alpha-albúmina
AFP Alpha Fetoprotein Alpha fetoproteína
AHSG Alpha-2-HS-glycoprotein Alpha-2-HS-glicoproteina
AINEs Antiinflamatorios no esteroideos
AKA Anti-Keratin Antibodies Anticuerpos anti-queratina
ALB Albumin Albúmina
ANA Antinuclear antibodies Anticuerpos antinucleares
Apaf1 Apoptotic Protease Activating Factor-1.
APC Antigen Presenting Cell Célula presentadora de antígeno
APF Anti-Factor Perinuclear Antibody Anticuerpos anti-factor perinuclear
APO Apolipoprotein Apolipoproteína
APP Acute phase protein Proteína de fase aguda
APR Acute phase response Respuesta de fase aguda
AQUA Absolute quantification cuantificación absoluta
ATIII Antithrombin III Antitrombina
BCR B cell Receptor Receptor de las células B
BiP Binding innmmunoglobulin protein Proteína fijadora de inmunoglobulina
BSA Bovine Serum Albumin Seroalbúmina bovina
CCP Citrullinated cyclic peptide. Péptido citrulinado cíclico
CCP Cyclic citrullinated peptide Péptido cíclico citrulinado
CE Capillary electrophoresis Electrophoresis capilar
CEA Carcinoembryonic antigen Antígeno carcinoembrionario
CEA Carcinoembryonic antigen Antígeno Carcinoembrionario
Proteína de transferencia de ésteres de
CETP Cholesterol ester transfer protein
colesterol
CFA Complete freund adjuvant Coadyuvante completo de freund
CIA Collagen-induced arthritis Artritis inducida por colágeno
Collision induced dissociation/ collisionally Disociación inducida por colisión / disociación
CID/CAD
activated dissociation por colisión activada

XIII
COX-2 Cyclooxygenase-2 Ciclooxigenasa-2
CP Ceruloplasmin Ceruloplasmina
Biblioteca de ligandos peptídicos
CPLL Combinatorial peptide ligand library
combinatorios
CRP C-Reactive Protein Proteína C reactiva
CSF Cerebral spinal fluid Fluido cerebroespinal
cTnT Cardiac troponinT Troponina T cardiaca
CV Coeficiente de variación
DAPMs Damage-associated molecular patterns Patrones moleculares asociados al daño
DBP Vitamin D binding protein Proteína de unión a vitamina D
DCs Dendritic cells Células dendríticas
DIGE Difference gel electrophoresis Electrophoresis diferencial en gel
Fármacos antirreumáticos modificadores del
DMARDs Disease-Modifying Antirheumatic Drugs
curso de la enfermedad
DTT Dithiothreitol Ditiotreitol
EBV Epstein-barr Virus Virus Epstein-barr
ECD Electron capture dissociation Disociación por captura de electrones
ECM Extracellular matrix Matriz extracelular
Endosomal sorting complex required for
ESCRT1
transport
ESI Electrospray ionization Ionización por electro-spray
ESR Erythrocyte sedimentation rate Ratio de sedimentación de eritrocitos
ETD Electron transfer dissociation Disociación por transferencia electrónica
EULAR European League Against Rheumatism
FDR False discovery rate Tasa de falsos positivos
FFE Free-flow Electrophoresis Electrophoresis de flujo libre
FF-IEF Free-flow isoelectrofocusing Isoelectroenfoque de flujo libre
FGF Fibroblast Growth Factor Factor de crecimiento de fibroblastos
FNR Fracción no retenida
FR Fracción retenida
FT-ICR Fourier transform ion cyclotron ressonance
HCD Higher-energy collisional dissociation Energía de disociación por colisión
HDL High-density lipoprotein Lipoproteínas de alta densidad
HIC Hydrophobic interaction chromatography Cromatografia de interacción hidrofóbica
HIV Human immunodeficiency virus Virus inmunodeficiencia humana
HLA Human Leucocyte Associated Asociado con los leucocitos
Hp haptoglobin haptoglobina

XIV
HPLC High-performance liquid chromatography Cromatografía liquida de alta resolución
HPPP Human Plasma Proteome Project
HSA Human serum albumin Albúmina humana
HSV Herpes Simplex Virus Virus herpes simplex
HTLV1 Human T-Lymphotropic Virus type 1 Virus linfotropico humano tipo 1
HUPO Human Proteome Organization
ICAT Isotope-Coded Affinity Tag
Etiquetas de proteínas codificadas por
ICPLs Isotope-coded protein labels
isótopos
IEF Isoelectric focusing Isoelectroenfoque
IFN-γ gamma interferon Interferon Gamma
Ig Inmunoglobulin Inmunoglobulina
IL Interleukin Interleuquina
ILVs Intraluminal vesicle Vesículas intraluminales
IMAC Immobilized metal chelate chromatography
IPG Inmobilized pH gradients Gradientes de pH inmobilizados
IT Ion trap Trampa de iones
Isotope Tagged Relative and Absolute
iTRAQ
Quantification
KDa Kilodalton Kilodalton
KNG1 Kininogen-1 Kininógeno-1
LC Liquid Chromatography Cromatografía líquida
LCAT lecithin-cholesterol acyltransferase Lecitina-colesterol aciltransferasa
LDL Low-density lipoprotein Lipoproteínas de baja densidad
LHR Long homologous repeats Dominios de homología repetidos
LIT Linear ion trap Trampa de ions lineal
LRG Leucine-Rich α2-Glycoprotein Glicoproteína α-2 rica en leucina
LRR Leucine-Rich Repeats Dominios ricos en leucina
LTβ Lymphotoxin β Linfotoxina β
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Desorción/ionización láser asistida por matriz
MBL Mannose-binding-lectin Lectina de unión a manosa
MCP Monocyte chemotactic protein-1 Proteína quimiotáctica de monocitos-1
MHC Major Histocompatibility Complex Complejo Mayor de Histocompatibilidad
Factor inhibidor de la migración de
MiF Macrophage migration inhibitory factor
macrófagos
M-LAC Multi-lectin affinity Chromatography Cromatografía de afinidad basada en lectinas
MMP Metalloproteinase Metaloproteinasa

XV
MRM Multiple reaction monitoring Monitorización de reacciones múltiples
MS Mass spectrometry Espectrometría de masas
MTX Methotrexate Metotrexato
Multimensional Protein Identification
MudPIT
Technology
MVBs Multivesicular bodies Cuerpos multivesiculares
NO Nitric Oxide Oxido nítrico
NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drug Drogas antiinflamatorias no esteroideas
OA Osteoarthritis Osteoartritis
OSM Oncostatina M
OT Orbitrap Orbitrap
PAD Peptidylarginine demininase Peptidil arginina deiminasa
PBS Phosphate buffer saline Tampón fosfato salino
PC Phosphoryl Choline Fosforil colina
PCA Principal components analysis Análisis de componentes principales
PCR Polymerase Chain Reaction Reacción en cadena de la polimerasa
PDGF Platelet-derived Growth Factor Factor de crecimiento de plaquetas
PFF Peptide fragment fingerprinting
PGK1 Phosphoglycerate kinase-1 Fosfoglicerato quinasa-1
PLG Plasminogen Plasminógeno
PMF Peptide mass fingerprint Huella peptídica
PNA Peanut agglutinin Aglutinina de cacahuete
PPP Plasma Proteome Project Proyecto del proteoma del plasma humano
Patrones de reconocimiento altamente
PRRs Pattern recognition receptors
conservados
PRX5 peroxiredoxin 5 Peroxiredoxina 5
PSA Prostatic antigen Antígeno prostátrico
PSD Post-source decay Proceso de descomposición metastable
pSS Progressive systemic sclerosis Esclerosis sistémica progresiva
PTMs Modificaciones postraduccionales
Q cuadrupolo
QconCAT Quantification concatemer
Qq Doble cuadrupolo
QQQ Triple cuadrupolo
RA Rheumatoid Arthritis Artritis Reumatoide
RAFs Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts Fibroblastos sinoviales de la RA
RBP Retinol binding protein Proteína fijadora de retinol

XVI
RF Rheumatoid Factor Factor Reumatoide
RNS Reactive nitrogen species Especie reactiva de nitrógeno
ROS Reactive Oxygen Specie Especie Reactiva de Oxígeno
RP Reverse phase Fase reversa
RP Reverse phase chromatography Cromatografía de fase reversa
RT Room Temperature Temperatura ambiente
S Suero de individuo control sano
SAA Serum Amyloid A Proteína amiloide sérica A
SAP Serum amyloid P-component Componente P amiloide del suero
SAR Suero de paciente con arthritis reumatoide
SAX Strong Anion Exchange Cromatografia de intercambio aniónico
SCX Strong cationic exchange chromatography Cromatografía de intercambio catiónico
SD Standard Deviation Desviación estándar
SDS- sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel Electroforesis de proteínas en gradiente por
PAGE electrophoresis SDS
SEC Size Exclusion Chromatography Cromatografía de exclusion molecular
Surface-enhanced laser
SELDI Ionización por láser inducida en superficie
desorption/ionization
SF Synovial fluid Fluido sinovial
SLE Systemic lupus erythematosus Lupus Eritematoso Sistémico
SRCR Scavenger receptor cystein-rich domain
SS Sjögren's syndrome Síndrome de Sjögren
Signal transducer and activator of Transductor de señal y activador de la
STAT4
transcription 4 transcripción 4
T1D Type 1 Diabetes Mellitus Diabetes Mellitus tipo 1
TCA Trichloroacetic Tricloroacético
TCR T cell Receptor Receptor de las células T
TF Transferrin Transferrina
TGF-β Transforming Growth Factor-β Factor de crecimiento transformante β
TH Helper T cell Linfocito T colaborador
TLR Toll-Like Receptor Receptor tipo Toll
TMTs Tandem mass tags Etiquetas de masa en tándem
TN Tetranectin Tetranectina
TNF-R Tumor Necrosis Factor Receptor Receptor del factor de necrosis tumoral
TNF-α Tumor Necrosis Factor-Alpha Factor de necrosis tumoral α
TOF Time of flight Tiempo de vuelo
Treg Regulatory T cell Célula T reguladora

XVII
TTR Transthyretin Transtirretina
VEGF Vascular endothelial growth factor Factor de crecimiento endotelial vascular
Vacuolar protein-sorting associated protein
Vps28
28
VSG Velocidad de sedimentación globular
WGA Wheat germ agglutinin Aglutinina de germen de trigo
Y2H Yeast two-hybrid Sistema de doble híbrido
ZAG Zinc-α2-glycoprotein Zinc-α2-glicoproteina

XVIII
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1
1.- ENFERMEDADES REUMÁTICAS ............................................................................... 1
1.1.- Artritis reumatoide .................................................................................................................................. 1
1.2.- Epidemiología de la RA ............................................................................................................................ 2
1.2.1.- Morbilidad, co-morbilidades y mortalidad ...................................................................................... 3
1.3.- Impacto socioeconómico ........................................................................................................................ 3
1.4.- Morfología de la RA: manifestaciones clínicas ........................................................................................ 5
1.4.1.- Manifestaciones articulares ............................................................................................................. 5
1.4.2.- Manifestaciones extra-articulares.................................................................................................... 7
1.5.- Etiología de RA: Factores genéticos y medioambientales ...................................................................... 9
1.6.- Histopatología, fisiopatología y alteración de la respuesta inmune en la RA ....................................... 12
1.6.1.- Cambios histológicos en RA ........................................................................................................... 12
1.6.2- La respuesta inmune en la RA ......................................................................................................... 13
1.6.3.- Células T en la RA ........................................................................................................................... 15
1.6.4.- Células B en la RA ........................................................................................................................... 19
1.6.5.- Otras células que intervienen en la patogénesis de la RA ............................................................. 20
1.6.6. Citoquinas y quimioquinas .............................................................................................................. 25
1.7.- Biomarcadores ...................................................................................................................................... 25
1.7.1.- Biomarcadores en RA ..................................................................................................................... 27
1.8.- Diagnóstico y pronóstico en RA............................................................................................................. 31
1.8.1.- Diagnóstico: criterios de la ACR 1987 y ACR/EULAR 2010 ............................................................. 31
1.8.2.- Pronóstico ...................................................................................................................................... 35
1.9.- Tratamiento de la RA............................................................................................................................. 35

2.- PROTEOMA Y COMPLEJIDAD DE LOS ESTUDIOS DE PROTEÓMICA ........................ 37

2.1.- Aplicaciones de la proteómica .............................................................................................................. 42
2.1.1.- Detección/enumeración de las proteínas presentes en una determinada muestra biológica:
“MINING”................................................................................................................................................... 42
2.1.2.- Cuantificación de las proteínas presentes en una determinada muestra biológica ...................... 42
2.1.3.- Detección y cuantificación de modificaciones en las proteínas: “MAPPING OF PROTEIN
MODIFICATIONS”....................................................................................................................................... 43
2.1.4.- Detección y cuantificación de interacciones entre proteínas: “PROTEIN-NETWORK MAPPING”.
Interactómica ............................................................................................................................................ 44
2.1.5.- Proteómica estructural................................................................................................................... 44
2.1.6.- Proteómica funcional ..................................................................................................................... 44
XIX
 2.2.- Proteómica de biofluidos ...................................................................................................................... 45
2.3.- Tecnologías empleadas en proteómica................................................................................................. 56
2.3.1.- Preparación de muestras de plasma y suero ................................................................................. 56
2.3.2.- Electroforesis: 1-DE, electroforesis preparativa, FFE, electroforesis capilar, electroforesis en chips
y IEF en fase líquida ................................................................................................................................... 58
2.3.3 Fraccionamiento de proteínas mediante cromatografía líquida: afinidad, intercambio, exclusión,
fase reversa ............................................................................................................................................... 60
2.4.- Estrategias empleadas en proteómica .................................................................................................. 63
2.5.- Herramientas proteómicas ................................................................................................................... 66
2.5.1.- Tecnologías de separación de proteínas (I): Estrategia basada en geles ....................................... 66
2.5.2.- Digestión proteolítica ..................................................................................................................... 75
2.5.3.- Tecnologías de separación de proteínas (II): Estrategia “gel-free” ................................................ 77
2.5.4.-Espectrometría de masas ................................................................................................................ 81
2.5.5.- Análisis de los resultados de espectrometría de masas: software y bases de datos ..................... 86

OBJETIVOS ............................................................................................................. 91
MATERIAL & MÉTODOS ......................................................................................... 93
1.- OBTENCIÓN DE SUERO.......................................................................................... 93
2.- DESCONGELACIÓN DE LA MUESTRA Y CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN
DE PROTEÍNA ............................................................................................................. 94
3.- FRACCIONAMIENTO DEL PROTEOMA.................................................................... 94
3.1 Kit de Adsorción tiofílica (Pierce®) .......................................................................................................... 94
3.2.- Resina de afinidad Anti-HSA (Vivapure®) .............................................................................................. 96
3.3.- Enriquecimiento de proteínas menos abundantes en muestras de suero mediante el uso de librerías
de péptidos aleatorios: ProteominerTM ......................................................................................................... 98

4.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL ......... 99

5.- ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL ...................................................................... 100
5.1.- Primera dimensión .............................................................................................................................. 100
5.2.- Equilibrado de las tiras de ief .............................................................................................................. 101
5.3.- Segunda dimensión: SDS-PAGE ........................................................................................................... 102

6.- TINCIÓN .............................................................................................................. 103

7.- ANÁLISIS DE DATOS ............................................................................................ 106
7.1.- Análisis de imagen ............................................................................................................................... 106
7.1.1.- PDQuestTM 7.3.1 ........................................................................................................................... 106
XX
 7.1.2.- REDFINsolo 2-D gel image analysis software ............................................................................... 110
7.2.- Análisis estadísticos ............................................................................................................................. 111
7.2.1.- Análisis univariante ...................................................................................................................... 112
7.2.2.- Análisis multivariante ................................................................................................................... 113

8.- IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR HUELLA PEPTÍDICA (PMF) ......................... 115

RESULTADOS & DISCUSIÓN .................................................................................. 119
1.- MUESTRAS DE SUERO. VARIABLES PREANALÍTICAS Y ELIMINACIÓN DE
INMUNOGLOBULINAS MEDIANTE ADSORCIÓN TIOFÍLICA (T-GEL) ........................... 120
2.- ELIMINACIÓN DE LA ALBÚMINA SÉRICA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE
AFINIDAD ................................................................................................................. 132
3.- ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD INTRA- E INTERMUESTRAL .................................. 138
3.1.- Muestras de suero sin inmunoglobulinas ni albúmina ....................................................................... 138
3.2. Inmunoglobulinoma ............................................................................................................................. 143

4.- IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LOS GELES BIDIMENSIONALES MEDIANTE

HUELLA PEPTÍDICA ................................................................................................... 145
4.1.- Proteoma del inmunoglobulinoma ..................................................................................................... 152
4.2.- Proteoma del albuminoma.................................................................................................................. 158
4.3.- Proteoma del suero sin inmunoglobulinas ni albúmina...................................................................... 160

5.- LA ELIMINACIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA ALBÚMINA DE LAS MUESTRAS

DE SUERO FACILITA LA DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS Y VARIACIONES
POSTRADUCCIONALES ............................................................................................. 165
6.- REDUCCIÓN DEL RANGO DINÁMICO DE ABUNDANCIA DE PROTEÍNAS MEDIANTE
LIBRERÍAS PEPTÍDICAS: PROTEOMINER™ ................................................................. 169
7.- ESTUDIO PRELIMINAR DE LOS NIVELES SÉRICOS DE PROTEÍNAS EN EL
DIAGNÓSTICO PRECOZ DE PACIENTES CON AR Y DONANTES SANOS ....................... 178
8.- ESTUDIO PROTEÓMICO CUANTITATIVO EN SUEROS DE PACIENTES CON ARTRITIS
REUMATOIDE .......................................................................................................... 183
8.1.- Estudio estadístico univariante ........................................................................................................... 186

9.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO MULTIVARIANTE ............................................................. 212

9.1.- Análisis de Componentes Principales.................................................................................................. 212

XXI
10.- USO DE BIBLIOTECAS DE LIGANDOS PEPTÍDICOS COMBINATORIOS
(PROTEOMINERTM) EN LA DETECCIÓN DE BIOMARCADORES DE DIAGNÓSTICO
TEMPRANO DE ARTRITIS REUMATOIDE ................................................................... 230
11.- DESARROLLO DEL PROYECTO A CORTO PLAZO .................................................. 239
CONCLUSIONES .................................................................................................... 241
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 243

XXII
INTRODUCCIÓN
 Introducción

1.- ENFERMEDADES REUMÁTICAS

Las enfermedades reumáticas pertenecen a un amplio grupo de patologías que

afectan al sistema músculo-esquelético provocando, de forma general, la inflamación y
desgaste de una o varias articulaciones. Algunas de ellas pueden incluso ocasionar
lesiones en órganos internos, como corazón, riñón o pulmones. La Sociedad Española de
Reumatología (SER) incluye dentro del término “artritis” todas aquellas enfermedades
reumáticas en las que el proceso desencadena inflamación. Existen más de 100 tipos
diferentes de artritis que pueden ser causadas por enfermedades autoinmunes, lesión
ósea, infección o degeneración de las articulaciones. Las diferentes formas de artritis son
frecuentemente divididas en “autoinmunes” y “no-autoinmunes”. La variedad más
común, dentro de las enfermedades reumáticas consideradas no autoinmunes, es la
osteoartritis (OA, ICD-M-15 M-19, OMIM 165720). Afecta al cartílago y en ocasiones a la
membrana sinovial, ligamentos, músculos periarticulares y hueso subcondral, a menudo
desencadenando esclerosis (Meulenbelt et al., 2006). También se la conoce como
artrosis o artritis degenerativa.

1.1.- ARTRITIS REUMATOIDE

La artritis reumatoide (RA) es el segundo tipo de artritis más frecuente, siendo

encasillada por la Clasificación Internacional de Enfermedades de la Organización
Mundial de la Salud (ICD-WHO) como una poliartropatía inflamatoria crónica que
presenta trastornos extra-articulares (sistémicos) diversos, incluyendo tejidos y órganos
como los pulmones, ojos, corazón, nervios periféricos, vasos sanguíneos y bazo, así
como la formación de nódulos reumatoides y la existencia de anemia. Es una
enfermedad heterogénea que puede presentarse con varios cursos de evolución, bien
en forma de un proceso autolimitado (tipo I), como una variante recurrente (tipo II) o
mucho más frecuentemente como una enfermedad progresiva y deformante (tipo III)
(Pincus, 1995). Esta heterogeneidad hace que se piense actualmente en la RA, más que
como una única enfermedad, como un conjunto de ellas, determinadas por diversos
factores genéticos y ambientales que en un individuo predispuesto determinan la
progresión, el grado y el patrón de la inflamación (McInnes & Schett, 2011). La RA es una
1
 Introducción

enfermedad autoinmune en donde generalmente se produce dolor, rigidez y

tumefacción en las articulaciones y normalmente de forma simétrica, lo que puede
degenerar con el tiempo en deformaciones, distintos grados de discapacidad y una
calidad de vida limitada (Alcalde et al., 2003; Yilmaz & Simsek, 2013).

1.2.- EPIDEMIOLOGÍA DE LA RA

Los estudios de epidemiología muestran una prevalencia del 0.5-1 %, siendo

mayor en mujeres que en hombres o en población urbana con respecto a la rural
(Spector, 1990; Orozco et al., 2006). Las prevalencias más altas se detectan en tribus de
indios americanos y en grupos de esquimales, y las más bajas en países africanos y
asiáticos. En España el estudio EPISER 2000 (Prevalencia e impacto de las enfermedades
reumáticas en la población adulta española, (Carmona et al., 2001), realizado entre
1999-2000, estimó una prevalencia en mayores de 20 años del 0.5 % (95 % CI: 0.2-0.8 %;
aproximadamente, unos 200,000 pacientes), un valor situado en el límite inferior del
rango observado a nivel mundial e idéntico al observado para otros países del sur de
Europa. La prevalencia en la población española también es mayor dentro de la
población femenina (0.8 % vs 0.2 %), con un pico entre los 40-60 años (aunque existe
una forma juvenil a los 8-15 años poco común; Smith & Haynes, 2002; Stinson et al.,
2012).

La incidencia en la población española ha sido poco estudiada. El proyecto SERAP

(Evaluación de un Modelo de Gestión de la Artritis), con un retraso de 6-18 meses desde
el inicio de los síntomas de una artritis indiferenciada hasta la confirmación del
diagnóstico de RA, ha indicado que existen unos 8-11 nuevos diagnósticos por cada
100,000 habitantes/año, nuevamente un valor similar al encontrado en otros países del
sur de Europa, e inferior a lo observado en el norte de Europa o Norteamérica. Estos
menores niveles de prevalencia e incidencia en el sur de Europa, y más concretamente
en España, parecen depender de la menor frecuencia de factores de riesgo genéticos
que implican una mayor severidad de la enfermedad (Carbonell et al., 2008).

2
 Introducción

1.2.1.- Morbilidad, co-morbilidades y mortalidad

La mortalidad prematura asociada a RA está directamente relacionada con la

gravedad de la enfermedad (Gabriel et al., 2003, 2010) y con el alto número de co-
morbilidades (presencia de dos o más enfermedades en una misma persona) que tienen
estos pacientes. Estas co-morbilidades pueden estar asociadas a la enfermedad primaria
(patológicas) o bien al tratamiento (iatrogénicas). En cualquier caso, los pacientes con
RA tienen un mayor riesgo, en comparación con una población control con las mismas
características (rango de edad, proporción de sexos, etc.), de padecer algunas de estas
patologías asociadas. Pueden ser características de la RA, como los nódulos
reumatoides, problemas no específicos relacionados con procesos inflamatorios de larga
duración, como los problemas gastrointestinales (esofagitis, úlceras gástrica y duodenal,
dispepsia, sangrado, colitis, perforaciones, etc.), cardiovasculares (infarto agudo de
miocardio, etc.), respiratorios (enfermedad pulmonar intersticial, etc.), hepáticos
(hepatitis crónica, cirrosis), óseos (osteoporosis), periodontales, infecciosos o
hematológicos (anemia), o bien patologías que aparecen en estos pacientes con la
misma frecuencia que en otras poblaciones. Todos estos problemas asociados
incrementan sus discapacidades y disminuyen en su esperanza de vida, como por
ejemplo las enfermedades cardiovasculares o el cáncer. La co-morbilidad más
importante es enfermedad cardiovascular, vinculada al proceso inflamatorio crónico, así
como las patologías gastrointestinales y respiratorias. Estas dos últimas están, sobre
todo, relacionadas con el tratamiento con fármacos antiinflamatorios no esteroideos
(“non-steroidal anti-inflammatory drugs”/NSAIDs) y drogas modificadoras de la
enfermedad (“Disease-modifying drugs”/DMARDs) como el metotrexato (MTX) (Gullick
& Scott, 2011)

1.3.- IMPACTO SOCIOECONÓMICO

La RA es una patología con elevados costes socioeconómicos. Los costes directos

de tipo médico se han incrementado notablemente desde la introducción de los
fármacos específicos de la RA (como por ejemplo los biológicos frente a TNFα) o con el
uso cada vez mayor de fármacos para paliar las co-morbilidades asociadas a la RA, como
3
 Introducción

los problemas cardiovasculares o pulmonares (Furneri et al., 2012). Un ejemplo de ello

es la mayor prevalencia de la depresión en este tipo de pacientes, que requiere el
empleo de psicofármacos (García-Vadillo et al., 2001). Además, la RA tiene un impacto
notable en la calidad de vida de los pacientes. Por ejemplo, el estudio EMECRA (Estudio
de Morbilidad y Expresión Clínica de la Artritis Reumatoide) de 1999 mostró que el 37 %
de los pacientes de RA presentan dificultades moderadas-intensas en su trabajo
habitual, mientras que un 19 % sufre de una incapacidad severa, con necesidad
asistencial en el día a día (Tornero & Vidal, 1999). De este modo, en RA no sólo se
generan gastos directos como los médicos sino también unas cargas socioeconómicas
elevadas en términos de costes indirectos. Así, el estudio publicado por el Dr. Ruiz-
Montesinos en el año 2005 (Ruiz-Montesinos et al., 2005) estimó una proporción entre
costes directos e indirectos del 76 % y 24 %, respectivamente. Dentro de los primeros, el
81 % se correspondía con gasto médico, distribuido del siguiente modo: 56 % de gastos
farmacéuticos, 11 % de gastos de hospitalización, 21 % de visitas médicas y 12 %
pruebas de laboratorio y complementarias. En cambio, el metaestudio más moderno de
Lundkvist et al., 2008 reflejó que un coste medio anual por paciente en Europa de
aproximadamente 13,500€, con grandes diferencias entre el oeste (17,000€) y el centro-
este (5,000€) de Europa. Dentro de este estudio, tan sólo 1/3 de dicha cantidad
representaba los costes médicos y los fármacos, y el resto pérdidas de productividad (32
%), cuidados médicos no formales (19 %) y gastos no médicos (14 %) (Figura 1). A pesar
de esta variabilidad en los cálculos de los costes, lo que sí está claro es que éstos varían
en función de la severidad y actividad de la enfermedad, así como de la edad y del status
socioeconómico del paciente (Furneri et al., 2012). De este modo, los pacientes con baja
actividad de la enfermedad presentan un bajo gasto directo médico (<2,800 €/año) en
relación a pacientes con actividad moderada o alta de la enfermedad (<4,200 €/año). A
medida que avanza la enfermedad dichos gastos se disparan, por ejemplo debido a la
discapacidad creciente en los pacientes o al uso de fármacos más modernos como los
DMARDs biológicos frente a TNFα. Sin embargo, estos nuevos tratamientos así como un
diagnóstico cada vez más temprano de la RA están llevando a una mejora notable en los
índices de actividad de la enfermedad, daño en las articulaciones o en la productividad,

4
 Introducción

lo que redunda en reducciones de los costes (Boonen & Severens, 2011; Furneri et al.,
2012).

Figura 1. Distribución de los costes asociados a la RA en Europa. Tomado de “The burden of

rheumatoid and access to treatment: health burden and costs” (Lundkvist et al., 2008).

1.4.- MORFOLOGÍA DE LA RA: MANIFESTACIONES CLÍNICAS

1.4.1.- Manifestaciones articulares

La RA está caracterizada por una destrucción del cartílago de la articulación y del

hueso adyacente (Figura 2). La desestructuración del cartílago resulta de la acción de
proteasas del tejido conectivo liberadas por el tejido sinovial, condrocitos y el
denominado pannus (del latín, paño) una capa anormal de tejido fibrovascular granular
presente en la articulación afectada formada por células sinoviales e inflamatorias,
pequeños vasos sanguíneos, proteínas estructurales y proteoglicanos. El pannus también
puede causar una destrucción local del hueso de la articulación (osteoporosis), una
situación también conectada con la inflamación persistente. Dicha inflamación favorece
la diferenciación de células multinucleadas que destruyen el hueso a partir de los
macrófagos (osteoclastos), así como su actividad y supervivencia, lo que también
conduce a la larga a una osteopenia sistémica (Gravallese, 2002; Ono et al., 2013).

5
 Introducción

Figura 2. Esquema de una articulación normal

(a) y una articulación afectada con RA (b). En
la RA la membrana sinovial sufre hiperplasia y
se produce una infiltración de células
inflamatorias. Con la progresión de la
enfermedad, la membrana sinovial se
transforma en un tejido patológico e invasivo
llamado pannus. La destrucción ósea es el
sello distintivo de la RA. La imagen (d) muestra
tres articulaciones metacarpofalángicas de la
radiografía de un paciente con RA establecida.
Se puede apreciar cómo, en comparación con
una radiografía de las segunda, tercera y
cuarta articulaciones metacarpofalángicas de
una mano normal (c), los espacios de las
articulaciones se han reducido o
desaparecido,lo que implica la degradación
del cartílago y la destrucción del hueso
(Smolen & Steiner, 2003)

Un 65 % de los pacientes presenta como síntomas iniciales de la enfermedad

tanto astenia como dolor musculoesquelético, mientras que sinovitis debuta más
tardíamente. El dolor inflamatorio es de tipo continuo y más intenso en reposo,
mejorando con el movimiento de las articulaciones. El dolor predomina sobre todo por
la noche, y se acompaña de una rigidez matutina. Comienza en extremidades como
manos y pies, y presenta una progresión normal hacia las rodillas y codos casi siempre con
predominio de la simetría (Smolen & Steiner, 2003) (Figura 3). Es frecuente la existencia de
fatiga/astenia relacionada con algo de fiebre y pérdida de peso (Lee & Weinblatt, 2001),
así como deformidades en las manos. Pueden verse afectadas articulaciones como
cadera, hombros, codos o incluso la columna cervical (Figura 3). También pueden
presentar el denominado “quiste de Baker” en la rodilla (Van Linthoudt & Gerster,
2001), así como alteraciones en las articulaciones temporomandibulares.

6
 Introducción

Figura 3. Distribución de las posibles

articulaciones afectadas por la RA en
el organismo. La RA se manifiesta
como una poliartritis de pequeñas
articulaciones que de forma progresiva
avanza hasta afectar a las grandes
articulaciones. (Tomada de A.D.A.M.
Illustrated Medical Encyclopedia:
[Link]

1.4.2.- Manifestaciones extra-articulares

La RA es una enfermedad con un componente sistémico importante, con

manifestaciones extra-articulares. Entre las más frecuentes se encuentran por ejemplo
las cardiovasculares y las pulmonares o el nódulo subcutáneo reumatoide. Este último
está formado por granulomas pequeños caracterizados por una zona de necrosis central
y una vaina externa de células mononucleares (MN) y tejido fibroso, localizándose en las
superficies de presión como codos, antebrazos o regiones sacra y aquileana (Amett,
2000; Yamamoto, 2000; Yamamoto, 2013b). Como acabamos de decir, el pulmón es uno
de los órganos más afectados debido a su fuerte vascularización y a la gran cantidad de
tejido conjuntivo que presenta, generándose alteraciones como la fibrosis pulmonar, la
obstrucción de vías aéreas o los nódulos pulmonares (Hozumi et al., 2013). Estos
problemas sólo suelen ser evidentes tras la autopsia del paciente (Colby, 1998).
7
 Introducción

La enfermedad cardiaca más frecuente en la RA es la pericarditis (inflamación del

pericardio), pudiendo además aparecer daños vasculares o granulomas en el miocardio y
originar arritmias (Badui, 1999). Las manifestaciones vasculares pueden aparecen como
vasculitis reumatoide bien en forma de pequeños infartos (por ejemplo, en los pliegues
de las uñas y pulpa digital) o como una vasculitis necrosante grave que puede conducir a
úlceras y gangrena en zonas como los maléolos (tobillo) (Radic et al., 2013). La
aterosclerosis también es otro proceso patológico que afecta a las paredes de los vasos
sanguíneos como las arterias y que incrementa el riesgo cardiovascular. Los pacientes de
RA tienen un elevado riesgo de aterosclerosis temprana debido a la inflamación crónica
(Pasceri & Yeh, 1999; Goodson et al., 2002; Hürlimann et al., 2004; Kahlenberg & Kaplan,
2013) y la desregulación del Sistema Inmune (Sherer & Shoenfeld, 2006; Kahlenberg &
Kaplan, 2013). Esta ateroesclerosis se caracteriza por una acumulación de partículas
lipídicas y células del Sistema Inmune en las regiones subendoteliales, lo que provoca
una placa y estrechamiento del lumen vascular y un mayor riesgo de enfermedad
isquémica y de trombosis. Por todos estos motivos, los pacientes con RA tienen
complicaciones cardiovasculares más extensas y que generan mayores mortalidades que
en la población general. Su presentación además es atípica y su gravedad parece
correlacionarse positivamente con marcadores tradicionales de inflamación como la
velocidad de sedimentación eritrocitaria elevada (ESR; “erythrocyte sedimentation rate“)
(Wallberg-Jonsson et al., 1997) o la proteína C-reactiva (CRP; “C reactive protein”)
(Goodson et al., 2002; 2005), la presencia de autoanticuerpos como el factor reumatoide
(Goodson et al., 2002) o la existencia de citrulinización y anticuerpos frente a estas
proteínas citrulinadas en las placas ateroescleróticas (Sokolove et al., 2013), o la
presencia de manifestaciones extrarticulares graves (Turesson et al., 2007), nódulos
reumatoides o un genotipo HLA-DRB1 (ver más adelante).

La anemia es la alteración hematológica más frecuente. Es una anemia moderada

de tipo normocítica y normocrómica mediada por la inflamación crónica (Möller et al.,
2013) y que mejora con el control de la actividad de la enfermedad. Suele ser
asintomática, por lo que el uso periódico de hemogramas (recuento eritrocitario,
reticulocitario, leucocitario y plaquetario, volumen corpuscular medio, etc.) y la

8
 Introducción

valoración bioquímica general de la función hepática y renal es habitual en este tipo de

pacientes. Además, puede verse agravada como consecuencia de efectos secundarios
dependientes de fármacos como los antiinflamatorios no esteroideos o NSAIDs, que
inducen una anemia microcítica por pérdidas de hierro en el tubo digestivo (Miyake et
al., 2013).

La manifestación neurológica suele aparecer en forma de neuropatía periférica

por atrapamiento (síndrome del túnel carpiano), mononeuritis o alteraciones oculares
(Chang & Paget, 1993; Zlatanović et al., 2010). Como ya se ha comentado, los trastornos
psicológicos (depresión y ansiedad) también son muy frecuentes en la RA, existiendo
una relación estrecha entre depresión, ansiedad, dolor crónico y aparición de
discapacidad (Van der Heijde, 1994; Escalante, 1999; Lisitsyna et al., 2013). Finalmente,
otros síndromes característicos de la RA son el de Sjögren (queratoconjuntivitis,
xerostomia), el de Felty (neutropenia y esplenomegalia) o el de Caplan (nódulos
reumatoideos en la periferia pulmonar).

1.5.- ETIOLOGÍA DE RA: FACTORES GENÉTICOS Y MEDIOAMBIENTALES

Aunque su etiología es desconocida (Rindfleisch & Muller, 2005; Yamamoto,

2013a), existe un consenso general acerca de su naturaleza multifactorial, resultante de
la interacción de factores endógenos (sexo y edad, etnia, factores hormonales,
genéticos, etc.) y ambientales (infecciones, dieta, tabaquismo, etc.) (Rioux & Abbas,
2005; Svendsen et al., 2013). Más que una única enfermedad, la RA es una enfermedad
genética compleja o un grupo heterogéneo de síndromes autoinmunes solapados con
una fuerte predisposición genética (aproximadamente, se estima que un 60% de los
factores desencadenantes de la RA son genéticos, y el 40 % restante ambientales; Seldin
et al., 1999). Estos factores genéticos, al interactuar con los ambientales, da lugar a una
primera etapa de producción asintomática de anticuerpos que desembocará,
finalmente, en una artritis inflamatoria clínica (Rioux & Abbas, 2005).

Se han descrito muchos alelos de riesgo, con modestos efectos aditivos que
contribuyen a la susceptibilidad global a la enfermedad. La conexión de algunos de estos

9
 Introducción

alelos con otras enfermedades autoinmunes y con vías proinflamatorias o

antiinflamatorias. Un ejemplo de ello lo tenemos en el MHC (“major histocompatibility
complex” o complejo mayor de histocompatibilidad) de clase II (MHC II). Las moléculas
del MHC II están presentes en la superficie de células presentadoras de antígeno como
los monocitos/macrófagos, las células dendríticas o los linfocitos B. Constan de dos
cadenas polipeptídicas (α y β) unidas de forma covalente. Estas moléculas son las
encargadas de presentar los péptidos antigénicos a los linfocitos T CD4 + (ver más
adelante), por lo que intervienen tanto en el proceso de tolerancia frente a los
autoantígenos como en la inducción de una respuesta inmune adaptativa frente a los
aloantígenos. Las cadenas α y β del MHC II son codificadas por una serie de genes
localizados en una zona con elevada densidad génica del cromosoma 6 (6p21.3)
denominados HLA-DR, -DP y -DQ (la abreviatura HLA procede del inglés “human
leukocyte antigen”). La susceptibilidad a RA está asociada con el alelo HLA DR4 (30-50 %
de la susceptibilidad genética global; Lee, 2008), concretamente con las variantes Dw4
(DRB1*0401) y Dw14 (DRB1*0101), que se asocian a una mayor severidad y a
manifestaciones extra articulares (Jadue, 2007). La susceptibilidad a RA también está
relacionada con HLA DR1 en el Mediterráneo, HLA-DR14 en nativos americanos o HLA
DR10, al tener en común con HLA DR4 una secuencia de aminoácidos presente en la
mayoría de los pacientes RA denominada el “epitopo compartido” (QKRAA, QRRAA,
RRRAA) (de Almeida et al., 2011). Este epitopo se encuentra en la tercera región
hipervariable de la cadena β, una región en contacto directo con el receptor de células T
(TCR).

Aparte de los genes de clase II el MHC contiene también los de clase I (HLA-A, B y
C), expresados en todas las células nucleadas. Su función es presentar antígenos a los
linfocitos T CD8+, y en el caso de la RA los alelos HLA-C*03 y *05 se relacionan con la
existencia de vasculitis (Turesson et al., 2004). Otros genes interesantes en RA son los
relacionados con la inflamación de las articulaciones, un mecanismo fundamental en la
iniciación de la enfermedad. Un ejemplo son los receptores TLR2 y TLR4 (TLR= “Toll-Like
Receptor”), encargados de disparar la respuesta inflamatoria innata y la respuesta
inmune adaptativa posterior (Sánchez et al., 2004; Kirchner et al., 2013), los receptores

10
 Introducción

de inmunoglobulinas (FCγR) como FCRL3, que puede influir en el desarrollo de células B

autorreactivas (Martinez et al., 2006) o el gen MiF (“macrophage migration inhibitory
factor”), una citoquina proinflamatoria que promueve la respuesta de tipo T H1 y que
está asociada con mayor susceptibilidad y progresión de la enfermedad (Xie et al., 2012).
Por otro lado, STAT4 (“signal transducer and activator of transcription 4”) codifica un
importante mediador de la actividad tanto de IL-12 (una citoquina que promueve el
desarrollo de las células TH1) como de IL-23 (una citoquina que facilita el desarrollo de
las células TH17) (Orozco et al., 2008; Tong et al., 2013). Como se verá más adelante,
ambos poblaciones efectoras TH juegan un papel patológico importante en RA. Otro gen
importante es FOXP3, cuyo producto es crítico en el desarrollo de las células T reg. La
actividad de estas células inmunosupresoras es crucial para el mantenimiento de la
tolerancia inmune y la prevención de la autoinmunidad (Nie et al., 2013).

Por otro lado, ningún factor medioambiental es determinante en el desarrollo de

RA, sino que actúan como desencadenantes en individuos genéticamente predispuestos.
Es evidente que la mayor prevalencia en mujeres sugiere un papel de las hormonas
como los estrógenos en la susceptibilidad de padecer RA. Algunos estudios muestran
una gran reducción de la incidencia de la RA entre las usuarias de anticonceptivos orales,
mientras que otros estudios sólo observan retrasos de la aparición de la enfermedad
pero no prevención (Hannaford et al., 1990). Otro ejemplo es la terapia hormonal
sustitutiva en pacientes postmenopáusicas, que reduce la actividad de la enfermedad y
tiene un efecto protector sobre la articulación (Islander et al., 2011), o el embarazo,
asociado con un menor riesgo de desarrollo o remisión de la enfermedad. Sin embargo,
existe un riesgo incrementando de desarrollar RA o tener un rebrote de ésta durante el
puerperio o el primer año tras el parto (Heliovaara & Aho, 1995; Østensen et al. 2012).

La implicación de agentes infecciosos como agentes etiológicos en la RA en un

huésped genéticamente predispuesto ha sido sugerida desde hace tiempo (Gerard et al.,
2001). Diversos microorganismos (virus como Parvovirus, Rubeola o Epstein-Barr,
bacterias como Borrelia burgdorferi o Proteus mirabilis o micobacterias como
Mycobacterium tuberculosis) y mecanismos han sido implicados, por ejemplo en

11
 Introducción

fenómenos de “mimetismo molecular” (Aho & Heliovaara, 2004; Rashid et al., 2012). Sin
embargo, la ausencia habitual de antecedentes de infección, un intervalo entre la
infección y el debut de la enfermedad largo y la ausencia de aumentos de incidencia de
RA en relación a epidemias dificultan la demostración del papel de los microorganismos
en RA (Silman et al., 1997; Scher & Abramson, 2011).

1.6.- HISTOPATOLOGÍA, FISIOPATOLOGÍA Y ALTERACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE EN LA RA

1.6.1.- Cambios histológicos en RA

Los cambios histológicos en el sinovio son centrales en RA. En condiciones

normales, la membrana sinovial tiene dos capas: una superficial, en contacto con el
espacio articular, y otra más profunda. La primera está formada por 1-3 capas de
sinoviocitos de dos tipos: los A, con características de monocitos-macrófagos, y los de
tipo B, con características de fibroblastos. En RA la membrana sinovial se vuelve
hiperplasica, con mayor cantidad de sinoviocitos tipo A y B debido a la proliferación
inducida por citoquinas como IL-1 y TNF-α. Estos sinoviocitos tienen un fenotipo
activado/alterado, produciendo ellos mismos factores promotores de la inflamación y la
destrucción de hueso y cartílago (Meinecke et al., 2005, Bartok & Firestein, 2010).

También existe una angiogénesis muy activa, que facilita oxígeno y nutrientes al
sinovio hipertrófico y el reclutamiento de células inflamatorias. Esta angiogénesis es
fruto de un desequilibrio entre factores pro-angiogénicos y anti-angiogénicos que causa
un exceso de proliferación vascular. Entre los primeros (liberados por células
endoteliales y macrófagos en la articulación) se incluyen factores de crecimiento como
los factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs; “fibroblast growth factors”),
angiopoyetina 1 o el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF; “vascular
endothelial growth factor”), citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α (“tumor necrosis
factor”), IL-1, IL-8, IL-13, IL-15 e IL-6, quimioquinas (familia CXC), componentes de la
matriz extracelular (colágeno tipo I, fibronectina, heparina, laminina), enzimas
proteolíticos (metaloproteasas, activadores del plasminógeno) y moléculas de adhesión.
(Paleolog, 2002; Szekanecz et al., 2009; Maruotti et al., 2013). Al activarse, las células

12
 Introducción

endoteliales producen enzimas proteolíticos (ejemplo, metaloproteasas), que dan como

resultado la degradación de la membrana basal y de la matriz extracelular perivascular,
proliferan y migran al área perivascular, agregándose y generando una red capilar de
novo (Bodolay et al., 2002; Maruotti et al., 2013). Este incremento de la angiogénesis en
RA favorece la acumulación en el sinovio de proteasas (e inhibidores de éstas) y
citoquinas así como cambios en la expresión de moléculas de adhesión que conducen a
una gran extravasación/infiltración de leucocitos inflamatorios como neutrófilos,
mastocitos, células T, células B, macrófagos y células plasmáticas, con formación de un
tejido sinovial localmente invasivo (pannus) característico de la RA e involucrado en los
procesos de erosión articular (Lee & Weinblatt, 2001; Firestein, 2003; Koch, 2003;
Bucala, 2012, Kong et al., 2013).

1.6.2- La respuesta inmune en la RA

La defensa del organismo está mediada por el Sistema Inmunológico. Su función

es proteger el cuerpo de microorganismos invasores como bacterias, virus, hongos, etc.
Dicha función defensiva es mediada por una gran variedad de células y factores solubles
agrupados en lo que se conocen como procesos de inmunidad adaptativa o de
inmunidad innata. Esta separación sólo se hace en aras de una mejor comprensión de su
funcionamiento, puesto que en la práctica existe un gran solapamiento entre estos dos
tipos de respuesta, ya que la adaptativa puede dirigir elementos de la respuesta innata
como son los fagocitos o el sistema del complemento (Figura 4).

13
 Introducción

Figura 4. Mecanismos de inmunidad innata y adaptativa y solapamiento entre ambas. Los mecanismos innatos implican
un tipo de respuestas inmediatas y no específicas frente a agentes infecciosos que incluyen procesos como la fagocitosis o
la endocitosis por parte de macrófagos y neutrófilos. Los mecanismos adaptativos, en cambio, suponen el uso de
receptores específicos que han sido seleccionados por su reactividad frente a determinados antígenos, como el receptor de
la célula T (TCR) o el de la célula B (BCR). En este último tipo de mecanismos existe una expansión y diferenciación de
células las células T y B específicas, así como la generación de memoria inmunológica. Ambos compartimentos no son
estancos, sino que están íntimamente interrelacionados. Así, los antígenos que son fagocitados por macrófagos de la
inmunidad innata son presentados por estas mismas APCs a las células T en el contexto del MHC (clase I y II) y de señales
accesorias (moléculas coestimuladoras, citoquinas, etc.) que modulan la respuesta adaptativa resultante. Otro ejemplo son
las proteínas del complemento de la inmunidad innata, que median las respuestas efectoras inducidas por anticuerpos
(inmunidad adaptativa). APC, célula presentadora de antígeno; BCR, receptor de célula B; TCR, receptor de células T; PRRs,
pattern-recognition receptors; TLRs, toll-like receptors; CRP, proteína c reactiva; MBP, proteína de unión a manosa; PAMPs,
pathogen- associated molecular pattern. (Tomada de la tesis doctoral de Gisela Orozco Cebada, 2007).

14
 Introducción

La inmunidad innata actúa frente a antígenos desencadenando una respuesta rápida e

inmediata mediada por células como los neutrófilos, los macrófagos o las células NK y
factores solubles como las proteínas del complemento. Por el contrario, la inmunidad
adaptativa se desarrolla a más largo plazo. Es un tipo de defensa específica y se
caracteriza por la generación de memoria inmunológica. Como muestra la Figura 4,
ambas respuestas (innata y adaptativa) actúan coordinadamente para formar un sistema
global de defensa inmunitaria (Fattahi & Mirshafiey, 2012). El proceso inflamatorio en
RA parece desencadenarse por una respuesta inmune adaptativa aberrante por parte de
células T y B autoreactivas debido a un fallo en los mecanismos activos y pasivos de
tolerancia y una permanente migración de leucocitos proinflamatorios desde el torrente
sanguíneo al microambiente sinovial. Se produce así una acumulación de linfocitos
activados (T y B), células plasmáticas y macrófagos en la articulación, con el consiguiente
desarrollo de respuestas celulares y humorales que median el daño tisular local y extra-
articular (Ortiz García & García de Vicuña, 2005).

1.6.3.- Células T en la RA

La inmunidad celular es importante en RA, ya que están presentes macrófagos y

linfocitos T activados (principalmente CD4+). Tanto la asociación genética con los alelos
del MHC de clase II como la detección de un elevado número de células T en el sinovio
inflamado hablan de la implicación de las células T autoreactivas que no han sido
eliminadas a través de los procesos de selección negativa en el timo. Estos linfocitos T
CD4+ son responsables del inicio de la sinovitis en la RA, al reconocer un antígeno (Smith
& Haynes, 2002) que puede ser exógeno (por mimetismo molecular con una proteína
viral, por ejemplo) o una proteína endógena que puede haber sufrido PTMs (por
ejemplo, citrulinización, modificaciones oxidativas, cortes proteolíticos, etc.) que la
convierten en más antigénica (neoantígenos) como el fibrinógeno, las proteínas de
choque térmico (“heat-shock proteins”) Hsp65 y Hsp90, proteínas de unión a
inmunoglobulinas como BiP, proteínas relacionadas con la apoptosis como anexina V,
enzimas como calpastatina, glucosa 6 fosfato isomerasa o α-enolasa, proteínas
estructurales como el colágeno de tipo II, gelsolina o vimentina) (Bedar, 2000; Eggleton

15
 Introducción

et al., 2008; Biswas et al., 2013). Es la denominada fase de inmunización. Estas células T
autoreactivas desencadenan a continuación la fase “efectora” de la enfermedad,
durante la cual se produce el daño a los tejidos.

En general, cualquier célula TH (CD4+) madura que no haya encontrado su

antígeno específico se denomina células TH naïve. Tras dicho encuentro (presentado por
células presentadoras de antígenos/APCs como las células dendríticas en el contexto del
MHC de clase II), las células TH naïve se activan, proliferan y se diferencian en células con
distintas funciones “efectoras”, como las TH1, TH2, TH17 o TFH (células TH foliculares)
(Figuras 5 y 6). Basándose mayoritariamente en estudios con modelos murinos, la RA fue
considerada inicialmente una enfermedad mediada por células T H1 y
citoquinas/quimioquinas proinflamatorias como IL-1, IL-6, IL-8, interferón γ (IFNγ),
linfotoxina β (LTβ) y factor de necrosis tumoral α (TNFα) (Schulze-Koops & Kalden,
2001). El entorno sinovial contiene IL-12, IL-23, IL-6 y TGF-β (Fattahi & Mirshafiey, 2012),
lo que promueve la diferenciación a células TH1 pero también TH17 (Figuras 5 y 6). Hasta
hace poco se creía que las células TH1 eran las responsables primarias del daño tisular en
las respuestas autoinmunes en RA. Sin embargo, IFNγ y otras citoquinas T H1 son
detectadas en tejido sinovial de RA a unos niveles muy inferiores a los de otras
citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1 e IL-6. Por ese motivo, las células T
productoras de IL-17 (TH17) son consideradas actualmente como las efectoras cruciales
en la RA (Lubberts et al., 2005; Sakaguchi et al., 2008; Pernis, 2009) (Figura 5), ya que
migran mucho más rápido a las áreas dañadas y organizan la respuesta inflamatoria
reclutando otras células como los linfocitos TH1. La combinación de ambos subtipos
favorece la inflamación y destrucción del tejido afectado (Steinman, 2007) mediante la
liberación de citoquinas proinflamatorias, la colaboración con las células B o la activación
de células mesenquimales, macrófagos, fibroblastos y células endoteliales (McInnes &
Schett, 2007).

La identificación de esta vía TH17 ha vuelto a poner de manifiesto el papel pro-

inflamatorio de las células T en la RA. TH17 es un linaje de células T efectoras cuya
diferenciación se inicia con la interleuquina 6 (IL-6) y el factor de crecimiento

16
 Introducción

transformante beta (TGF-β), mientras que IL-23 promueve su expansión y supervivencia.

Las células TH17 producen IL-17, citoquina que tiene carácter proinflamatorio y está
presente abundantemente en aquellas zonas afectadas por RA (Steinman, 2007;
Annunciato et al., 2007; Sakaguchi et al., 2008). IL-17 induce una amplia gama de
moléculas efectoras como IL-1β, IL-6 y TNF-α, además de quimioquinas múltiples y otras
moléculas (prostaglandina E2) o enzimas como COX-2 (ciclooxigenasa 2) y
metaloproteasas (Camafeita et al., 2009).

Figura 5. Modelo clásico de diferenciación de los linfocitos TH hacia los subtipos principales.
El proceso de diferenciación está regulado por diferentes combinaciones de citoquinas
presentes en el medio que rodea a las células TH naïve. Asimismo, estas poblaciones de células
TH efectoras están caracterizadas por la expresión de distintos factores de transcripción (GATA-
3, T-bet, RORγt, etc.), por la producción de diferentes citoquinas y por tener distintos papeles
en las respuestas humorales y celulares. Así, las células TH1 activan a los macrófagos e inducen
la destrucción de patógenos intracelulares, mientras que las células T H17 reclutan neutrófilos a
los lugares de infección y son útiles en las respuestas adaptativas celulares frente a patógenos
extracelulares. Las células TH2, en cambio, inducen la producción de IgE por los linfocitos B,
mientras que las células THF cooperan con las células B en la producción de anticuerpos de
otras clases, por lo que TH2 y THF están más relacionadas con la respuesta adaptativa humoral
frente a amenazas extracelulares. Finalmente, las células iTreg (células T reguladoras
inducidas) suprimen las respuestas adaptativas controladas por las T H “efectoras”. Este modelo
de “linajes celulares”, no obstante, es una simplificación, ya que las diferentes subpoblaciones
TH efectoras no tienen un fenotipo inflexible, ni marcadores ni patrones de citoquinas
secretadas invariables que las definan y muchas de las citoquinas producidas por ellas también
son liberadas por otras células del Sistema Inmune (revisado en Zhu et al., 2010). Figura
adaptada de O´Shea & Paul, 2010.

17
 Introducción

Por otro lado, IL-17 también actúa sobre multitud de tipos celulares implicados en los
procesos de inflamación en RA, tales como monocitos, macrófagos, fibroblastos,
osteoclastos y condrocitos (Sato et al., 2006), y presenta una acción directa sobre el
desarrollo de síntomas clínicos, ya que favorece la destrucción del cartílago y del hueso,
aumentando la actividad de IL-1 y TNF-α.

Figura 6. Modelo más actual de diferenciación de células T H. La caracterización de nuevos subtipos de

células TH como las TH3 o TH10 (no mostradas), las TH22 y las TH9 (productoras de IL-9 y que participan en
la defensa frente a helmintos; Nowak et al., 2009), con patrones de citoquinas menos conocidos, así
como el descubrimiento de la plasticidad de estas diferentes subpoblaciones han hecho que el modelo
clásico quedase obsoleto (Zhu et al., 2010). De este modo, se ha propuesto un modelo alternativo en el
que las células TH son mucho más heterogéneas, plásticas y flexibles a todos los niveles, pudiendo
convertirse unas en otras (TH1  TH17; iTreg  TH17), alterar el patrón de citoquinas que secretan o
modificar la expresión de marcadores intracelulares (factores de transcripción) o de superficie (O´Shea &
Paul, 2010).

También han sido detectadas células T reguladoras naturales (nTreg) (linfocitos T

CD4+ CD25+ Foxp3+) en el sinovio de pacientes con enfermedad activa y particularmente
en el fluido sinovial. En contraposición a las inducidas en la periferia (iTreg; Figura 6),
estas nTreg proceden de una diferenciación que tiene lugar en el timo. Sin embargo,
también actúan suprimiendo la activación del sistema inmunitario, favoreciendo así la

18
 Introducción

tolerancia hacia los autoantígenos. Existen datos contradictorios sobre las posibles
alteraciones numéricas de las células T reguladoras en pacientes con RA (Liepe et al.,
2005; Skapenko et al., 2005; Chavele & Ehrenstein, 2011). Estas discrepancias pueden
deberse a la difícil identificación fenotípica de las mismas, puesto que no se dispone de
ningún marcador que sea homogéneo y específico para esta población. En estudios más
recientes con roedores, se ha demostrado su papel supresor en la autoinmunidad
(Esesten et al., 2009). También existe más consenso en cuanto al defecto funcional de
las células T reguladoras en RA (Chavele & Ehrenstein, 2011). Así, se sabe que citoquinas
inflamatorias como TNFα, IL-6 o IL-1 controlan el equilibrio entre células Treg y células
patogénicas TH17 y TH1 en RA a través de la metilación de residuos CpG en el promotor
del FOXP3 (que “apaga” el gen) o bien a través de la defosforilación de Ser418 en la
proteína FOXP3 y reducción de los niveles de este factor de transcripción en nTregs
(Chavele & Ehrenstein, 2011; Nie et al., 2013).

1.6.4.- Células B en la RA

Tradicionalmente, se ha considerado que las células B autoreactivas son uno de

los efectores principales de RA, puesto que son las responsables de la producción de
autoanticuerpos como el factor reumatoide (RF) o inmunoglobulinas frente a péptidos
cíclicos citrulinados (anti-CCP). En la segunda fase de la RA los linfocitos T activan a las
células B autorreactivas, un proceso en el que participan citoquinas y moléculas
coestimuladoras (CD40/CD40L). Esta salida del estado de anergia o ignorancia por parte
de las células B autoreactivas provoca la producción de autoanticuerpos (ver más
adelante) e inmunocomplejos, que causan la activación del complemento y
desencadenan un proceso de inflamación crónica en RA (Wu et al., 2007a). Además, las
células B cumplen otras funciones dentro de la patogénesis de la RA, como la activación
de los mismos linfocitos T cooperadores mediante la presentación de autoantígenos y la
liberación de citoquinas como IFN γ / IL-4 (Edwards & Cambridge, 2006; Finnegan et al.,
2012).

19
 Introducción

1.6.5.- Otras células que intervienen en la patogénesis de la RA

Neutrófilos

Desde el conocimiento del importante papel de las células TH17 en RA, la relevancia
de la población de neutrófilos en etapas tempranas de la enfermedad y como mediadora
de la inflamación tisular ha crecido en paralelo. Los neutrófilos, atraídos por la IL-17, son
los fagocitos que llegan más rápidamente (seguidos de los monocitos) y los más
abundantes tanto en el fluido sinovial de la articulación afectada como en la interfase
entre el pannus y el cartílago. En RA, los neutrófilos circulantes se encuentran en un
estado pre-activo, pudiendo diferenciarse en APCs y exponer autoantígenos en ese
momento o cuando se mueren por apoptosis. Contienen diferentes tipos de gránulos,
que les permiten liberar enzimas como elastasa, colagenasa, mieloperoxidasa,
gelatinasa, etc. Son también una fuente de enzimas como las peptidil-arginina
deiminasasas, responsables del proceso de citrulinización (ver más adelante), y secretan
citoquinas proinflamatorias como IL-1β, IL-8, TNFα u oncostatina M (OSM), que actúan
sobre diferentes poblaciones leucocitarias (incluidos los mismos neutrófilos),
cronificando la inflamación. Además, pueden generar prostaglandinas como PGE2,
importantes en la degradación del hueso y cartílago, y leucotrienos como LTB 4, cuya
función es potenciar la acumulación de más neutrófilos. Expresan receptores FcR, que
unen y transportan los autoanticuerpos/inmunocomplejos hasta el compartimento
extravascular, donde activan al complemento (Eyles et al., 2006; Cascão et al., 2010;
Németh & Mócsai, 2012).

Por lo general, los neutrófilos tienen una vida corta en circulación (6-18 h) antes de
sufrir apoptosis. La apoptosis o muerte celular programada es un mecanismo mediante
el cual estas células se eliminan de forma segura y sus restos son fagocitadas por los
macrófagos. Estos últimos, por su parte, producen mediadores antiinflamatorios que
contrarrestan el proceso inflamatorio. Sin embargo, si dicho proceso de apoptosis está
impedido, como parece ocurrir en RA debido por ejemplo a la hipoxia, las altas
concentraciones de citoquinas anti-apoptóticas (IL-2, IL-4, IL-15, GM-CSF y G-CSF) o los
fibroblastos sinoviales (ver más adelante), los neutrófilos sufren un proceso de necrosis
20
 Introducción

secundaria y los macrófagos que los fagocitan entran en un estado proinflamatorio

(Cascão et al., 2010).

La activación de células fagocíticas como neutrófilos o macrófagos (mediada por

complejos inmunes y células T) produce grandes cantidades de especies reactivas
derivadas del oxígeno (ROS, “reactive oxygen species”) mediante el sistema NADPH-
oxidasa (NOX2). Estos ROS pueden ser empleados intracelularmente o liberados al
medio extracelular, causando en este último caso daño tisular. Cuando los ROS (aniones
superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo) exceden la capacidad de
tamponamiento se genera estrés oxidativo tanto en articulaciones como en células
como los eritrocitos (anemia). La liberación de hemoglobina/grupos hemo por estos
últimos amplifica aún más el estado pro-oxidativo, con efectos variados:
despolimerización del ácido hialurónico, daño oxidativo a proteínas, activación de
metaloproteasas e inactivación de inhibidores de proteasas, oxidación de lípidos y
lipoproteínas, daño al DNA nuclear, inducción de apoptosis, etc. (Halliwell, 1995; Hitchon
& El-Gabalawy, 2004). No obstante, los ROS también pueden ser importantes en los
procesos de comunicación intercelular, modulando el metabolismo y la expresión
génica, de modo que un defecto la producción intracelular de ROS por células como los
granulocitos puede exacerbar la respuesta inflamatoria en RA (Cascão et al., 2010).

Los neutrófilos también producen especies reactivas de nitrógeno (RNS, “reactive

nitrogen species”). Un ejemplo es el óxido nítrico (NO), cuya producción está
incrementada en RA y que tiene efectos pro-inflamatorios (daño al DNA, angiogénesis,
activación de metaloproteasas, producción de citoquinas, apoptosis de condrocitos, etc.)
como antiinflamatorios (disminución de expresión de adhesinas en células endoteliales,
inhibición de la síntesis de IL-6, supresión de la secreción de citoquinas TH1, etc.)
(Halliwell, 1995; Nagy et al., 2010).

21
 Introducción

Macrófagos

Desempeñan una función importante en la RA, ya que se encuentran de manera

abundante en la membrana sinovial y también en la unión cartílago-pannus. Actúan
como APCs, iniciando así la respuesta inmunológica. Cuando se activan, dañan los tejidos
mediante la liberación de ROS, NO y ácido araquidónico. El ácido araquidonico es un
ácido graso de cadena larga poliinsaturado que es liberado por la fosfolipasa A2 de la
membrana de las células y se transforma por oxidación en prostaglandinas, leucotrienos
y lipoxinas. La síntesis de fosfolipasa A2 es inducida por IL-1 y TNF-α, e inhibida por
glucocorticoides, de modo que en pacientes con RA está aumentada. En general, las
prostaglandinas aumentan las manifestaciones agudas de la inflamación en las
articulaciones, el dolor o la permeabilidad vascular. Los leucotrienos, por su parte,
aumentan la producción de IL-1 y la adhesión/degranulación de neutrófilos (Arteaga &
Díaz, 2003; Chou et al., 2010). Los macrófagos producen grandes cantidades de
citoquinas proinflamatorias, como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 o TNF (Sacre et al.,
2005; Kontny & Prochorec-Sobieszek, 2013). Estas citoquinas modulan la
proliferación/diferenciación de los linfocitos T e inducen la proliferación de los
sinoviocitos y la liberación de metaloproteasas y prostaglandinas (Camafeita et al.,
2009), que ejercen un papel esencial en la destrucción de los tejidos articulares. Por otro
lado, estas células mononucleares derivan de las mismas células madre sanguíneas que
dan origen a los osteoclastos multinucleados responsables de la resorción ósea y con los
que comparten muchas propiedades. Los macrófagos son capaces también de generar
fibrosis debido a la secreción de factores de crecimiento como el factor de crecimiento
transformante β (TGF-β), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y el factor de
crecimiento de plaquetas (PDGF) (Kinne et al., 2000; Cañete, 2012).

Mastocitos

Los mastocitos parecen estar implicados en la interacción Sistema Inmune innato y

adaptativo. Se ha visto acumulación de mastocitos en el tejido sinovial en RA, donde
expresan proteasas y citoquinas proinflamatorias (Nigrovic & Lee, 2005; Cañete 2012;

22
 Introducción

Kritas et al., 2013). Promueven también la proliferación de fibroblastos a través de la

producción de histamina, serotonina y heparina.

Células dendríticas

Intervienen en la patogenia de la RA, principalmente, por su función como APCs

profesionales. Tras la captura de los autoantígenos en la periferia (en forma de cuerpos
apoptóticos, por ejemplo), las células dendríticas (DCs) migran a los tejidos linfoides, en
donde “maduran” (aumento de MHC y moléculas CD80/CD86), dejan de ser
tolerogénicas y presentan dichos autoantígenos a las células T naïve, provocando de este
modo respuestas autoinmunes MHC-restringidas. Dependiendo de los estímulos que
influyan en ese proceso de maduración, las distintas DCs modulan la diferenciación de
los linfocitos TH naïve hacia células como las TH1 o las TH17, y secretan citoquinas que
participan en la activación de los linfocitos B y en la producción de autoanticuerpos.
También pueden liberar mediadores inmunes proinflamatorios y favorecer la aparición
de complicaciones típicas de la RA, como la aterosclerosis (Lutzky et al., 2007; Khan et
al., 2009).

Fibroblastos sinoviales

En los últimos años se ha sugerido que los fibroblastos (“Rheumatoid arthritis

synovial fibroblasts” o RASFs) contribuyen a la iniciación y perpetuación de la RA (Lee et
al., 2007). Una vez activados, los RASFs producen una serie de citoquinas/quimioquinas
y enzimas que degradan la matriz; las primeras median la interacción con células
inflamatorias y endoteliales vecinas, mientras que las segundas son responsables de la
destrucción progresiva del cartílago articular y hueso (Huber et al., 2006). Estudios más
recientes ponen de manifiesto la capacidad de estas células para migrar de una
articulación a otra, lo que podría explicar la evolución clínica de la RA (Isaacs, 2010).

Al igual que se mencionó previamente para el caso de neutrófilos, en la RA se

produce mediante varios procesos (cambios en la vías mitocondriales de la apoptosis,
alteraciones en la transducción de señales de Fas/CD95, modificaciones en la expresión

23
 Introducción

de NFκB, etc.), una resistencia al estimulo apoptótico de las células sinoviales,

especialmente las similares a fibroblastos (tipo B). Esto aumenta su vida media y
contribuye a la hiperplasia sinovial y a la destrucción del cartílago/hueso. Estos
sinoviocitos (vía interacciones célula-célula y factores solubles) “contagian” este
fenotipo resistente a la apoptosis a neutrófilos y linfocitos B y T que infiltran la
articulación (Catrina et al., 2002; Korb et al., 2009).

Plaquetas

Son fragmentos citoplasmáticos irregulares y carentes de núcleo derivados de la

fragmentación de células precursoras denominadas megacariocitos que en RA se
encuentran en un estado reactivo (Gasparyan et al., 2011). Son una fuente de factores
de crecimiento y tienen un importante papel en angiogénesis e inflamación crónica. Una
vez producida la lesión, las plaquetas comienzan a producir quimioquinas. CXCL-4, CXCL-
5 y CXCL-7 sirven para reclutar neutrófilos al foco inflamatorio, mientras que CXCL-1 y
CXCL-8 (IL-8) favorecen la angiogénesis y la formación del pannus. Por otro lado, las
plaquetas están detrás de los procesos de disfunción endotelial, trombosis,
ateroesclerosis y del mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares en RA (Gasparyan
et al., 2011).

En pacientes con RA existe un estado inflamatorio que favorece un ambiente

procoagulatorio causante de un riesgo incrementado de tromboembolismo venoso
(Hoppe & Dörner, 2012). Varios mecanismos están implicados, como disfuncionalidades
en las células endoteliales y plaquetas o cambios en el flujo de sangre, mayor actividad
de factores procoagulatorios, reducción de las vías anticoagulatorias y de la fibrinolisis,
etc. Por otro lado, el estado procoagulatorio aumenta la inflamación, lo que genera un
círculo vicioso. Así, la mayor actividad de la trombina (que procesa el fibrinógeno y lo
transforma en fibrina) induce la secreción de citoquinas proinflamatorias y de factores
de crecimiento, favorece la mitogénesis de las células sinoviales, tiene propiedades
angiogénicas, aumenta la expresión de moléculas de adhesión endotelial y promueve la
agregación plaquetaria (Undas et al., 2010).

24
 Introducción

1.6.6. Citoquinas y quimioquinas

Citoquinas

Las citoquinas son esenciales para la comunicación intercelular. Los niveles de

citoquinas proinflamatorias como IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, el
factor estimulador de colonias granulocíticas-monocíticas (GM-CSF) o el factor de
necrosis tumoral (TNF-α) se encuentran aumentados en RA (Guzmán, 2003; Cordero et
al. 2001; Machado et al., 2012; Chu et al., 2013). Junto con IL-1 e IL-6, TNF-α constituye
uno de los reguladores más importantes de la enfermedad, con un amplio espectro de
actividades biológicas tales como la inducción de la respuesta de fase aguda o favorecer
la vasodilatación, permeabilidad vascular, activación plaquetaria o apoptosis/necrosis
(necroptosis). Puede estimular la degradación tisular mediante enzimas como la
colagenasa, o participar en la inhibición de la actividad de los osteoblastos al mismo
tiempo que favorece la de los osteoclastos (Feldmann & Maini, 2001; Chu et al., 2013).
La actividad biológica de TNF-α se produce tras la interacción con receptores
transmembrana específicos (TNF-R1 y TNF-R2), presentes en las articulaciones y en altas
concentraciones en el líquido sinovial y plasma (Bayley et al., 2003; Chu, 2013).

Quimioquinas

Dentro de este grupo destaca la CXCL-8 (IL-8) como potente agente quimiotactico
para los neutrófilos hacia la articulación (Cunha et al., 2008). Otras quimioquinas como
CXCL-9 (MIG), CXCL-10 (IP-10) y CXCL-11 (I-TAC) contrarrestan el proceso de inflamación
a través de la inmovilización de fibroblastos (Romagnani et al., 2004; Nedjai et al., 2012).

1.7.- BIOMARCADORES

Un biomarcador es una característica medible que presenta una asociación con

un determinado fenotipo, como puede ser un proceso biológico normal o la presencia
de una enfermedad (o su severidad). Los biomarcadores pueden ser evaluados desde un
punto de vista cualitativo (presencia/ausencia) o cuantitativo, pero siempre de manera
objetiva (son signos). Nos brindan la posibilidad de alcanzar objetivos como los i)

25
 Introducción

diagnósticos (detección de enfermedades en etapa temprana), de ii) estratificación

(clasificación de pacientes según riesgo), de iii) prognosis (monitorización de la
progresión de una enfermedad), de iv) selección de una terapia o de v) monitorización
de la eficacia de un tratamiento. Un biomarcador puede estar basado en una técnica de
imagen (CT, PET, MRI) o ser una propiedad biológica/fisiológica detectada y medida en
una parte del cuerpo (presión sanguínea en riesgo cardiovascular, velocidad de
eritrosedimentación o el número de articulaciones inflamadas/dolorosas en RA, etc.).
También puede ser una población de células específica (ejemplo, el número de
eritrocitos en anemia) o una molécula (ejemplo, glucosa en diabetes), una variante de
un gen (BRCA1 en cáncer de mama) o su producto génico, un enzima (transaminasas en
hepatitis) o una hormona determinada (TSH en hipotiroidismo). Si hablamos de
moléculas en general, un biomarcador puede ser tanto una sustancia exógena
introducida en un organismo (un marcador radioactivo en una gammagrafía para evaluar
la presencia de un tumor) o bien una molécula endógena (la CRP en inflamación o el PSA
en cáncer de próstata) (Fuentes-Arderiu, 2013).

Se puede decir que existen biomarcadores primarios y secundarios. Si nos

referimos a los biomarcadores moleculares, un biomarcador primario sería una molécula
cuyos niveles, modificaciones, variantes, etc., fuesen directamente responsables del
fenotipo bajo estudio (por ejemplo, la proteína CFTR en fibrosis cística). En cambio, un
biomarcador secundario sería aquel que se modificase como consecuencia de la
enfermedad, pero no sería el desencadenante de ésta (CA125 en cáncer de ovario o PSA
en cáncer de próstata). Si concretamos aún más y hablamos de biomarcadores
moleculares proteicos, podemos establecer tres grandes grupos: (A) Proteínas que
muestran una abundancia diferencial, incluyendo las que se expresan únicamente en
asociación con un fenotipo o que muestran un aumento o reducción significativa en la
población problema con respecto a una población de referencia (ejemplos: PSA, CA125);
(B) proteínas que presentan PTMs diferenciales. En este caso la modificación
postraduccional (fosforilaciones, glicosilaciones, metilaciones, etc.) está asociada al
fenotipo, y un ejemplo serían los patrones de glicosilación proteica alterados en cáncer;
finalmente, (C) variantes proteicas dependientes de variaciones alélicas, procesamiento

26
 Introducción

alternativo del mRNA o fragmentos proteicos, que reflejan cambios en los mismos genes
(hereditarios o espontáneos), la maquinaria de “splicing” o la capacidad de las proteasas
para procesar/degradar una proteína determinada (ejemplo, apoE4 en Alzheimer) (Liu et
al., 2013).

1.7.1.- Biomarcadores en RA

La RA es una patología crónica con una importante reducción de la calidad y

esperanza de vida de los pacientes, un desconocimiento de su etiología y una gran
complejidad en el diagnóstico. La cronicidad y la destrucción articular tardan tiempo en
manifestarse, lo que hace que en etapas tempranas la RA sea fácilmente confundida con
otras dolencias reumáticas y el diagnóstico sea difícil (Kenneth et al., 2001; Willemze et
al., 2012). Sin embargo, un tratamiento precoz aumenta la probabilidad de controlar la
inflamación y el daño estructural (Boers, 2003, Kyburz & Finckh, 2013), lo que se conoce
como “ventana terapeútica de oportunidad” (Raza et al., 2006). La búsqueda de
biomarcadores tempranos en RA ha sido por ello objeto de interesantes investigaciones
en los últimos años, apareciendo tanto en distintas localizaciones (biomarcadores
solubles en sangre, plasma/suero, orina y líquido sinovial, biomarcadores en tejido
sinovial, etc.), con distinta naturaleza (autoanticuerpos, marcadores genéticos, etc.) o
con usos varios (biomarcadores para diagnóstico o pronóstico, biomarcadores de
“remodelado articular”, biomarcadores de respuesta al tratamiento antirreumático, etc.)
(Sanmartí & Gómez-Puerta, 2011).

En el diagnóstico de la RA se emplean desde hace algún tiempo “biomarcadores

de imagen”, los cuales ofrecen una información complementaria al diagnóstico
radiológico tradicional que permite evaluar aspectos clave como las erosiones óseas. Un
70 % de los enfermos presenta estas erosiones en manos o pies al final de los dos o tres
primeros años (van der Heijde, 1995; Schett & Gravallese, 2012), estando asociadas a
peor pronóstico, persistencia de la inflamación y mayor discapacidad física (Scott, 2000;
Schett & Gravallese, 2012).

27
 Introducción

Otro gran grupo de biomarcadores en RA son las moléculas solubles. El líquido

sinovial apenas es utilizado en el diagnóstico de esta enfermedad, aunque en algunas
ocasiones es analizado a la búsqueda de signos inflamatorios poco específicos que
permiten clasificarlo en normal, no inflamatorio, inflamatorio, purulento y hemorrágico.
Los más habituales en el diagnóstico de la RA son, sinembargo, los detectados en
plasma/suero. Así, la presencia de ciertos autoanticuerpos producidos por la activación
de linfocitos B (células plasmáticas) constituye un biomarcador bastante habitual. Un
ejemplo es el factor reumatoide (RF), que puede detectarse en líquido sinovial y suero.
Este autoanticuerpo reacciona contra el fragmento Fc (fracción constante) de la IgG
autóloga. En su mayoría es de clase IgM, aunque también puede ser IgA, IgG o IgE
(Nakamura, 2000). Los complejos RF (IgM)-IgG son capaces de depositarse en las
articulaciones. No parecen interpretar un papel etiológico primario, pero sí parecen
intervenir en la cronificación de la enfermedad. Alrededor del 70 % de los pacientes
presentan estos autoanticuerpos circulantes (Zendman et al., 2006) y por ello el RF es
una prueba inmunológica incorporada ya en 1987 en los criterios de clasificación del
American College of Rheumatology (Arhett et al., 1998) (Tabla 1). El RF presenta una
relativa sensibilidad diagnóstica (65-85 %), pero su ausencia no excluye la RA. RF
tampoco es específico de esta enfermedad, ya que está presente en otras patologías
autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (SLE) o el síndrome de Sjögren.
También se ha detectado su presencia en individuos sanos, particularmente en mayores
de 55 años (Dorner et al., 2004; Gómez, 2005), lo que genera bajos valores de
especificidad diagnóstica (55-80 %) (Zendman et al., 2006; Avouac et al., 2006) (Tabla 1).

28
 Introducción

Causas %
Sujetos normales 1-15
Sujetos normales >65 años 7-30
Familias de pacientes con RA 15-20
Tabla 1. Causas de positividad en el factor
Síndrome de Sjögren 75-98 reumatoide (RF). RF puede presentarse en
Otras enfermedades del tejido 20-50 diversas enfermedades así como también
conectivo en personas sanas, especialmente en
Endocarditis infecciosa 30-50 adultos mayores. Tabla adaptada de:
[Link]
Sarcoidosis 0-10 3_A_artritis/contenidos_INTERIOR.htm
Fibrosis pulmonar 30-45
Silicosis 15-40
Macroglobulinemia 20-30
Sífilis 15-25
Infecciones bacterianas 10-11
Infecciones virales 15-18
Mononucleosis infecciosa 5-50

El principal avance en el diagnóstico temprano de la RA han sido los

denominados anticuerpos frente a péptidos/proteínas citrulinados (ACPAs; “anti-
citrullinated protein/peptide antibodies”; Sanmartí et al., 2008), ya que al igual que el RF
se detectan antes del surgimiento de los primeros síntomas (Nielen et al., 2004) y están
asociados con la severidad de la misma (Kroot et al., 2000). Además, los niveles de estos
ACPAs indican si la enfermedad va a progresar hacia un fenotipo severo o no (valor
pronóstico). La citrulinación de las proteínas se genera cuando los residuos de arginina
son deiminados a citrulina por el enzima PAD (“peptidylarginine demininase”). Existen
cinco PADs en humanos, de las cuales dos (PAD2 y PAD4) se encuentran en células de
fluido sinovial y en la membrana sinovial. Estos enzimas son dependientes de calcio, y se
piensa que debido a ello su actividad es mayor en el compartimento extracelular. El
proceso de citrulinización parece jugar un papel importante en la generación de
autoanticuerpos, pero no es exclusivo. Así, la presencia de proteínas citrulinadas es
favorecida por la inflamación, de modo que el proceso de la citrulinación de proteínas
también ha sido detectada en otras enfermedades inflamatorias (artríticas o no) (Kinloch
et al., 2008). Sin embargo, el desarrollo de ACPAs en el compartimento sinovial sí que
parece ser específico de RA, dependiendo tanto de la citrulinización (del fibrinógeno,
fibronectina, vimentina, etc.) como de la presencia de moléculas del MHC de clase II que
29
 Introducción

presenten el epitopo compartido. Esta modificación por citrulina provoca un mejor

encaje de los péptidos endógenos (más inmunogénicos) en la hendidura del MHC,
provocando un mejor reconocimiento por las células TH, su activación, una cooperación
T-B más efectiva, la acumulación de células plasmáticas productoras de ACPAs en la
membrana sinovial y la generación de altas concentraciones de ACPAs e
inmunocomplejos que contribuirían a la destrucción de la articulación (de Clerck, 1995;
Olivares Martínez et al., 2011; Willemze et al., 2012).

La primera generación de ELISAs para la detección de estos ACPAs empleó

péptidos citrulinados cíclicos con el fin de aumentar la afinidad de los autoanticuerpos
por el antígeno. Debido a ello, estos ACPAs pasaron a denominarse anticuerpos anti-
péptidos citrulinados cíclicos (anti-CCP). Pese a ello, la primera generación de ensayos
anti-CCP tenía una sensibilidad analítica baja (48-68 %), de modo que fueron
seleccionados nuevos péptidos citrulinados cíclicos altamente reactivos para generar la
segunda generación de ensayos (anti-CCP2). Esta segunda generación de tests presenta
un incremento notable de la sensibilidad analítica, e incluso ha sido seguida de una
tercera generación (anti-CCP3), que sólo ha mejorado ligeramente su eficacia
(Debaugnies et al., 2013). Según la Sociedad Española de Reumatología
([Link]
_III3.php), la sensibilidad de los test anti-CCP oscila entre el 12 y el 93 % y es similar a la
alcanzada con el RF, mientras que su especificidad diagnóstica es algo más elevada (63-
100 %), sólo apareciendo un 1-3 % de falsos positivos en personas sanas (Zendman et
al., 2006; Jadue, 2007). A pesar de la limitada sensibilidad, que hace que su valor
predictivo positivo sea bajo (<75 %; al contrario que su valor predictivo negativo, >95 %;
Kim et al., 2010), los test anti-CCP ELISA son las pruebas/biomarcadores con mejor
balance sensibilidad/especificidad para el diagnóstico de la RA (Sanmartí et al., 2008),
complementado los resultados obtenidos con el FR (~ 40 % de los pacientes RA con FR-
son anti-CCP+). Esta importancia queda reflejada en los criterios de clasificación
propuestos por ACR/EULAR 2010 (Tabla 2) (Aletaha et al., 2010), demostrando una gran
utilidad en aquellos pacientes con artritis indiferenciadas o inclasificables (Van Gaalen et
al., 2004; Bedran et al., 2013). Son también útiles como herramientas en la

30
 Introducción

monitorización de tratamientos con DMARDs biológicos. En cambio, se desconoce su

papel en los mecanismos patológicos de la RA, y tienen una moderada utilidad
pronóstica (Mewar & Wilson, 2006; Kyburz & Finckh, 2013).

Otro grupo de biomarcadores empleados en el diagnóstico de la RA son los

reactantes de fase aguda. Aparecen o varían su concentración en presencia de una
inflamación, independientemente del agente causal de ésta. Alteraciones de este grupo
de proteínas tienen lugar durante procesos quirúrgicos, infecciones, traumatismos,
quemaduras, infartos tisulares, procesos autoinmunes o en cáncer. Por lo tanto, estos
biomarcadores reflejan la existencia de un proceso inflamatorio así como su intensidad,
pero desafortunadamente, por sí mismos, no tienen mucho valor diagnóstico debido a
su inespecificidad. El más utilizado es la proteína C reactiva (CRP) (van Leeuwen et al.,
1997; Paulus et al., 1999; Wasserman, 2011), que se correlaciona con otro biomarcador
de la inflamación: la velocidad de sedimentación globular (ESR).

1.8.- DIAGNÓSTICO Y PRONÓSTICO EN RA

Ninguno de los biomarcadores anteriormente descritos (por separado) permite

hacer un diagnóstico claro, simple y rápido de la enfermedad. Por ello, actualmente el
diagnóstico es fundamentalmente clínico, apoyado en exámenes físicos y pruebas de
laboratorio (analíticas y radiográficas). El diagnóstico de la RA, una vez la enfermedad ya
está establecida, ha logrado unas elevadas cotas de eficacia, mientras que para su
diagnóstico en fases iniciales todavía se espera la llegada de nuevas mejoras y
biomarcadores moleculares que permitan mayores niveles de sensibilidad, especificidad,
valor predictivo y eficacia diagnóstica.

1.8.1.- Diagnóstico: criterios de la ACR 1987 y ACR/EULAR 2010

Los criterios propuestos en 1987 por el American College of Rheumatology (ACR)

para la clasificación de RA (Tabla 2) utilizan como biomarcadores la rigidez matutina, la
presencia de artritis en tres o más articulaciones, la existencia de artritis en manos, la
simetría de la artritis, la presencia de nódulos reumatoides, la positividad para el RF o los
cambios radiológicos (Tabla 2). Estos criterios no fueron desarrollados con un objetivo
31
 Introducción

diagnóstico temprano, sino con el fin de distinguir aquellos pacientes con RA ya

establecida de pacientes con enfermedades reumáticas similares (artrosis, SLE,
fibromialgia, etc.). Por este motivo, los criterios de 1987 demostraron una gran eficacia
como punto de partida para definir la RA avanzada y diferenciarla de otras reumáticas,
pero no fueron útiles en diagnóstico de artritis indiferenciadas de reciente comienzo. De
este modo, mediante los criterios de 1987 era difícil de saber si la artritis indiferenciada
evolucionaría a una RA u otra enfermedad articular inflamatoria, se resolvería
espontáneamente o bien persistiría de forma indiferenciada (Hitchon et al., 2005;
Machold et al., 2007). Así, estos criterios de clasificación de la ACR (1987) sirvieron como
punto de partida, pero demostraron no ser válidos en diagnóstico precoz.

Como solución han surgido más recientemente nuevos modelos de clasificación,

algo más complejos. Así, en el año 2010 surgieron los nuevos criterios de clasificación de
la ACR/EULAR (Tabla 2) fruto de un estudio en dos fases liderado por el American College
of Rheumatology y la European League Against Rheumatism (Aletaha et al., 2010; Neogi
et al., 2010). Estos nuevos criterios identifican una artritis como RA al presentarse
sinovitis en por lo menos una de las articulaciones (en ausencia de diagnóstico
alternativo) y si se alcanza una puntuación de 6 (de un total de 10) en cuatro bloques: 1)
Número y articulaciones afectadas (0-5); 2) Cambios serológicos en RF y ACPA (0-3); 3)
Aumentos de CRP y de ESR (0-1); 4) Duración de los síntomas y signos de la enfermedad
(0-1).

No obstante, estos nuevos criterios de 2010 deben de ser aplicados teniendo en

cuenta varias cuestiones: i) Debe de haber, como mínimo, sinovitis, de modo que no
deben ser aplicados a pacientes con simplemente dolor en la articulación (artralgias) o
personas normales; ii) Esta sinovitis no debe de tener una causa conocida que la
explique; iii) La existencia de simetría en la sinovitis no es indispensable; iv) Son criterios
que permiten un diagnóstico dinámico, entendiéndose por ello que si un paciente no es
clasificado inicialmente como RA sí lo puede ser al cabo de un cierto tiempo; v) Están
basados en el conocimiento que se tiene actualmente sobre esta enfermedad, por lo
serán revisados con el advenimiento de nuevos biomarcadores serológicos, genéticos o

32
 Introducción

de imagen; vi) El punto de corte probablemente pueda acomodarse en un futuro con el

fin de otorgar distintos usos a estos criterios; vii) se debe recordar que siguen siendo
criterios de clasificación, no de diagnóstico en sentido estricto, de modo que el objetivo
sigue siendo discriminar, de forma estandarizada, el subgrupo de pacientes con sinovitis
indiferenciadas que, con mayor probabilidad, puede finalmente desarrollar una RA
erosiva y persistente. Además, algunos investigadores sostienen que los criterios de la
ACR/EULAR 2010 parecen mostrar una menor sensibilidad diagnóstica (debido a la
exclusión de pacientes seronegativos) que los de la ACR de 1987, pero sin embargo una
mayor especificidad (Kasturi et al., 2013), mientras que estudios como el Berglin &
Dahlqvist o metanálisis como el de Radner et al. sostienen todo lo contrario: una mayor
sensibilidad (82-84 %) de los criterios de la ACR/EULAR 2010 a costa de una menor
especificidad (54-61 %) en comparación con los criterios de la ACR/1987 (Radner et al.,
2013; Berglin & Dahlqvist, 2013). En cualquiera de los dos casos, parece claro que se
requieren criterios y/o biomarcadores de mayor sensibilidad y especificidad diagnóstica.

Otros parámetros aparte de los criterios clasificatorios en el diagnóstico de la RA

son el hemograma, a la búsqueda de signos como la presencia de una anemia
normocrómica/normocítica/hemolítica y leucocitosis o leucopenia, estudios bioquímicos
para evaluar la modificación de otras proteínas de fase aguda tanto negativas (albúmina)
como positivas (haptoglobina, orosomucoide, etc.) que complementen la información
proporcionada por la CRP o el ESR, la presencia de anticuerpos antinucleares (ANA), el
fondo genético (HLA DR4-DR1) o el análisis del líquido sinovial, como ya se ha
comentado anteriormente.

33
 Introducción

Tabla 2
Criterios de Clasificación de la Artritis Reumatoide *

1. Rigidez matutina (>1h)

Cuatro de estos
2. Artritis en 3 o más articulaciones
siete criterios deben
3. Artritis en manos (≥1 articulación
Criterios de estar presentes.
inflamada) [Arnett et al.,
clasificación ACR Criterios 1-4 deben
4. Simetría 1988]
(1987) haber estado
5. Nódulos reumatoides
presentes durante al
6. Factor reumatoide
menos 6 semanas
7. Cambios radiográficos (erosiones)

1. Articulaciones involucradas (0–5)

• Una articulación pequeña o grande (0)
• De dos a diez articulaciones pequeñas
Los puntos se
o grandes (1)
muestran entre
• De una a tres articulaciones pequeñas
paréntesis. Punto de
(articulaciones grandes no cuentan) (2)
corte para la artritis
• De cuatro a diez articulaciones
reumatoide
pequeñas (articulaciones grandes no
6 puntos o más. Los
cuentan) (3)
Criterios de pacientes también
• Mas de diez articulaciones (al menos
clasificación se pueden clasificar [Aletaha et al.,
una articulación pequeña) (5)
ACR/EULAR como RA 2010]
2. Serología (0–3)
(2010) si tienen: (a) las
• RF y ACPA negativos (0)
erosiones típicas, (b)
• RF o ACPA valor positivo bajo (2)
enfermedad de larga
• RF o ACPA valor positivo alto (3)
evolución que
3. Reactantes de fase aguda (0–1)
cumpla los criterios
• CRP y ESR valor normal (0)
de clasificación
• CRP o ESR valor anormal (1)
4. Duración de los síntomas (0–1)
• Menos de 6 semanas (0)
• 6 semanas o más (1)
*Adaptada de Scott et al., 2010

34
 Introducción

1.8.2.- Pronóstico

La RA es una enfermedad de curso impredecible y en muchos casos progresiva.

Algunos factores parecen implicar un peor pronóstico, como por ejemplo la presencia
del RF y/o ACPA, que son indicativos de un mayor riesgo de mortalidad prematura
(Pincus et al., 2001; Ymmons & Gabriel, 2011). Otros factores pronóstico, presentes al inicio
de la enfermedad, son la edad avanzada, sexo femenino, el grado de actividad de la
enfermedad (medida mediante el DAS28), la presencia de una actividad inflamatoria
importante o manifestaciones extra-articulares, un estatus funcional (HAQ) con
discapacidad marcada, la existencia precoz de erosiones articulares, un número elevado
de articulaciones afectadas, una incapacidad temprana, un tratamiento precoz o el
genotipo HLA-DR4. Estos factores pronóstico ayudan a identificar aquellos pacientes con
mayor probabilidad de tener un curso más agresivo en la enfermedad (Robustillo-
Villarino & Rodríguez-Moreno, 2011). Desafortunadamente, ninguno de ellos permite
una predicción totalmente fiable, de modo que se hace necesaria una evaluación
periódica de la actividad de la enfermedad y de la respuesta a los fármacos para el
manejo de la RA a largo plazo. Lo que sí parece claro es que un diagnóstico precoz es
importante a la hora de mejorar el pronóstico, y por ello numerosos investigadores en
RA tratan de conseguir descubrir métodos nuevos y más eficaces de diagnóstico
temprano. Como se verá más adelante, los estudios proteómicos de muestras habituales
en clínica (como el suero, el plasma o el fluido sinovial) y las herramientas
bioinformáticas surgen como estrategias óptimas para avanzar en la detección temprana
de la RA.

1.9.- TRATAMIENTO DE LA RA

Un diagnóstico temprano y un tratamiento agresivo que impida la destrucción y

la preserve la función de las articulaciones y contrarreste las comorbilidades es el
estándar hoy en día en RA. Junto con medidas generales como alternar reposo (para
disminuir la intensidad de la artritis) y ejercicio (para evitar la rigidez y mantener el tono
muscular), una dieta equilibrada, un peso ideal y el abandono de hábitos perjudiciales
como el tabaquismo, cuatro familias de fármacos se utilizan hoy en día en el tratamiento
35
 Introducción

de los pacientes con RA: i) Analgésicos; ii) drogas antiinflamatorias no esteroideas (“non-
steroideal anti-inflammatory drugs” o NSAIDs); iii) corticosteroides; y iv) fármacos
antirreumáticos modificadores del curso de la enfermedad (“disease-modifying anti-
rheumatic drugs”/DMARDs), que pueden ser tanto sintéticos como biológicos (O´Dell,
2004; Scott et al., 2010).

Los analgésicos como el acetaminofeno (paracetamol), los opioides (morfina,

codeína), los NSAIDs no selectivos (aspirina, diclofenaco, ibuprofeno, indometacina, etc.)
de la ciclooxigenasa/COX (síntesis de prostaglandinas) y los NSAIDs selectivos de COX-2
(celecoxib, valdecoxib, etc.) constituyen un pilar importante en el control del dolor,
rigidez e inflamación en RA, lo que permite mantener la capacidad funcional del
paciente. Este tipo de fármacos, no obstante, presentan bastantes efectos secundarios
(efectos a nivel intestinal y cardiovascular) y no modifican la historia natural de la
enfermedad, por lo que deben ser utilizados junto a los DMARDs. Los corticoides son
también potentes y rápidos supresores de la respuesta inflamatoria, pero su uso
también está rodeado de controversia debido a su toxicidad y efectos secundarios. En
cuanto a los DMARDs, estos fármacos son de acción mucho más lenta, comenzando su
efecto a los 2-3 meses de iniciarse el tratamiento. Permiten una mejoría clínica
serológica (reducción de RF, ESR, CRP) y frenan la progresión de la enfermedad. Entre los
DMARDs sintéticos podemos encontrar el metotrexato (MTX), sulfasalazina,
leflunomida, ciclosporina, oro intramuscular y antimaláricos, entre otros, mientras que
entre los DMARDs biológicos existen disponibles muchos inhibidores del TNF-α como
Infliximab (anti-TNFα; Remicade®), Etarnercept (soluble TNF receptor; Enbrel®),
Adalimumab (anti-TNFα; Humira®), Golimimab (anti-TNFα; Simponi®) o Certolizumab
pegol (anti-TNFα; Cimzia®). Agentes biológicos alternativos a los agentes bloqueantes de
TNF-α son Anakinra (un antagonista de IL-1R), la proteína de fusión Abatacept (CTLA-4-
Ig; Orencia®), Rituximab (anti-CD20; Mabthera®) o Tocilizumab (anti-IL-6R; RoActemra®).
Este tipo de fármacos biológicos son combinados con otros DMARDs como el MTX (Rigby
et al., 2009; Westhovens et al., 2009; Scott et al., 2010) y continuamente se están a
generar nuevos, como ixekizumab (anti-IL-17A), brodalumab (anti-IL-17R) y
especialmente secukinumab (anti-IL-17A), este último en fase III (Kellner, 2013). Sin

36
 Introducción

embargo, estos fármacos biológicos son extremadamente caros, presentan también

efectos adversos (toxicidad hepática, enfermedad pulmonar intersticial, infecciones,
malignidades) y sobre todo preocupa la generación de resistencias.

2.- PROTEOMA Y COMPLEJIDAD DE LOS ESTUDIOS DE PROTEÓMICA

La Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral

del funcionamiento, contenido, evolución y origen de los genomas de los organismos.
Uno de sus principales cometidos es obtener el catálogo de genes del genoma. Dicho
catálogo contiene información sobre la ubicación del gen así como elementos
promotores y reguladores, la delimitación de exones e intrones, su secuencia de bases,
su función, la proteína codificada en su secuencia, la presencia de polimorfismos y
mutaciones, etc. Es por tanto una lista detallada, finita y, podríamos decir, estática
(Pandey & Mann, 2000). Por este motivo, concluida la secuenciación del genoma
humano, es necesario disponer de herramientas y/o estrategias que nos permitan
entender la relación entre la expresión de los genes, sus funciones y el fenotipo (es
decir, cualquier rasgo observable de un organismo, como la morfología, desarrollo,
propiedades bioquímicas, fisiología o comportamiento). La disciplina denominada
Genómica Funcional va en este sentido, al tener como objetivo el análisis de la expresión
de los genes (RNA) y basarse en el dogma central de la Biología (que establece una
relación directa entre los contenedores de información o genes, la molécula mediadora
o RNA y las moléculas efectoras o proteínas) para establecer una conexión entre el
transcriptoma y el fenotipo. De hecho, en términos generales el número de moléculas
de RNA y proteínas está directamente relacionado con el número de genes de un
organismo, aunque desafortunadamente esta relación no es tan directa porque un único
individuo nunca expresará ni todos ni los mismos RNAs o proteínas característicos de la
especie a lo largo de su ciclo vital o en relación a otros individuos debido a variaciones
genéticas (mutaciones, polimorfismos, etc.) o influencias medioambientales. Un buen
ejemplo lo tenemos en los anticuerpos del plasma sanguíneo de un individuo, cuya
diversidad no se puede inferir a través del estudio del genoma y es dependiente de los
antígenos a los que ha sido expuesto el organismo. Por lo tanto, no sólo el genoma sino

37
 Introducción

también el transcriptoma y las influencias externas definen en última instancia el

proteoma de un organismo, un término acuñado en 1997 por Peter James que podría
definirse como “el conjunto de proteínas presentes en un organismo, célula, tejido u
órgano dado en un momento determinado y bajo unas condiciones concretas”. Este
proteoma es dependiente de factores medioambientales diversos (presencia de una
enfermedad, consumo de drogas, alimentación, estrés, temperatura, momento del día,
etc.), lo que le confiere una gran complejidad y dinamismo y dificulta enormemente su
análisis (Figura 7).

Figura 7. Factores que

Genoma afectan al proteoma. El
proteoma de un organismo
Transcripción
Procesamiento del mRNA es un conjunto dinámico de
Traducción proteínas que se ve
Edad PTMs afectado constantemente
Drogas
por factores
Estrés Proteoma de una célula Metabolitos
medioambientales que
Condiciones O2, CO2 actúan sobre el
de cultivo
genoma/transcriptoma o
Hormonas/ Nutrientes
factores de Temperatura bien directamente sobre el
crecimiento proteoma (Lovrić, 2011).

El análisis del proteoma es abordado por una nueva disciplina –ÓMICA

denominada Proteómica. La Proteómica supone el estudio a gran escala del proteoma,
particularmente de la estructura y función. Mientras que para algunos la Proteómica
constituye una parte de la Genómica Funcional, para otros supone una entidad
totalmente aparte. Junto con otras –ÓMICAS como la Genómica, la Farmacogenómica, la
Transcriptómica, la Metabólómica o la Interactómica (entre otras), la Proteómica intenta
obtener información y compresión global acerca de los mecanismos que subyacen al
funcionamiento de los sistemas biológicos complejos (formados por muchos
componentes) y de cómo responden estos sistemas a cambios tanto internos como
externos. A esta visión holística se la conoce como Biología de Sistemas (Figura 8).

38
 Introducción

Genómica
Genómica Funcional
Transcriptómica

Figura 8. Ómicas y
Metabolómica Proteómica Biología de
Fosfoproteómica, Sistemas. (Lovrić,
glicómica, peptidómica, 2011).
interactómica, etc

Biología de Sistemas

Por otro lado, mientras que las moléculas de DNA y RNA se construyen mediante
un ordenamiento variable de sólo cuatro componentes estructuralmente invariables, las
moléculas de proteínas están constituidas por una serie de “bloques” estructurales
seleccionados entre un conjunto de 20 posibilidades: los aminoácidos. Dado que la
longitud promedio de las proteínas es de uno 450 aminoácidos, ello hace que las
proteínas, ya de partida, presenten una diversidad estructural extraordinaria. Por si
fuera poco, el uso de promotores alternativos en los genes, el procesamiento alternativo
del mRNA o los procesos de edición del mensajero (procesos no codificados por el
genoma) elevan la complejidad de la muestra a analizar en su camino desde el genoma
(20,000-30,000 genes en humanos) al transcriptoma (100,000-200,000 mRNAs) (Figura
9). Por si esta complejidad no fuese suficiente, las 100,000-200,000 proteínas generadas
por la traducción de estos mRNAs sufren procesos de modificaciones postraduccionales
(PTMs). Estas PTMs (oxidación, deamidación, proteolisis, ubiquitinación, glicosilación,
acetilación, farnesilación, fosforilación, metilación, sulfonación o la citrulinización)
tampoco pueden ser inferidas con total seguridad a partir de la secuencia de los genes, y
pueden resultar de procesos de envejecimiento de la proteína o formar parte de un
mecanismo regulado importante para la funcionalidad de éstas. De este modo, el
número de proteínas inicial (100,000-200,000) puede dar origen un montante final de 1-
2 x 106 proteínas, de las cuales las células sólo presentan varios miles a un tiempo y de
una forma dinámica en respuesta a microambientes cambiantes (Figura 9).

39
 Introducción

Figura 9. Modificaciones postraduccionales como mecanismo para incrementar la diversidad

proteómica. Mientras que el genoma humano comprende entre 20-25,000 genes, se estima que el
proteoma es capaz de abarcar 1-2 millones de proteínas. La información fluye del DNA genómico al
mRNA mediante la transcripción y el procesamiento de los mensajeros, y sigue su curso desde estos
últimos a la proteína mediante la traducción. Las modificaciones postraduccionales son el conjunto de
procesos que modifican las proteínas una vez ha terminado su síntesis, contribuyendo al plegamiento
adecuado y a la regulación de las funciones biológicas de las proteínas. Dichas modificaciones ayudan
a incrementar aún más la complejidad del proteoma. Figura tomada de:
[Link]

Aparte de la complejidad del análisis de muestras en Proteómica, otro reto es la

localización de estas proteínas y la formación de complejos con otras macromoléculas.
Ambos son aspectos importantes para el desarrollo de las funciones biológicas de las
proteínas, y ambos muestran también un gran dinamismo al están sometidas a la
influencia del estado fisiológico. Un ejemplo lo tenemos en el plasma sanguíneo, en
donde un 18 % de las proteínas plasmáticas tienen un peso molecular <20 kDa y un 69 %
<60 kDa. Sin embargo, la mayor parte de las proteínas del plasma son retenidas por el
riñón y no atraviesan la barrera de filtración glomerular, una cuestión altamente
dependiente de la formación de macrocomplejos proteicos (>>65 kDa) por >70 % de las
proteínas en sangre (Anderson & Anderson, 2002). De este modo, al estudio de la
localización y abundancia de una proteína en una muestra debe de acompañarle el
análisis de la red de interacciones con otras proteínas, de modo que no se pierda
información biológica relevante, lo que supone un gran reto analítico. Otra de las
40
 Introducción

razones de este reto es que mientras en Genómica los ácidos nucleicos como el DNA
pueden ser amplificados (PCR), muestran un comportamiento uniforme durante la
purificación y manipulación, presentan complementariedad de bases y son estables a
diferentes procesos experimentales, las proteínas no presentan ninguna de estas
ventajas. De este modo, no existe ninguna tecnología capaz de aumentar el número de
copias de una proteína de baja abundancia con el fin de poder detectarla, ni forma por
ejemplo de solubilizar completamente todas las proteínas de un determinado tejido. La
Proteómica aborda, por tanto, cuestiones de mayor complejidad que la Genómica ya
que el genoma es una colección de genes cuya naturaleza es “estática” mientras que el
proteoma es una colección compleja y dinámica de proteínas (Pando-Robles & Batista,
2008).

La Proteómica es una ciencia relativamente reciente, y para su despegue ha sido

necesaria la espectrometría de masas (MS). La MS permite no sólo la identificación de
proteínas, sino también el conocimiento de su estructura primaria, la identificación de
sus PTMs y la cuantificación de su abundancia (proteómica cuantitativa). Todo esto,
combinado con el empleo de potentes métodos de fraccionamiento y separación de
péptidos y proteínas como la electroforesis de poliacrilamida en dos dimensiones (2D-
PAGE; Weiss & Görg, 2009) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha
permitido consolidar la Proteómica desde mediados de los años 90 como una
extraordinaria estrategia para el estudio masivo de proteínas. En 2001 se fundó la HUPO
(“Human Proteome Organization”; [Link] una organización científica
internacional clave para el asentamiento, la promoción y el desarrollo de la Proteómica.
Además, la HUPO ha marcado las directrices en cuanto a la estandarización de la
manipulación de las muestras y análisis de los datos, con el objeto de facilitar la
reproducibilidad de los mismos y promover la robustez de los estudios, aspectos muy
importantes hoy en día en Proteómica.

41
 Introducción

2.1.- APLICACIONES DE LA PROTEÓMICA

Los objetivos de la Proteómica pueden ser resumidos en siete grandes grupos: i)

Detección/enumeración de las proteínas presentes en una determinada muestra
biológica y estudio de su localización; ii) Cuantificación de dichas proteínas; iii) Detección
y cuantificación de PTMs en proteínas; iv) Detección y cuantificación de sus
interacciones (Interactómica); v) Proteómica Estructural; vi) Proteómica Funcional
(Lovrić, 2011)

2.1.1.- Detección/enumeración de las proteínas presentes en una determinada muestra

biológica: “MINING”

Uno de los primeros objetivos en Proteómica suele ser la identificación de todas

(o al menos la mayoría) las proteínas presentes en una muestra; se trata de una labor de
catalogación directa del proteoma (“mining”), en vez de inferir su composición a partir
de los datos de los ensayos de Genómica Funcional (microarrays) (Lovrić, 2011).

2.1.2.- Cuantificación de las proteínas presentes en una determinada muestra biológica

En Proteómica Cuantitativa se mide la “abundancia” de las proteínas en una

muestra, o lo que es lo mismo su “cantidad”. Esta abundancia puede ser expresada de
manera relativa, comparando la cantidad de una proteína en al menos dos muestras y
determinando la razón de ocurrencias entre ellas (por ejemplo, en forma de ratio), o
menos frecuentemente en valores absolutos como el número de copias por célula (por
ejemplo, 100 copias por célula), moles, masa (por ejemplo, pg, ng o fg) o concentración
(por ejemplo, fm/μL). Esta abundancia no tiene que ver con la importancia de la
proteína. Tampoco depende sólo de la expresión de los genes (tasa de transcripción) o la
eficacia de la traducción de los mensajeros (“codon-usage bias”, etc.), sino también de la
vida media de estos últimos y de las proteínas, de procesos degradativos o del volumen
del compartimento acuoso que la contiene (Lovrić, 2011).

La abundancia de las proteínas puede cambiar en cuestión de segundos (debido a

una mayor tasa de síntesis o de degradación) y ser muy significativa desde el punto de

42
 Introducción

vista biológico. Por ese motivo la cuantificación de proteínas es quizás la aplicación de

uso más extendido. Se trata de una forma especializada de “mining”, ya que el objetivo
sigue siendo la descripción del mayor número posible de proteínas presentes en una
muestra a la que se suma el estudio de los cambios cualitativos y cuantitativos del
proteoma en condiciones biológicas concretas (estado de desarrollo, salud, edad, sexo,
exposición a fármacos, drogas o agentes físicos, etc.). Este tipo de estudios requieren el
uso de “análisis diferenciales” en donde se compara dos o más muestras en diferentes
situaciones metabólicas, fisiológicas y/o patológicas. Ello permite identificar aquellas
proteínas cuya presencia, ausencia o alteración en sus niveles se correlacione
precisamente con dichos estados. En Biomedicina esto se suele traducir en identificar
una serie de proteínas (biomarcadores) que permitan diagnosticar una enfermedad,
pronosticar la evolución de la misma, servir de dianas potenciales en terapias con drogas
o evaluar la eficacia del tratamiento que pretende la curación de una determinada
patología (Lundblad, 2005; Hanash et al., 2008).

2.1.3.- Detección y cuantificación de modificaciones en las proteínas: “MAPPING OF PROTEIN

MODIFICATIONS”

El objetivo es identificar cómo y dónde las proteínas son modificadas, ya que

estas modificaciones gobiernan la estructura, función, vida media y localización de las
proteínas. Estas modificaciones pueden ser naturales o artefactos causados por agentes
químicos, drogas o una preparación incorrecta de la muestra, como por ejemplo la
oxidación, la deamidación o los cortes proteolíticos. Estas modificaciones pueden ser
detectadas mediante el uso de anticuerpos específicos (por ejemplo, residuos
fosforilados), pero las aproximaciones proteómicas tienen la ventaja de permitir
caracterizar simultáneamente un número elevado de estas PTMs en muchas proteínas al
mismo tiempo (Lovrić, 2011).

43
 Introducción

2.1.4.- Detección y cuantificación de interacciones entre proteínas: “PROTEIN-NETWORK

MAPPING”. Interactómica

Esta es una de las aplicaciones con mayor potencial cara al futuro. La mayoría de
las proteínas llevan a cabo sus funciones biológicas mediante la formación de complejos
con otras proteínas o biomoléculas. Hasta hace relativamente poco este tipo de
interacciones se estudiaban in vitro con proteínas purificadas o mediante análisis Y2H
(“yeast two-hybrid”). Sin embargo, las aproximaciones proteómicas permiten un análisis
más profundo de estos entramados de interacciones, contribuyendo de manera
importante al establecimiento de mapas de interacciones cada vez más completos y con
ello a un mejor conocimiento sobre cómo se llevan a cabo diferentes funciones
biológicas. Además, la Interactómica está cada vez más íntimamente relacionada con la
siguiente disciplina, la Proteómica Estructural, gracias al uso de la espectrometría de
masas con proteínas en estado nativo (Heck, 2008).

2.1.5.- Proteómica estructural

En esta disciplina se aplican los principios de la química de proteínas y de la

espectrometría de masas para caracterizar la estructura tridimensional de las proteínas
en su conformación activa y a gran escala, así como la detallada descripción de las
interacciones entre proteínas. Se trata, por ejemplo, de ser capaz de determinar
(cristalografía de rayos X, resonancia magnético nuclear/RMN) o predecir (modelado
comparativo, etc.) la estructura de las proteínas, obteniendo además datos de gran
relevancia por MS que pueden ser empleados para el estudio de interacciones de
proteínas con fármacos (Farmacoproteómica), con ligandos, con otras proteínas, etc.
(Hyung & Ruotolo, 2012; Serpa et al., 2012).

2.1.6.- Proteómica funcional

Se encarga del estudio de la función de las proteínas dentro de los sistemas

biológicos, infiriendo ésta a través del análisis de los cambios en la abundancia de las
proteínas y su regulación, e incluyendo además estudios sobre PTMs, interacciones que
se producen entre las proteínas y otras moléculas, y localización y distribución subcelular
44
 Introducción

de las proteínas en el contexto de un organismo, fluido u orgánulo sometido a

condiciones biológicas diferentes, teniendo que ser una de ellas la condición control que
es la que se va a considerar como referencia. Este tipo de trabajos son de gran valor en
Biomedicina (Reinders et al., 2004).

2.2.- PROTEÓMICA DE BIOFLUIDOS

Son numerosos los tipos de muestra analizados en Biomedicina a través de

técnicas Proteómicas, abarcando desde organismos enteros a células, orgánulos,
micropartículas (microvesículas, exosomas, vesículas apoptóticas) y, sobre todo,
biofluidos. Estos últimos son muy habituales en la práctica clínica, especialmente
derivados de la sangre como el suero y el plasma, el fluido cerebroespinal (CSF) o el
fluido sinovial (Figura 10). La elección del tipo de muestra a analizar es importante en la
búsqueda de biomarcadores moleculares, dada su habitual baja concentración.
Tipos de muestras más frecuentes en Proteómica
aplicada a Biomedicina
Fluido broncoalveolar

Orina Saliva Fluido amniótico

Suero
Fluido sinovial Fluido pericárdico
Plasma
CSF Fluido pleural Leche
Organismos enteros
Humor vítreo Fluido ascítico Fluido pancreático

Fluido seminal Fluido biliar

Linfa Lágrimas
Biofluidos Órganos
Biopsias
Tejidos LCM

Micropartículas
Proteómica Tumores

FACS, MACS

Orgánulos Células Líneas celulares

Figura 10. Tipos de muestras más frecuentes analizadas en Proteómica aplicada a Biomedicina. El origen
de la muestra utilizada en un experimento proteómico puede ser muy diverso y las fuentes desde las que
extraer proteínas muy diferentes. En investigación biomédica destacan especialmente las biopsias (de
órganos, tejidos o tumores), las células procedentes de cultivos in vitro o purificadas, los fluidos corporales
y más recientemente las micropartículas (exosomas, microvesículas, vesículas apoptóticas, etc.).

45
 Introducción

El plasma es el líquido resultante de eliminar las células de la sangre. Representa

aproximadamente el 55 % del volumen inicial, y está formado fundamentalmente por
agua (90 %) y proteínas (7 %). El 3 % restante lo constituyen
lípidos, glucosa, vitaminas, hormonas, O2, CO2, N2 y otras moléculas como ácido úrico,
sales o urea. El suero, en cambio, es el fluido que resulta de permitir que la sangre se
coagule y del proceso de centrifugación subsiguiente. Se diferencia del plasma sobre
todo por la ausencia de fibrinógeno y otras proteínas que desaparecen durante la
coagulación (Hu et al., 2006; González-Hernández, 2010). Plasma y suero son una fuente
de posibles biomarcadores proteicos, y se pueden emplear indistintamente en estudios
proteómicos. No obstante, el suero tiene como ventajas la no existencia de
interferencias procedentes de los anticoagulantes, un proteoma más simple y una
concentración proteica menor (al desaparecer el fibrinógeno). En cambio, el plasma es
más inmediato (menos manipulación de la muestra) y se obtiene en mayores cantidades,
siendo obligatorio su uso en estudios proteómicos centrados en los componentes de la
cascada de coagulación. Pero además, el plasma es recomendado por la HUPO dentro de
su Proyecto del Proteoma del Plasma Humano (“Human Plasma Proteome
Project/HPPP”), ya que la activación de ciertas proteasas durante la coagulación parece
afectar también a proteínas no relacionadas con la hemostasis según algunos estudios
peptidómicos/proteómicos (Rai et al., 2005; Omenn et al., 2005; Hu et al., 2006).

La disponibilidad de plasma o suero en Clínica inclina la balanza hacia su uso en

estudios proteómicos aplicados a Biomedicina, si bien a costa de una mayor dificultad a
la hora de detectar las firmas moleculares de la enfermedad debido al enriquecimiento
diferencial de los biomarcadores (tejido>fluido intersticial>linfa>sangre). Esta dificultad
es compensada por la facilidad de obtención del plasma/suero o su conexión con el
fluido intersticial que baña a todas las células del organismo, lo que convierte a estos
biofluidos en la versión más extensa y compleja del proteoma humano. A este respecto,
varios trabajos han descrito un número entre 1,929-3020 proteínas no redundantes en
el plasma humano (Omenn et al., 2005; Omenn 2007; Farrah et al., 2011), mientras que
la base de datos del proteoma del plasma de la HUPO
([Link] señala un número algo mayor: 10,546
46
 Introducción

proteínas; en cualquier caso, una alta probabilidad de encontrar “proteínas candidatas”

a marcadores biológicos de enfermedades.

Este elevado número de proteínas en el plasma/suero no sólo genera una gran

complejidad, sino también una alta variabilidad estructural y elevado rango dinámico
(Hu & Loo, 2006). De hecho, el plasma, con una concentración total de proteínas de 57-
80 g/L, es la versión del proteoma humano con mayor rango dinámico de
concentraciones: unos 12 órdenes de magnitud (1012). Así, a diferencia de un tejido
(rango dinámico de 107-108; Lescuyer et al., 2004), las concentraciones de las proteínas
plasmáticas son muy variadas, yendo desde la albúmina (50 % de la proteína del suero;
g/L) hasta las citoquinas (pg/mL). Ambos factores, complejidad y rango dinámico,
generan muchas dificultades analíticas, lo que hace que la identificación de
biomarcadores en plasma/suero mediante técnicas proteómicas avance muy
lentamente. Otros contratiempos son la concentración extremadamente baja que
suelen tener los biomarcadores potenciales (al ser proteínas “no específicas” del plasma;
ver más adelante), su interacción con proteínas muy abundantes o su rápido recambio
proteico debido a una gran sensibilidad a ser degradados por proteasas (Anderson &
Anderson, 2002; Riguetti et al., 2005b).

Los primeros estudios que analizaron la composición de proteínas del suero

humano describieron cinco grandes fracciones de acuerdo con su comportamiento
electroforético en acetato de celulosa a pH básico y baja fuerza iónica: la albúmina y las
globulinas α1, α2, β y γ (Figura 11). Cada una de estas fracciones, especialmente las
globulinas, estaba constituida por cientos de proteínas, encontrando tanto proteínas
específicas (es decir, aquellas liberadas hacia el plasma por desarrollar allí sus funciones
biológicas) como no específicas (es decir, procedentes por ejemplo de la rotura de las
células y por ello sin función específica en el plasma) (González-Hernández, 2010).

47
 Introducción

Figura 11. Electrofroresis de

proteínas del suero
(proteinograma). La figura muestra
la separación de las proteínas
séricas mediante electroforesis en
tiras de acetato de celulosa a pH
alcalino, y la generación de 5
bandas: una mayoritaria, la
albúmina, y cuatro
correspondientes a las globulinas
(α1, α2, β y γ).
[Link]
_libro/capitulo_06.htm

Proteínas específicas del plasma y respuesta de fase aguda

Las funciones de las proteínas específicas del plasma (albúmina, haptoglobina,

transferrina, etc.) son variadas, incluyendo el mantenimiento de la presión osmótica, el
transporte de sustancias como lípidos, metales y hormonas, la reserva de nitrógeno, la
defensa del organismo, la hemostasia o el equilibrio ácido-base. La mayoría de estas
proteínas específicas tienen un origen hepático, aunque existen excepciones como las
inmunoglobulinas producidas por los linfocitos B o las apolipoproteínas específicas de
los enterocitos (González-Hernández, 2010).

La albúmina (68.5 kDa; gen ALB) es la proteína específica del plasma que se
encuentra en mayor proporción, siendo la única que apenas está glicosilada. Su
concentración oscila entre 35-52 g/L y supone aproximadamente un 50 % de las
proteínas plasmáticas. La albúmina es fundamental para el mantenimiento de la presión
oncótica, se une a cationes divalentes y trivalentes (Ca2+, Cu2+ y Fe3+) y también presenta
zonas de unión para sustancias no polares como ácidos grasos de cadena larga, grupo
hemo, bilirrubina, biliverdina, fármacos, algunas hormonas esteroideas (cortisol,
aldosterona) y vitaminas (González-Hernández, 2010). La banda perteneciente a la ALB

48
 Introducción

está asociada a otra pequeña de mayor movilidad electroforética denominada por ello
prealbúmina (transtirretina; gen TTR). Esta TTR es una proteína no glicosilada de vida
media corta (2.5 días) y 55 kDa, encargada de transportar las hormonas tiroideas T3 y T4
y unirse a la proteína fijadora de retinol (gen RBP4; “retinol binding protein 4”)
(González-Hernández, 2010).

Dentro de las globulinas α1 tenemos la α1-antitripsina (gen SERPINA1; 90 % de la

banda α1), una glicoproteína de 55 kDa con numerosas variantes genéticas sintetizada
en hígado y macrófagos alveolares. La SERPINA1 es una proteína inhibidora de serín-
proteasas como la calicreína, plasmina, trombina, colagenasa y elastasa (Crowther et al.,
2004; Fregonese & Stolk, 2008; Köhnlein & Welte, 2008). Otra globulina α1 es la α1-
glucoproteína ácida (orosomucoide; genes ORM1 y ORM2), una proteína de 40 kDa con
una gran riqueza en hidratos de carbono y con un punto isoeléctrico extremadamente
ácido transportadora de fármacos y sustancias lipófilas e inhibidora de la agregación
plaquetaria y de algunas células del Sistema Inmune (González-Hernández, 2010). La
proteína transportadora de retinol (gen RBP4) es una proteína no glicosilada de 21 kDa
de vida media muy corta (12h) que se encuentra acomplejada con la TTR y que
transporta vitamina A (González-Hernández, 2010).

Englobadas dentro de las globulinas α2 tenemos la haptoglobina (gen HP), una

glicoproteína de 85-160 kDa producida en el hígado formada por cadenas α
(polimórficas) y β (invariante) unidas por puentes disulfuro. Su función en sangre es unir
dímeros αβ de hemoglobina libre (procedentes de los eritrocitos) y favorecer su captura
por los macrófagos (un proceso mediado por el receptor CD163), de modo que el hierro
no se pierda en la filtración glomerular y el grupo hemo pueda convertirse en
biliverdina/bilirrubina, reduciendo así sus efectos tóxicos (Van Vlierbergue et al., 2004;
Carter & Worwood, 2007; Quaye, 2008; Polticelli et al., 2008; Nielsen & Moestrup,
2009). Otra α2-globulina importante es la α2-macroglobulina (gen A2M), una
glicoproteína dimérica de 820 kDa mayoritaria en la banda α2 del proteinograma. Su
vida media es pequeña (5.5 días), pero se reduce notablemente (10 min.) en presencia
de ciertas proteasas a las que inhibe (plasmina, trombina, elastasa, calicreína, etc.) al ser

49
 Introducción

retirada por el sistema retículoendotelial (Rehman et al., 2012). Finalmente, dentro de

las globulinas α2 tenemos la ceruloplasmina (gen CP), una proteína de 132 kDa
sintetizada en hígado, macrófagos y linfocitos encargada de la mayor parte del
transporte del cobre en sangre. Esta proteína impide también la peroxidación de lípidos
y la formación de radicales, de modo que protege los tejidos durante la inflamación.
Otra de sus funciones es la oxidación del hierro ferroso (Fe2+) a férrico (Fe3+), de modo
que pueda ser transportado por la transferrina (González-Hernández, 2010).

La transferrina (una β-globulina, gen TF) es una glicoproteína de 79 kDa con

numerosas variantes con base genética. Su vida media es de 8-10 días y, aparte de Fe3+,
también transporta algo de cobre en sangre (González-Hernández, 2010). Otra β-
globulina es la hemopexina (gen HPX), que se encarga de captar el grupo hemo libre (con
efectos oxidativos al intercalarse en las membranas y producir radicales libres). El
complejo HPX-hemo es captado por el sistema retículoendotelial (ejemplo, células de
Kupffer en hígado) y el grupo hemo transformado en biliverdina/bilirrubina (Delangue &
Langlois, 2001; Piccard et al., 2007; González-Hernández, 2010).

Las inmunoglobulinas (Igs) o γ-globulinas median la respuesta inmune humoral y

actúan tanto asociadas a la membrana de las células B (BCR o “B-Cell Receptor”) como
en forma soluble (anticuerpos). Están formadas por cadenas ligeras (κ o λ) y pesadas,
unidas por puentes disulfuro y producidas independientemente, y poseen regiones
variables (importantes para el reconocimiento del antígeno) y constantes, que en el caso
de las cadenas pesadas permiten diferenciarlas en cinco clases: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE.
La IgM (cadena pesada μ; 5-10 %) es una inmunoglobulina pentamérica (900 kDa;
monómeros unidos por una cadena J) producida durante la respuesta inmunitaria
temprana o primaria y con propiedades aglutinantes y citolíticas. La IgG (160 kDa;
cadena pesada γ) es la que se produce en mayor cantidad (70 % de las Ig circulantes), y
es generada durante la respuesta inmunitaria secundaria. Existen cuatro subclases de
IgG, como la IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y a diferencia de la IgM son capaces de pasar a
espacio extravascular o atravesar la placenta (inmunidad pasiva en el feto y al neonato).
Sus funciones son variadas, como la activación del complemento (IgG3) o la fagocitosis.

50
 Introducción

Por otro lado, la IgA (10-15 %; cadena pesada α) presenta dos subclases, denominadas
IgA1 e IgA2. La primera de ellas tiende a ser monomérica y encontrarse sobre todo en
sangre. En cambio, IgA2 tiende a estar presente en secreciones mucosas (leche, saliva,
lágrimas, sudor, secreciones gastrointestinales o bronquiales, etc.) en forma dimérica
(sIgA) y unida al denominado componente secretor. Su función principal es opsonizar y
evitando el contacto de los patógenos invasores (virus, bacterias, etc.) con las zonas
mucosas. IgD (cadena pesada δ; 184 kDa) se encuentra junto con IgM en la superficie de
los linfocitos B maduros, participando en la activación celular. También aparece en el
suero en pequeñas cantidades (1 %), si bien su función en más desconocida en este
último caso. Finalmente, IgE (cadena pesada ε; 0.05 %) es una inmunoglobulina
monomérica de 188 kDa importante en la inmunidad frente a gusanos parásitos como
Schistosoma mansoni, Trichinella spiralis y Fasciola hepatica, protozoos parásitos como
Plasmodium falciparum, reacciones de hipersensibilidad de tipo I y alergias. Se une a
receptores FcR de mastocitos y basófilos, produciendo la liberación de histamina (amina
vasoactiva) en los primeros o citoquinas TH2 (IL-4, IL-13) en los segundos (Schroeder et
al., 2010; González-Hernández, 2010).

La concentración de todas estas proteínas específicas del plasma depende del

volumen del líquido que las contiene (ejemplo, deshidratación y sobrehidratación,
cambios posturales, etc.), de la tasa de degradación (proteasas extracelulares, hígado) y
de su tasa de síntesis (especialmente en hígado) (González-Hernández, 2010). Si
hablamos de la última, podemos decir que existen dos tipos de proteínas específicas: i)
Constitutivas, liberadas de forma constante en el plasma y con concentración estable; e
ii) inducibles, sintetizadas y liberadas sólo en fases concretas. Un ejemplo de las últimas
lo tenemos en las proteínas (o reactantes) de fase aguda (“acute phase proteins”, APPs),
una serie de proteínas cuya concentración se altera durante la inflamación como
consecuencia de la acción de IL-6, IL-1 y TNFα sobre hepatocitos. Estas APPs tienen
funciones hemostáticas, de control de la actividad de proteasas (α1-antitripsina α1-
antiquimotripsina, α2-macroglobulina), vasculares, endocrinas, de control del estado
redox o defensivas por ejemplo (Koj, 1996; Suffredini et al., 1999; González-Hernández,
2010).

51
 Introducción

Un pequeño número de APPs reduce su concentración en plasma durante una

inflamación, como por ejemplo la ALB, TTR, TF o la RBP4, y son denominadas por ello
APPs negativas (APPs-). En contraposición, la gran mayoría incrementa su presencia en
plasma, y se denominan por ello APPs positivas (APPs+): proteína C reactiva (gen CRP), la
SERPINA1 y la SERPINA3 (α1-antiquimotripsina), ORM1, ORM2, HP, fibrinógeno, A2M,
CP, inmunoglobulinas y diversos factores del complemento (Koj, 1996; Suffredini et al.,
1999; González-Hernández, 2010). Dado que durante una reacción inflamatoria se
produce una reducción de la albúmina (con carga negativa) y un aumento de las
globulinas α1, α2 y γ (especialmente fibrinógeno e inmunoglobulinas, con mayor
número de cargas positivas), el resultado es una alteración de las propiedades físico-
químicas del plasma y una mayor velocidad de sedimentación eritrocitaria (ESR) de los
hematíes (carga eléctrica superficial negativa) (Crowson et al., 2009; González-
Hernández, 2010). Por otro lado, las modificaciones en los niveles de las APPs no son
todas iguales en intensidad ni simultáneas, sino que siguen diferentes cinéticas. Así,
existen ciertas APPs+ con cinéticas muy rápidas (<24h), como CRP, SERPINA3, ORM1 u
ORM2; otras, en cambio, presentan cinéticas algo más lentas (24-48h), como SERPINA1,
HP, C4, fibrinógeno o A2M. Finalmente, algunas APPs+ como CP o C3 presentan cinéticas
aún más pausadas (>48h) (Koj, 1996; Suffredini et al., 1999; González-Hernández, 2010).

Un ejemplo típico de APP+ es la pentraxina corta CRP (Garlanda et al., 2005;

Bottazzi et al., 2010; Deban et al., 2011), una proteína no glicosilada de 115-118 kDa
sintetizada en el hígado. Su concentración en plasma es ≤3 mg/L, pero varía
enormemente (100-1000 veces) y en poco tiempo durante los procesos inflamatorios,
infecciosos o con daño tisular debido a una transcripción acelerada en hígado inducida
sobre todo por IL-6 (Bottazzi et al., 2010; Deban et al., 2011). CRP es una proteína de
estructura pentamérica que se une a la fosforil colina (PC) del polisacárido C de las
paredes celulares de Streptococcus pneumoniae. CRP se une también a muchas
bacterias, hongos, levaduras y parásitos (Plasmodium, Leishmania) vía PC,
fosfatidilcolina o estructuras carbohidratadas. También reconoce proteínas
intracelulares (histonas), polianiones como los ácidos nucleicos, lipoproteínas de baja
densidad (LDLs) modificadas, células apoptóticas, etc. (Bottazzi et al., 2010; Deban et al.,

52
 Introducción

2011). La CRP favorece así la opsonización, la fagocitosis, la activación de la vía clásica

del complemento o la destrucción de los patógenos. Sin embargo, como ocurre con
otras APPs, la CRP no es un biomarcador específico, ya que puede elevarse en infarto
agudo de miocardio, estrés, traumatismo, infección, cirugía o neoplasia. Así, su uso es
más adecuado en seguimiento de una enfermedad (ejemplo, para evaluar el rechazo de
un transplante o complicaciones en el embarazo) que en diagnóstico (González-
Hernández, 2010; Bottazzi et al., 2010; Deban et al., 2011).

Proteínas no específicas del plasma y proteoma de media-baja abundancia

Las 22 proteínas más abundantes del plasma son proteínas específicas que dan
cuenta del 90-99 % de la cantidad de proteína de este fluido biológico (Figura 12). El 1-
10 % restante (el proteoma profundo o “deep proteome”; Righetti et al., 2005c)
contiene proteínas de media y baja abundancia (en el rango de los μg/mL, ng/mL o
pg/mL) que pueden corresponderse tanto con proteínas secretadas hacia el medio
extracelular (ejemplo, citoquinas y hormonas) como con proteínas no específicas. Estas
últimas aparecen en el plasma como consecuencia del proceso de recambio celular y el
gran gradiente de concentración existente entre el interior y exterior de la célula.

Figura 12. Abundancia de

proteínas en plasma. La mayor
parte de las proteínas específicas
del plasma tienen una elevada
concentración y dan cuenta del
99% de la abundancia de
proteínas en este fluido
biológico. El 1% restante está
formado por proteínas de media
y baja abundancia, en donde
están representadas proteínas no
específicas del plasma (origen
tisular) o proteínas específicas
del plasma, como las citoquinas,
hormonas, quimioquinas o
factores de crecimiento.
[Link]
H_libro/capitulo_06.htm

53
 Introducción

La abundancia de las proteínas tisulares en plasma suele ser constante y muy

baja, pero puede alterarse de forma brusca si la permeabilidad de las membranas se
altera. Un ejemplo lo tenemos en el daño celular producido por cambios en la
producción de energía que afectan a la membrana o provocan necrosis debido a hipoxia
por estrechamiento (placas ateromatosas), bloqueo (trombosis) de venas y arterias,
fallos en la perfusión tisular, anemia, fallo cardiorespiratorio, etc. Otros ejemplos son el
daño inducido por agentes físicos (traumas, calor, frío, radiaciones, electricidad),
químicos (contaminantes, fármacos) o biológicos (bacterias, virus, protozoos, hongos,
helmintos, etc.), diversos mecanismos inmunitarios (anafilaxis, citotoxicidad, complejos
autoinmunes, etc.), defectos genéticos o el estado nutricional (González-Hernández,
2010).

Las proteínas tisulares del plasma pueden ser constitutivas o inducibles, y pueden
proceder de glándulas exocrinas (páncreas, próstata), células óseas o de la mucosa
gástrica, de modo que sus valores se elevan cuando se bloquea el modo de excreción
normal o se produce una mayor cantidad de enzima, o éstos descienden si se produce
un daño o necrosis en el tejido que las produce. También pueden ser proteínas
citosólicas (ejemplo, enzimas del metabolismo intermediario) o de otros
compartimentos (membrana, nucleoplasma, mitocondrias, lisosomas, fracción
microsomal), cuya concentración se eleva en el plasma debido a un daño en la
membrana, necrosis, mayor recambio celular, procesos de inducción o menor tasa de
eliminación (Figura 13) (González-Hernández, 2010).

El compartimento de procedencia influye notablemente en las formas

moleculares de estas proteínas tisulares del plasma así como en la velocidad de llegada
al compartimento extracelular, lo que nos puede indicar el origen tisular o la gravedad
del daño. Esta velocidad de llegada afecta a la abundancia en plasma de las proteínas
tisulares, pero otros muchos factores como la irrigación del tejido, el peso molecular de
la proteína, su vida media (pH, temperatura, concentración salina, etc.) o su tasa de
eliminación también son importantes.

54
 Introducción

En síntesis, la identificación de estas proteínas no específicas alteradas nos

brinda información sobre el tejido de origen (aunque con una especificidad no total), la
intensidad del daño o el tipo de patología. Por ello, la caracterización de los cambios en
del proteoma profundo del plasma/suero suministra una información muy valiosa a la
hora de identificar biomarcadores específicos de enfermedades humanas (Anderson &
Anderson, 2002; Righetti et al., 2005c; González-Hernández, 2010).

Secreción Degradación

Necrosis Inducción

Secreción Degradación

Proliferación celular
(e.j, cáncer)
Obstrucción

Figura 13. Posibles orígenes de los cambios de abundancia de proteínas no específicas

(tisulares) del plasma. La abundancia de una proteína tisular presente en el plasma depende
del recambio celular existente y de la secreción (pasiva) por parte de las células y de los
procesos de eliminación de estas proteínas del plasma (proteolisis, filtración glomerular,
etc.). Esta concentración estacionaria puede fluctuar (normalmente al alza) debido a varias
razones: i) inducción de la síntesis de la proteína dentro de las células; ii) necrosis celular que
incrementa la permeabilidad de la membrana y provoca la liberación de numerosas
proteínas al medio; iii) un incremento del recambio hístico, como ocurre en la proliferación
celular; iv) una obstrucción de la secreción celular; y por último, v) una menor degradación o
eliminación del plasma (por ejemplo, un fallo renal) (Adaptado de González-Hernández, 2010).

55
 Introducción

2.3.- TECNOLOGÍAS EMPLEADAS EN PROTEÓMICA

2.3.1.- Preparación de muestras de plasma y suero

Antes de acometer el análisis de las muestras de suero o plasma, una serie de

variables preanalíticas deben de ser tenidas en cuenta de modo que no influyan sobre
los resultados de un estudio proteómico. Factores preanalíticos técnicos, como el tipo de
muestra (plasma o suero), la forma de recoger las muestras (tipo de aguja, postura del
donante, tiempo de torniquete, etc.), el tipo de tubo (vidrio o plástico, con geles
separadores o no, con anticoagulantes/procoagulantes o inhibidores de proteasas, etc.),
velocidad y tiempo de centrifugación, temperatura de procesado y almacenamiento,
tiempo de procesado, forma de transporte, alicuoteado, congelación (N 2), ciclos de
congelación-descongelación, etc., son aspectos importantes a tener en cuenta. También
lo son los factores preanalíticos biológicos tanto intrínsecos (edad, sexo, raza, genética,
embarazo, etc.) como extrínsecos (dieta, alcohol, tabaco, cafeína, estrés, ejercicio, etc.),
como lo demuestra el estudio publicado en 2004 por Rai et al. o más recientemente la
revisión realizada por Ferguson et al., 2007.

Además de estos factores preanalíticos técnicos y biológicos, una buena

preparación de muestras de suero/plasma en Proteómica implica mantener todas las
proteínas en solución empleando un tampón adecuado que contenga bien altas
concentraciones de agentes caotrópicos (urea/tiourea) y detergentes como CHAPS (en
electroforesis bidimensional/2-DE) o sustancias como el acetonitrilo (ACN) (en
cromatografía líquida bidimensional /2D-LC). También hay que eliminar aquellos
componentes (otras proteínas, sales, DNA, RNA, etc.) que puedan interferir con los
análisis posteriores mediante procesos de precipitación, diálisis, filtración, sonicación,
uso de DNAsa o RNAsa, etc. Es importante, además, preservar la integridad de las
proteínas frente a procesos como la proteolisis mediante tampones con una alta
concentración de urea/tiourea y CHAPS (o una baja concentración de urea pero en
presencia de SDS), el uso de inhibidores de proteasas (exceptuando algunos como PMSF
o AEBSF que generan modificaciones covalentes) o la oxidación de aminoácidos como
Met, Cys, Lys, His, Trp o Pro (tratamiento con DTT/iodoacetamida). Finalmente, es
56
 Introducción

esencial proteger la integridad de las PTMS (fosforilaciones, ubiquitinaciones,

glicosilaciones, etc.) mediante el uso de tampones con una alta concentración de
urea/tiourea y CHAPS, inhibidores de fosfatasas, etc. (Luque-García et al., 2007).

Como acabamos de comentar, frecuentemente es necesario eliminar algunas

proteínas con el fin de que no interfieran con los análisis posteriores (por ejemplo, en
MS al causar la supresión de señales). Este es un problema en Proteómica derivado de la
existencia en suero/plasma de una gran cantidad de proteínas diferentes a identificar y
un rango dinámico de abundancias muy amplio (1012). Aunque la instrumentación en
Proteómica ha mejorado significativamente, este segundo punto supone un gran reto
tecnológico que actualmente sólo puede ser abordado con gran eficacia por tecnologías
“dirigidas” como los inmunoensayos (ELISA, RIA, etc.), ya que los análisis proteómicos
convencionales (2-DE o LC/MS/MS) tienen rangos dinámicos de tan sólo 10 2-104, lo que
dificulta la detección de proteínas de muy baja concentración.

Podemos extender algo dicho rango de detección (por un factor de 10 1-102)

mediante metodologías de fraccionamiento (separación máxima) y prefraccionamiento
(enriquecimiento), resumidas en la Figura 14 (Anderson & Anderson, 2002). Los
protocolos de fraccionamiento diferencial mediante centrifugación (bloque 1, Figura 14)
y extracción secuencial utilizando diferentes detergentes (bloque 2, Figura 14) son
aplicados normalmente a muestras celulares, mientras que en el caso de los fluidos
biológicos como el suero y el plasma los métodos de
fraccionamiento/prefraccionamiento más utilizados son los de tipo electroforético y
cromatográfico (bloques 3 y 4, Figura 14).

57
 Introducción

1DE
Electroforesis preparativa
FFE
Electroforesis capilar
Centrifugación Electroforesis en chips
Electroforesis IEF en fase líquida

Fraccionamiento celular y subcelular

Orgánulos (e.j., mitocondrias) Métodos Afinidad
Compartimentos (membrana)

Intercambio

Cromatografía
Extracción Exclusión
secuencial

Fase reversa
Basados en solubilidad

Figura 14. Estrategias de fraccionamiento y prefraccionamiento de muestras en Proteómica

2.3.2.- Electroforesis: 1-DE, electroforesis preparativa, FFE, electroforesis capilar, electroforesis

en chips y IEF en fase líquida

La electroforesis puede ser empleada como metodología preparativa en procesos

de fraccionamiento, aunque no son las más populares en Proteómica. Un ejemplo de
ello lo tenemos en la electroforesis convencional o monodimensional (1-DE), llevada a
cabo en geles verticales de poliacrilamida (PAGE) en condiciones desnaturalizantes (SDS-
PAGE; Laemmli, 1970) o nativas. Cuando las separaciones se han completado, los geles
se tiñen y las bandas así visualizadas se escinden para ser analizadas por LC-MS/MS
(Tang et al., 2005). Una técnica alternativa a este tipo de electroforesis convencional es
la capilar (“capillary electrophoresis”; CE), realizada en tubos capilares (diámetro interno
<0.1 mm, longitud de 50 cm a 1 m) sometidos a un campo eléctrico de 300-500 V/cm y
que permite, entre otras ventajas, la separación rápida y con alta resolución de las
proteínas <20 kDa (Desiderio et al., 2010; Zürbig & Jahn, 2012). Una variante de la CE
utilizada más bien con propósitos exclusivamente analíticos (pero no preparativos)
debido a los bajos volúmenes de muestra empleados sería la tecnología "Lab-on-a-chip",
basada en el uso de chips que contienen microcanales que permiten separar las
proteínas dentro de un campo eléctrico. La CE convencional también adolece de los

58
 Introducción

volúmenes reducidos de muestra que pueden ser cargados en los capilares, lo que limita
la sensibilidad de detección, pero la mejora de los métodos de espectrometría de masas
ha permitido su aplicación en Proteómica Clínica (Desiderio et al., 2010; Zürbig & Jahn,
2012). Otra técnica de fraccionamiento importante es el isoelectroenfoque
(“isoelectrofocusing” o IEF), técnica basada en la separación de las proteínas en función
de su punto isoeléctrico (pI). La combinación de IEF (primera dimensión) con SDS-PAGE
(segunda dimensión) da lugar a la electroforesis bidimensional o 2-DE (O´Farrell, 1975),
una técnica que se puede aplicar con fines analíticos (ver apartado 5 de Material y
Métodos) o preparativos (fraccionamiento).

Otros tipos de electroforesis son realizadas en ausencia de fases estacionarias y

empleadas con fines preparativos debido a su elevada capacidad de carga. Un ejemplo lo
tenemos en la electroforesis (FFE; “Free-Flow Electrophoresis”) y el isoelectroenfoque
(FF-IEF; “Free-Flow Isoelectrofocusing”) de flujo libre. Se trata técnicas de separación en
forma continua de proteínas en función de sus movilidades electroforéticas o pI (Righetti
et al., 2003, 2005a). En FFE la solución de electrolito fluye de forma ortogonal a un
campo eléctrico y las proteínas de las muestras (en modo nativo o desnaturalizas) son
añadidas de manera continua, siguiendo trayectorias diagonales en función de su
movilidad electroforética y siendo recogidas en forma de 96 fracciones (Righetti et al.,
2003, 2005a; Islinger et al., 2010). La separación, por tanto, se lleva a cabo en forma de
base líquida, sin ninguna interacción con matrices sólidas como geles, lo que asegura
una alta tasa de recuperación al no perderse los analitos. La electroforesis de flujo libre
parece tener menores coeficientes de difusión de las proteínas trabajando en modo FF-
IEF, por lo que esta última se aplica más frecuentemente en Proteómica (Righetti et al.,
2003, 2005a; Islinger et al., 2010). Finalmente, una variante de la IEF preparativa en fase
líquida son los instrumentos comerciales como los RotoforTM (que puede fraccionar
hasta 1 g de proteína), mini-RotoforTM o el microRotoforTM de BioRad, o el ZOOM-IEF
FractionatorTM de Life Technologies. Dichos instrumentos generan hasta 20 fracciones de
proteínas concentradas en función de su pI, las cuales pueden ser analizadas
posteriormente por otras metodologías como 1-DE, 2-DE o 2D-LC-MS/MS (Righetti et al.,
2003, 2005a; Islinger et al., 2010).

59
 Introducción

2.3.3 Fraccionamiento de proteínas mediante cromatografía líquida: afinidad, intercambio,

exclusión, fase reversa

Las técnicas de cromatografía líquida (LC) son muy empleadas en Proteómica

para fraccionar mezclas complejas de proteínas (o péptidos; ver más adelante). Pueden
ser empleadas de manera única (LC monodimensional) o combinada (LC bidimensional o
2D-LC). Se basan en el equilibrio que se da en las proteínas a la hora de distribuirse entre
la fase estacionaria (pequeñas esferas sólidas empaquetadas en columnas) y la fase
móvil (un líquido, que es el que le da nombre a la LC). Esta fase móvil puede ser
cambiada durante el proceso cromatográfico, alterando el equilibrio y por ello el reparto
de los proteínas entre la fase móvil y la estacionaria (Lescuyer et al., 2004). Destaca el
uso en Proteómica de instrumentos de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC,
“High Performance Liquid Chromatography”), tanto sistemas estándar (flujos de varios
mL por min; diámetros de columna de 4.6 mm) como nano-HPLC (150-300 nL/min;
diámetros de columna de 50 μm), las últimas empleadas con péptidos. Además, en
Proteómica se usan técnicas cromatográficas diversas aplicadas tanto al fraccionamiento
de proteínas como de péptidos, como la cromatografía de exclusión molecular (SEC,
“Size Exclusion Chromatography”), de intercambio catiónico (SCX, “Strong Cation
Exchange”) o aniónico (SAX, “Strong Anion Exchange”), de afinidad o la cromatografía de
interacción hidrofóbica (HIC; “Hydrophobic interaction chromatography”),
especialmente columnas de fase reversa (RP-HPLC). Esta estrategia genera una gran
cantidad de fracciones o subproteomas (Lescuyer et al., 2004; Righetti et al., 2005a).

Prefraccionamiento mediante cromatografía de afinidad: eliminación de proteínas de

alta abundancia

Se han desarrollado diferentes estrategias para eliminar proteínas de elevada

abundancia del suero/plasma que interfieren con la detección de especies proteicas
menos representadas. Algunas están basadas en técnicas de precipitación diferencial de
proteínas (por ejemplo, la albúmina; Chen et al., 2005), mientras que otras pertenecen
al ámbito de la cromatografía, como la LC de exclusión (Tirumalai et al., 2003;
Terracciano et al., 2006) o la de afinidad (“immunodepletion” o “immunoaffinity
60
 Introducción

substraction”) (Liu et al., 2006; Whiteaker et al., 2007). Actualmente, esta última es la
más utilizada. La LC de afinidad se basa en el uso de interacciones biológicas reversibles
y altamente específicas entre moléculas (enzima-sustrato, ligando-receptor, antígeno-
anticuerpo, etc.). Permite purificar (o en este caso eliminar) una proteína (o un conjunto
de ellas, dependiendo del grado de selectividad) partiendo de una mezcla compleja. Las
aproximaciones más comunes se corresponden con el uso de fases sólidas (resinas) que
poseen pigmentos (Cibacron blue) para la eliminación de albúmina, o proteínas A o G
para remover inmunoglobulinas como la IgG, pero sobre todo resinas de inmunoafinidad
comerciales (con anticuerpos de mamíferos unidos covalentemente a la fase sólida) que
eliminar específicamente de 1-20 proteínas del plasma/suero, como por ejemplo las
columnas ProteoPrep® 20 Plasma Immunodepletion (Sigma®) o la Human 14 multiple
Affinity Removal System (MARS; Agilent). Sin embargo, el uso de estas columnas
comerciales tampoco está exento de dificultades debido a la reactividad cruzada (lo que
puede solucionarse mediante el empleo de anticuerpos policlonales IgY de yema de
huevo de gallina; ProteomeLabTM IgY-12, Beckman Coulter), los volúmenes de muestra
limitados (20-50 μL por lo general, y con ello la imposibilidad de acceder al proteoma de
media-baja abundancia), la dilución de la muestra o el problema de la co-precipitación
de proteínas (Boschetti et al., 2012).

Reducción del rango dinámico mediante enriquecimiento direccionado de

componentes minoritarios por cromatografía de afinidad: concanavalina A, M-LAC,
IMAC, heparina y librerías de hexapéptidos aleatorios

Algunas resinas de afinidad tienen un amplio espectro de especificidades, lo que

se ha aprovechado para el enriquecimiento en determinadas familias de proteínas y
reducir así el rango dinámico. Un ejemplo lo tenemos en la cromatografía basada en
lectinas como la ConA (concanavalina A), WGA (“wheat germ agglutinin”) o la PNA
(“peanut agglutinin”) o combinaciones de ellas (M-LAC; “multi-lectin affinity
chromatography”), que permite capturar distintas subfamilias de glicoproteínas séricas
pero no aquellas proteínas no glicosiladas, como la albúmina (Righetti et al., 2005a).
Otro ejemplo es la cromatografía de afinidad basada en heparina (“heparin-affinity

61
 Introducción

chromatography”), un polisacárido que se une a factores de coagulación, lipoproteínas,

lipasas, hormonas, etc. (Lei et al., 2008), o la tecnología IMAC (“immobilized metal
chelate chromatography”), utilizada bien para la eliminación de inmunoglobulinas del
plasma/suero o la purificación de proteínas glicosiladas o fosfoproteínas (Wang et al.,
2013).

Otra manera de reducir el rango dinámico es el enriquecimiento en proteínas de

baja abundancia en plasma/suero (y la reducción simultanea de las muy abundantes)
mediante el uso de bibliotecas de ligandos peptídicos aleatorios (“combinatorial peptide
ligand libraries”, CPLLs), desarrolladas en 2005 por el grupo de Egisto Boschetti
(Thulasiraman et al., 2005; Righetti et al., 2006; Keidel et al., 2010; Righetti et al., 2011),
como por ejemplo las comercializadas bajo el nombre de ProteoMiner TM o EqualizerTM
Estas bibliotecas se basan en el uso de amplias librerías de hexapéptidos fijados a fases
sólidas (Boschetti & Righetti, 2008). En teoría, cada una de las esferas que conforman la
matriz está recubierta por un conjunto de hexapéptidos que posee una secuencia
aminoacídica concreta. Miles de estas esferas en la matriz significan miles de posibles
sitios de unión específicos para una proteína. De este modo, las proteínas más
abundantes del suero/plasma saturan rápidamente sus ligandos en cada “bead”, siendo
eliminadas mediante lavados aquellas no retenidas; por el contrario, las proteínas poco
abundantes podrán unirse todas a sus ligandos específicos, lo que aumenta su
representación en la muestra y acorta sustancialmente el rango dinámico inicial de las
proteínas del suero/plasma (Figura 15). Esta metodología tiene como gran ventaja el uso
de grandes volúmenes de muestra de suero/plasma (1 mL), así como un proceso de
unión de la matriz a la muestra y de elución de las proteínas retenidas que se puede
realizar en diferentes condiciones (salinidad, pH, detergentes, etc.) para obtener
diferentes proteomas (Bellei et al., 2011; Di Girolamo et al., 2011; Righetti et al., 2012).
No obstante, no está exenta de controversia, tanto desde el punto de vista de la
especificidad de los hexapéptidos (Keidel et al., 2009), de si se logra acceder realmente
al proteoma de baja abundancia (Di Girolamo et al., 2011) o de si esta tecnología
permite realizar medidas cuantitativas.

62
 Introducción

Muestra de suero
Unión de la Lavado del
(amplio rango dinámico)
muestra a la exceso de
librería proteína

Eluido de las
proteínas
“retenidas”
por las
diferentes
beads
Librería de Hexapéptidos

Figura 15. Funcionamiento de las bibliotecas de ligandos peptídicos aleatorios (“combinatorial peptide
ligand libraries”, CPLLs). Esta tecnología se basa en el uso de bibliotecas de hexapéptidos aleatorios
diversas unidas a soportes cromatográfico. Dichos soportes están formados por esferas, recubiertas cada
una de ellas con un único péptido de 6 aminoácidos. Dichos péptidos son capaces de reconocer, al menos
en teoría, una única proteína, de modo que al haber miles de “beads” en la matriz habrá miles de
especificidades diferentes. Cuando la proteína que reconoce la ”bead” tiene una elevada abundancia,
como la albúmina o la transferrina, su capacidad de retención es sobrepasada, de modo que muchas de
estas proteínas no son capturadas y desaparecen durante los lavados posteriores. En cambio, las proteínas
de baja-media abundancia se unen completamente a sus hexapéptidos correspondientes, de modo que su
concentración relativa aumenta. Se logra de este modo reducir el rango dinámico de abundancias de
proteínas en muestras como el suero o el plasma, incrementando el número de proteínas de baja-media
abundancia detectadas). Figura adaptada de [Link]
enrichment-kits.

2.4.- ESTRATEGIAS EMPLEADAS EN PROTEÓMICA

La investigación proteómica es el resultado de la aplicación estratégica de un

conjunto de técnicas (Pando-Robles & Batista, 2008). Estas estrategias suelen tener una
primera fase de separación (péptidos o proteínas), una segunda fase de visualización
(péptidos o proteínas), una tercera fase de análisis por espectrometría de masas (MS) y
una cuarta fase de análisis de los datos obtenidos. Podemos hablar de dos grandes tipos
de aproximaciones, en las cuales se aplica una mezcla de distintas tecnologías (Figuras
16A y B). En las denominadas “bottom-up” (Figura 16A; 90 % de todos los análisis
proteómicos) las proteínas son digeridas en péptidos antes del análisis por
espectrometría de masas (MS). Esta digestión puede hacerse después de la separación
de las proteínas en un gel de electroforesis bidimensional (2-DE; estrategia basada en
63
 Introducción

geles; Figura 16C), o bien antes de la separación por cromatografía líquida (LC; estrategia
“gel-free”; Figura 16C). En ambos casos se trata de generar péptidos para poder
identificar posteriormente las proteínas de las cuales procedían. En cambio, en las
aproximaciones menos frecuentes, de tipo “top-down” (Figura 16B), las proteínas
completas son analizadas por MS para generar datos que permitan identificarlas o
caracterizarlas (Lovrić, 2011).

64
 Introducción

A) Aproximación “Bottom Up” MS de péptidos

Digestión

Identificación de
Identificación de
proteínas
proteínas
MS/MS

B) Aproximación “Top Down”

MS de proteínas intactas
Sin
Digestión
Identificación de
Identificación de
proteínas intactas
proteínas intactas
y caracterización
y caracterización
MS/MS

C) Dos posibilidades en las aproximaciones “Bottom Up”

proteínas

separación digestión

MALDI, MS/MS

digestión

separación

Identificación

(LC)-MS/MS
péptidos

Figura 16. Estrategias empleadas en Proteómica. Existen dos grandes grupos de

aproximaciones metodológicas. Las denominadas “bottom up” (A y C) se basan en la
identificación de las proteínas presentes en una muestra a partir de la información contenida en
los péptidos, de modo que en algún momento las proteínas de la muestra son procesadas
proteolíticamente mediante proteasas como la tripsina. En cambio, las denominadas “top-
down” (B), se basan en la identificación y caracterización de proteínas intactas, sin que
intermedie ningún proceso de generación de péptidos por proteolisis. Dentro de las estrategias
“bottom up”, que son las más frecuentes, podemos distinguir dos grandes subcategorías (C): Los
protocolos basados en la separación de proteínas intactas mediante geles (2-DE) y la
identificación de las proteínas de los “spots” por digestión tríptica/espectrometría de masas; los
protocolos en los que se digieren las proteínas de la muestra inicialmente para luego realizar
una separación de los péptidos por cromatografía líquida (LC) en combinación con
espectrometría de masas.

65
 Introducción

2.5.- HERRAMIENTAS PROTEOMICAS:

2.5.1.- Tecnologías de separación de proteínas (I): Estrategia basada en geles

En la actualidad, el método más eficiente para la separación de mezclas

complejas de proteínas es la electroforesis bidimensional de alta resolución (2-DE). La 2-
DE, desarrollada por O´Farrel y Klose (O´Farrel, 1975; Klose, 1975), permite separar de
cientos a más de 4,000 isoformas de proteínas en un solo experimento, frente a las
aproximadamente 100 que se consiguen separar mediante electroforesis unidimensional
(1-DE). Esta alta resolución es el resultado de utilizar, de modo ortogonal, dos
metodologías que hacen uso de propiedades de las proteínas que son independientes: la
carga/punto isoeléctrico (primera dimensión) y su tamaño aparente (segunda
dimensión) (Görg et al., 2004; Lovrić, 2011).

Primera dimensión

Basándonos en la estructura primaria de las proteínas podemos decir que la

mayor parte de ellas poseen, teóricamente, un punto isoeléctrico (pI) en el rango de pH
2.5-12, si bien hay que tener en cuenta que las cargas de una proteína no sólo proceden
de los grupos N-terminales, C-terminales o las cadenas laterales de los aminoácidos, sino
también de PTMs como fosforilaciones o glicosilaciones (no predecibles a partir de la
secuencia primaria). La primera dimensión se lleva a cabo mediante isoelectroenfoque
(IEF) desnaturalizante. En ella, las proteínas, previamente desnaturalizadas en un
tampón que contiene altas concentraciones de urea, son separadas en función de su pI
en geles de poliacrilamida que contienen gradientes de pH. De este modo, tan pronto
como se aplica un campo eléctrico, las proteínas cargadas negativamente migran hacia
el ánodo (polo +) y las proteínas cargadas positivamente migrarán hacia el cátodo (polo -
) , volviéndose en ambos casos menos cargadas a medida que alcanzan valores de pH en
el medio más similares a su pI. Una vez encuentran su pI, las proteínas paran de moverse
y permanecen así enfocadas durante horas o días mientras el campo eléctrico
permanezca conectado (Görg et al., 2004; Lovrić, 2011).

66
 Introducción

La generación de los gradientes de pH se puede realizar mediante dos

aproximaciones: i) Gradientes de pH móviles; ii) gradientes de pH inmovilizados (IPG;
“inmobilized pH gradients”). En el primero de los casos se emplea una mezcla de
moléculas ácidas de bajo peso molecular con distintos valores de pI denominadas
anfolitos. Estos anfolitos son añadidos a los tampones necesarios para generar un gel de
poliacrilamida cilíndrico de 3 mm de diámetro y 20 cm de largo. Cuando se aplica una
corriente eléctrica a través de dicho gel cilíndrico los anfolitos migran en función de su
valor de pI. Así, los de menor valor de pI (cargados negativamente) serán los que migren
más rápidamente hacia el ánodo (polo +), mientras que los de mayor pI (cargados
positivamente) serán los que migren con mayor celeridad hacia el cátodo (polo -). En
medio de estos extremos habrá un amplio abanico de posibilidades, con anfolitos
disponiéndose a distintas alturas dentro del gel en función del número de cargas
positivas y negativas que tengan. Una vez establecido con anfolitos este gradiente de
pH, las proteínas de la muestra biológica también se dispondrán a lo largo del gel en
función de su pI. Los gradientes móviles de pH siguen siendo empleados hoy en día en
geles de gran formato (40 cm x 30 cm x 0.75 mm), capaces de resolver hasta 10,000
proteínas a la vez. Sin embargo, su falta de reproducibilidad y su laboriosidad hizo que se
abandonase prácticamente su uso a favor de las tiras de gel de poliacrilamida con pH
inmovilizados (tiras de IPG; Görg et al., 2000, 2004; Lovrić, 2011).

Las tiras IPG han simplificado la primera dimensión y mejorado la resolución de

los geles debido a una mejor focalización de las proteínas y reproducibilidad. En este
caso el gradiente de pH se encuentra fijado dentro del gel, ya que se forma durante la
polimerización del mismo. Para su generación se emplean monómeros de bisacrilamida
y monómeros modificados de acrilamida con distintos valores de pKa. Estos últimos se
producen mediante la sustitución de uno de los protones de un monómero estándar de
acrilamida con diferentes residuos unidos covalentemente, los cuales tienen un valor de
pKa específico (inmobilinas). El gradiente de pH se forma cuando se van mezclando en
diferentes proporciones dos (o más) soluciones de acrilamida/bisacrilamida de diferente
densidad y que contienen cada una de ellas una única inmobilina (ejemplo, una solución
de pH 3 de baja densidad y solución de pH 10 con alta densidad). Una vez polimerizados,

67
 Introducción

los geles (3-4 %) son secados y cortados en tiras de 3 mm, cada una de ellas con
exactamente el mismo gradiente de pH (por ejemplo, pH 3-10). Actualmente, este tipo
de gradientes inmobilizados pueden ser adquiridos ya preparados en distintas
compañías, con rangos de pH amplios (pH 3-10), estrechos (ejemplo, pH 4-7) o que
cubren diferencias tan pequeñas como una unidad de pH. El gradiente, además, puede
ser de naturaleza lineal o no lineal, y la longitud de la tira de IPG variable (ejemplo, 7-24
cm) dependiendo de la cantidad de muestra que deba ser acomodada (Görg et al., 2004;
Lovrić, 2011).

El IEF incluye una fase previa clave para el funcionamiento de la primera

dimensión que se denomina de rehidratación (Görg et al., 1995, 2004; Lovrić, 2011).
Dicha rehidratación puede realizarse de varias maneras: i) En forma activa a 50 V, en la
que las tiras IPG son rehidratadas con un tampón de rehidratación al que se le ha
añadido la muestra; ii) en forma pasiva, en la que el tampón de rehidratación contiene
también la muestra, pero la que no se aplica ningún tipo de voltaje: iii) finalmente, en la
técnica de “cup-loading” las tiras IPG son rehidratadas en tampón de rehidratación sin
muestra y sin aplicar voltaje, para posteriormente ser cargadas con la muestra en un
punto concreto del gel antes de comenzar el IEF. El tampón de rehidratación suele
contener una elevada concentración de urea, un agente caotrópico (Rabilloud et al.,
1997; Görg et al., 2004; Lovrić, 2011) capaz de desplegar y desnaturalizar las proteínas al
romper sus puentes de hidrógeno, así como tiourea. Este último se añade en menor
cantidad, con una proporción aconsejada de urea 5-7 M/tiourea 2 M. El tampón de
rehidratación puede contener además un agente reductor como el ditiotreitol (DTT),
trazas de colorante (como el azul de bromofenol) y una pequeña cantidad de anfolitos
para favorecer la solubilización y migración de las proteínas de la muestra. Finalmente,
también se utiliza un detergente zwiteriónico que previene las interacciones entre las
proteínas hidrofóbicas y su consecuente agregación/precipitación. Este suele ser CHAPS
(Rabilloud, 1999; Görg et al., 2004; Lovrić, 2011), lo que garantiza que la migración de las
proteínas sea la correcta (de acuerdo con su propia carga). A pesar de todos estos
cuidados, uno de los problemas de la primera dimensión sigue siendo la solubilización de
las proteínas de membrana o de aquellas que tienen un pI básico (>7). Es importante

68
 Introducción

además que los componentes elegidos no incrementen la fuerza iónica de la solución,

para permitir que se alcancen los voltajes aplicados durante el IEF (Görg et al., 2004;
Lovrić, 2011).

Segunda dimensión

La segunda dimensión se basa en una electroforesis convencional y

desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). El SDS, un detergente aniónico
que interacciona fuertemente con el esqueleto proteico (aproximadamente una
molécula de SDS por cada dos aminoácidos), añade un número de cargas negativas
proporcional a la longitud del polipéptido, al mismo tiempo que despliega la proteína
(desnaturalización). De este modo, las proteínas adquieren una relación carga/masa
contante, migrando en función del número de aminoácidos si existe un campo eléctrico.
El porcentaje de monómero total empleado en esos geles (% T) suele oscilar entre el 7-
20 %, dependiendo del rango de pesos moleculares de proteínas a separar, mientras que
la ratio acrilamida: bisacrilamida típicamente empleada es de 37.5:1 (2.6 % C). También
es posible utilizar geles en gradiente, pero su uso está menos extendido. En cualquier
caso, los geles están tamponados a pH 8.8 con Tris HCl (Görg et al., 2004; Lovrić, 2011).

Antes de transferir las proteínas desde las tiras de IPG al gel de SDS-PAGE
(segunda dimensión) las primeras deben de ser equilibradas en un tampón que contiene
Tris HCl (pH 6.8), SDS y una concentración menor de urea que el tampón de
rehidratación (por ejemplo, 6 M). Este proceso consta de una primera etapa en donde
los grupos -SH de las proteínas son reversiblemente reducidas con DTT (o DTE), y una
segunda donde dicha reducción se hace permanente mediante iodoacetamida, un
compuesto que alquila los grupos –SH de las cisteínas (para formar carbamidometil
cisteína). Este proceso impide la aparición de múltiples péptidos en diferentes estados
de oxidación durante los análisis de espectrometría de masas (MS) (Görg et al., 2004;
Lovrić, 2011). Finalizado el equilibrado, los geles de la primera dimensión son colocados
(equilibrados a pH 6.8) sobre geles de SDS-PAGE (equilibrados a pH 8.8), creando un
sistema discontinuo de electroforesis que se resuelve mediante diferentes carcasas.
Estas permiten correr 1-2 (PROTEAN® II xi Cell, Bio-Rad), 4 (PROTEAN® II XL Cell, Bio-
69
 Introducción

Rad), 6 (Ettan DALT Six System de GE Healthcare) o incluso 12 geles al mismo tiempo
(PROTEAN Plus Dodeca Cell de Bio-Rad), lo que favorece la reproducibilidad
experimental, especialmente en combinación con equipos de control de la temperatura
(Görg et al., 2004; Lovrić, 2011). La utilización de marcadores de peso molecular permite
el cálculo del peso molecular aparente de las proteínas en los geles, lo que proporciona
información adicional importante a la hora de la identificación por espectrometría de
masas. Además, la 2-DE es una metodología proteómica muy popular debido a su
versatilidad, buena reproducibilidad, poder resolutivo e instrumental necesario no
demasiado sofisticado (Görg et al., 2004; Lovrić, 2011). Sin embargo, la 2-DE tiene
limitaciones, ya que no permite analizar todas las proteínas por igual (ejemplo, existen
problemas con las proteínas de membrana o las básicas), y se pueden producir hasta un
20-90 % de pérdidas de proteínas durante el análisis que repercuten en una baja señal
(Görg et al., 2004; Lovrić, 2011).

Tinción y visualización

Una vez separadas, es necesario: i) fijar las proteínas en el gel (para evitar el
proceso de difusión) mediante ácidos y/o alcoholes; y ii) utilizar un método de tinción y
de desteñido para poder visualizar las proteínas. Existen multitud de métodos de tinción,
como las tinciones orgánicas (azul de Coomassie; Nuehoff et al., 1988), la tinción de
plata (Nesterenko et al., 1994), las tinciones negativas (Amido Black; Candiano et al.,
2004) o las tinciones fluorescentes comerciales (Sypro Ruby, Deep Purple, Flamingo,
etc.) (Miller et al., 2006; Harris et al., 2007) (Tabla 3). La aplicación de una u otra está
determinada por factores como la sensibilidad, el rango lineal, la facilidad de uso, el
precio, el equipo de adquisición de imagen o la compatibilidad con las técnicas de
identificación posteriores, pero en Proteómica aplicada a Biomedicina las tinciones
deben de ser sensibles, reproducibles y tener un rango dinámico que permita detectar
cambios en la concentración de biomarcadores potenciales. El uso de equipos
especializados ha permitido simplificar notablemente los protocolos e incrementar el
número de geles teñidos simultáneamente (Miller et al., 2006; Harris et al., 2007; Lovrić,
2011).

70
 Introducción

La tinción de Coomassie se une reversiblemente a las proteínas, pero no a otras

moléculas. Esta unión es lineal (≈2.5 órdenes de magnitud) e independiente de su
secuencia primaria (pero no del contenido en ciertos aminoácidos). Dos tipos se
emplean en Proteómica: el convencional y el coloidal. El primero se basa en el colorante
R-250 (rojo), mientras que el coloidal está basado en el colorante G-250 (verde) y
requiere protocoles más largos (hasta dos días de trabajo). Este tipo de tinciones son
poco sensibles, oscilando entre 50-100 ng para el Coomassie R-250 y hasta los 10 ng
para el Coomassie G-250 gracias a su conversión en estado coloidal en presencia de un
12.5 % de ácido tricloroacético (TCA) (Candiano et al., 2004) (Tabla 3). R-250 y G-250
interaccionan de forma no covalente con las proteínas, pero el mecanismo no está claro,
siendo favorecido por la presencia de aminoácidos con cadenas laterales básicas (Arg,
His, Lys) o aromáticas (Trp, Tyr y Phe). Tampoco tiñen por igual todas las proteínas, pero
sí son muy compatibles con procesos de espectrometría de masas (Miller et al., 2006;
Lovrić, 2011).

Existen distintos protocolos de tinción de plata, pero todos ellos se basan en la

formación de precipitados de sales de plata. A diferencia del Coomassie R-250, este tipo
de protocolos son algo más largos y no son de punto final. Generan también una enorme
variabilidad en la intensidad de tinción, no son específicos de proteínas (tiñen ácidos
nucleicos) y no son compatibles con espectrometría de masas (salvo aquellos protocolos
que omiten el formaldehido o el glutaraldehido). En conclusión, su uso no es aconsejable
en Proteómica, si bien este tipo de tinciones son muy sensibles (0.1-1 ng de proteína por
spot) (Miller et al., 2006; Lovrić, 2011).

Las tinciones fluorescentes presentan una mayor sensibilidad que las orgánicas.
Son tinciones con gran facilidad de uso, linealidad y buena sensibilidad, aunque
presentan inconvenientes como el elevado coste, la necesidad de sistemas de captación
de imagen específicos y la dificultad para recortar los spots de los geles de forma manual
para su identificación. Hay una gran variedad de tinciones fluorescentes, con diferentes
longitudes de onda de excitación y de emisión. Los fluoróforos tienen distintos
mecanismos de unirse a las proteínas: i) unión indirecta mediante intercalación de una

71
 Introducción

molécula de detergente; ii) unión directa no covalente; iii) unión directa covalente.
Algunos permiten detectar globalmente las proteínas, como por ejemplo SYPRO® Ruby
(Invitrogen Corp.), Deep Purple (GE Healthcare), Flamingo (Bio-Rad) o Krypton (Pierce
Biotechnology). SYPRO® Ruby pertenece a una familia de fluorocromos que se unen no
covalentemente a las proteínas, sobre todo a aminoácidos básicos (aunque no se
descartan interacciones hidrofóbicas). Es una molécula muy fotoestable que tiene un
átomo de rutenio como metal de transición, gracias al cual se excita a 280 nm y emite a
una longitud de onda mucho mayor (450/610 nm). Presenta una gran sensibilidad (1
ng/spot; Tabla 3), pero a costa de un proceso de tinción largo, y un gran rango de
linealidad (tres órdenes de magnitud). Es capaz de teñir muchos tipos distintos de
proteínas pero no ácidos nucleicos, lo que lo convierte en una opción igual de sensible
pero más reproducible que la tinción de plata. Otras tinciones fluorescentes detectan,
en cambio, sólo determinadas PTMs de las proteínas, como las fosforilaciones (Pro-Q
Diamond; Invitrogen Corp) o las glicosilaciones (Pro-Q Emerald; Invitrogen Corp.) (Miller
et al., 2006; Harris et al., 2007; Lovrić, 2011).

En ocasiones, el marcaje fluorescente de las proteínas ocurre antes de separarlas

electroforéticamente. De hecho, este ha sido uno de los desarrollos más importantes en
2-DE, la técnica denominada DIGE (“Difference gel electrophoresis”). DIGE simplifica los
estudios de Proteómica diferencial, al permitir la comparación simultanea de 2-3
muestras biológicas, lo que significa una mejora en la reproducibilidad de la técnica y de
la capacidad de obtener información cuantitativa. En DIGE las proteínas de las muestras
son marcadas con fluorocromos distintos, espectralmente distinguibles (ejemplo, Cy2,
Cy3 y Cy5), antes de ser separadas por 2-DE (Miller et al., 2006; Lovrić, 2011; Minden,
2012b).

72
 Introducción

Tabla 3
Principales características de los métodos de tinción más frecuentes
(adaptado de Miller et al., 2006)

Método Detección Sensibilidad Linealidad Características

Azul de Colorimetría 50-100 ng +++ Tinción posterior a la 2-DE.
Coomassie Compatible con MS. Bajo coste.
R-250 Protocolos sencillos. Alta
reproducibilidad. Permite
estudios cuantitativos. Bajo
coste. Método robusto en
análisis a gran escala.
Azul de Colorimetría 10 ng +++ Tinción posterior a la 2-DE.
Coomassie Compatible con MS. Protocolos
G-250 sencillos, pero largos. Alta
reproducibilidad. Permite
estudios cuantitativos. Bajo
coste. Método robusto en
análisis a gran escala.
Tinción de Colorimetría 0.1-1 ng + Tinción posterior a la 2-DE. Baja
plata compatibilidad con MS. Alta
sensibilidad, pero baja
reproducibilidad; no permite
estudios cuantitativos. Tiñe
además ácidos nucleicos. Bajo
coste. Método poco robusto para
estudios a gran escala.
SYPRO Fluorescencia 1 ng +++ Tinción posterior a la 2-DE.
Ruby Compatible con MS. Alta
sensibilidad. Alta
reproducibilidad. Se necesita
equipo especial de captación de
imagen. Alto coste. Método
robusto en análisis a gran escala.
DIGE Fluorescencia <1 ng +++ Marcaje de las proteínas anterior
a la 2-DE. Compatible con MS.
Alta sensibilidad. Alta
reproducibilidad. Se necesita
equipo especial de captación de
imagen. Alto coste. Método
robusto en análisis a gran escala.

El proceso de marcaje en DIGE es optimizado de tal manera que tan solo un 1-5 %
de las lisinas de una proteína determinada son marcadas, pero dicho proceso las vuelve
más acídicas y reduce la sensibilidad de detección. Con el fin de solventar estos
problemas, se han desarrollado nuevos fluorocromos Cy2, Cy3 y Cy5 capaces de unirse a

73
 Introducción

todas las proteínas de una muestra con cisteínas libres (marcaje de saturación) o bien
que presentan cargas positivas que reemplazan las perdidas en las lisinas. En cualquiera
de estas estrategias, tanto las dos muestras a comparar como el estándar interno (un
pool de las dos muestras) son marcadas con su respectivo fluorocromo (Cy2, Cy3 o Cy5),
mezcladas y separadas en un único gel sin que se pierda la información sobre la
abundancia relativa de las proteínas. De este modo, DIGE reduce el número de geles por
experimento y la variabilidad técnica, incrementando la velocidad del análisis y
facilitando el proceso de identificación y de medición de la intensidad de fluorescencia
de los spots a lo largo de las distintas muestras. El uso de fluorescencia en DIGE, además,
hace que se necesite menos cantidad de muestra para el análisis (pero no para la
posterior identificación por espectrometría de masas) (Tabla 3). Sin embargo, DIGE es
una técnica que encarece notablemente el coste por muestra procesada (Miller et al.,
2006; Lovrić, 2011; Minden, 2012a).

Digitalización y análisis de imagen

Existen tres categorías de sistemas de captura de imagen, todos ellos controlados

por software específicos. Los más comúnmente usados son los escáneres calibrados
como los GS-800 y GS-900 de Bio-Rad o el ImageScanner III de GE Healthcare Life
Sciences, útiles en la mayoría de las aplicaciones densitométricas no fluorescentes
aunque de limitado rango dinámico (Miller et al., 2006; Lovrić, 2011). Los geles también
pueden ser digitalizados en instrumentos como el GelDoc™ System (Bio-Rad) que
emplean cámaras CCD de alta resolución y sensibilidad situadas a una mayor distancia
focal (de mejor rango dinámico; > 3 órdenes de magnitud), fuentes de iluminación
(trans- o epi-) que emiten luz UV (300 nm) o blanca y una serie de filtros adecuados
Miller et al., 2006; Lovrić, 2011). Finalmente, la tercera categoría de instrumentos se
corresponde con la más cara, los escáneres de fluorescencia basados en láseres como los
equipos de la serie Typhoon FLA de GE Healthcare Life Sciences o el Molecular Imager
PharosFX™ de Bio-Rad. En éstos un haz de luz láser, con una longitud de onda adecuada
para excitar los fluorocromos unidos a las proteínas, barre cada punto del gel y la
fluorescencia emitida es captada y amplificada (PMT), de modo que se alcanzan altas

74
 Introducción

resoluciones y elevados rangos dinámicos (hasta 105) (Miller et al., 2006; Lovrić, 2011).
Una vez las imágenes de los geles son obtenidas, normalmente son guardadas en el
formato original del instrumento de captación de imagen o en formatos más
estandarizados como TIFF (Miller et al., 2006; Lovrić, 2011).

Una serie de programas informáticos se emplean en Proteómica para el análisis

de imagen, como Melanie (vendido bajo el nombre ImageMaster2D por GE Healthcare,
UK), PDQuest (Bio-Rad, USA), Phoretix 2D (Nonlinear, UK), Progenesis (Nonlinear, UK),
Delta2D (Decodon, Germany), REDFIN (Ludesi, Sweden) DeCyder (GE Healthcare, UK)
(Biron et al., 2006; Palagi et al., 2006; Dowsey et al., 2010; Lovrić, 2011). Estos
programas permiten sustraer el fondo de una imagen, detectar los spots, eliminar
artefactos, realizar un proceso de alineamiento de los geles y de correspondencia de los
diferentes spots a lo largo de las distintas imágenes (“landmarking” y “matching”),
transformar y normalizar los datos, agrupar los geles según distintas clases (ejemplo,
sanos, enfermos, no tratados, tratados, etc.), analizar las diferencias cualitativas
(presencia/ausencia) y/o cuantitativas (intensidad, volumen de los spots), estudiar el
grado de significación estadística de estas diferencias o realizar procesos de anotación
de los spots (masa molecular, pI, identificación, hipervículos, etc.). El esquema de
funcionamiento de cada uno de los programas anteriormente citados varía ligeramente;
por ejemplo, en función de si el “spot matching” es realizado después de la detección de
los spots o si por el contrario el alineamiento de los geles es realizado antes de la
detección de los spots. En cualquier caso, el análisis de imagen constituye también una
fuente de variabilidad técnica que debe de ser tenida en cuenta (Wheelock & Buckpitt,
2005). Una vez detectadas las proteínas que presentan una abundancia diferencial, los
spots son cortados (manual o de manera automatizada) y las proteínas procesadas
proteolíticamente e identificadas mediante espectrometría de masas.

2.5.2.- Digestión proteolítica

En las aproximaciones “botton-up” las proteínas son digeridas en péptidos más

cortos antes de su análisis por espectrometría de masas; esto puede hacerse después de
la 2-DE (estrategia basada en geles) o antes de la LC (estrategia “gel-free”; ver siguiente
75
 Introducción

apartado) a través de un enzima (Tabla 4) que, de forma general, suele ser tripsina. Se
trata de una endopeptidasa barata, robusta, altamente específica y que trabaja en un
amplio rango de concentraciones. Funciona mejor en un ambiente ligeramente alcalino y
si las proteínas de la muestra estén desnaturalizadas, sus puentes disulfuro reducidos y
sus cisteínas alquiladas. La razón del uso mayoritario de la tripsina se debe a su
frecuencia de su diana de corte, ya que hidroliza específicamente el enlace peptídico
situado en una posición C-terminal a una lisina (K) o arginina (R) siempre y cuando no
sean seguidos de prolina (Tabla 4). Esto genera péptidos de 8-23 aminoácidos de
longitud (<3 kDa) y propicia, además, la presencia de por lo menos dos cargas positivas
en los péptidos (N-terminal y C-terminal con K o R), idóneo para la identificación por
espectrometría de masas. No obstante, la eficacia del proceso no es del 100 %, de modo
que pueden producirse pérdidas de cortes proteolíticos (Lovrić, 2011).

En el caso de los “spots” procedentes de los geles de 2-DE (con una o varias
proteínas), éstos son troceados en pequeños fragmentos e incubados en un volumen de
10-20 μL y una gran cantidad (10-150 ng) de tripsina (debido a que tiene que difundir
dentro del gel). Las digestiones se realizan durante 3-16h a 37 ºC, y pueden ser
empleadas directamente en espectrometría de masas o ser sometidas a un proceso de
limpieza de contaminantes utilizando microcolumnas de cromatografía de fase reversa
(Lovrić, 2011). En la estrategia “gel-free” las digestiones trípticas, en cambio, son más
simples, ya que son realizadas durante 4-16h a 37 ºC con las proteínas en solución (50
μL), por lo que la cantidad de tripsina necesaria es menor. Para asegurar la
desnaturalización de las proteínas de la muestra (incluidas posibles proteasas endógenas
generadoras de péptidos no trípticos o enzimas que eliminen PTMs) se emplean
tampones que contienen SDS, urea y acetonitrilo (Lovrić, 2011).

76
 Introducción

Tabla 4. Enzimas utilizadas frecuentemente en digestión enzimática de péptidos.

Enzima Sitio de corte Excepción Rango de pH

Tripsina C-terminal de R-X, K-X Cuando X=P 7-9
Endoproteinasa Glu-C C-terminal de E-X, D-X Cuando X=P
4-8
(V8-DE
Quimiotripsina) C-terminal de F, Y, W, L, Cuando X=P
7.5-8.5
I, V, M-X
Endoproteinasa Lis-C C-terminal de K-X Cuando X=P 8.5-8.8
Endoproteinasa Arg-C C-terminal de R-X Cuando X=P 7.5-8.5
Pepsina C-terminal de F, L y E 2-4

2.5.3.- Tecnologías de separación de proteínas (II): Estrategia “gel-free”

La 2-DE posee algunas limitaciones a la hora de analizar proteínas hidrofóbicas,

con puntos isoeléctricos muy ácidos o muy básicos, o de tamaños muy grandes o
demasiado pequeños (Lovrić, 2011). El otro gran problema todavía no resuelto en 2-DE
es el rango dinámico. Por tales motivos, la tendencia actual es trabajar con péptidos (en
vez proteínas) y con sistemas de separación que no empleen geles (“gel-free”). Así, el
uso de nanocolumnas de cromatografía líquida (nano-LC) acopladas a espectrometría de
masas (nano-LC-MS/MS) permite realizar la separación de los péptidos y la identificación
de las proteínas de las cuales proceden. En este tipo de protocolos se emplean
esquemas cromatográficos ortogonales (basados en propiedades como el tamaño,
carga, hidrofobicidad o afinidad), para lograr una separación lo más resolutiva posible de
mezclas complejas de péptidos. Entre los más empleados se encuentra la cromatografía
de intercambio catiónico (SCX; “Strong cationic Exchange”), combinada con la
cromatografía de fase reversa (RP; “reverse phase”). Esta combinación de intercambio
catiónico y RP-HPLC se conoce como MudPIT (“Multimensional Protein Identification
Technology”) o “shotgun” (Washburn et al., 2001; Wolters et al., 2001; Lovrić, 2011;
Zhang et al., 2013), y es quizás el método más eficiente de identificación de proteínas a
partir de mezclas complejas de péptidos. En esta metodología los péptidos son
separados en una primera dimensión en múltiples fracciones en función de su carga en
77
 Introducción

un ambiente ligeramente acídico en la nanocolumna de SCX. Posteriormente, cada una

de esas fracciones es sometida a separación mediante fase reversa en una segunda
nanocolumna, lo que genera un continuo de péptidos (cada vez más hidrofóbicos) que
son ionizados antes de entrar en distintos tipos de analizadores de masas. Se han
desarrollado procedimientos SCX-RP para una gran variedad de aplicaciones (Pang et al.,
2002; Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013), así como otras combinaciones bidimensionales
acoplando la cromatografía de fase reversa con otros tipos de cromatografía o técnicas
de separación (electroforesis capilar, CE). En cualquier caso, con la aplicación de esta
metodología se logra identificar proteínas muy poco abundantes (elevada sensibilidad),
proteínas muy hidrofóbicas, o proteínas de pI extremos, solucionando algunos de los
problemas de la 2-DE. En cambio, la realización de estudios cuantitativos es más
compleja que mediante 2-DE.

Los análisis proteómicos cuantitativos mediante la tecnología “shotgun” son

variados. Se han desarrollado distintas aplicaciones proteómicas que permiten la
cuantificación relativa de proteínas sin el uso de ningún tipo de marcaje (“label-free
quantification”). En este tipo de técnicas (menos costosas y más simples) los péptidos
derivados de distintas muestras se analizan mediante múltiples ensayos de LC-MS.
Posteriormente, los espectros de cada uno de estos experimentos es alineado mediante
uso de potentes programas informáticos, de manera que las áreas de los picos
seleccionados pueden compararse para determinar las cantidades relativas de los
péptidos a través de las intensidades de los picos correspondientes (Bondarenko et al.,
2002; Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013). La cuantificación también es posible mediante la
técnica de contaje espectral, en donde se calcula la abundancia de una proteína en base
al número de veces que un péptido de una proteína es seleccionado para MS/MS (Liu et
al., 2004; Zhang et al., 2013). Este tipo de metodologías “label free” presenta ventajas
derivadas de omitir las modificaciones químicas de los péptidos presentes en otras
aproximaciones (ver más adelante), lo que acorta y abarata los experimentos. El número
de muestras a comparar es ilimitado, y el rango dinámico de concentraciones analizables
grande; sin embargo, como los distintos péptidos ionizan de forma variable de

78
 Introducción

experimento en experimento, sus intensidades también pueden variar de un análisis a

otro, haciendo muy difícil la cuantificación (Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013).

La cuantificación relativa en LC-MS/MS puede hacerse también mediante

marcaje químico isotópico. En este tipo de ensayos se incorporan diferentes “etiquetas
isotópicas estables” a los péptidos/proteínas (dependiendo de la muestra de la cual
proceden) (Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013) mediante marcaje metabólico, químico o
enzimático. En el primero (ejemplo, SILAC o SILAM) se emplean diferentes isótopos
estables (uno “ligero” y otro “pesado”) introducidos en el medio de cultivo en forma de
moléculas como aminoácidos esenciales (por ejemplo, lisina, arginina en SILAC) o
precursores de aminoácidos, de modo que las células las introducen activamente en sus
proteínas. El resultado es que las proteínas de las células de uno de los cultivos serán
portadoras del “marcaje ligero” y las proteínas de las células del segundo de los cultivos
serán portadoras del “marcaje pesado”. Sin embargo, este tipo de protocolos no son
aplicables a los estudios cuantitativos del proteoma de fluidos biológicos como el
suero/plasma (Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013). Un segundo grupo de técnicas emplea el
marcaje químico, en donde se emplean “etiquetas” que son unidas covalentemente bien
a las proteínas o bien a los péptidos después de la digestión. Los reactivos utilizados en
marcaje químico reaccionan normalmente con los grupos amino (extremo N-terminal,
lisina) o con los grupos sulfidrilo o tioles presentes en las cisteínas. También se han
18
generado algunos reactivos con afinidad por los grupos carboxílicos (C-terminal; O),
por los residuos de triptófano o por los de serina y treonina fosforilados (Leitner &
Lindner, 2006; Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013). Los isótopos estables más usados en
estas “etiquetas” son los de hidrógeno/deuterio (1H/2H), carbono (12C/13C), nitrógeno
(14N/15N) y oxígeno (16O /18O). Existen dos aproximaciones metodológicas diferentes
dentro del marcaje químico para obtener datos cuantitativos. En la primera de ellas (por
ejemplo ICAT, “Isotope-Coded Affinity Tag”) se calcula la abundancia relativa de la
proteína en las diferentes muestras en base a la abundancia relativa de los péptidos
precursores en el espectro MS. En la segunda, en cambio, las etiquetas son isobáricas
(mismo valor m/z) y poseen una sección (ión informador) que se separa durante la
fragmentación del péptido precursor (MS/MS o MS2) y permite la cuantificación relativa

79
 Introducción

(por ejemplo iTRAQ, “Isotope Tagged Relative and Absolute Quantification”).

Finalmente, un tercer grupo de técnicas en donde se mide la abundancia relativa de los
péptidos precursores en el espectro MS es el marcaje enzimático, en el que las
“etiquetas” son incorporadas por una proteasa en el momento de la digestión
proteolítica, lo que simplifica el protocolo de cuantificación. Un ejemplo de este último
grupo de técnicas es el marcaje del C-terminal con 18O cuando se utiliza tripsina u otros
enzimas (Stewart et al., 2001; Zhang et al., 2013).

El primer método químico de marcaje desarrollado para proteómica cuantitativa

mediante MS fue ICAT (Gygi et al., 1999). Las etiquetas moleculares en ICAT incluyen
tres partes: i) un marcador (biotina) para aislar mediante cromatografía de afinidad
basada en avidina los péptidos “etiquetados; ii) un grupo “linker” (con dos versiones,
una pesada con 8 átomos de 2H y una ligera con 8 átomos de 1H); iii) un grupo reactivo
iodoacetamida, que se une covalentemente con los grupos sulfhidrilo de las cisteínas”
(Leitner & Lindner, 2006; Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013). De este modo, las dos
muestras a comparar se marcan por separado con una de las dos versiones del reactivo
ICAT (la ligera o la pesada), se combinan y se someten a proteolisis con tripsina. Una vez
purificados los péptidos biotinilados (lo que reduce la complejidad de la muestra), se
procede a su separación (2D-LC) y análisis por MS, determinando tanto su cantidad
relativa (MS) como la identidad de las proteínas de origen (MS 2) (Gygi et al., 1999;
Leitner & Lindner, 2006; Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013).

El desarrollo del marcaje ICAT supuso un avance importante en Proteómica

cuantitativa basada en LC-MS/MS, dando origen a nuevas generaciones de reactivos
como el etiquetado isobárico mediante iTRAQ (Ross et al., 2004), su variante mTRAQ
para MRM (“multiple reaction monitoring”), las etiquetas de masa en tándem (“tandem
mass tags” o TMTs), o las etiquetas de proteínas codificadas por isótopos (“isotope-
coded protein labels” o ICPLs (DeSouza & Siu, 2013; Zhang et al., 2013). En cuanto a
iTRAQ, actualmente se han desarrollado hasta ocho reactivos diferentes que permiten
una cuantificación de tipo MS2 (Pierce et al., 2008; Evans et al., 2012). Están formados
por tres regiones: i) el grupo reactivo, procedentes de la N-hidroxisuccimida y que

80
 Introducción

reacciona con el grupo ε-amino de la lisina y el extremo N-terminal; ii) el grupo

compensador, que iguala las masas de los distintos reactivos, de manera que la masa
total de cada uno de ellos sea la misma (isobárico); y iii) el grupo “informador” o
“reporter”, derivado de la N-metilpiperacina. Debido a la naturaleza isobárica de los
reactivos iTRAQ, los mismos péptidos de cada una de las muestras aparecen como un
pico único en el espectro de MS independientemente de la muestra de procedencia,
reduciendo la complejidad de los espectros (en comparación con ICAT). En cambio,
durante la fragmentación de los péptidos precursores por CID (“collision induced
dissociation”), los grupos informadores se liberan (junto con iones de la serie b e y, entre
otros), siendo detectados en una región del espectro de MS 2 de baja relación m/z (113.1;
114.1; 115.1; 116.1; 117.1; 118.1; 119.1; 120.1 y 121.1) y aportando datos sobre la
cantidad relativa del péptido de origen en cada una de las ocho muestras que se pueden
llegar a comparar. De este modo, la comparación de las intensidades de estos iones
“informadores” permite conocer la abundancia relativa del péptido precursor (y por ello
de la proteína) (Lovrić, 2011; DeSouza & Siu, 2013; Zhang et al., 2013). Finalmente,
aunque mucho menos frecuente, también se puede realizar una cuantificación absoluta
de péptidos/proteínas mediante el uso de patrones marcados isotópicamente de
concentración conocida previamente introducidos en las muestras (“spikes”). Estos
estándares pueden ser, por ejemplo, un péptido sintetizado químicamente y marcado
con un isótopo pesado como en AQUA (“absolute quantification”), una proteína artificial
que contenga péptidos correspondientes a 20-30 proteínas diferentes como en QconCAT
(“quantification concatemer”) o bien una proteína concreta marcada isotípicamente
como en PSAQ (Zhang et al., 2013).

2.5.4.-Espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MS) es una técnica analítica de elevada precisión,

exactitud y sensibilidad que permite obtener información sobre el peso molecular y la
estructura de las moléculas y emplea instrumentos (los espectómetros de masas)
formados por tres componentes: i) el sistema de ionización; ii) el analizador de masas;
iii) el detector de iones. Los primeros generan iones en fase gaseosa a partir de mezclas

81
 Introducción

en estado sólido o líquido. Dichos iones atraviesan posteriormente un analizador de

masa, el cual presenta un campo electromagnético en el vacío que permite separar (con
una alta resolución analítica, que llega en algunos casos a distinguir diferencias tan
pequeñas como 0.001 amu) los iones en función de su relación masa/carga (m/z).
Finalmente, los iones son detectados mediante diferentes tipos de detectores y los
datos generados registrados y recuperados posteriormente para poder realizar análisis
manuales o bioinformáticos (Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011).

El desarrollo de sistemas suaves de ionización como MALDI (“Matrix Assisted

Laser Desorption”; Tanaka et al., 1988) o ESI (“Electrospray Ionization”; Fenn et al., 1989)
ha impulsado notablemente los estudios proteómicos gracias a permitir la ionización de
cantidades pequeñas de péptidos y proteínas sin inducir procesos de fragmentación
(Tabla 5). El sistema MALDI genera iones a partir de muestras co-cristalizadas con
matrices sólidas, mientras que el sistema ESI lo hace a partir de muestras en fase líquida
(Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011). En MALDI la mezcla de péptidos (o proteínas) es
combinada con un exceso de una solución saturada de moléculas acídicas pequeñas,
denominada matriz. La mezcla de péptidos y matriz es colocada sobre una placa de
MALDI y dejada evaporar hasta que se forman cristales. La placa es luego colocada en el
espectrómetro de masas y sometida a alto vacío. El impacto de un rayo láser
(normalmente N2; λ= 337 nm) sobre los cristales de las moléculas de la matriz, como el
ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) o, más comúnmente, el ácido 3,5-dimetoxi-4-
hidroxicinámico (ácido sinapínico o SA) o el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA),
provoca la absorción de fotones por sus grupos aromáticos y la transferencia del exceso
de energía y protones a los péptidos de la muestra. De este modo, los péptidos son
proyectados hacia la fase gaseosa en forma de iones positivos, formados por aceptación
de un único protón [M+H]+. Durante la ionización MALDI se produce, además, una
competencia por dichos protones, favoreciéndose la ionización de los péptidos trípticos
que contienen arginina en su c-terminal debido al valor de pKa de su cadena lateral.
Consecuentemente, los valores de cobertura en MALDI-MS no suelen superar el 30-40%
(Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011). Una variante del MALDI es el SELDI (“Surface-enhanced
laser desorption/ionization”), en la que la mezcla de proteínas se coloca sobre una

82
 Introducción

superficie que, o bien está químicamente activada o bien presenta moléculas

capturadoras (por ejemplo, anticuerpos, lectinas, etc.), de modo que se une
específicamente al grupo de proteínas que tenemos interés en analizar (Tang et al.,
2004; Lovrić, 2011).

Por otro lado, en ESI los péptidos (o proteínas) a analizar están en medio acuoso,
de modo que su carga dependerá del pH del medio. Así, a pH ácido la protonación de las
aminas generará una carga neta positiva (modo de iones positivos), de manera que
después de la ionización de los péptidos trípticos mediante ESI se van a producir iones
con una, dos (forma predominante) o tres cargas, dependiendo del tamaño y número de
aminoácidos básicos (Lovrić, 2011). El funcionamiento de las fuentes de tipo ESI (o sus
formas miniaturizadas microESI y nanoESI) se basa en aplicar una elevada diferencia de
potencial a un líquido, de manera que se genera un pulverizado muy fino constituido por
gotas de pequeño tamaño (< 10 μm de diámetro). La muestra, que fluye a través de un
capilar muy estrecho (normalmente procedente de un nanoHPLC), alcanza un cono de
acero inoxidable o aguja. A medida que la muestra abandona dicho cono o aguja se
forma un electropulverizado formado por microgotas que contienes tanto los iones
peptídicos como componentes de la fase móvil (agua, acetonitrilo, ácido acético, etc.). Al
evaporarse estos últimos, el número de cargas en la superficie de las microgotas se hace
demasiado grande, superando el denominado límite de Rayleigh, explotando y
generando microgotas de menor tamaño. Al repetirse este proceso, los péptidos
escapan finalmente de las microgotas y son desolvatados completamente (bien
mediante contracorrientes de gas nitrógeno o capilares calentados) antes de entrar en el
analizador de masas (Zhang et al., 2013).

Los analizadores de masas separan a los iones obtenidos en la fuente (ESI o

MALDI) en función de su relación masa/carga (m/z) gracias a un campo eléctrico o
magnético que tiene efectos directamente proporcionales a la masa del ión e
inversamente proporcionales a su carga. Dicha separación de los iones tiene lugar en el
vacío (10-6 a 10-3 torr), lo que evita la colisión con las moléculas del aire. La resolución de
los analizadores actuales es tal que permite resolver los picos isotópicos de los iones

83
 Introducción

peptídicos o su carga. Los analizadores de masas más usados son el tiempo de vuelo o
TOF (“time of flight”), el cuadrupolo (Q) y las trampas de iones lineales/2D (LIT; “linear
ion trap”), 3D (trampa de Paul o IT), orbitrap (OT) y FT-ICR (“Fourier transform ion
cyclotron ressonance”). En el caso de los experimentos proteómicos basados en geles de
2-DE los espectrómetros de masa más utilizados son de tipo MALDI-TOF, mientras que
en los experimentos proteómicos “gel-free” los espectrómetros más empleados
presentan fuentes de ionización de tipo ESI y suelen presentar más de un analizador de
iones colocado en tándem, que pueden ser del mismo o diferente tipo (analizadores de
masa híbridos). Ejemplos de analizadores de masa en tándem los tenemos en los TOF en
tándem (TOF-TOF), el triple cuadrupolo (QQQ), el doble cuadrupolo (Qq) unido a TOF
(Qq-TOF) o a una trampa lineal (LIT) (Qq-LIT), o la trampa lineal (LIT) conectada con FT-
ICR (LIT-FT-ICR) (Tabla 5). Estos equipos presentan mejor resolución, exactitud,
sensibilidad y versatilidad en el análisis de péptidos y proteínas, permitiendo estudios
tanto de MS como la selección de iones parentales para realizar procesos de
fragmentación (MS/MS) (ver siguiente sección). Por ello, son utilizados para secuenciar y
cuantificar proteínas, identificar PTMs, y en general, para el estudio de muestras
biológicas complejas (Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011).

Los analizadores QqQ, IT y QqTOF se emplean normalmente para la mayoría de

los estudios de fragmentación (MS/MS) en Proteómica. La fragmentación de iones
peptídicos parentales es realizada a través de diferentes metodologías como CID/CAD
(“collision induced dissociation”/ “collisionally activated dissociation”), ETD (“electron
transfer dissociation”), HCD (“higher-energy collisional dissociation”) o ECD (“electron-
capture dissociation”) (Tabla 5). Frecuentemente los iones precursores/parentales que
se fragmentan tienen carga 2+. En la fragmentación CID/CAD los iones parentales se
aceleran adquiriendo una elevada energía cinética y se hacen pasar por una celda de
colisión que contiene un gas inerte como el argón, el helio o el nitrógeno. Durante la
colisión con el gas parte de le energía cinética es utilizada para romper diferentes
enlaces covalente dentro del péptido (sobre todo el enlace peptídico) y generar así
fragmentos mayormente de varios tipos: los iones de la serie “b” (que presentan el
amino-terminal del péptido), los iones de la serie “y” (que presentan en carboxilo-

84
 Introducción

terminal del péptido) y algunos fragmentos neutros. Estos procesos de fragmentación

pueden repetirse en algunos instrumentos como las trampas iónicas, pasando de MS2 a
MSn (Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011).

Tabla 5

Resumen de los principales instrumentos utilizados en MS y de diferentes métodos de fragmentación

Fuentes Analizadores de masas Detectores Fragmentación
ESI Cuadrupolo (Q) SEM: Multiplicador de CID/CAD: collision-induced
electrones secundarios dissociation / collisionally
MALDI Tiempo de vuelo (TOF) activated dissociation
CEM: multiplicador de
SELDI Trampa de iones (IT) HCD: Higher-energy collisional
electrones secundarios
dissociation
Trampa de iones lineal (LIT) tipo canal
o”channeltron” ETD: Electron-transfer
Orbitrap (OT) dissociation

Detector de ECD: Electron-capture

FT-ICR
conversión fotónica o dissociation
Triple cuadrupolo (QQQ)
de centelleo

TOF-TOF Detectores multicanal

Qq-TOF

Qq-LIT

LIT-FT-ICR

Finalmente, los detectores de iones en MS (Tabla 5) tienen como objetivo

registrar la carga inducida o la corriente producida por el flujo iónico procedente del
analizador, amplificarla y transmitir dicha señal al ordenador, donde se digitaliza y se
registra en forma de un espectro de masas. En este espectro de masas son
representados (en el eje de las ordenadas) los valores m/z de los iones peptídicos,
mientras que en el eje de las abscisas aparece reflejada la intensidad de cada uno de
esos iones. Estos espectros pueden ser, de mayor a menor complejidad, de distinto tipo:
i) la denominada traza del detector; ii) los datos en crudo (“raw data”); iii) una lista de
picos (“peak list”); iv) una lista de picos procesada (“processed peak list”) (Cañas et al.,
2006; Lovrić, 2011).
85
 Introducción

2.5.5.- Análisis de los resultados de espectrometría de masas: software y bases de datos

La identificación de proteínas mediante huella peptídica (PMF, “Peptide Mass

Fingerprinting”) es la más simple y utilizada en los análisis proteómicos basados en
geles. Los péptidos proteolíticos procedentes de la digestión con un enzima
(frecuentemente tripsina) de las proteínas de un spot de 2-DE son extraídos y analizados
con un espectrómetro de masas de elevada exactitud analítica (normalmente MALDI-
TOF o ESI-TOF). Dicha lista de valores m/z experimentales (la “huella peptídica”),
relacionada con la estructura primaria de la(s) proteína(s), es comparada con la ayuda de
diferentes herramientas bioinformáticas con espectros (m/z) teóricos obtenidos
mediante la digestión in silico con el mismo enzima de todas las secuencias proteicas
presentes en bases de datos como UniProtKB/Swiss-Prot ([Link] o
NCBI (CNBInr; [Link] En caso de encontrar concordancias, un
listado de proteínas es generado y ordenado de acuerdo con la probabilidad de la
identificación (Hernandez et al., 2006; Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011).

Distintos programas son utilizados en PMF, como MASCOT (Perkins et al., 1999),
ProFound (Zhang & Chait, 2000; Zhang et al., 2002), MS-Fit (Clauser et al., 1999), Aldente
(Palagi et al., 2009), PeptideSearch (Mann & Wilm, 1994), PeptIdent (Wilkins et al.,
1997) o PepFrag (Fenyo et al., 1998). Estos programas emplean diferentes algoritmos
para calificar la similitud entre los valores m/z experimentales y los teóricos, teniendo en
cuenta variables tan dispares como el número de picos teóricos que no están presentes
en el espectro experimental, el número de picos experimentales que no encajan con los
teóricos (debido a procesos como la autolisis de la tripsina o la presencia de otras
proteínas acompañantes o contaminantes como las queratinas o moléculas procedentes
de la matriz), el número de péptidos de la proteína que han sido identificados (es decir,
la cobertura), el nivel de exactitud analítica en las mediciones, la intensidad de los picos
identificados, la presencia de aminoácidos modificados o la desaparición de puntos de
corte durante la digestión proteica. En cualquier caso, una identificación correcta de una
proteína por PMF debe de tener al menos 5 péptidos identificados con una exactitud
analítica mejor que 30 ppm y un 15 % de cobertura de secuencia (Hernández et al.,

86
 Introducción

2006; Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011). El resultado de la búsqueda mediante estos
programas suele ser un listado de proteínas ordenado en función de una puntuación,
valor probabilístico o “score” que indica lo bien correlacionados que se encuentran entre
sí los valores experimentales y los teóricos (Palagi et al., 2006; Lovrić, 2011). En algunos
algoritmos, dicho score está basado únicamente en el número de valores m/z
experimentales que coinciden con los presentes en el espectro teórico, mientras que en
otros como el utilizado por el motor de búsqueda MASCOT se emplean “scores” más
sofisticados como el de similitud MOWSE (“Molecular Weight Search”), que tiene en
cuenta la probabilidad (p) de que la identificación observada se deba a un suceso
aleatorio. Dichas diferencias hacen recomendable el uso de distintos motores de
búsqueda así como enzimas proteólíticos diferentes con el fin de validar los resultados
obtenidos.

En algunos espectrómetros de masa acoplados sobre todo a fuentes de

ionización ESI como las trampas de iones, los triples cuadrupolos, los TOF-TOF, el Qq-
TOF, etc., ciertos iones peptídicos con más de una carga y buena intensidad de señal
(iones parentales) pueden ser seleccionados para ser fragmentados y generar iones
“hijos” (MS/MS) mediante diferentes técnicas como PSD (“post-source decay”), CID/CAD
(“collision-induced dissociation / collisionally activated dissociation”), HCD (“Higher-
energy collisional dissociation”), ETD (“Electron-transfer dissociation”) o ECD (“Electron-
capture dissociation“) (Tabla 5). La fragmentación CID/CAD es la más frecuente, y
consiste en acelerar los iones en fase gaseosa de manera que adquieran una mayor
energía cinética y hacerlos impactar con átomos de moléculas neutrales como argón,
nitrógeno o helio. Aparte de pérdidas neutrales, dos tipos de iones son generados
mayormente en CID/CAD: la denominada serie “b”, que contiene el amino terminal del
péptido original, y los iones más abundantes de la serie “y”, que conservan el carboxilo
terminal. El algunos espectrómetros de masas, como las trampas, estos procesos de
fragmentación pueden sucederse para generar espectros de MS n (Cañas et al., 2006;
Lovrić, 2011). La identificación de proteínas mediante el empleo de estos espectros de
fragmentación MS/MS puede llevarse a cabo empleando cualquiera de las siguientes
aproximaciones: i) Mediante el uso de distintos motores de búsqueda como Mascot,

87
 Introducción

Sequest, ProID, Phenyx, Protein ProPhet, OMSSA, X!Tandem, InsPect, MS-Seq, PepFrag,
Popitam, SpectrumMill, VEMS, Sonar o Andromeda, que realizan un proceso conocido
como PFF o “Peptide Fragment Fingerprinting”, que consiste en la comparación del
espectro de fragmentación experimental con el espectro de fragmentación teórico de
los péptidos producidos mediante digestión in silico de todas las proteínas contenidas en
una base de datos (por ejemplo, UniProt/SwissProt o bases de datos EST) y en la
asignación de un valor estadístico (“score”) a dicha comparación (por ejemplo, XCorr en
Sequest); ii) Mediante programas de búsqueda como MASCOT, que emplean las
denominadas etiquetas de secuencia peptídicas o “peptide sequence tags”, que consiste
en usar la masa del péptido parental así como secuencias primarias cortas procedentes
de la interpretación parcial de los espectros; o iii) Cuando la identificación mediante las
otras dos metodologías no da sus frutos, mediante secuenciación de novo a partir de
espectros MS/MS de alta calidad, tanto de manera manual (lo cual requiere experiencia
y tiempo) como asistida por diferentes programas (PEAKS, SeqMS, Sherenga, Lutefisk,
DeNovoX, PepNovo, SpectrumMill), lo que da origen a secuencias parciales que pueden
ser utilizadas en programas de búsqueda como BLAST (Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011).

PFF es empleado normalmente para identificar, de manera automatizada,

proteínas presentes en mezclas complejas, como las analizadas mediante LC-MS/MS. En
estos análisis el espectrómetro de masas selecciona los iones precursores o parentales
del espectro de barrido (MS o MS1) para su fragmentación posterior (espectros MS/MS o
MS2), lo que genera cientos de espectros MS1 y MS2. Del mismo modo que ocurría con
PMF, PFF sólo es útil si existe información genómica detallada del organismo bajo
estudio. Además, la variabilidad de espectrómetros de masa y de paquetes informáticos
disponibles en estos análisis automatizados genera una variabilidad significativa en los
posibles resultados (aunque los parámetros de búsqueda se mantengan similares), lo
que habla de la importancia que tiene una validación posterior de las identificaciones
mediante secuenciación de novo (manual o asistida). No obstante, tal validación manual
sólo es factible si el número de espectros es pequeño, pero no cuando dicho número se
incrementa a miles de espectros. Por ese motivo, se han desarrollado diferentes criterios
de cribado para intentar separar las identificaciones correctas de las incorrectas, como

88
 Introducción

por ejemplo realizando las mismas búsquedas contra bases de datos revertidas o
aleatorias con el fin de establecer un valor de corte (“cutoff”) a partir del cual poder
estimar la tasa de falsos positivos (FDR; “False Discovery Rate”) en las identificaciones de
péptidos y proteínas (Cañas et al., 2006; Lovrić, 2011; Zhang et al., 2013). Pese a todas
estas mejoras, un problema todavía no resuelto de las metodologías “shotgun” es la
correcta asignación de las secuencias peptídicas a sus proteínas de origen, debido a la
existencia de proteínas homólogas o proteínas que comparten péptidos (Problema de la
Inferencia). De este modo, el uso de tecnologías alternativas (immunoensayos, western
blot, etc.) sigue siendo necesario para la confirmación tanto de datos cualitativos como
cuantitativos de espectrometría de masas. Finalmente, dada la multitud de tipos de
muestras y biomarcadores diferentes o la variabilidad de herramientas disponibles
(fraccionamiento, enriquecimiento, 2-DE, LC-MS/MS, “antibody arrays”, etc.) que se han
mencionado en esta introducción, es claro que el propósito de un estudio proteómico
debe de ser definido con precisión antes de ser acometido, así como las pautas a seguir
y herramientas analíticas a emplear para generar respuestas acordes con los objetivos
planteados (Duncan & Hunsucker, 2006). Un ejemplo lo tenemos en la descripción de la
utilidad de diferentes técnicas proteómicas proporcionada por la Tabla 6.

89
 Introducción

Tabla 6

TIPOS DE BIOMARCADORES Y TÉCNICAS PROTEÓMICAS QUE DEBEN EMPLEARSE PARA SU HALLAZGO

Tecnología

Tipo de 2-DE LC-MS/MS Técnicas basadas en “Affinity arrays”

biomarcador patrones (SELDI)

Proteínas Si Si, vía técnicas cuantitativas Si, aunque la identificación de Si

con como ICAT la proteína que ha dado
abundancia origen al cambio en el patrón
diferencial puede ser difícil

PTMs Sí, si la Si; sin embargo, la No; puede producirse un No

modificación búsqueda es dirigida hacia cambio en el patrón, pero es
produce un un tipo particular de PTMs difícil confirmar que eso sea
cambio debido a una PTM.
notable en
masa o carga

Fragmentos Sí, cuando los Sí, sobre todo cuando los No; puede producirse un Los fragmentos
proteicos fragmentos fragmentos son de cambio en el patrón, pero es no serán
son de medio pequeño tamaño y se están difícil confirmar que se detectados a
a gran analizando por peptidómica origine por proteolisis menos que el
tamaño anticuerpo
reconozca
específicamente
ese fragmento

Variantes Sí, si las Difíciles de encontrar a No; puede producirse un Las variantes
alélicas e variantes menos que estén presentes cambio en el patrón, pero es alélicas o
isoformas alélicas o las en la base de datos de difícil confirmar que eso sea generadas por
generadas isoformas referencia debido a una variante alélica splicing no serán
por splicing producen un o de splicing detectados a
cambio menos que el
notable en anticuerpo las
masa o carga reconozca
específicamente

90
OBJETIVOS
 Objetivos

E l diagnóstico actual de la artritis reumatoide está basado en una serie de

criterios definidos en 2010 por la ACR/EULAR, los cuales han venido a
sustituir a los criterios de la ACR de 1987, que presentaban problemas en la detección de
la enfermedad de reciente comienzo. Estos nuevos criterios de la ACR/EULAR de 2010
siguen siendo criterios de clasificación de pacientes con sinovitis sin causa conocida, no
de diagnóstico, mostrando todavía una moderada sensibilidad (79-84 %) y baja
especificidad (59-64 %). Sin embargo, son unos criterios dinámicos, en el sentido de
estar prevista su revisión en el caso de aparecer nuevos biomarcadores genéticos,
serológicos o de imagen que permitan mejorar su rendimiento. Las aproximaciones
ómicas, como la proteómica, ofrecen una oportunidad sin precedentes a la hora de
buscar paneles de biomarcadores genéticos o proteicos que permitan mejorar el
diagnóstico de la artritis reumatoide, siendo los fluidos biológicos uno de los tipos de
muestras más interesantes para dicha búsqueda. Sin embargo, el análisis sistemático y a
gran escala del proteoma del suero o plasma presenta numerosas dificultades técnicas,
las cuales generan sesgos importantes hacia la detección de proteínas de alta
abundancia. Por este motivo, el presente estudio se inició con un doble objetivo:

1. Desarrollar una metodología de pre-fraccionamiento que permita eliminar con alta

eficiencia inmunoglobulinas y albúmina a partir de grandes volúmenes de suero (1 mL) y
optimizar las condiciones experimentales de los análisis proteómicos basados en geles
bidimensionales (2-DE) para el análisis de las muestras de suero así tratadas.

2. Utilizar dicha metodología para realizar un estudio proteómico comparativo

(cuantitativo/cualitativo) entre muestras de suero de donantes sanos y muestras de suero de
pacientes con artritis reumatoide de reciente diagnóstico (o sin tratamiento) con el fin de
identificar paneles de proteínas con abundancia diferencial que puedan ser candidatos a
biomarcadores de la enfermedad y permitir en el futuro un diagnóstico más temprano de esta
enfermedad.



91
92
MATERIAL & MÉTODOS
 Material & Métodos

1.- OBTENCIÓN DE SUERO

Para la obtención de muestras de suero se seleccionaron individuos caucásicos

de edades comprendidas entre 40-60 años. Las muestras “control” del estudio fueron
recogidas por el Servicio Médico de la USC y las muestras de los “pacientes” por el
Servicio de Reumatología del Hospital Universitario de Santiago de Compostela. La
sangre fue introducida, en ambos casos, en tubos aceleradores de la coagulación
sanguínea BD Vacutainer SST II Advance de 3.5 mL (BD; #367953, LOT 7305374;
Plymouth, UK). Después de 30 minutos a RT, la sangre coagulada se centrifugó a 3,000 x
g (15 min, a 4 ºC) para obtener el suero. Los tubos vacutainer (Figura 17) contienen un
gel separador inerte en el fondo del mismo, que proporciona una barrera entre el
coágulo y el suero de la muestra. El polímero del gel, debido a su densidad, se mueve
durante la centrifugación hacia la parte superior del tubo, formando una barrera entre el
sobrenadante (suero) y el sedimento (coágulo de fibrina y células). El interior de estos
tubos separadores, está recubierto de silicona y partículas de sílice micronizadas que
aceleran el proceso de coagulación.

Figura 17. Tubo BD ® Vacutainer SST

II Advance. Tubos siliconados que
contienen geles que favorecen el
proceso de coagulación y permiten
separar físicamente el suero de la
fracción celular tras un proceso de
centrifugación. En la figura se
muestra el resultado tras el proceso
de coagulación diferenciándose el
coágulo de sangre en la parte
inferior y el suero en la parte
Suero superior.

Coágulo
de sangre

93
 Material & Métodos

Para mantener la estabilidad del suero y siguiendo las recomendaciones de la

HUPO (Rai et al., 2005) se le añadió un cóctel de inhibidores de proteasas (20 µL/mL de
suero) que no contenía AEBSF, debido a los artefactos detectados en 2-DE con el uso de
este inhibidor (AEBSF-free protease inhibitor cocktail [BD; #554779, LOT 37839; UK]: 800
µg/mL de benzamidina HCl, 500 µg/mL de fenantrolina, 500 µg/mL de aprotinina, 500
µg/mL de leupeptina, 500 µg/ml de pepstatina A y 50 mM de PMSF). A continuación se
centrifugaron las muestras de suero a 13,000 x g (10 min, a 4 ºC) para eliminar posibles
precipitados proteicos, para finalmente almacenar las muestras de suero así tratadas en
alícuotas de 1 mL a -80 ºC.

2.- DESCONGELACIÓN DE LA MUESTRA Y CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE

PROTEÍNA

Las muestras de suero fueron descongeladas durante 2h en hielo. Se determinó

la concentración de proteína mediante BCA Protein Assay Kit (Pierce®; Rockford, EEUU)
que se basa en el método del ácido bicinconínico (Smith et al., 1985). Como muestra
patrón fue utilizada Seroalbúmina Bovina (BSA) (Sorensen & Brodbeck, 1986). La
concentración de proteína total en dichas muestras oscilaba entre 70-80 mg/mL lo que
coincide con el rango esperado (66-87 g/L; libro de Bioquímica Clínica y Patología
Molecular de Álvaro González-Hernández, 2010).

3.- FRACCIONAMIENTO DEL PROTEOMA

3.1 KIT DE ADSORCIÓN TIOFÍLICA (PIERCE®)

Este método de cromatografía de afinidad permitió descartar casi todas las

inmunoglobulinas presentes en el suero (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2)
eliminando aproximadamente un 20 % del total de las proteínas séricas (Hardouin et al.,
2007). Se basa en la habilidad que tienen algunas proteínas de unirse a un ligando que
contiene un grupo sulfona en la proximidad de un grupo tioéter. Esta unión recibe el
nombre de unión tiofílica y es promovida por sales no caotrópicas (sulfato amónico o
potásico) debido a su interacción con las moléculas de agua. Se partió de muestras de 1
ml de suero (descongelado), al que se le añadió 87 mg/mL de sulfato potásico. Una vez

94
 Material & Métodos

disuelto, las muestras fueron centrifugadas a 10,000 x g (20 min a 4 ºC) para eliminar las
proteínas precipitadas antes de la cromatografía. El suero así preaclarado fue finalmente
filtrado a través de un filtro MILLEX ® HV de 0.45 µm de Millipore (#SLHV033NS, LOT
R8BN38411; Carrigtwohill, Ireland) antes de pasarlo por la columna. Esta última se vació
del tampón de conservación de la columna y se le añadieron 12 mL de tampón de unión
con el fin de equilibrarla (0.5 M sulfato potásico, 50 mM fosfato sódico, 0.05 % azida
sódica, pH 8). Finalizado este proceso, el suero fue añadido (el volumen no debía superar
los 1.5 mL, ya que la capacidad de la T-Gel era de 20 mg de proteína por cada mL de gel).
Después de cargar la muestra y tras haber recogido la primera fracción no retenida
(FNR1), la columna fue lavada con 39 mL de tampón de unión. Se descartaron estas
nuevas FNR, mientras que la FNR1 (12 mL) fue concentrada y desalada antes de
continuar con el experimento. En este proceso fueron utilizados unidades de filtración
centrifugables Amicon® Ultra-4 de Millipore (10,000 MWCO), siguiendo un protocolo
basado en repetidas centrifugaciones: 4 mL de muestra, 4,000 x g, 15 min a 4 ºC (x3
veces; 12 mL en total); 2 mL de agua destilada, 4,000 x g, 15 min a 4 ºC (x2 veces). Las
proteínas de la FNR eran finalmente resuspendidas en 200-300 μL de agua destilada,
quedando de este modo libres de sales y concentradas antes de guardar a -80 ºC.

El siguiente paso fue añadir 36 mL de tampón de elución (50 mM fosfato sódico,

0.05 % azida sódica, pH 8) a la columna de cromatografía tiofílica con el fin de separar las
inmunoglobulinas captadas por la misma (Fracción retenida o FR). En experimentos
previos de optimización de la columna en los que se siguió el perfil cromatográfico de
elución (fracciones de 3 mL) de las inmunoglobulinas de la columna T-gel mediante
espectrofotometría a 280 nm y cuantificación de la proteína por BCA (Pierce; #23225,
LOT IH114297B; Rockford, EEUU; ver más adelante) se comprobó que la mayor parte de
éstas se separaba de la columna en los primeros 9 mL. Por este motivo, en todos los
experimentos posteriores este fue el volumen de elución de la columna recogido en
tubos BD Falcon® de 15 mL. Estas muestras fueron almacenadas a -20 °C para una diálisis
posterior, ya que la concentración de sales de la muestra de inmunoglobulinas
resultante tras la T-gel (FR) era incompatible con un análisis posterior mediante
electroforesis bidimensional como diversos ensayos nos mostraron. Las muestras de FR
fueron dializadas utilizando una tripa de diálisis con un cutoff de 12 KDa, en un volumen
95
 Material & Métodos

de 3 L de agua destilada (renovada en dos ocasiones) y durante aproximadamente un

periodo de 20h a 4 ºC en agitación permanente. Dado que este proceso diálisis
provocaba una dilución del suero del orden de 10 a 15 veces fue necesario concentrar
las muestras antes de realizar la electroforesis bidimensional. El método de
concentración escogido fue la precipitación mediante acetona, un protocolo simple,
poco costoso y que además de concentrar permitía eliminar cualquier interferente
potencial de la muestra (Görg et al., 2004). A cada volumen de muestra se le añadieron 6
volúmenes de acetona y las proteínas (inmunoglobulinas) se precipitaron toda la noche
a -20 ºC. Transcurrido ese tiempo, las muestras se centrifugaban en frío (4 ºC) a 9,000
rpm durante 30 min. El sobrenadante era retirado y los tubos se dejaban a temperatura
ambiente durante unas horas, de modo que la acetona pudiese terminar de evaporarse.
Por último, el precipitado de inmunoglobulinas era resuspendido en tampón de
rehidratación de IEF (ver más adelante la sección de preparación de la muestra en
Material y Métodos), que permitía la solubilización y desnaturalización de las proteínas.
Se comprobó experimentalmente (datos no mostrados) que cada vez que
precipitábamos en esas condiciones conseguíamos recuperar el 80 % de la cantidad de
proteína inicial. Finalmente, la regeneración de la columna T-gel fue llevada a cabo
añadiendo 15 mL de tampón de regeneración (8 M guanidina-HCl), un agente
desnaturalizante que arrastra cualquier proteína remanente pegada a la columna. Dicho
tampón era eliminado totalmente de la columna para a continuación ser reemplazado
por agua MilliQ. Tras este lavado, la columna era lavada con 6 mL y 3 mL de tampón de
almacenamiento (1 M Tris, 0.05 % azida sódica, pH 7.4), tras lo cual era sellada tanto por
la parte superior como inferior. Este tipo de columnas fueron guardadas en posición
vertical a 4 °C y reutilizadas un número máximo de 5-6 veces, de acuerdo con las
instrucciones de la empresa manufacturadora.

3.2.- RESINA DE AFINIDAD ANTI-HSA (VIVAPURE®)

Este método nos permitió eliminar de manera rápida, sencilla y específica la

albúmina presente en las muestras de suero a las que previamente se les habían
eliminado las inmunoglobulinas mediante cromatografía tiofílica y que suponían una
gran cantidad de proteína inicial (Figura 18). Se partió de 4 mL de resina anti-HSA, a los

96
 Material & Métodos

que se añadieron 10-12 mg de proteína obtenida de la FNR de la T-Gel. La resina fue

incubada con la muestra durante 15 min a temperatura ambiente. Pasado este tiempo
las muestras fueron centrifugadas a 4,000 x g (5 min, a 10 ºC) en tubos centrifugables
vivaspin 6 (0.2 µm, Sartorius; Goettingen, Germany) y el eluido (FNR I) fue recogido.
Seguidamente se añadieron 2 mL de tampón de unión (Tris HCl pH 7.4, 20 mM, NaCl 100
mM) y la resina fue incubada durante 2 min a RT, tras lo cual los tubos fueron
centrifugamos a 4,000 x g durante 15 min (10 ºC). Este proceso fue repetido 2 veces
más, de tal manera que fueron recogidas dos FNR a mayores (FNR II y FNR III). Las
absorbancias de todas estas fracciones no retenidas fueron medidas a 280 nm en todos
los ensayos para obtener un perfil cromatográfico. Para separar la albúmina retenida por
la resina, esta última fue resuspendida en 2 mL de tampón de elución (Gly 0.1 M, a pH
2.8) durante 2 min a RT. El tubo fue centrifugado a 4,000 x g durante 15 min a 10 ºC,
recogiendo un eluido que denominamos fracción retenida I (FR I). Como anteriormente,
este proceso fue repetido 2 veces más, generando las fracciones FR II y FR III. El pH de
estas muestras fue neutralizado añadiendo 400 µl de tampón de neutralización (Tris 1
M, pH 9) y el cambio de pH semicuantitativamente comprobado mediante tiras de pH
comerciales.

Figura 18. Fragmentos de anticuerpos Anti-HSA, que junto a la agarosa de enlaces cruzados, consiguen una
alta capacidad de unión de la albúmina. Vivascience Sartorius group.

97
 Material & Métodos

Tanto las fracciones correspondientes a la FR (I, II y III) como las de la FNR (I, II y
III; 5-6) fueron juntadas formando de este modo dos “pooles” denominados FR y FNR.
Estas muestras fueron desaladas y concentradas mediante tubos centrifugables Amicon®
Ultra-4 (10,000 MWCO, Millipore) siguiendo el siguiente protocolo: añadir un volumen
máximo de 4 mL de muestra al depósito superior del tubo, centrifugación a 4,000 xg
durante 15 min a 4 ºC; adición de otros 2 mL de muestra al depósito superior del tubo y
2 mL de agua destilada, centrifugación a 4,000 x g durante 15 min a 4 ºC; por último,
adición de 2 mL de agua destilada al depósito superior del tubo, centrifugación a 4,000 x
g durante 15 min a 4 ºC y resuspensión final tanto de las muestras FR como FNR en 200-
300 μL de agua destilada. La concentración proteica de dichas muestras desaladas y
concentradas fue cuantificada mediante BCA. Las muestras fueron almacenadas a -80 ºC
para su posterior análisis por 2D-PAGE.

3.3.- ENRIQUECIMIENTO DE PROTEÍNAS MENOS ABUNDANTES EN MUESTRAS DE SUERO

MEDIANTE EL USO DE LIBRERÍAS DE PÉPTIDOS ALEATORIOS: PROTEOMINERTM

Para la aplicación de esta tecnología se siguieron punto por punto las

instrucciones del kit ProteoMinerTM (Bio-Rad; #163-3009, USA). Las muestras (“pooles”
de sueros) deben de tener una concentración de proteína ≥50 mg/mL (la concentración
de proteína se calculó mediante BCA), y han de estar libres de precipitado, es decir
homogeneizadas. Para asegurarnos de este hecho las muestras (1 mL) fueron
centrifugadas a 10,000 x g durante 10 min a RT. En primer lugar se preparó la columna
del ProteoMinerTM. Para ello se introdujo la columna de afinidad en uno de los tubos
específicos del kit, centrifugando a 1,000 x g durante 2 min con el fin de eliminar el
tampón de almacenamiento. Se añadió 1 mL de agua milli-Q, agitando manualmente
durante unos 5 min. Transcurrido ese tiempo, la columna fue centrifugada a 1,000 x g
durante 2 min para eliminar el agua introducida. Por último, la columna fue nuevamente
centrifugada a 1,000 x g durante 1 min para eliminar cualquier resto de agua; una vez
hecho, la columna estaba lista para el siguiente paso: la unión de la muestra a la
columna. Para ello se añadió 1 mL de muestra a la columna, dejándola rotar en un
agitador orbital durante 2h a temperatura ambiente. La muestra fue centrifugada a
1,000 x g durante 2 min y el sobrenadante eliminado. El proceso de centrifugación

98
 Material & Métodos

(1,000 x g, 1 min) fue repetido una vez más para eliminar posibles restos, descartando
nuevamente el sobrenadante. Se añadió 1 ml de tampón de lavado (tampón PBS pH 7.4:
150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4) a la columna, que fue rotada en un agitador orbital
durante 5 min. La columna fue centrifugada nuevamente a 1,000 x g durante 2 min, y el
sobrenadante eliminado. Para descartar posibles restos la centrifugación (1,000 x g, 1
min) fue repetida una vez más, desechando una vez más el sobrenadante. Este paso de
lavado con PBS pH 7.4 fue repetido un par de veces más, empleando un total de 3 mL de
tampón de lavado. Una vez lavada la columna, se procedió a la elución de la muestra
retenida. Para ello se añadió 1 mL de agua milli-Q a la columna y se rotó ésta durante 1
min, centrifugando a continuación (1,000 x g, 2 min) para eliminar el sobrenadante
acuoso. Este proceso fue repetido una vez más antes de añadir 100 µL de tampón de
elución (8 M urea, 2 % CHAPS). Tras agitar la columna durante 5 s, la columna fue
incubada 15 min con el tampón de elución a temperatura ambiente y en agitación. Tras
la incubación, la columna fue centrifugada (1,000 x g, 2 min) y la fracción retenida I (FR I)
recogida. Este paso de elución fue repetido 2 veces más, de tal manera que al final del
proceso habíamos añadido 300 µL de tampón de elución, recogiendo tres fracciones: FR
I, FR II y FR III. Finalmente, juntamos las tres fracciones retenidas en un único tubo (FR) y
las limpiamos de contaminantes y sales indeseadas (que interferían con el proceso de
IEF) mediante el kit 2-D Clean Up de GE Healthcare (Freiburg, Germany) (Marco-Ramell
& Bassols, 2010). Las muestras fueron finalmente congeladas a -80 ºC.

4.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Las proteínas de las fracciones retenidas (inmunoglobulinoma y albuminoma)

como de la fracción no retenida (suero sin inmunonoglobulinas ni albúmina) que van a
ser analizadas mediante 2-DE fueron desnaturalizadas, disgregadas, reducidas y
solubilizadas empleando un tampón de rehidratación basado en urea y la tiourea como
agentes caotrópicos (Rabilloud et al., 1997) y que empleaba CHAPS como detergente no
iónico y DTT como agente reductor. La composición de este tampón en donde se
resuspendieron las muestras fue: Urea 7 M, Tiourea 2 M, CHAPS 4 % (v/v), DTT 3 % (p/v),
IPG buffer 0.5 % (v/v) y trazas de bromofenol. El IPG buffer variaba dependiendo de las
muestras y de las tiras de IEF empleadas posteriormente en la primera dimensión. Así, el

99
 Material & Métodos

tampón empleado para resuspender las proteínas de las fracciones retenidas (FR)
correspondientes con el albuminoma, inmunoglobulinoma y la del kit ProteoMiner (Bio-
Rad) fue siempre el tampón Bio-lyte 3-10 (Bio-Rad). En cambio, en el caso del tampón
rehidratación utilizado para resuspender las proteínas de la FNR (suero sin
inmunoglobulinas ni albúmina) el tampón empleado fue o bien el IPG buffer pH 4-7 de
GE Healthcare (#17-6004-40; LOT 10012127; Freiburg, Germany) o el Bio-lyte 3-10 buffer
(Bio-Rad; #163-2094).

5.- ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

5.1.- PRIMERA DIMENSIÓN

Para la primera dimensión utilizamos gradientes de pH inmovilizados (tiras de

IPG) de distinto tipo en función de la muestra analizada. Así, para el albuminoma e
inmunoglobulinoma se utilizaron tiras de 11 cm pH 3-10 NL de (Bio-Rad), cargadas con
0.5 mg de proteína cada una. En cambio, las proteínas de la FR del ProteoMiner fueron
separadas en tiras de IPG de 11 cm pH 5-8 (Bio-Rad; 0.1 mg de proteína por tira),
mientras que para analizar la FNR (suero sin inmunoglobulinas ni albúmina) se utilizaron
dos tipos de tiras de IPG: 11 cm, pH 4-7 NL (GE Healthcare; 0.5 mg de proteína/tira) ó 17
cm, pH 3-10 NL (Bio-Rad; 1 mg de proteína por tira).

Para rehidratar los geles de las tiras de IPG y facilitar la entrada de las proteínas
dentro de éstos (especialmente las de alto peso molecular) se optó por un método de
rehidratación activo en una placa de IEF; es decir, la muestra en tampón de
rehidratación y la tira de IPG estuvieron en contacto directo durante las 12h que duraba
el proceso en presencia de un bajo voltaje (50 V, 20 ºC). Esta rehidratación activa se
TM
realizó en la PROTEAN IEF cell (Bio-Rad), un instrumento que puede acomodar hasta
24 tiras de IEF de 7 cm o 12 tiras de IEF de 17 cm dentro de bandejas de IEF colocadas a
su vez en el interior de una plataforma Peltier con control de temperatura. Se insertó
una pausa en el programa antes de empezar con la primera fase del IEF. Dicha pausa fue
empleada para colocar dos “wicks” humedecidos en agua milli-Q (uno en cada polo) por
tira de IEF. Dichos “wicks” son pequeños cuadrados de papel de filtro que fueron
empleados para captan restos de sales y otros contaminantes que pudiesen estar
100
 Material & Métodos

presentes en las muestras. Es importante cubrir las tiras con “aceite mineral” para evitar
la pérdida de líquido por evaporación durante el proceso.

Completada la fase de rehidratación y con los “wicks” ya colocados se programó

una primera dimensión dividida en varias etapas: FASE S1 (250 V, 15 min): Este bajo
voltaje favorecía la entrada de las proteínas de mayor tamaño en las tiras de 11 y 17 cm.
FASE S2: Es la denominada rampa de voltaje, que puede ser aplicada de tres modos
diferentes (lineal, rápida o lenta). En nuestro caso se optó por una rampa rápida, que
consistió en alcanzar el máximo voltaje para la migración proteica (8,000 V y 2 h 30 min
para tiras de 11 cm; 10,000 V durante 3h para tiras de 17 cm). FASE S3: En esta etapa
tenía lugar la separación final de las proteínas de acuerdo con su pI, una vez alcanzado el
máximo voltaje. El programa terminaba cuando se llegaba a los 35,000 voltios
acumulados/ hora para tiras de 11 cm, y a los 60,000 voltios acumulados/hora para tiras
de 17 cm. FASE S4: Es la denominada fase de mantenimiento, ya que se aplicaba un
voltaje de 500 V para mantener las proteínas enfocadas dentro de las tiras de IEF una
vez concluido el proceso. Durante todas las fases de la primera dimensión fue
seleccionado un límite de 50 µA por tira, de modo que se minimizaba la reacción de
carbamilación en las proteínas (debido a la presencia de urea en los tampones).

5.2.- EQUILIBRADO DE LAS TIRAS DE IEF

Para permitir la unión del detergente aniónico SDS a las proteínas de cara a la
segunda dimensión y reducir/alquilar los grupos –SH de las proteínas las tiras de IEF se
equilibraron en una carcasa de rehidratación utilizando un tampón de equilibrado con la
composición siguiente: 50 mM Tris HCl pH 6.8, 6 M urea, 30 % (v/v) glicerol, 2 % (p/v)
SDS). Las tiras de IPG se equilibraron en una carcasa de rehidratación en dos pasos y
siguiendo este orden: i) Tampón de equilibrado suplementado con DTT, 10 mg/mL (2 mL
por tira, 10 min en agitación); ii) Tampón de equilibrado suplementado con
iodoacetamida, 25 mg/mL (2 mL por tira, 10 min en agitación). Una vez equilibradas las
tiras, éstas se corrieron directamente o fueron congeladas a -80 ºC para su uso
posterior.

101
 Material & Métodos
5.3.- SEGUNDA DIMENSIÓN: SDS-PAGE

La separación de las proteínas en función de su peso molecular durante la

segunda dimensión se realizó en geles de poliacrilamida de gran formato. Se prepararon
geles con un porcentaje del 12-12.5 %, un grosor de 1.5 mm y un tamaño de 20 x 24 cm.
Para la elaboración de dichos geles se utilizó agua destilada y las siguientes soluciones
stock: 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, solución acrilamida:bisacrilamida (#161-0158) procedente
de laboratorios Bio-Rad (CA, USA) con una concentración de acrilamida del 30 % (p/v)
(37.5:1 acrilamida:bisacrilamida; 2.6 % C) y 10 % (p/v) SDS. La mezcla final consistió en
una solución 375 mM Tris HCl pH 8.8, 12.5 % acrilamida/ y 0.1 % (p/v) SDS, que fue
desgasificada para favorecer el proceso de polimerización. Este último fue iniciado con la
adición de un volumen (6 mL) del stock 10 % (p/v) APS (persulfato amónico) seguido de
la adición de un volumen (83 µL) del stock del catalizador 10 % TEMED (N,N,N´,N´-
Tetrametiletilendiamina). Los geles se dejaron polimerizar al menos 3h, recubiertos por
una solución de isobutanol (2 partes de isobutanol x 1 parte de agua destilada) para que
la superficie del gel fuese totalmente lisa. Tras la polimerización, se colocaron las tiras de
IPG equilibradas (apdo. 5.2 equilibrado, Material y Métodos) sobre la parte superior del
gel, evitando el atrapamiento de burbujas entre ellos. La posición de las tiras de IPG
sobre los geles de la segunda dimensión fue fijada mediante una solución de sellado que
consistía en agarosa 0.5 % (p/v) disuelta en 50 mM Tris HCl pH 6.8 y que contenía trazas
de bromofenol poder visualizar el frente de migración de la electroforesis.

Gracias al gran tamaño de los geles (20 x 24 cm) y para disminuir la variabilidad
técnica se pudieron cargar dos tiras de IPG por gel, una correspondiente a una muestra
de donantes sanos y otra correspondiente a una muestra de pacientes RA, lo que facilitó
también los estudios comparativos. Los marcadores de peso molecular utilizados fueron
los SDS-PAGE Molecular Weight Standars Low Range de Bio-Rad (#161-0304; fosforilasa
B de 97.4 kDa, seroalbúmina bovina de 66.2 kDa, ovoalbúmina de 45 kDa, anhidrasa
carbónica de 31 kDa, inhibidor de tripsina de soja de 21.5 kDa y lisozima de 14 kDa).
Estos fueron aplicados (10 μL) sobre un papel de filtro que se colocó entre ambas tiras
de IPG. La electroforesis se resolvió en el sistema Ettan DALT Six System de GE
Healthcare®, que permitía acomodar hasta 6 geles al mismo tiempo (por lo tanto, 12

102
 Material & Métodos

muestras). El amperaje empleado fue de 85-95 mA (Power Pac 1000, Bio-Rad), y la

electroforesis duró unas 22-23h a una temperatura constante de 15 ºC (MultiTemp III
cooling device de GE). En el caso de los experimentos preliminares para poner a punto la
técnica de 2-DE y en los experimentos de variabilidad (Resultados & Discusión, pág 139)
la electroforesis se desarrolló en el sistema de carcasas Protean II XL 2-D Cell (Bio-Rad).
En este caso la carcasa sólo tenía capacidad para dos geles de 20 x 20 cm, y debido a ese
tamaño en cada gel sólo se pudo analizar una única tira de 17 cm en la que se había
cargado 1 mg de proteína de la correspondiente muestra. La electroforesis se desarrolló
a una temperatura constante de 4 ºC (en cámara fría) y con un amperaje de 15 mA
(Power Pac 1000, Bio-Rad), a lo largo de aproximadamente 22-23h. Los marcadores de
peso molecular utilizados fueron los ya mencionados en este apartado.

6.- TINCIÓN

Para poder visualizar las proteínas de los geles nos decantamos en nuestros
experimentos por dos tipos de tinciones basadas por un lado en la tinción fluorescente
Sypro Ruby (Bio-Rad) y por otro en el colorante orgánico Coomassie G-250. En este
último caso dos protocolos fueron empleados: El denominado Coomassie G-250 “Blue
TM
Silver” y el comercial Coomassie G-250 Bio-Safe (Bio-Rad). Cada gel fue siempre
teñido sólo en contenedores apilables de plástico y en las condiciones adecuadas para
alcanzar la máxima intensidad de tinción. Finalizada la tinción, los geles fueron
guardados al vacío y a 4 ºC en bolsas herméticamente selladas.

Coomassie G-250 “Blue Silver”

Este método fue el más ampliamente utilizado en nuestros ensayos. Se trata de

una modificación de la fórmula original del Coomassie Coloidal G-250 (Neuhoff et al.,
1988; Candiano et al., 2004). Este protocolo presenta una alta sensibilidad (cercana a 1
ng de proteína por banda según los autores, de ahí el nombre de “blue silver”) y buena
linealidad. La mayor sensibilidad se debe al incremento en la cantidad de colorante y de
ácido fosfórico en comparación con el protocolo original de Coomassie coloidal de
Neuhoff, que potencia aún más el estado micelar del Coomassie. Además, la mayor
cantidad de ácido fosfórico reduce aún más el pH, favoreciendo la captación de protones
103
 Material & Métodos

por aminoácidos como Asp y Glu (menor número de cargas negativas en las proteínas) y
permitiendo una mayor unión del Coomassie G-250 mediante interacciones iónicas a
residuos básicos como His, Lys o Arg. Es un protocolo con una alta reproducibilidad
debido a que es un método donde las proteínas son teñidas a punto final; es decir, la
cantidad de proteína es directamente proporcional a la intensidad de tinción (Patton,
2002). Otras ventajas de este tipo de tinción son la insensibilidad a ciertos parámetros
(temperatura, tiempo de exposición, calidad de los reactivos, etc.) y la compatibilidad
con espectrometría de masas.

El protocolo del Coomassie Coloidal G-250 “blue silver” fue el siguiente: i)

Fijación en una solución acuosa que contenía un 50 % (v/v) y un 3 % (v/v) ácido fosfórico
durante al menos 3h (o toda la noche); ii) Lavado con agua destilada en tres etapas de 20
min cada una y un volumen de 400 mL/gel; iii) Incubación de los geles con una solución
acuosa que contenía un 34 % (v/v) de metanol, un 3 % (v/v) de ácido fosfórico, y 17 % de
sulfato amónico durante 1h (330 mL/gel); iv) Tinción añadiendo a la solución anterior
0.35 g/L Coomassie G-250 (disuelto en metanol) y dejando los geles en agitación durante
5 días; v) Transcurrido dicho tiempo de tinción, se procedió a hacer el desteñido de los
mismos con agua destilada (3 lavados con ~ 400 mL de agua destilada, de 30 min cada
uno).

Coomassie G-250 Bio-Safe TM

Este método de detección también estaba basado en el uso de azul de Coomassie

coloidal G-250. Consiste en una solución de tinción comercial lista para su uso que no
requiere la utilización de metanol ni de ácido acético en la solución de desteñido (de ahí
el nombre de Bio-SafeTM (Bio-Rad; #161-0787). Aunque la casa comercial señala que se
trata de un protocolo muy sensible que produce una ratio señal/ruido muy elevada lo
cierto es que su sensibilidad es bastante menor que la alcanzada con el protocolo “blue
silver”. Sin embargo, la solución de tinción Bio-Safe™ fue empleada para teñir los geles
de electroforesis mono- y bidimensionales en muchos de los experimentos preliminares
debido a la simpleza y rapidez del protocolo y al hecho de que no interfiere con la
identificación de proteínas por espectrometría de masas, permitiendo una correcta

104
 Material & Métodos

identificación de las proteínas analizadas. El protocolo consistió en lavar los geles con
abundante agua milli-Q tras la electroforesis, con el fin de eliminar los restos de SDS que
interferían con la tinción. Seguidamente los geles fueron sumergidos en ~ 300 mL de
solución Bio-Safe e incubados durante toda la noche sin agitación. Para desteñir los
geles, se realizaron varios lavados de 30 min cada uno con ~ 350 mL de agua destilada. El
tiempo total de los lavados fue de 4h.

SYPRO®Ruby

Se trata de una solución comercial (Bio-Rad; #170-3125; Molecular Probes, USA)

que viene lista para ser usada (1X). Esta tinción está especialmente formulada para
detectar proteínas analizadas mediante 2D-PAGE con elevada sensibilidad y rango lineal,
siendo además totalmente compatible con espectrometría de masas (López et al., 2000).
Su sensibilidad es igual a la obtenida mediante tinción de plata y mayor que la obtenida
mediante tinciones orgánicas (Berggren et al., 2000). Esta alta sensibilidad fue un
condicionante para su uso en la detección de proteínas en los experimentos con
bibliotecas de péptidos aleatorios (ProteoMiner), ya que la cantidad de muestra que se
podía cargar en los geles era muy limitante. El protocolo que se siguió fue el siguiente: i)
Fijación con una solución acuosa que contenía 40 % (v/v) de etanol y 10 % (v/v) de ácido
acético durante toda la noche (o/n); ii) Tres lavados con ~300 mL/gel de agua destilada
con una duración de 30 min cada uno; iii) Tinción con la solución comercial Sypro Ruby®,
(200 mL/gel) durante al menos 4 h (podía dejarse o/n) y siempre en oscuridad, ya que
como todas las moléculas fluorescentes es fotosensible; iv) Desteñido durante 20 min en
una solución acuosa (300 mL/gel) que contenía 10 % (v/v) de etanol y 7 % (v/v) de acido
acético; finalmente, v) los geles fueron lavados dos veces (~300 mL/gel, 10 min cada
lavado) con agua destilada para retirar el olor a acético.

Esta tinción fue visualizada mediante un transiluminador de luz azul ya que tiene
2 picos máximos de excitación 280 y 450 nm y un máximo de emisión próximo a 610 nm.
Los geles fueron digitalizados a través del analizador de imágines luminiscentes con
cámara Fuji, denominado LAS 3000, que mediante el uso de LEDs (verde: 520 nm, Rojo:
630nm Y azul: 470 nm) permite detectar una gama más amplia de reactivos

105
 Material & Métodos

fluorescentes, como es el caso de SYPRO Ruby (LED azul: 470 nm)

“[Link]
7.- ANÁLISIS DE DATOS

7.1.- ANÁLISIS DE IMAGEN

7.1.1.- PDQuestTM 7.3.1

Los geles fueron digitalizados mediante el escáner calibrado ScanMaker 9800XL

de Microtek a una resolución de 300 dpi y con una escala de grises de 16 bits para tener
un buen rango dinámico. Las imágenes resultantes fueron salvadas en el formato *TIFF,
y analizadas mediante el programa PDQuestTM versión 7.3.1 (Bio-Rad). El PDQuest es un
software informático que permite visualizar, analizar y crear bases de datos a partir de
geles bidimensionales, siendo por ello una herramienta básica para la interpretación de
resultados procedentes de estudios proteómicos de este tipo. Permite, por ejemplo,
desvelar cambios de posición o la existencia de diferencias (tanto cualitativas como
cuantitativas) en spots presentes en los múltiples geles que conforman un experimento
de Proteómica. Como muchos de los programas clásicos de análisis de imágenes de 2-
DE, estos estudios en PDQuest constan de tres etapas: i) detección de los spots
presentes en cada uno de los geles; ii); detectar si un spot en un gel de referencia está
presente o ausente en el resto de los geles de un experimento o bien si ha cambiado de
posición (“matching”); iii) cuantificación de los spots.

Cada una de las imágenes empleadas está compuesta por pequeños píxeles
individuales. Cada píxel representa la posición vertical y horizontal de la imagen
(coordenadas X e Y) y el valor de intensidad del mismo (coordenada Z). Para que una
mancha sea visible y cuantificable, por tanto, la intensidad del conjunto de píxeles de la
misma debe ser más alta que la intensidad del conjunto de píxeles que conforman el
fondo del gel. Por este motivo, el primer paso que seguimos para comenzar un análisis
con este software fue seleccionar las imágenes a analizar, ajustar su tamaño y
orientación y eliminar algo del ruido de fondo (“background”) empleando la herramienta
“Filter Wizard” de PDQuestTM y distintos tipos de filtros (en función del tipo de ruido
observado). Se definieron una serie de parámetros adecuados para poder realizar la

106
 Material & Métodos

detección de los “spots”. Esto último fue posible gracias a la función “Spot Detection
Wizard”, una herramienta que automatiza el proceso de establecer las condiciones de
sensibilidad, tamaño mínimo y tamaño máximo de los spots que queríamos que el
programa reconociese como válidos. A continuación, el programa realizó una detección
automática de todos los spots identificados en cada una de las imágenes.

Tras este paso, fue siempre necesario realizar una detección manual para
seleccionar aquellos spots válidos que el software no hubiese detectado, o para eliminar
otros considerados artefactos. También se empleó las herramientas “Spot Boundary”
para definir aquellos spots de proteínas muy abundantes como la albúmina, A1AT,
transferrina, haptoglobina, etc., que debido a su naturaleza irregular o saturada eran de
más difícil cuantificación mediante un modelado Gausiano (ver Figura 19). Durante este
proceso de detección de los spots también se eliminaron líneas verticales/horizontales
de los geles y se restó el valor de background empleando el método del la pelota
flotante (“floating ball”).

Una vez procesados todos los geles y detectados los spots, las imágenes
originales escaneadas fueron filtradas y procesadas por el programa. De este modo, a
partir de cada imagen original se generó una imagen filtrada y a partir de esta última una
imagen gausiana; es decir, una imagen sintética o virtual sobre la que trabaja el
programa. Este tipo de imágenes gausianas contienen spots gausianos, que son una
representación precisa y tridimensional de los spots originales escaneados. Estas
imágenes gausianas no presentan, sin embargo, aquellos spots existentes en las
imágenes originales pero no en las imágenes filtradas, si bien podían ser añadidos (o
eliminados) a posteriori en dicha imagen gausiana. De este modo, el programa facilitaba
la identificación y cuantificación de aquellos spots borrosos, saturados o solapados cuya
identificación y cuantificación era muy difícil sobre la imagen Raw 2D (imagen original
escaneada).

La cantidad de un spot se corresponde con su intensidad total en una imagen de

un gel bidimensional, la cual es directamente proporcional a la cantidad de proteína
existente en dicho spot. En el caso de los spots definidos mediante las “Boundary Tools”

107
 Material & Métodos

esta intensidad total se corresponde con la suma de las intensidades de los pixeles
dentro de los límites del spot. En cuanto a los spots Gausianos, el programa PDQuestTM
no suma las intensidades de los pixeles dentro de los límites del spot, sino que aplica una
fórmula que le permite cuantificarlos: Altura del spot x π (3.141592..) x σx (desviación
estándar de la distribución Gausiana del spot en la dirección del eje x; expresado en
unidades de imagen) x σy (desviación estándar de la distribución Gausiana del spot en la
dirección del eje y; expresado en unidades de imagen). Una unidad de imagen = 100 μm
o 0.1 mm. A su vez, la altura del spot es el valor del pico de la representación Gausiana,
medido en unidades de densidad óptica (OD; el ScanMaker 9800XL utilizado en nuestros
ensayos trabaja con unidades de OD). De este modo, esta fórmula permitió a PDQuestTM
cuantificar los spots Gausianos y expresarlos en OD x IU2.

El siguiente paso fue la creación de un “Matchset”. La función “Matchset” del

PDQuestTM nos permitió comparar y analizar los spots presentes en todos los miembros
(geles) de un experimento, una vez que éstos habían sido detectados por el programa.
Cada imagen del matchset (denominada miembro) aparecía en forma de imagen
original, imagen filtrada (copia de la imagen original escaneada, filtrada y procesada) e
imagen gausiana. Pero además, PDQuestTM seleccionaba automáticamente uno de los
miembros del matchset como gel maestro (“master gel”) en función de la calidad
promedio de sus spots, y generaba a partir de dicho miembro una imagen maestra
virtual (Master image; Figura 19). Esta última imagen, tras la adición de diferentes spots,
contenía todos y cada uno de los presentes en los diferentes miembros del Matshset.
Por lo tanto, elegimos para nuestro análisis una estrategia de comparar
simultáneamente todos los geles de la situación A (sanos) con todos los geles de la
situación B (enfermos RA), generando una única imagen maestra. Tras crear dicho
Matchset, dio comienzo el reconocimiento de cada uno de los spots presentes en el gel
maestro a lo largo de los distintos geles del estudio. Debido a la complejidad de nuestras
muestras no pudimos trabajar en modo automático, de forma que dicho proceso se
acometió de manera manual mediante el uso de “landmarks”, es decir, spots bien
resueltos para los cuales estábamos completamente seguros que representaban la
misma proteína en todos los geles.

108
 Material & Métodos

A B

AFigura 19. Representación del gel máster (FR delBsuero fraccionado). Podemos observar dos
representaciones, el gel maestro o máster (A) y otro gel cualquiera del análisis, en este caso
S10 (B). El máster es una imagen virtual que contiene todos los spots que se encuentran en
los diferentes geles del experimento; por el contrario el S10 es la imagen original escaneada
(imagen Raw 2D). Todos los spots marcados en la imagen (B) se encuentran representados
en el máster (A).

Una vez concluido este proceso, todos los spots fueron revisados empleando la
función “Spot Review” dentro de las herramientas de análisis de PDQuest TM. Este
programa también permite establecer diferentes clases y grupos con los datos de un
experimento. En nuestro caso, se crearon dos clases (sanos y enfermos), cada una de
ellas compuesta por un determinado número de grupos (9 grupos para el
inmunoglobulinoma y 8 grupos para el estudio con suero sin inmunoglobulinas ni
albúmina). A su vez cada, grupo presentó tres réplicas. Finalizado este proceso, las
cantidades de los spots en cada gel fueron normalizadas. Con la normalización se
eliminaron las variaciones debidas a factores de manipulación como pueden ser errores
de pipeteo, pérdidas de muestra durante el proceso de hidratación activa de las tiras de
IPG, variaciones en el proceso de tinción, errores en la cuantificación, etc. En el método
de normalización elegido (“total density in gel image”) la cantidad de partida de cada
spot en cada miembro del matchset fue dividida por el valor de intensidad total de todos

109
 Material & Métodos

los píxeles de la imagen. Este modo de normalización asume que la intensidad total de
una imagen (fondo+spots) va a variar poco de un gel a otro. Dentro de las herramientas
de análisis de PDQuestTM también empleamos la función Mrai para introducir los valores
de peso molecular y punto isoeléctrico de cada spot y la función “Scatter-plot” para
mostrar el grado de relación entre dos condiciones (por ejemplo, dos geles dentro de la
misma réplica, dos grupos de réplicas o dos clases dentro de un matchset). En este tipo
de análisis la cantidad normalizada de cada spot en la primera condición fue
representada (en escala logarítmica) en el eje X frente a la cantidad en la segunda
condición (eje Y). Este tipo de representaciones venían acompañadas de datos como la
pendiente o el coeficiente de correlación (valores 0-1), lo que nos permitió calcular la
variabilidad inter- e intra-muestral. Finalmente, las herramientas de PDQuestTM
denominadas “Analysis Sets” admitían análisis de tipo cualitativo (spots presentes en
sanos pero no en pacientes o viceversa), cuantitativo (cuantificación relativa; spots que
estaban incrementados o reducidos un número X de veces en pacientes con respecto a
sanos; “fold-change”), análisis booleanos y análisis estadísticos (T de Student, Mann-
Whitney, Wilcoxon, PLS; ver apdo. 7.2 de Material y Métodos).

7.1.2.- REDFINsolo 2-D gel image analysis software

El análisis de imagen de los geles pertenecientes a los ensayos con librerías de

péptidos aleatorios se llevó a cabo mediante el software REDFINsolo 2D, de la casa
LUDESI ([Link] , Sweden). Durante el análisis las
seis imágenes (en formato TIFF) de los geles a estudiar (teñidos con SYPRO®Ruby) fueron
cargadas, analizadas para evaluar su calidad, el tipo de tinción indicado, editadas y el
número de réplicas técnicas indicado. La estrategia que se sigue a la hora de analizar las
imágenes en REDFINsolo 2D es muy distinta a la de PDQuest TM, ya que se basa en la
deformación de la imagen y la detección de todos los “spots” en una única imagen
denominada imagen-fusión. En primer lugar, seleccionamos la imagen de referencia
adecuada para ser utilizada como imagen-fusión. La imagen-fusión, es una imagen
compuesta por todas las imágenes del experimento. Contiene todos los spots presentes
en los geles del análisis y se considera como una imagen maestra o máster. La
deformación de la imagen-fusión significa la alineación de todas las imágenes entre sí

110
 Material & Métodos

mediante algoritmos específicos del programa. A pesar de que esta deformación y

alineación automática de todas las imágenes, respecto a la imagen-fusión, es
determinante para asegurar unos resultados óptimos, siempre es necesario realizar
ajustes manuales, sobre todo en la periferia de los geles, para generar un solapamiento
más perfecto de las imágenes (debe de aparecer como un único gel con algunos spots en
colores ligeramente diferentes)

Una vez comparadas y alineadas todas las imágenes de los geles, el siguiente
paso fue detectar los spots en el máster y en todos y cada uno de los geles del
experimento (diferencias presencia/ausencia). La detección de los spots, en el máster, es
automática, simplemente ajustando la sensibilidad de la detección. También se puede
modificar manualmente en el máster los bordes de cada spot o adicionar o eliminar
spots durante el análisis. En este paso, además, se eliminan todas las interferencias del
análisis como son burbujas, grietas y spots no validos (procedimiento manual). Una vez
establecido el máster y detectados todos los spots, el software permite normalizar
(descartando de esta forma variaciones debidas a factores de manipulación, como
errores de pipeteo, cuantificación etc), eliminar la señal de fondo, filtrar el ruido y crear
los diferentes grupos del análisis (en nuestro caso hubo dos grupos, el “pool” sanos y el
“pool” de enfermos RA). El software REDFIN permite aplicar diferentes test estadísticos,
tanto univariantes (ANOVA, Mann-Whitney) como multivariantes (Análisis de Componentes
Principales), en función de las necesidades de cada análisis (ver siguiente sección).

7.2.- ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

Algunos de los análisis estadísticos fueron llevados a cabo mediante las

herramientas estadísticas existentes dentro de los programas de análisis de imagen
PDQuestTM (Bio-Rad) y REDFINsolo 2D (Ludesi). En el caso de los ensayos de Proteómica
Diferencial realizados con las muestras de inmunoglobulinoma y el ensayo definitivo con
las muestras de suero sin inmunoglobulinas ni albúmina los datos de cuantificación de
los spots en PDQuestTM fueron analizados mediante el programa R ([Link]
[Link]/) (R Core Team, 2012) por la Dra. Rosa María Crujeiras Casais, del
Departamento de Estadística e Investigación Operativa de la Facultad de Matemáticas
de la Universidad de Santiago de Compostela.
111
 Material & Métodos
7.2.1.- Análisis univariante

En los análisis estadísticos llevados a cabo, se consideró como variable respuesta

o independiente (VI) los datos de cuantificación de cada uno de los spots y como
variable dependiente (VD) o factor la variable que define el estado de salud o
enfermedad (VD=0 si sano, S; VD=1 si enfermo, SAR). Para analizar las posibles
diferencias entre la VI en ambos grupos se utilizó un contraste paramétrico (prueba T)
siempre que fuese posible, y un contraste no paramétrico en otros casos (Milton, 2007).

En concreto, se contrastó si la media de la VI era igual (H0; hipótesis nula) o

diferente (H1; hipótesis alternativa) en ambos grupos de la VD, utilizando una prueba T
de Student. Esta prueba paramétrica nos permitió la comparación de medias entre dos
grupos, pero bajo ciertas hipótesis: (1) la variable dependiente seguía una distribución
normal en todos los grupos, con la misma varianza (homocedasticidad); y (2) las
mediciones dentro de cada grupo y entre grupos eran independientes (Milton, 2007).
Dado que se trataba de distintos grupos de individuos (sanos y enfermos), la condición
(2) se verificaba en nuestros experimentos. En caso de que la hipótesis de
homocedasticidad no se cumpliese (varianzas en los grupos diferentes), la prueba T se
podía adaptar para tener esto en cuenta.

Cabe destacar que la prueba T es equivalente, para el caso de dos grupos, al

análisis de varianza (ANOVA), que sirve para comparar las medias poblacionales de una
variable cuantitativa medida en varios grupos bajo los mismos supuestos que la prueba T
(Milton, 2007). EL ANOVA de un factor también nos permitió, dentro del programa de
análisis de imagen REDFINsolo 2D (Ludesi), contrastar la hipótesis nula (H0) de que las
medias poblacionales de la variable independiente (intensidad de cada spot) en los
distintos grupos (sanos y enfermos) coincidían. Para realizar esta prueba, se construyó
un estadístico de contraste (estadístico F) que comparaba la variabilidad interna de los
grupos frente a la variabilidad entre los grupos. Si dicho estadístico de contraste
generaba un valor bajo no había razón para rechazar la H0, pero en caso de ser alto era
indicativo de la existencia de diferencias entre las medias. La determinación del valor
alto o bajo del estadístico se realizó atendiendo a la distribución del mismo, que sigue
una F de Snedecor.
112
 Material & Métodos

Sin embargo, para algunos casos, la variable dependiente no siguió la distribución

normal (lo cual se contrastó mediante un test de Shapiro-Wilk; Milton, 2007). En estos
casos, se utilizaron otros contrastes no paramétricos que permitiesen la comparación de
la cantidad de estos spots entre los grupos. En concreto, se consideró la prueba U de
Mann-Whitney, considerando como hipótesis nula que la distribución de la VD en los
dos grupos era la misma. En caso de tener más de dos grupos, se podía utilizar la
generalización de esta prueba, que es el test de Wilcoxon.

En otras situaciones, fue necesario trabajar con dos variables categóricas o

factores (el caso de la Tabla 28 en Resultados y Discusión; haptoglobinas), en las que el
objetivo fue ver si eran independientes. Los datos se recogieron en tablas de
contingencia, en donde en cada dimensión se colocaron las categorías de las variables de
interés, y en los “cruces” el recuento de individuos de cada tipo. La prueba chi-cuadrado
de independencia permitió abordar este problema (contrastar H0: las variables son
independientes). Sin embargo, esta prueba se basa en la distribución asintótica (número
grande de individuos) del estadístico de contraste. En caso de que el tamaño de muestra
no fuese lo suficientemente grande, o ésta no se encontrase bien balanceada en las
distintas categorías, se utilizó el test exacto de Fisher (Milton, 2007).

En los distintos tests que se aplicaron, se consideró un nivel de significación del 5

%. Por tanto, se rechazó la hipótesis nula cuando el p-valor asociado al estadístico de
contraste fue inferior a este nivel (el p-valor asociado nos da la probabilidad de obtener
valores mayores que el observado, bajo la hipótesis nula).

7.2.2.- Análisis multivariante

En nuestros estudios definitivos con las muestras de suero sin inmunoglobulinas

ni albúmina los datos de cuantificación de los spots obtenidos en PDQuest TM fueron
sometidos a dos métodos estadísticos de análisis multivariante. En concreto, se hizo uso
de un método de reducción de la dimensión (componentes principales) y de un método
de clasificación (análisis clúster jerárquico) (Everitt, 2004).

113
 Material & Métodos

Componentes principales

El método de componentes principales permitió resumir una gran cantidad de

variables correlacionadas en unas pocas componentes principales. Básicamente, el
método buscaba combinaciones lineales de las variables originales que representasen lo
mejor posible la variabilidad presente en los datos. Las componentes principales fueron
dichas combinaciones lineales, que además pudiesen ser utilizadas en análisis
posteriores. Al reducir la dimensión, con la consecuente pérdida de información,
tuvimos que decidir cuántas componentes se consideraban. Para ello, el criterio que se
siguió fue el de la varianza explicada. Otra observación importante es que los resultados
de un análisis de componentes principales dependen de la escala de medida de las
variables originales. Para evitar esta dependencia, se trabajó sobre variables
estandarizadas, lo que equivalía a considerar la matriz de correlaciones en lugar de la
matriz de covarianzas (Everitt, 2004).

Análisis clúster

La técnica de análisis clúster nos permitió agrupar individuos, en grupos no

definidos de antemano, en base a las observaciones de varias variables. En este caso, se
utilizó una técnica de formación de grupos de tipo jerárquico aglomerativo, donde
partiendo de una matriz de distancias entre individuos, se construyó un árbol de
clasificación considerando como grupos iniciales cada uno de los individuos. Para la
asignación de grupos, a partir de los individuos, se consideraron distintas distancias
(mínimo, máximo y promedio) obteniendo resultados similares. Las unidades a clasificar
fueron los individuos del estudio, y las puntuaciones sobre las componentes principales de
los distintos spots para cada uno de ellos fueron las variables consideradas para la
clasificación (Everitt, 2004).

114
 Material & Métodos

8.- IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR HUELLA PEPTÍDICA (PMF)

Los spots de interés en los geles de 2-DE fueron recortados adaptándose

estrictamente a su contorno (1-2 mm de diámetro), con el fin de que no se incrementase
la cantidad de acrilamida en la muestra. Este proceso se llevó a cabo con puntas de
micropipeta amarillas (volumen máximo 200 μL) recortadas y estériles, empleando
guantes, bata y mascarilla para evitar cualquier tipo de contaminación de las muestras
con queratinas, que abundan en el polvo, los cabellos y las huellas dactilares. Estas
muestras se depositaron en tubos eppendorf de 1.5 mL que contenían agua milli-Q antes
de su envío al Servicio de Espectrometría de Masas y Proteómica de la Red de
Infraestructuras de Apoyo a la Investigación y al Desenvolvimiento Tecnológico (RIAIDT).
Una vez en dicho servicio, las proteínas fueron digeridas dentro de los geles (“In-gel”)
con tripsina mediante el kit Montage In-Gel DigestZP de la casa Millipore (USA), en el que
las soluciones empleadas en las diversas etapas son pipeteadas dentro de los pocillos de
una placa y su eliminación es realizada a través del fondo de los mismos pocillos
mediante vacío. Brevemente, el proceso consta de cinco etapas que son: i) desteñido; ii)
deshidratación; iii) corte proteolítico; iv) extracción; v) adsorción en ZipTips. En primer
lugar los fragmentos de gel con las proteínas de interés se colocaron en distintos pocillos
de una microplaca y las proteínas se destiñeron durante 20 min con 100 μL de una
solución de desteñido comercial basaa en acetonitrilo (ACN) y bicarbonato amónico (4
veces). A continuación los geles fueron deshidratados y encogidos mediante el uso de
200 μL 100 % ACN durante 10 min. Las proteínas fueron posteriormente digeridas con
50 μL de una solución de tripsina porcina en bicarbonato amónico (10-150 ng) durante
6h a 37 ºC o bien durante toda la noche (o/n) a 30 ºC. Los péptidos resultantes de la
digestión fueron extraídos mediante la incubación con 50 μL de solución de extracción
(ACN/TFA) durante 30 min, concluido lo cual fueron transferidos mediante vacío a una
nueva microplaca, secados hasta alcanzar un volumen <5 μL en un concentrador
centrífugo de vacío con adaptador de microplacas (SpeedVac), resuspendidos en 10 μL
de solución de lavado ZipTip y desalados en puntas comerciales (ZipTipμC18) acopladas a
micropipetas de 10 μL que contenían una fase reversa C18 para aumentar la calidad de
los espectros. Se establecieron una serie de controles que consistieron en: i) control de
digestión, en la que se difería una proteína conocida (marcador de peso molecular del
115
 Material & Métodos

propio gel); ii) control de contaminantes, en la que se utilizaba una fragmento de gel que
no contenía ningún spot o se omitía incluso éste para poder observar los picos de
autodigestión de la tripsina; iii) control de sensibilidad, en la que se identificaba un
estándar de BSA de muy baja concentración (50 mol).

La identificación por espectrometría de masas de las proteínas presentes en los

spots se realizó mediante huella peptídica (“peptide mass fingerprinting” o PMF)
mediante un espectrómetro de masas Ultraflex III TOF/TOF de la casa Bruker que
combinaba una fuente de ionización MALDI (“Matrix-assisted laser
desorption/ionization”) con un analizador de masas TOF (“Time Of Flight”)/TOF que
permitía determinar con gran exactitud la masa de los péptidos resultantes de la
digestión tríptica. La elución de los péptidos trípticos acumulados en las puntas
ZipTipμC18 se realizó aspirando 2 μL de matriz de MALDI (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico
en ACN/TFA), dispensando los péptidos directamente sobre la placa de MALDI y dejando
secar las gotas antes de la adquisición. Los espectros de masas generados por este tipo
de espectrómetros son sencillos de interpretar, debido a que los péptidos ionizados
contienen por lo general una única carga, lo que reduce el número de picos. Este
instrumento realiza un procesamiento automático de los espectros (substracción del
fondo, suavizado, etc.) y de reconocimiento de cada pico, determinando las masas
monoisotípicas de los péptidos más significativos y descartando algunos contaminantes
como los procedentes de la tripsina, queratinas o polímeros.

La medida de la masa de los péptidos trípticos generó un espectro de masas,

denominado huella peptídica, que es característico de dicha proteína y permite
identificarla de forma inequívoca cuando se compara dicha la huella peptídica obtenida
de forma experimental con la teórica fruto de cortar con tripsina “in silico” la secuencia
de la misma proteína almacenada en las distintas bases de datos disponibles. Dentro de
los diferentes motores de búsqueda disponibles (MASCOT, PepMAPPER, ProFound, etc.)
se seleccionó Mascot Peptide Mass Fingerprint (Matrix Science;
[Link] ). Para
dicha búsqueda se cargó en MASCOT un fichero con la lista de picos procedente del
espectrómetro de masas. Se tuvieron en cuenta no sólo los valores m/z de los

116
 Material & Métodos

principales péptidos sino también la especie de la cual derivaban las muestras (Homo
sapiens) o las bases de datos frente a las cuales se realizaba dicha búsqueda (MSDB, que
desde 2006 no está actualizada, y sobre todo NCBInr, que contiene entradas
procedentes de GenBank CDS translations, PIR, SWISS-PROT, PRF y PDB). En cuanto a las
modificaciones químicas esperables en los péptidos, se consideraron tanto fijas como
variables. Debido a la alquilación de las cisteínas con iodoacetamida, se seleccionó como
modificación fija (presente en todas las cisteínas) el carbamidometil. Por otro lado, como
modificación variable (no presente en todos los aminoácidos) se consideró la oxidación
de la metionina. Como enzima de corte fue seleccionada la tripsina, admitiendo un único
corte perdido. Se utilizó en la identificación por MASCOT una estima del peso molecular
del spot del gel en kDa, una tolerancia admitida en la masa de los péptidos de ± 50 ppm
y se señaló la forma en que los valores de masa de los péptidos eran introducidos (MH +
por utilizar una fuente de ionización MALDI, y valores de masa monoisotípicas).

Los resultados de una identificación por PMF empleando MASCOT mostraban en

primer lugar la proteína que había sido identificada con mayor probabilidad, así como su
masa nominal (Mr), su punto isoeléctrico calculado (pI), el número de péptidos buscados
inicialmente y el número de péptidos que finalmente habían sido encontrados por
MASCOT en dicha proteína (indicando los valores de m/z observados
experimentalmente, los calculados y la diferencia en ppm). MASCOT también indicaba la
ubicación de los péptidos identificados dentro de la secuencia primaria de la proteína y
el valor de cobertura (en %), así como también el número de cortes trípticos perdidos (0
o 1) y las modificaciones consideradas en dicha identificación. Más importante, la
identificación de la proteína por MASCOT iba acompañada de un histograma con una
puntuación (“Probability Based Mowse Score”) que suponía una indicación del grado de
confidencia estadística de la identificación o de la calidad del resultado. Esta puntuación
viene dada por la expresión -10 x Log10(P), en donde P es la probabilidad absoluta. De
este modo una probabilidad de 10-20 se traduce en una puntuación de 200, un valor que
tiene en cuenta factores como la exactitud asumida en las mediciones, el número de
valores m/z (péptidos) utilizados en la búsqueda y el número de ellos identificado en la
proteína (cobertura), el tamaño de la base de datos empleada, la longitud de secuencia
primaria de la proteína, el tamaño de los péptidos identificados, etc. Un valor de
117
 Material & Métodos

puntuación por encima de 65 suponía considerar una identificación como significativa

con un grado de significación de p<0.05; es decir, que la probabilidad de que aún
superado dicho valor umbral esa identificación fuese falsa (falso positivo) era del 5 %.
Finalmente, en cada búsqueda en MASCOT también se indicaba un valor de expectativa
o valor esperado (“expectation value”), equivalente al valor-E en las búsquedas de Blast.
Dicho valor viene definido por el número de coincidencias con puntuaciones iguales o
mejores que se esperaría que ocurriesen simplemente por casualidad, lo cual quería
decir que cuanto menor fuese más significativo debíamos considerar el “Mowse Score”.
Por lo tanto, para dar por buena una identificación el proceso se repitió varias veces (con
spots procedentes de diferentes geles), se trabajó con varias bases de datos (NCBInr,
MSDB) y se tuvo en cuenta la existencia de un número elevado de péptidos reconocidos,
la existencia de una buena cobertura, unos valores de peso molecular y pI teóricos
cercanos a lo observado en los geles y, lo más importante, el Mowse score y el valor
esperado.

118
RESULTADOS & DISCUSIÓN
 Resultados & Discusión

Las muestras más frecuentes en el laboratorio clínico son el plasma y el suero,

dado que su obtención es mínimamente invasiva. El estudio de su proteoma resulta muy
interesante, debido a la presencia de numerosas especies proteicas (con un abanico muy
amplio de concentraciones) capaces de aportar datos interesantes sobre el estado
fisiopatológico del organismo (Pando-Robles & Lanz-Mendoza, 2009; San Miguel-
Hernandez et al., 2010). El número de proteínas que conforman el proteoma del plasma
o suero está creciendo constantemente, sobre todo gracias a metodologías modernas
que han ido ganado peso en este tipo de estudios proteómicos, como la cromatografía
líquida multidimensional acoplada a espectrometría de masas (“shotgun proteomics” o
MudPIT). Así, el último listado proporcionado por el Proyecto del Proteoma del Plasma
humano (PPP; “Plasma Proteome Project”) de la HUPO (“Human Proteome
Organization”) arroja un número de 1929 proteínas recogidas en el “PeptideAtlas”
(Farrah et al., 2011) ([Link] Sin embargo, la
electroforesis bidimensional (2-DE) (O´Farrell, 1975; Klose, 1975) sigue siendo una de las
técnicas más profusamente utilizadas en Proteómica de fluidos biológicos, y ello pese a
algunos problemas que dificultan su aplicación y que favorecen la visualización de las
proteínas más abundantes en detrimento de las más infrecuentes: grado de resolución,
reproducibilidad, incompatibilidad con proteínas hidrofóbicas o de puntos isoeléctricos
extremos y sobre todo el pequeño rango de concentraciones de las proteínas detectadas
tras la tinción (no más de 3 órdenes de magnitud), (Corthals, 2003).

La razón del uso estriba en que la 2-DE sigue siendo especialmente adecuada si
se trabaja con muchas muestras, si el objetivo del análisis proteómico es resolver
mezclas complejas de proteínas en un solo paso y si se pretende la obtención de datos
cuantitativos en un contexto, en donde existe un elevado polimorfismo en las proteínas
debido a causas genéticas o postraduccionales (glicosilación, oxidación, fosforilaciones)
(Pando-Robles & Lanz-Mendoza, 2009; San Miguel-Hernandez et al., 2010). Además, en
el caso de fluidos biológicos como el plasma o el suero apenas existen proteínas
hidrofóbicas o con puntos isoeléctricos extremos, mientras que otros problemas de la 2-
DE como la reproducibilidad pueden ser parcialmente solucionados con el uso de tiras
comerciales de gradientes inmobilizados de pH. Más problemático resulta el bajo rango
119
 Resultados & Discusión

dinámico de concentraciones detectadas por 2-DE, que contrasta con los más de 10-11
órdenes de magnitud de concentraciones de proteínas del suero (ej., 40 mg/mL de la
albúmina a los 0.4-4 pg/mL de una citoquina), muy superior al que se puede encontrar
en tejido u otros fluidos biológicos. Para solucionar estos problemas, han sido
desarrollados varios sistemas de simplificación de la muestra, como la cromatografía de
afinidad o las librerías peptídicas. Esta tesis está centrada precisamente en el desarrollo
de una nueva metodología de fraccionamiento de muestras de suero y en su aplicación
en conjunto con la electroforesis bidimensional al caso particular de la Artritis
Reumatoide.

1.- MUESTRAS DE SUERO. VARIABLES PREANALÍTICAS Y ELIMINACIÓN DE

INMUNOGLOBULINAS MEDIANTE ADSORCIÓN TIOFÍLICA (T-GEL)

El PPP de la HUPO emplea EDTA-plasma para sus estudios, debido a que

observan menos degradación ex vivo y variabilidad en los datos al no tener lugar el
proceso de coagulación, durante el cual son liberadas algunas sustancias intracelulares
procedentes de plaquetas (K+, LDH) normalmente no presentes en el plasma in vivo. Sin
embargo, es nuestro estudio se van a emplear muestras de suero, que se obtienen tras
recoger la sangre en tubos siliconados que contienen geles que favorecen el proceso de
coagulación y permiten separar físicamente el suero de la fracción celular tras un
proceso de centrifugación. La razón del uso de muestras de suero reside en que las
posibles proteínas procedentes de plaquetas son, en realidad, muy poco abundantes;
(Ray et al., 2011), pero sobre todo, en la ausencia de los factores que intervienen en la
coagulación sanguínea, lo que supone una gran simplificación de la muestra
(Thadikkaran et al., 2005) (por ejemplo, al eliminar el fibrinógeno, una proteína con una
concentración en plasma de 2-4 mg/mL).

Como se comento en el aptdo. 1 de Material y Métodos para reducir la

variabilidad analítica, las muestras fueron recogidas en tubos BD Vacutainer® SSTTM II
Advance del mismo lote y aproximadamente a la misma hora de la mañana, evitando así
posibles variaciones circadianas. También se tuvieron en cuenta otros aspectos que
afectaban a la variabilidad biológica (edad, sexo, raza, embarazo, dieta, ejercicio, estrés,
120
 Resultados & Discusión

fármacos), y cuestiones técnicas como la postura a la hora de la extracción o el tiempo

de aplicación del torniquete. Las muestras de suero fueron cuidadosamente
transportadas a temperatura ambiente con los tubos en vertical, para evitar procesos
hemolíticos (si estos se producían, las muestras eran descartadas). Finalmente, se añadió
un cóctel de inhibidores de proteasas (aptdo. 1 de Material y Métodos) para evitar la
degradación de las proteínas séricas antes de ser congeladas (Tabla 7).

Tabla 7. Condiciones probadas para la preparación de muestras y análisis 2-DE

Tipo de muestras: sueros de pacientes con RA/donantes sanos (caucásicos).

Hora de extracción: 9-10h.

TM
Tubos: 3.5 mL BD Vacutainer® SST II Advance (lot #526629C). 30 min de coagulación (RT).
Descartando procesos hemolíticos.

Manipulacion de las muestras: 3,000 xg (15 min, 4 ºC).

Eliminación de restos celulares: 13,000 xg (15 min, 4 ºC).

Tiempo de procesamiento: 1h después de la flebotomía.

Cocktail de inhibidores de proteases (BD) w/o AEBSF: añadido al suero.

Almacenaje: alicuotas de 1 mL, -80 ºC, no más de 4 semanas. Descongelación (2h en hielo).

A pesar de la ventaja que supone la reducción del número de proteínas en el

suero con respecto al plasma, el rango dinámico de concentraciones de proteínas sigue
siendo todavía demasiado elevado como ha demostrado el grupo de Anderson
(Anderson & Anderson 2002; Pieper et al., 2003). Esto dificulta la identificación y
cuantificación de todos sus constituyentes, especialmente los que están presentes en
unas pocas copias, que conforman más del 50 % de las proteínas del proteoma del suero
(Boschetti et al., 2008). Este es un gran problema hoy en día, junto con la complejidad

121
 Resultados & Discusión

de las muestras derivada del procesamiento alternativo de proteínas, las numerosas

variaciones postraduccionales, etc. En Proteómica no hay métodos como la PCR en
ácidos nucleicos que nos permitan “amplificar” las proteínas poco abundantes y poder
así analizar el “proteoma profundo”. Por esta razón, el mismo set de proteínas
abundantes (muchas de ellas reactantes de fase aguda) suelen aparecer una y otra vez
identificadas en los análisis proteómicos.

Una de las estrategias de la proteómica moderna es la eliminación de las

proteínas con mayor presencia en fluidos biológicos como el suero (Faca et al., 2007;
Ettorre et al., 2006). Dos grandes fracciones predominan en el suero sanguíneo, la
albúmina y las globulinas, que dan cuenta del 60-80 % del total de las proteínas séricas.
Así, la eliminación de al menos estas dos familias es un requisito imprescindible para la
obtención de buenos resultados en la búsqueda de marcadores biológicos en suero
mediante técnicas proteómicas (Fountoulakis et al., 2004).

La albúmina es la proteína más abundante del suero (40-60 % del total), y tiene
un peso molecular de 68.5 kDa (Figura 20; HSA), mientras que el resto está constituido
por las globulinas (α1-, α2-, β- y γ-globulinas). La mayor parte de las γ-globulinas son
inmunoglobulinas, las cuales representan el 20 % (8-26 %) de las proteínas totales del
suero. Existen 5 clases de inmunoglobulinas, siendo la IgG (70 %; 6-16 g/L), la IgA (10-15
%; 0.8-4 g/L) y la IgM (5-10 %; 0.5-2 g/L) las más abundantes en comparación con la IgD e
IgE. Todas ellas están formadas por cadenas ligeras de dos tipos (κ y λ) unidas por
puentes disulfuro a las cadenas pesadas, que son de 5 tipos (γ, α, μ, δ y ε) y dan origen a
las distintas clases de inmunoglobulinas. Como ilustra la Figura 20, dos grupos de spots
relacionados con las inmunoglobulinas predominan en el proteoma del suero humano:
las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de clase G (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4)
(indicadas por la letra H), de un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, y las
cadenas ligeras κ y λ de las inmunoglobulinas, con un peso molecular de
aproximadamente 25 kDa (indicadas por la letra L).

La mayor parte de las metodologías comerciales disponibles actualmente para la

eliminación de proteínas abundantes del plasma o suero tienen como dianas principales
122
 Resultados & Discusión

Figura 20. Análisis del proteoma del suero humano mediante 2-DE. 0.5 mg de proteína en
tiras de 11 cm, pH 3-10 NL para la 1D, la 2D se resolvió en la carcasa Ettan Dalt Six en geles
continuos cuya concentración de acrilamida fue la siguiente: 30 % A-0.8 % B, finalmente los
geles fueron teñidos con Coomassie G-250 blue silver. La albúmina (68.5 kDa), aparece
indicada como HSA (Human Serum Albumin). Las cadenas pesadas de la IgG (50 kDa) están
señaladas con la letra H (“Heavy”), mientras que las cadenas ligeras κ y λ de las
inmunoglobulinas (25 kDa) están destacadas con la letra L (“Light”). Ambas (HSA e
Inmunoglobulinas) son las proteínas más abundantes del suero.

123
 Resultados & Discusión

la albúmina y la IgG (Tabla 8; con lo que logran descartar aproximadamente un 80 % de

las proteínas. Algunas metodologías, como las comercializadas por Agilent (Human 14
multiple Affinity Removal Spin Cartridge), Beckman Coulter (ProteomeLabTM IgY-12 High
Capacity SC), R&D (Proteome PurifyTM 12) y especialmente Sigma (ProteoPrep® 20
Plasma Immunodepletion Kit) logran incrementar el número de proteínas mayoritarias
eliminadas hasta las 12-20, incluyendo entre éstas la albúmina, IgG, IgA, IgM, IgD,
transferrina, fibrinógeno, α2-macroglobulina, α1-antitripsina, haptoglobina,
orosomucoide, Apo A-I, Apo A-II, Apo B, ceruloplasmina, complemento C1q,
complemento C3, complemento C4, transtirretina y plasminógeno, con lo que se
consigue una depleción del 99 %. Estas metodologías resultan, pues, muy interesantes,
sobre todo si se tiene en cuenta la simplificación de la muestras original (la 2-DE puede
resolver típicamente 1,000-2,000 proteínas en un gel) y que los posibles biomarcadores
van a concentrarse en esa fracción de proteínas restantes que constituye menos del 1 %
de las proteínas del plasma/suero (Anderson & Anderson 2002). Aunque algunos de
estos sistemas comerciales están disponibles en formato de columna de cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC). Este formato en “spin column” presenta una baja
capacidad, aceptando volúmenes de muestra que van desde los 5 μL hasta los 180 μL.
Ello supone un serio inconveniente, puesto que un biomarcador del cáncer de próstata
como el antígeno prostático (PSA), una proteasa de la familia de las kalicreínas tisulares
similar a la quimotripsina, tiene una concentración en sueros no patológicos <4 ng/mL. Si
tenemos en cuenta que la sensibilidad máxima de la 2-DE es de 1 ng de proteína por
spot (por ejemplo, con SYPRO® Ruby), está claro que se necesitan manejar volúmenes
iniciales de muestra muy superiores a los 180 μL a los que ofrecen los métodos actuales
o bien emplear otras metodologías proteómicas más sensibles alternativas a la 2-DE. Por
todo ello, al comienzo del proyecto nos planteamos como primer objetivo, el desarrollo
de un método de eliminación de inmunoglobulinas y albúmina que pudiese trabajar con
muestras de 1 mL de suero.

124
 Tabla 8. Algunos kits comerciales disponibles para la eliminación de varias proteinas abundantes del suero/plasma.

Empresa Nombre del kit Número de proteínas eliminadas Formato Reutilización y volumen de muestra

(14) Eliminación especifica de 14 proteinas altamente

abundantes, mediante cromatografía de afinidad:
Human 14 multiple
Albúmina, IgG, IgA, IgM, transferrina, fibrinogeno, α2- Columna Cada cartucho puede usarse unas 200 veces,
Agilent Affinity Removal Spin
macroglobulina, α1-antitripsina, haptoglobina, centrifugable 8-10 µL/cada vez.
Cartridge
orosomucoide, Apo A-I, Apo A-II, factor C3 complemento y
transtirretina.
(12) ) Eliminación de 12 proteinas altamente abundantes,
mediante cromatografía de afinidad con anticuerpos Cada columna puede usarse al menos 100
ProteomeLabTM IgY- Columna
Beckman Coulter especificos IgY: (Albúmina, IgG, IgA, IgM, transferrina, veces,
12 High Capacity SC centrifugable
fibrinogeno, α2-macroglobulina, α1-antitripsina, 20 µL/cada vez.
haptoglobina, orosomucoide, Apo A-I y Apo A-II.
Aurum Serum Protein (2) eliminación mediante cromatografia de afinidad de Columna
BioRad 10 muestras de 60 µL/cada vez.
Mini kit Albúmina (Resina Affi-gel blue) e IgG (Affi-Gel Protein A). centrifugable
ProteoExtract®
(2) Albúmina (resina basada en anticuerpos no específicos 10 muestras de 60-180 µL/cada vez,
Calbiochem Albumin/IgG 2 columnas
de HSA) e IgG (resina basada en proteina A). (reutilizable 10 veces).
Removal kit, Maxi

125
Albumin and IgG Columna
GE Healthcare (2) Resina específica para Albúmina e IgG. 10 muestras de 10-15 µL/cada vez.
Removal Kit centrifugable
TM
ProteoSeek
Thermo Scientific Antibody Based (2) Albúmina (resina con anticuerpos especificos HSA) e IgG Columna
12 muestras de 10 µL/cada vez.
Pierce Albumin/IgG (resina basada en anticuerpos especificos IgG). centrifugable
Resultados & Discusión

Removal kit
TM
ProteoSeek
Thermo Scientific (2) Albúmina (cromatografia de afinidad) e IgG (Resina Columna
Albumin/IgG 25 muestras de 10 µL/cada vez.
Pierce basada en proteina A). centrifugable
Removal kit
Qproteome
(2) Anticuerpos monoclonales específicos unidos a un Columna
Qiagen Albumin/IgG 6 muestras de 25 µL/cada vez.
soporte sólido para eliminar tanto la albúmina como la IgG. centrifugable
Depletion Kit
 Tabla 8 (Continuación).

Empresa Nombre del kit Número de proteínas eliminadas Formato Reutilización y volumen de muestra

(12) Eliminación de 12 proteinas

altamente abundantes, mediante
cromatografía de afinidad
TM
Proteome Purify (albúmina, IgG, IgA, IgM, Columna
R&D 20-40 muestras de 10-15 µL/cada vez.
12 transferrina, fibrinogeno, α2- centrifugable
macroglobulina, α1-antitripsina,
haptoglobina, orosomucoide, Apo A-
I y Apo A-II.
(2) Albumin (Fagmentos de
12 muestras de 20 µL/cada vez
Vivapure anti- anticuerpo específico para albúmina, Columna
Sartorious (se pueden procesar volúmenes más grandes mediante el uso de resinas y
HSA/IgG kitr acoplado a soporte sólido) e IgG centrifugable
columnas centrifugables más grandes).
(resina basada en proteina G).
(20) Affinity-purified polyclonal IgGs
and small recombinant
immunoaffinity ligands based resin

126
that specifically removes 20 highly
abundant proteins: albúmina, IgG,
ProteoPrep® 20 IgA, IgM, IgD, transferrina,
Plasma fibrinogeno, α2-macroglobulina, α1- Columna Cada columna puede reutilizarse unas 100 veces,
Sigma
Immunodepletion antitripsina, haptoglobina, centrifugable 5 µL/cada vez.
Kit orosomucoide, Apo A-I, Apo A-II,
Apo B, ceruloplasmina,
Resultados & Discusión

complemento factor C1q,

complemento factor C3,
complemento factor C4,
transtirretina y plasminogeno.
ProteoPrep® Blue (2) Albúmina (eliminación mediante
Columna
Sigma Albumin&IgG cromatografía de afinidad) e IgG 25 muestras de 100 µl/cada vez.
centrifugable
Depletion Kit (resina basada en proteina G).
 Resultados & Discusión

Varios son los métodos que permiten la eliminación de las inmunoglobulinas de una
mezcla de proteínas compleja como el proteoma del suero (Tabla 8). Como se puede ver,
algunos de estos protocolos se basan en resinas de afinidad que emplean anticuerpos
específicos para las principales clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA y la IgM. Estos
métodos son muy eficientes, pero caros y con poca capacidad de carga (20-50 µL/suero).
Por otro lado, un gran número de kits utilizan la proteína A, la proteína G, la proteína L o
proteínas recombinantes de fusión que incluyen los dominios de unión a IgG de las
proteínas A y G, (proteína A/G). Estas proteínas, procedentes de bacterias como
Staphylococcus aureus (Proteína A y Proteína G) o Peptostreptococcus magnus (Proteína
L), son útiles debido a que poseen varios centros de unión de alta afinidad y selectividad
por las inmunoglobulinas, bien a través de la región Fc (Proteína A, proteína G o proteína
A/G) o las cadenas ligeras κ (Proteína L). Sin embargo, las columnas basadas en resinas
que contenían proteínas A, G o A/G seguían presentando una pobre capacidad de carga.
Además, tanto las proteínas A, G como la A/G unen la clase IgG de las inmunoglobulinas,
pero presentan escasa afinidad por IgA, IgM e IgD (Tabla 9). En contraste, la proteína L sí
permitía capturar IgG, IgM, IgA, IgE e IgD (Tabla 9), aunque sólo aquellas que poseyesen
las cadenas ligeras κ apropiadas.

Tabla 9. Características de unión a las inmunoglobulinas de las proteínas A, G, A/G y L*

*Tabla adaptada de Pierce ([Link] W (unión débil),

M (unión media), S (unión fuerte), NB (no unión).

127
 Resultados & Discusión

Sin embargo, una tercera vía quedaba todavía por explorar, las matrices tiofílicas,
desarrolladas por Porath y colaboradores (Porath et al., 1984). De forma general, estas
matrices tiofílicas (T-Gel) se han empleado para la purificación de inmunoglobulinas a
partir de sobrenadantes de cultivo de hibridomas o a partir de suero o ascites en
condiciones suaves. La fase sólida en esta cromatografía consiste en esferas de agarosa
activada con divinilsulfona acopladas con 2-mercaptoetanol (Hardouin et al., 2007). Su
uso se basa en la capacidad que presentan algunas proteínas como las inmunoglobulinas
para unirse a un ligando inmobilizado que contiene un grupo sulfona y un grupo tioéter
próximo (Figura 21) en presencia de altas concentraciones de sales liotrópicas como el
sulfato potásico (0.5 M en nuestro caso) o sulfato de amonio. Dichas sales interactúan
con las moléculas de agua, lo que promueve la interacción de las γ-globulinas con el
ligando. Se trata, pues, de una variación basada en una resina de la precipitación rápida
de inmunoglobulinas mediante sulfato amónico.

Figura 21. Estructura de un grupo tiofílico

anclado a una “bead” de agarosa. Imagen
extraída de VWR
([Link]
p?product_id=8085803).

La gran ventaja de los geles tiofílicos en relación a los métodos anteriores estriba
en que estas resinas de afinidad no están basadas en proteínas (ej., anticuerpos,
proteína A, etc.), que pudiesen ser liberadas a la muestra. Presentan un bajo coste,
pueden ser reutilizados varias veces y su especificidad isotípica es bastante amplia,
puesto que se unen fuertemente a la mayoría de clases de inmunoglobulinas así como a
todas las subclases de IgG (IgG-IgG4). Sabíamos, además, que otra proteína mayoritaria
del suero, la α2-macroglobulina, también era retenida por cromatografía tiofílica, lo que
resultaba una ventaja en nuestro caso (Hardouin et al., 2007). Los geles tiofílicos tienen
un manejo simple y rápido, y se caracterizan no sólo por tener una alta capacidad de
carga (1-1.5 mL de suero), sino también por una amplia capacidad de recuperación, de
128
 Resultados & Discusión

modo que la fracción retenida por la columna (inmunoglobulinas) puede ser eluída con
tampones cercanos al pH neutro y baja fuerza iónica y así ser fácilmente analizada
posteriormente mediante electroforesis uni- o bidimensional. Se puede concluir, por
tanto, que este tipo de matrices resultaban idóneas en principio para la eliminación de
las inmunoglobulinas de muestras de suero, para estudios proteómicos.

Por todo lo anteriormente expuesto, en nuestros estudios las inmunoglobulinas

(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1 e IgA2) fueron sistemáticamente capturadas de
muestras de 1-1.5 mL de suero filtrado (MILLEX ® HV de 0.45 µm de Millipore) mediante
cromatografía de afinidad con columnas comerciales basadas en geles tiofílicos (Pierce
Thiophilic Adsorbent and Adsorption Kit). La Figura 22 muestra el patrón característico
de elución a 280 nm tanto de las fracciones no retenidas por la columna (FNR; suero sin
inmunoglobulinas) como de las retenidas (RF; principalmente inmunoglobulinas). Para
impedir la unión de proteínas de bajo peso molecular a proteínas transportadoras como
la albúmina o las inmunoglobulinas, este tipo de ensayos fueron realizados también en
presencia de un 20 % de acetonitrilo, pero finalmente el perfil cromatográfico no se vio
afectado. Debido a la alta concentración de sales (sulfato potásico 0.5 M), las muestras
de FNR fueron concentradas y desaladas utilizando tubos Amicon® Ultra-4 (Millipore)
antes de continuar con la siguiente etapa (la eliminación de la albúmina). En cambio, las
muestras de FR, eluídas mediante una tampón con baja fuerza iónica (50 mM fosfato
sódico, 0.05 % azida sódica, pH 8), fueron simplemente dializadas frente a agua destilada
y posteriormente concentradas empleando un protocolo de precipitación con acetona.
Tras la cromatografía tiofílica, se calculó la concentración existente de proteínas
tanto de la fracción retenida por la columna (FR; inmunoglobulinas) como en la no
retenida (FNR). Se utilizó el método colorimétrico del ácido bicinchonínico (BCA) en
microplaca a 550 nm (rango de lectura: 540-590 nm), debido a su gran linealidad (20-
2,000 µg/mL) y a que está menos afectado por diferencias en composición de proteínas
de muestra a muestra que metodologías similares.

129
 Resultados & Discusión

Elution pattern of NRF and RF

4
A280 nm

0
0 2 4 6 8 10 12 Figura 22. Perfil de elución de las fracciones
NRF no retenidas y retenidas por la columna de
4
cromatografía tiofílica.
A280 nm

0
0 2 4 6 8 10 12
RF
water
ACN

De este modo, determinamos el rendimiento de la columna. Como se puede

observar en la Tabla 10, que muestra resultados típicos de un ensayo perfectamente
extrapolables a otros ensayos, el 25 % de la proteína cargada se recuperó como FR; es
decir, las inmunoglobulinas unidas por la columna. En cambio, un 68 % de las proteínas
se recuperaron como FNR (proteínas de la muestra inicial, una vez eliminadas las
inmunoglobulinas). También hubo una cierta pérdida de proteína inicial en el proceso,
pero ésta fue mínima y siempre menor del 10 %.

Tabla 10. Rendimiento de la columna T-Gel (experimento tipo)

Concentración
Proteína Total
de Proteína Rendimiento (%)
(mg)
(mg mL-1)
Suero Inicial 56 56 100
FNR 91.60 38.8 68.75
FR 41 14.25 25.44

130
 Resultados & Discusión

Tras los análisis mediante 1-DE (Figura 23) ambos tipos de muestras (FR y FNR)
fueron analizadas también mediante 2-DE con el fin de visualizar la eficacia del proceso

ST FNR FR

Figura 23. Electroforesis unidimensional de la FR y FNR tras la T-Gel

Figura 23. Electroforesis unidimensional de la FR y FNR tras la T-Gel.

de eliminación de las inmunoglobulinas mediante cromatografía tiofílica. En línea con lo

esperado, la Figura 24 muestra un resultado típico en el que se compara el proteoma del
suero antes y después de ser sometida la muestra a cromatografía con geles tiofílicos. Se
puede apreciar tanto las cadenas pesadas de la IgG (H) como las cadenas ligeras κ-λ de
las inmunoglobulinas (L), presentes en el suero inicial (Figura 24A), desaparecen en el
suero fraccionado (Figura 24B). Vemos pues, que las inmunoglobulinas son eliminadas
de grandes volúmenes de suero con una gran eficacia mediante esta metodología.

La fracción retenida por la cromatografía tiofílica fue analizada mediante 2-DE

por un doble motivo. El primero es que, como se mencionó anteriormente, sabíamos
que otras proteínas aparte de las inmunoglobulinas podrían ser también capturadas por
la cromatografía tiofílica, como por ejemplo otra proteína mayoritaria del suero, la α2-
macroglobulina (Sottrup-Jensen, 1989; Wyatt et al., 2013). Por otro lado, las
inmunoglobulinas, al igual que muchas otras globulinas presentes en el plasma, cumplen
una importante función de transporte, ya que forman complejos con otras proteínas de
pequeño tamaño y de menor abundancia.

131
 Resultados & Discusión

Figura 24. Eliminación de inmunoglobulinas de muestras de suero humano mediante cromatografía

tiofílica. Suero inicial (A) vs suero al que se han eliminado las inmunoglobulinas mediante
cromatografía tiofílica (B). Se muestra un resultado típico.

De este modo, estas proteínas de peso molecular pequeño escapan al proceso de

filtración glomerular en el riñón, que afecta a aquellas menores de 60-65 kDa (algo
menos que el tamaño de la HSA). De este modo, su pequeña vida media en el plasma se
incrementa al asociarse a estas proteínas transportadoras más grandes. Además,
muchas de estas proteínas de bajo peso molecular son de interés en Biología, puesto
que están asociadas con el desarrollo de múltiples patologías como el cáncer (Sheikh et
al., 2012). De este modo, el análisis de las fracciones retenidas por la cromatografía
tiofílica puede ser interesante.

2.- ELIMINACIÓN DE LA ALBÚMINA SÉRICA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Como se comentó con anterioridad, la albúmina es la proteína más abundante

del suero (~50-60 % del total), y por esta razón es imprescindible su eliminación de las
muestras. Como se puede ver en la Tabla 8, se suele emplear cromatografía de afinidad
con varios tipos de fases estacionarias, sobre todo basadas en Cibacron-Blue (o
moléculas derivadas) o en anticuerpos policlonales específicos de la albúmina humana,

132
 Resultados & Discusión

que pueden haber sido desarrollados tanto en mamíferos como en pollo (IgY). También
han sido publicados protocolos basados en precipitación selectiva de la albúmina
mediante tricloroacético (TCA)/acetona (Chen et al., 2005). En nuestro caso las
fracciones no retenidas de la cromatografía tiofílica (sin inmunoglobulinas) fueron
desaladas, concentradas e incubadas con una resina de afinidad frente a albúmina
humana (Vivapure® anti-HSA affinity resin, VivaScience, Sartorious). Esta resina fue
seleccionada porque permite eliminar albúmina de grandes cantidades de muestra
inicial (10-12 mg de proteína, como era nuestro caso). Además, estaba basada en un
fragmento de anticuerpo acoplado covalentemente a beads de agarosa, por lo que se
limitaba la unión inespecífica de otras proteínas del suero a la resina, un problema
bastante común con las fases estacionarias basadas en Cibacron blue (Subramanian,
1984). Se emplearon 4 ml de resina, teniendo en cuenta que su capacidad de unión era
de 2 mg de albúmina por ml de resina, que la proporción de albúmina en el suero
oscilaba entre 57-71 % y que por ello la cantidad de albúmina como máximo en las
muestras sería del 7.1-8.52 mg. Debido a la gran cantidad de resina empleada, las
muestras fueron centrifugadas en tubos Vivaspin 6 (0.2 µm, Sartorius) como se indica en
el aptdo. 3.2 de Material y Métodos. El perfil de elución tanto de la fracción no retenida
(FNR; suero sin inmunoglobulinas ni albúmina) como de la retenida (FR; albúmina) se
representa en la Figura 25.

Figura 25. Perfil de elución de las

fracciones no retenidas y retenidas
de la cromatografía de afinidad con
resina anti-HSA.

133
 Resultados & Discusión

Por otro lado, tanto la FR como la FNR resultantes de esta última cromatografía
fueron concentradas/desaladas en tubos Amicon Ultra-4 y posteriormente cuantificadas
mediante BCA (550 nm). En la Tabla 11 se muestran los resultados de esta cromatografía
de afinidad en la que aproximadamente el 60 % de la proteína inicial (que se
corresponde con la FNR de la T-Gel y que encaja perfectamente con la proporción de
albúmina promedio esperada, un 64 %) fue recuperada como FR, frente a un 28 % del
total que se recuperó como FNR.

Tabla 11. Rendimiento de la resina Anti-HSA (experimento tipo)

Concentración
Proteína Total
de Proteína Rendimiento (%)
(mg)
(mg mL-1)
Muestra sin Igs 74.1 12.0 100
FNR 8.4 3.4 28.5
FR 18.6 7.3 60.5

La concentración de proteína total inicial del suero en nuestras muestras era de

60-80 mg/mL, por lo que la eliminación secuencial de inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM,
IgD e IgE por cromatografía tiofílica y de la albúmina (inmunoafinidad) suponía la
eliminación de un rango entre el 80-90 % de dicha cantidad total de proteína, y por ello
un incremento de sensibilidad de cómo máximo 10 veces. Hemos de tener en cuenta
que la columna comercial más eficaz, la de Sigma-Aldrich (Tabla 8), que elimina las 20
proteínas más abundantes, reduce en un valor cercano al 99 % la cantidad de proteína
total (Kim et al., 2008). Si tenemos en cuenta que la electroforesis bidimensional tiene
un rango de detección no mayor de 3 órdenes de magnitud, esto significaba incrementar
dicho rango de sensibilidad analítica un orden más (hasta los 4), de manera que si una
proteína como la albúmina presentaba una concentración de 40 mg/mL podíamos
acercarnos a la detección de proteínas cuya concentración estuviese en el orden de los 4
μg/mL. De este modo, seguiríamos todavía alejados de las concentraciones de proteínas
interesantes como el antígeno carcinoembrionario (CEA; valor de referencia <2.5 ng/mL;

134
 Resultados & Discusión

biomarcador de adenocarcinomas como el colorrectal, mama, pulmón y gástrico), la

troponina T cardiaca (cTnT; valor de referencia <0.01 ng/mL; biomarcador de infarto de
miocardio), el antígeno prostático (PSA; valor de referencia <4 ng/mL; biomarcador de
cáncer de próstata) etc. Sin embargo, asumiendo un 100 % de recuperación del analito,
geles preparativos con una elevada carga proteica (≥1 mg) y técnicas de tinción de
elevada linealidad y sensibilidad como el SYPRO Ruby, podríamos ya empezar a detectar
proteínas como la proteína C reactiva (valor de referencia <10 μg/mL; biomarcador de
inflamación y de riesgo cardiovascular) (Morley & Kushner, 1982; Deodhar, 1989), y
acercarnos al límite superior de proteínas como la alfa fetoproteína (AFP; valor de
referencia <1 μg/mL; biomarcador de cáncer testicular no seminomatoso), las proteínas
S-100 (Ortiz et al., 2003; Kluger et al., 2011; biomarcador de melanoma avanzado), la
mioglobina (valor de referencia 85 – 90 ng/mL) o incluso la ferritina (<0.2 μg/mL). Más
importante a tener en cuenta es el hecho que después del proceso de fraccionamiento
todavía se obtiene una cantidad de proteína (aproximadamente 3 mg) en la fracción no
retenida, que hace posible el estudio proteómico de réplicas y, sobre todo, nuevos
procesos de fraccionamiento que nos permitan acceder a proteínas de menor
abundancia. Esto sólo es posible al haber partido de muestras de 1-1.5 mL de suero, del
orden de 5-10 veces más en relación a otros protocolos comerciales (Tabla 8).

En un siguiente paso, las muestras de suero a las que se les eliminó tanto las
inmunoglobulinas como la albúmina fueron analizadas mediante 2-DE (Figura 26). Como
se puede ver la resina de afinidad específica de albúmina elimina la mayoría de esta
proteína de las muestras, pero dicho proceso no es completo a pesar de no superar la
capacidad de unión de la resina, (2 mg/mL). De hecho, se señalan tanto en la Figura 26A
como en la Figura 26C los dos spots en donde se han detectado péptidos
correspondientes a la HSA. Esta dificultad en la captura de todas las moléculas de
albúmina por parte de la fase estacionaria de la cromatografía de inmunoafinidad ya ha
sido descrita por otros autores (Bischoff & Luider, 2004), y varias podrían ser las
explicaciones. Así, el uso de anticuerpos monoclonales, que reconocen un único epitopo
en la molécula de albúmina, podrían no ser totalmente eficaces en este tipo de
procesos, especialmente debido a que esta proteína presenta más de 20 variantes

135
 Resultados & Discusión

genéticas (algunas con diferentes movilidades electroforéticas) y también sufre diversas

modificaciones postraduccionales. Dentro de estas últimas no se encuentran las
glicosilaciones (Peters, 1985; Carter & Ho, 1994), ya que la albúmina apenas contiene
hidratos de carbono, pero sí otras modificaciones como las fosforilaciones (Gerasimova
et al., 2008), oxidaciones (Kawakami et al., 2006 Taverna et al., 2013) o la adición a
ácidos grasos (Peters, 1996) que podrían provocar cambios en el punto isoeléctrico y en
los epitopos reconocidos por los anticuerpos anti-HSA. Del mismo modo, la albúmina es
una proteína de transporte de diversas moléculas, como ácidos grasos, fármacos,
bilirrubina, vitaminas, calcio u hormonas como la T3, T4, cortisol y aldosterona. Algunas
de estas moléculas también podrían enmascarar algunos epitopos en la HSA,
dificultando su captura por la resina de afinidad. A pesar de esta falta de eficacia, lo que
sí se puede decir es que el proceso de captura de la HSA es altamente
específico/selectivo, ya que las proteínas de la fracción retenida por la columna de
inmunoafinidad anti-HSA es fundamentalmente albúmina, fragmentos de esta proteína
o especies proteicas relacionadas con ésta (Figura 26B), un aspecto al que volveremos
posteriormente cuando hablemos del albuminoma en otra sección de esta tesis.

Por otro lado, la ausencia de albúmina e inmunoglobulinas en las muestras de

suero provocó un notable incremento en el número de spots detectados en los geles. La
Figura 26C aporta un ejemplo representativo de como el análisis con el programa
PDQuestTM permitió detectar en el suero inicial tan sólo 150 spots, debido
fundamentalmente a lo difuso de los spots y a la pobre resolución de los geles. En
cambio, la eliminación secuencial de las inmunoglobulinas y de la albúmina incrementó
la concentración de ciertas proteínas más minoritarias, lo que llevó a una mayor nitidez
de los spots detectados, una mejor resolución de los geles y un aumento del número de
spots detectados: 155 y 227 spots, respectivamente (Figura 26C). Dicho aumento
también se debió al “desenmascaramiento” de algunas proteínas ocultas tras los “trenes
de spots” correspondientes a la albúmina y a las inmunoglobulinas. En definitiva, la
eliminación de las proteínas mayoritarias del suero, inmunoglobulinas y albúmina, deja
al descubierto otras especies proteicas menos abundantes que podrían ser buenas
candidatas a nuevos biomarcadores (Liotta & Petricoin, 2010).

136
 Resultados & Discusión

A B

3 pI 10NL 3 pI 10NL
kDa kDa

97.4- 97.4-
66.2- 66.2-

45.0- 45.0-

31.0- 31.0-

21.5- 21.5-

14.4- 14.4-

Figura 26. Análisis cualitativo y cuantitativo de los fraccionados de suero. (A)

Variabilidad muestra #7
Sample #7 variability Variabilidad muestra #8
Sample #8 variability
suero sin inmunoglobulinas y albúmina. (B) muestra correspondiente a la
D 40 30
de spots
de spots

fracción
35 retenida en la columna anti-HSA, 25
es decir el albuminoma. (C)
Number of spots

Number of spots

cuantificación
30
25
de35.1
spots. 32.9 (n= 120) 20
39.3 27.9 (n= 97)
20 15
Número
Número

15
10
10
5
5
0 0
0-15 15-30 30-45 45-60 60-75 75-90 90-105 >105 0-15 15-30 30-45 45-60 60-75 75-90 90-105 >105
CV (%) CV (%)

Variabilidad muestra #9
Sample #9 variability Variabilidad Inter-muestral
Inter-sample variability
de spots

30 35
de spots

25 30
39.5 29.6 (n= 103) 49.1 28.2 (n= 127)
Number of spots

Number of spots

25
20
20
15
Número

Número

15
10
10
5

0
137 50
0-15 15-30 30-45 45-60 60-75 75-90 90-105 >105 0-15 15-30 30-45 45-60 60-75 75-90 90-105 >105
CV (%) CV (%)
 Resultados & Discusión

3.- ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD INTRA- E INTERMUESTRAL

3.1.- MUESTRAS DE SUERO SIN INMUNOGLOBULINAS NI ALBÚMINA

La capacidad discriminatoria de un biomarcador, es decir, la capacidad que tiene

para generar un resultado distinto en individuos pertenecientes a una población sana y
en individuos enfermos, depende del área de solapamiento entre las curvas de
frecuencias de ambas poblaciones. Obviamente, un área de solapamiento grande
implica una baja capacidad discriminatoria del biomarcador y una dificultad manifiesta
para establecer un punto de corte a partir del cual clasificar a un individuo como “sano”
o “enfermo”. Esta área de solapamiento, a su vez, está directamente correlacionada con
la variabilidad biológica del biomarcador, vinculada a los efectos genéticos (variabilidad
inter-individual), pero también a los medioambientales, tratamientos, etc (variabilidad
intra- e inter-individual). Por otro lado, el área de solapamiento también depende de la
variabilidad analítica (error aleatorio o imprecisión), que afecta a la variabilidad intra- e
inter-individual y que es un aspecto crítico en el caso de la 2-DE. Así, antes de acometer
un estudio estadístico sobre datos procedentes de electroforesis bidimensional con el fin
de detectar la presencia de nuevos biomarcadores de una enfermedad, es conveniente
realizar un estudio de la variabilidad técnica y biológica.

Para estudiar la reproducibilidad analítica (variación analítica) realizamos

triplicados de nueve sueros control (individuos sanos), a los que previamente se les
había eliminado las inmunoglobulinas y la albúmina. Para estos análisis preliminares las
muestras fueron analizadas por triplicado mediante 2-DE usando tiras de IEF de de 17
cm, pH 3-10 NL y el sistema Protean II XL Cell, todo de BIO-RAD. Este sistema sólo
permitía analizar dos muestras (en sendos geles) de cada vez, lo que no favorecía una
buena reproducibilidad analítica en principio. La cantidad de proteína cargada en todos
los geles fue de 1 mg, lo que fue facilitado por el protocolo de fraccionamiento
desarrollado previamente. Los geles fueron teñidos con la solución comercial Bio-SafeTM
(BioRad). El análisis bioinformático fue llevado a cabo mediante el programa PDQuest TM,
y durante dicho análisis se generaron tres matchsets, formado cada uno de ellos por
nueve geles (tres triplicados por lo tanto). Una vez detectados manualmente todos los
138
 Resultados & Discusión

spots y tras un proceso de normalización del análisis para eliminar posibles variaciones
debidas a factores de manipulación, se evaluó la reproducibilidad analítica. Ésta es
normalmente expresada como coeficiente de correlación de Pearson (r y R 2) o como
coeficiente de variación (CV %; calculado dividiendo la desviación estándar por la media
y multiplicando por 100).

El coeficiente de correlación puede ser obtenido mediante la herramienta Scatter

Plot del PDQuestTM. La Tabla 12 muestra los altos coeficientes de correlación obtenidos
entre los diferentes pares de triplicados de una misma muestra (0.90±0.03), lo cual
indica una reducida variabilidad técnica, dado que este valor debe de ser de al menos
0.90 según diversos autores (Challapalli et al., 2004). Dado que una mejor manera de
expresar la variabilidad técnica es el empleo de los coeficientes de variación (CV),
decidimos usar los datos procedentes del tercer grupo de datos (tercer matchset, Tabla
12) y evaluar la imprecisión técnica en los datos de intensidad de cada uno de los spots
de los geles a través de las distintas réplicas. Los datos fueron agrupados en intervalos
de clase y representados mediante histogramas correspondientes a los datos de los
donantes #7, #8 y #9 (Figura 27) donde se observa, que los datos de variabilidad
intramuestral son razonablemente bajos (35.1±32.9 %, 39.3±27.9 % y 39.5±29.6 %,
respectivamente) y cercanos a los CVs intramuestrales obtenidos por otros
investigadores (20-30 %) (Molloy et al., 2003; Hunt et al., 2005). La mayoría de los spots
presentan unos coeficientes de variación intramuestral que van desde 0 a 50 %, lo que
significa que las diferencias en intensidad de los spots menores de 1.7 veces podrían ser
debidas básicamente a aspectos técnicos de nuestro método, incluyendo el análisis de
imagen (Wheelock & Buckpitt, 2005).

Por otro lado, los datos de variabilidad intermuestral (entre muestras de

diferentes donantes) resultaron ser ligeramente más altos. Así, el coeficiente de
correlación intermuestral calculado mediante la herramienta Scatter Plot del PDQuest TM
arrojó un valor de 0.88±0.01 (Tabla 12), mientras que el coeficiente de variación
intermuestral fue de 49.1±28.2 (Figura 27), con todos los spots considerados válidos
(n=127) mostrando unos coeficientes de variación que oscilaban entre 0 y 100 %.

139
 Resultados & Discusión

Tabla 3. Coeficientes
Tabla 12. Coeficientes de correlación
de correlación intra e inter-muestrales
intra e inter-muestrales.

Grupo Muestras (geles) Coeficientes de correlación intra-muestrales

Suero 1 (A, B, C) A-B: 0.89; B-C: 0.90; C-A: 0.87

1 Suero 2 (A, B, C) A-B: 0.93; B-C: 0.87; C-A: 0.92

Suero 3 (A, B, C) A-B: 0.90; B-C: 0.91; C-A: 0.90

Suero 4 (A, B, C) A-B: 0.93; B-C: 0.85; C-A: 0.93

2 Suero 5 (A, B, C) A-B: 0.94; B-C: 0.92; C-A: 0.90

Suero 6 (A, B, C) A-B: 0.88; B-C: 0.84; C-A: 0.88

Suero 7 (A, B, C) A-B: 0.95; B-C: 0.94; C-A: 0.93

3 Suero 8 (A, B, C) A-B: 0.90; B-C: 0.90; C-A: 0.91

Suero 9 (A, B, C) A-B: 0.90; B-C: 0.93; C-A: 0.91

Pares de donantes Coeficients de correlación inter-muestrales

Suero 1 vs Suero 2 0.89

Suero 2 vs Suero 3 0.91

Suero 1 vs Suero 3 0.85

Suero 4 vs Suero 5 0.84

Suero 5 vs Suero 6 0.88

Suero 4 vs Suero 6 0.88

Suero 7 vs Suero 8 0.91

Suero 8 vs Suero 9 0.90

Suero 7 vs Suero 9 0.88

Este incremento en la variabilidad intermuestral en relación a la variabilidad

intramuestral está en línea con los datos obtenidos por Molloy y colaboradores (Molloy
et al., 2003), y se debe a la influencia de las variaciones biológicas (genéticas, efecto de
la medicación, medioambientales, etc.), pero también a la presencia de factores de tipo

140
 Resultados & Discusión

técnico que pueden surgir durante la toma de la muestra de suero, el fraccionamiento,

el almacenaje, etc.

Figura 27. Experimento previo: Variabilidad intra- e intermuestral. Se muestra la variabilidad

inter e intramuestral de los donantes #7, #8 y #9 expresada, como coeficientes de variación.
Los CV se calcularon como desviación estándar (SD)/media x 100, de cada spot.

Tras los buenos resultados obtenidos en el estudio preliminar, decidimos evaluar

la variabilidad intra-e intermuestral existente en un análisis más completo, ya que
constaba de un mayor número de muestras. En este nuevo estudio se analizaron, por
triplicado, las muestras de suero sin inmunoglobulinas ni albúmina de 8 individuos
sanos. Con el fin de reducir el efecto de la variabilidad técnica en la electroforesis
bidimensional, se utilizó la carcasa Ettan DALT Six System de GE Healthcare®.

Finalmente, las muestras fueron teñidas con Coomassie G-250 Blue Silver, un
protocolo largo de tinción que permite una mayor sensibilidad en la detección de
proteínas (Candiano et al., 2004). El análisis de imagen se realizó de la misma forma que
en el estudio previo (PDQuestTM), generándose un único matchset formado por 8 geles
con sus correspondientes triplicados. Como se puede observar en la Tabla 13 existe una

141
 Resultados & Discusión

mejora en los coeficientes de correlación intramuestral (0.93±0.02 frente a 0.90±0.03),

pero sobre todo intermuestral (0.90±0.04 frente a 0.88±0.01).

Todos estos datos de variabilidad técnica y variabilidad biológica son interesantes

porque nos permiten conocer el número de muestras y réplicas que deben de ser
analizadas para poder realizar un análisis de expresión diferencial y encontrar
diferencias significativas de una determinada magnitud (por ejemplo, dos veces, lo que
significa un efecto tamaño del 100 %).

Tabla 13. Coeficientes de correlación intra- e intermuestrales obtenidos para el análisis del
suero sin inmunoglobulinas ni albúmina.
Coeficientes de correlación intra e inter-muestrales
_______________________________________________________________________________________________

Grupo Muestras (geles) Coeficientes de correlación intra-muestrales

Suero S10 (A, B, C) A-B: 0.94; B-C: 0.95; C-A: 0.92
S11 (A, B, C) A-B: 0.94; B-C: 0.95; C-A: 0.93
S14 (A, B, C) A-B: 0.95; B-C: 0.95; C-A: 0.96
S15 (A, B, C) A-B: 0.90; B-C: 0.86; C-A: 0.88
S16 (A, B, C) A-B: 0.91; B-C: 0.95; C-A: 0.93
S17 (A, B, C) A-B: 0.95; B-C: 0.92; C-A: 0.94
S18 (A, B, C) A-B: 0.91; B-C: 0.91; C-A: 0.92
S19 (A, B, C) A-B: 0.90; B-C: 0.91; C-A: 0.90

Pares de donantes Coeficientes de correlación inter-muestrales

S10 vs S11 0.82
S11 vs S14 0.94
S10 vs S14 0.82
S15 vs S16 0.93
S16 vs S17 0.89
S15 vs S17 0.88
S18 vs S19 0.92
_______________________________________________________________________________________________

142
 Resultados & Discusión

3.2. INMUNOGLOBULINOMA

Tras el análisis del inmuniglobulinoma mediante 2D se decidió también, estudiar la

variabilidad inter- e intramuestral, para ello se emplearon muestras procedentes de 9
individuos sanos (donantes). En la primera dimensión se utilizaron tiras de IEF de 11 cm,
pH 3-10 NL de BIO-RAD (0.5 mg de proteína), mientras que para la segunda dimensión se
empleó el sistema de carcasa Ettan DALT Six System de GE Healthcare®. Los geles fueron
también teñidos con Coomassie G-250 Blue Silver y analizados con el programa
PDQuestTM. Se generó un único matchset formado por 9 geles analizados por triplicado.
En la Tabla 14 podemos observar unos coeficientes de correlación tanto intramuestral
(0.87±0.04; Inmunoglobulinoma) como intermuestral (0.82±0.04; Inmunoglobulinoma)
algo disminuidos en relación a los obtenidos con las muestras de suero sin
inmunoglobulinas ni albúmina. La razón de estos menores coeficientes de correlación se
debe a la distorsión del patrón del gel que provocan proteínas de gran tamaño (cadenas
pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, α-macroglobulina, etc.).A pesar de haber
aumentado considerablemente el número de individuos en cada uno de los análisis,
vemos que los resultados no distan mucho de los obtenidos en el estudio previo, por lo
tanto se consideró innecesario calcular los CV, ni para el inmunoglobulinoma ni para las
muestras de suero sin inmunoglobulinas ni albúmina, teniendo en cuenta el número
total de spots para cada análisis.

143
 Resultados & Discusión

Tabla 14. Coeficientes de correlación intra- e intermuestrales obtenidos para el análisis del
inmunoglobulinoma completo.

coeficientes de correlación intra e inter-muestrales

_______________________________________________________________________________________________

Grupo Muestras (geles) Coeficientes de correlación intra-muestrales

Suero S10 (A, B, C) A-B: 0.90; B-C: 0.89; C-A: 0.89

S11 (A, B, C) A-B: 0.89; B-C: 0.91; C-A: 0.91

S12 (A, B, C) A-B: 0.90; B-C: 0.92; C-A: 0.89

S13 (A, B, C) A-B: 0.88; B-C: 0.89; C-A: 0.84
S15 (A, B, C) A-B: 0.87; B-C: 0.89; C-A: 0.84
S16 (A, B, C) A-B: 0.86; B-C: 0.88; C-A: 0.84
S17 (A, B, C) A-B: 0.86; B-C: 0.78; C-A: 0.81
S18 (A, B, C) A-B: 0.93; B-C: 0.88; C-A: 0.86
S19 (A, B, C) A-B: 0.86; B-C: 0.90; C-A: 0.89

Pares de donantes Coeficientes de correlación inter-muestral

S10 vs S11 0.85
S11 vs S12 0.88
S10 vs S12 0.80
S13 vs S15 0.74
S15 vs S16 0.84
S13 vs S16 0.81
S17 vs S18 0.86
S18 vs S19 0.88
S17 vs S19 0.80
_______________________________________________________________________________________________

144
 Resultados & Discusión

4.- IDENTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LOS GELES BIDIMENSIONALES MEDIANTE

HUELLA PEPTÍDICA

En un siguiente paso procedimos a identificar la naturaleza de las proteínas

presentes en los geles bidimensionales correspondientes a las fracciones retenidas
(inmunoglobulinoma, albuminoma) y la no retenida (suero sin inmunoglobulinas ni
albúmina) de las cromatografías. Para ello los spots de interés fueron cortados en
condiciones controladas (para evitar la contaminación con queratinas de la piel) y
desteñidos para posteriormente realizar una digestión in-gel de las proteínas utilizando
el enzima tripsina. Este enzima es ampliamente utilizado en este tipo de protocolos de
digestión de proteínas, ya que produce un corte después de lisina o arginina (salvo que
estos aminoácidos, sean seguidos de una prolina) cuya frecuencia genera muchos
péptidos de un tamaño apropiado (6-20 aa) para el análisis posterior mediante
espectrometría de masas (Shevchenko et al., 2006). El uso del protocolo Coomassie G-
250 Blue Silver facilitó el proceso de digestión in-gel y la elución de los péptidos de las
muestras, mientras que la eficiencia en la identificación de las proteínas de menor
abundancia fue incrementada por la mayor cantidad de proteína por spot.

Las proteínas presentes en cada spot fueron identificadas mediante PMF

(“Peptide Mass Fingerprinting”) utilizando un instrumento MALDI-TOF (“matrix-assisted
laser desorption ionization-time of flight”) modelo AUTOFLEX de la casa Bruker,
perteneciente al Servicio de Espectrometría de Masas de la RIAIDT. Dado que en esta
técnica el éxito depende mucho de la calidad de las muestras, los contaminantes como
detergentes, sales, metales, DTT, urea o glicerol fueron eliminados, ya que pueden
inhibir la ionización de los péptidos en la fuente MALDI. Para ello se emplearon
ZipTipsTM, que consisten en un protocolo de extracción en fase sólida, sencillo y rápido
que permite la purificación y concentración de péptidos en unos pocos pasos, con el fin
de facilitar la detección de biomarcadores de diagnóstico (Tiss et al., 2007). Las muestras
se mezclaron con una matriz química y se depositaron en una placa de MALDI. Tras dejar
evaporar el agua residual y otros solventes, se forman cristales que engloban los
péptidos trípticos. La ionización tiene lugar cuando un láser incide sobre la muestra, la

145
 Resultados & Discusión

matriz absorbe la energía de los fotones y dicha energía es transferida a los péptidos,
que se ionizan (por ejemplo, aceptando la mayoría de los péptidos un protón y con ello
carga positiva) y son así expelidos hacia el analizador de masa (TOF). Dicha ionización fue
realizada en pulsos y la extracción hacia el analizador se realizó en modo retrasado, de
manera que todos los iones entraban en el tubo del TOF al mismo tiempo aumentando
así la resolución de las señales. El analizador mide el tiempo que le lleva a los iones
moverse desde un extremo al otro de un tubo e impactar con el detector. Cuanto mayor
sea el recorrido más grande será el m/z de los péptidos, y ello se traduce en una mayor
masa. Para aumentar la resolución de la técnica y poder distinguir iones con pequeñas
diferencias en los m/z, el analizador fue operado en modo reflectrón, alcanzándose así
resoluciones de 0.001 uma. Esta técnica de espectrometría de masas, además, es muy
sensible y permite medidas muy exactas de la masa de los péptidos, condición
indispensable para la identificación de las proteínas mediante PMF.

La huella peptídica experimental de cada spot (los valores m/z medidos) fue
comparada con la huella peptídica teórica obtenida al realizar la digestión virtual de las
proteínas presentes en la base de datos con el enzima tripsina. Para este proceso se
utilizó el motor de búsqueda MASCOT ([Link] un software de
tercera generación que tiene un sofisticado algoritmo que asigna puntuaciones en
función del número de péptidos identificados y que estima la significancia estadística de
la identificación y la probabilidad de tener un falso positivo (MOWSE) al tener en cuenta:
a) las proteínas de mayor tamaño generan un mayor número de péptidos; b) los
péptidos pequeños generan una mayor número de falsos positivos. Otra de las
condiciones para una identificación correcta de las proteínas mediante PMF es el uso de
bases de datos, se seleccionaron NCBI ([Link] MSDB
([Link] y Swiss-Prot
([Link] Se seleccionó la tripsina como enzima de corte (Thiede et
al., 2000), y se consideró la existencia de un número de cortes perdidos de 1. También
se limitaron las comparaciones al sistema humano, proporcionando además un rango de
peso molecular y una tolerancia de masa en los péptidos de ±50 ppm con el fin de
reducir el número de falsos positivos en las identificaciones. Se tuvieron en cuenta,

146
 Resultados & Discusión

además, las modificaciones más comunes de los aminoácidos: fosforilación, sulfatación,

glicosilaciones o modificaciones N-terminales. En algunos casos se empleó la
comparación con los spots presentes en la base de datos Swiss-2D
([Link] para identificar algunas proteínas muy evidentes.

A pesar del número elevado de spots en cada gel (265: FNR; 157:
inmunoglobulinoma), se puede decir que la mayoría de ellos se correspondían con
isoformas (o en algunos casos variantes con base genética). De este modo, el número de
proteínas representadas era muy inferior, y sólo fueron seleccionadas algunas de ellas
(51) para su identificación por PMF. Por otro lado, fue imposible identificar las proteínas
presentes en algunos de los spots debido al número insuficiente de péptidos
recuperados del gel (frecuentemente <60 %), como por ejemplo los spots #43-48 en la
Tabla 15. En otros casos, como con los spots #6 y #25, se identificaron péptidos
pertenecientes a varias proteínas, un hecho bastante común en electroforesis
bidimensional. En todos las identificaciones se empleo un número elevado de péptidos,
buenas coberturas de secuencia (cercanas en muchos casos al 90 %), altas puntuaciones
(MOWSE) y bajas probabilidades de falsos positivos (Tabla 15). Llama la atención el
sesgo hacia la detección de proteínas muy abundantes y la identificación de algunas de
estas proteínas (albúmina, α1-antitripsina, apolipoproteína A-I) en los tres tipos de
muestra. Una minoría de los spots identificados, tanto en el inmunoglobulinoma como
en el suero sin Ig/HSA, se correspondían con proteínas de una relativamente baja
concentración, como la apolipoproteína H (<240 μg/mL; Crook et al., 1999), la zinz-α2-
glicoproteína (ZAG; <140 μg/mL; Poortmans et al., 1968; Jirka et al., 1978), la proteína
fijadora de retinol (RBP; <60 μg/mL; Miura et al., 2009), la glicoproteína α2 rica en
leucina (LRG; <120 μg/mL; Andersen et al., 2010; Kharbanda et al., 2012), la α1-
microglobulina (<50 μg/mL; Takagi et al., 1980), el componente P amiloide del suero
(SAP; <40 μg/mL; Bijl et al., 2004) o la tetranectina (<14 μg/mL; Kamper et al., 1997,
1998). Destaca especialmente, dentro del inmunoglobulinoma, CD5L/AIM/SPα, con una
concentración en suero <1.5 μg/mL (Sarrias et al., 2005), así como CR1, cuyos niveles en
plasma son <180 ng/mL (Di Bona et al., 1998; Feinberg et al., 2005; Karthikeyan et al.,
2007). Además, todas ellas son proteínas circulantes, salvo la Vps28 (vacuolar protein-

147
 Resultados & Discusión

sorting associated protein 28), una proteína intracelular que, junto con Vps23, Vps37 y
Mvb12, forma parte del complejo ESCRT1 (“Endosomal sorting complex required for
transport”), encargado de la formación de vesículas intraluminales (ILVs) en los cuerpos
multivesiculares (MVBs) (Kostelansky et al., 2006; Boura et al., 2011).

La mayor parte de las proteínas del plasma (>70 %) tienen un peso molecular que
es inferior a los 60 kDa, de modo que podrían ser filtradas perfectamente por los
glomérulos renales y aparecer en la orina (“PPI Website”). Sin embargo,
aproximadamente un 30 % de las proteínas en la orina son de origen plasmático,
mientras que el resto de proteínas son excretadas por otros mecanismos que nada
tienen que ver con la ultrafiltración del plasma (Thongboonkerd et al., 2007). Esto quiere
decir que la mayor parte de las proteínas del plasma se van a encontrar en complejos.
De este modo, aparte del incremento del rango dinámico de detección de proteínas por
2-DE mediante la eliminación de proteínas de elevada abundancia como las
inmunoglobulinas o la albúmina, otra cuestión que debe de ser tenida en cuenta es que
dicho proceso puede reducir las probabilidades de detectar proteínas de baja
abundancia, que podrían ser transportadas por las primeras. Por este motivo, y con el fin
de no perder información importante en los estudios proteómicos, fueron identificados
muchos de los spots tanto del inmunoglobulinoma como del albuminoma (Tabla 15).

148
 Tabla 15. Análisis de masas
Proteínas detectadas (Mowse score) Peptidos Max.
Número de Base de Mw
Proteina Número de acceso Muestras sin Immunoglobulino reconocidos / Valor Covertura pI
spot datos Albuminoma (kDa)
Igs/HAS ma esperado (%)
1 Ácido Orosomucoide H.P.P.M n.d. + (n.d.) - - n.d./ n.d. n.d. 44.0 4.21
2 Albúmina NCBI, CAA00298 + (179) + (129) + (73-305) 10-22/4.7x10-26 56.5 67.50-104.12 5.59-5.88
(Serum albumin) MSDB 1AO6A

3 Proteína ALB (de NCBI Q86YG0_Human - - + (141-248) 13-22/2.3x10-20 91.0 49 # ** 6.0 # **

inhibición del
crecimiento 20)
4 Albúmina, isoforma NCBI gi/119626066 + (118) - - 9/9.9x10-6 88.2 24.17 5.72
CRA_c
-11
5 Alpha-1-antitripsina NCBI 1QLPA + (84-140) - - 7-20/1.5x10 97 55.04-117.14 5.17-4.50
MSDB AAH34554
ITHU
AAH15642
CAA00206
6 Alpha-1-antitripsina & MSDB 1QLPA + (105) - - 11/1.5x10-11 42.3 54.67 5.16
Vitamina D BP VYHUD + (79) 7/9.3x10-14 41.5
7 Alpha-1- MSDB 2ACHA + (155) - - 16/4.7x10-11 84.1 66.94 4.49
antiquimotripsina
8 Alpha-1- Beta MSDB OMHU1B + (127) - - 10/3x10-8 60.8 82.73 5.28

149
glicoproteína
-5
9 Alpha-2-HS MSDB WOHU + (99) - - 101.7x10 72.1 56.81-53.85 4.63-4.70
glicoproteína
-17
10 Alpha-fetoproteína MSDB E973181 - - + (84-217) 9-23/3x10 87.8 68 # ** 5.7 # **
11 Alpha-macroglobulina MSDB MAHU - + (156) - 21/1x10-12 79.4 186-190 * 5.3-5.6 *
12 Alpha-1-microglobulina MSDB HCHU + (77) - - 7/3x10-3 44.3 31.43-31.66 5.34-5.22

13 Antitrombina III NCBI 2ANTI2 + (107-160) - - 10-14/1.5x10-11 63.1 57.90-61.98 5.36-5.49

Resultados & Discusión

MSDB 1AZXI
14 Apolipoproteína A-I NCBI,MSD gi/90108664 + (127-257) + (116) + (237) 8-23/1.2x10-19 86.7 24.07 5.43
B CAA00975
-18
15 Apolipoproteína A-IV MSDB AAA51748 + (161) - + (230) 16-21/1.5x10 61.5 43.03 5.29
 16 Apolipoproteína J H.P.P.M n.d. - - - n.d./n.d. n.d. 37.82 4.93

-11
17 Apolipoproteína E MSDB AAB59518 + (106-158) - - 10-19/2.3x10 48.9 34.29-35.84 5.46-5.58

18 Apolipoproteína H MSDB 1QUBA + (114) - - 9/5.9x10-7 91.3 55.80-62.19 5.56-6.75

(Beta-2-glicoproteína)
19 C2 Complemento MSDB Q5JP69_Human + (78) - - 14/2.2x10-3 19 95.31-101.70 5.88-6.50
-3
20 C3 Complemento MSDB C3HU - + (93) - 14/1.7x10 79.4 70 * 6.9 *

21 C4a Complemento NCBI CO4A_HUMAN +(190) 1/n.d n.d 194.2* 4.99*

22 C4b Complemento MSDB Q5ST68_Human - + (95) - 9/1x10-3 89.8 31 * 6.5 *

23 CD5L MSDB AAD01446 - + (157) - 11/3x10-11 75.3 40 ** 5.3 **

24 Ceruloplasmina NCBI Q1L857_Human + (168) - - 27/2.3x10-12 28 116.20 5.43
25 Ceruloplasmina & NCBI Q1L857_Human + (73-141) - - 17-28/1x10-3 17-26 107.30 5.31
inhibidor Inter- alpha- JX0368 & 1.2x10-9
tripsina
26 Complemento Factor B MSDB BBHU + (77-97) - - 8-11/3.2x10-5 88.7 62.60-62.63 6.34-6.75
(Isoforma 2)
27 Cr1 Complemento MSDB C1HURB - + (96) - 12/7.8x10-4 67.6 80 ** 5.9 **
28 Haptoglobina cadena H.P.P.M n.d. - - - n.d./n.d. n.d. 12.32-17.10 5.03-6.07
alpha

150
29 Haptoglobina MSDB Q6NSB4_Human + (81-116) + (101) - 8-11/3x10-7 88.3 35.63-43.74 4.80-641
cadena beta AAA52687
-12
30 Hemopexina MSDB CAA26382 + (106-163) - - 12-18/7.4x10 90.9 18.30-78.62 4.56-6.43
NCBI
H.P.P.M
31 Inmunoglobulina A MSDB Q96KX8_Human - + (84) - 8/0.014 73.3 54 ** 4.5-5.6 **
cadena pesada
32 Inmunoglobilina G MSDB CAC20454 - + (92) - 6/1.9x10-3 81.5 50-51 * 6.8-8.8 *
Resultados & Discusión

cadena pesada
33 Inmunoglobulina G MSDB BAC01750 - + (111) - 9/2.6x10-5 83.6 29 ₤ 6.7 ₤
cadena ligera
34 Kininogeno MSDB/Uni KGHUH1/P01042 - + (114) - 10/1.3x10-5 58.5 72 # 6.3 #
prot
-4
35 Leucina-alpha-2- MSDB NBHUA2 + (79-88) - - 6/2.6x10 92.3 44.70-48.21 4.46-4.72
glicoproteína
 36 Plasminogeno MSDB Q5TEH4_Human - + (186) - 21/8.1x10-13 79.1 112-116 * 6.4-6.5 *
37 Proapolipoproteína A-I NCBI gi/178775 + (183) - - 17/3.1x10-12 73.2 24.53 5.51
38 Proteína de unión al NCBI gi/55663330 + (102) + (65) - 6/3.9x10-4 93.7 21.85 5.45
retinol MSDB VAHU
39 Suero amiloide P (SAP) NCBI gi/576259 + (87) - - 6/1.3x10-3 44.7 27.40 5.52
40 Tetranectina NCBI gi/267108 + (91) - - 7/4.9x10-3 43.2 21.27 5.48
41 Transtirretina MSDB AAA61181 + (213-251) - - 11-12/1.2x10-20 88.7 13.80-35.40 5.44-5.55
NCBI
H.P.P.M
42 Transferrina H.P.P.M TFHUP - + (146) - 20/8.1x10-9 82.3 81.98 6.62
MSDB
43 Desconocida n.d. n.d. n.d. - n.d./n.d. n.d. 116.17 5.78
44 Desconocida n.d. n.d. n.d. - n.d./n.d. n.d. 116.80 5.84
45 Desconocida n.d. n.d. n.d. - n.d./n.d. n.d. 48.97 6.58
46 Desconocida n.d. n.d. n.d. - n.d./n.d. n.d. 47.84 6.47
47 Desconocida n.d. n.d. n.d. - n.d./n.d. n.d. 33.85 5.49
48 Desconocida n.d. n.d. n.d. - n.d./n.d. n.d. 33.00 5.65
49 Proteína vacuolar MSDB Q548N1_Human + (72) - - 6/8.3x10-3 57.5 36.85 5.42
sorting 28
50 Proteína de unión a la MSDB VYHUD + (182) - - 17/9.3x10-14 40.6 48.72-55.59 5.33-5.47
vitamina D
51 Zinc-alpha-2- MSDB 1ZAGD - + (116) - 11/8.1x10-5 82.8 40.42 * 4.8-6 *
glicoproteína (ZAG)

151
n.d. no determinado
H.P.P.M Human Plasma Proteome Map ([Link]
(*) peso molecular y punto isoeléctrico obtenidos de H.P.P.M.
(**) peso molecular y punto isoeléctrico obtenidos de los valores teóricos de MASCOT
(#) peso molecular de la proteína completa
Resultados & Discusión

Disminuida Aumentada
 Resultados & Discusión

4.1.- PROTEOMA DEL INMUNOGLOBULINOMA

A pesar de que las inmunoglobulinas son el principal objetivo de la cromatografía

tiofílica, la especificidad de los geles tiofílicos es más amplia. En nuestros estudios por 2-
DE/MS, aparte de las esperadas cadenas pesadas de la IgA (spot #31) e IgG (spot #32),
las cadenas ligeras de la IgG (spot #33), se han identificado la α2-macroglobulina (spot
#11) y factores del complemento como C3 (spot #20), C4a (spot #21), C4b (spot #22) y

Otras proteínas que hemos detectado a través de nuestros estudios en el

inmunoglobulinoma son la transferrina (spot #42), albúmina (spot #2), α1-antitripsina
(A1AT; spot #5), Apo A-I (spot #14), zinc-α2-glicoproteína (ZAG; spot #51), proteína de
unión al retinol (RBP4; spot #38), plasminógeno (spot #36), kininógeno (spot #34),
haptoglobina (spot #29) y CD5L (spot #23) (Figura 28). Es evidente que otros spots
minoritarios están presentes en los geles del inmunoglobulinoma, lo que subraya la
importancia que supone el cuidadoso análisis de las fracciones retenidas. Así, cuanto
mayor sea el grado de pormenorización en la identificación de las proteínas presentes
dentro del inmunoglobulinoma (o el albuminoma), mayor será el potencial de este tipo
de protocolos en los estudios proteómicos de fluidos biológicos como el suero,
especialmente porque proteínas relevantes (y por ello potenciales biomarcadores)
podrían llegar a ser detectadas (Gundry et al., 2007).

En relación a los factores del complemento C3 (spot #20), C4a (spot #21) y C4b
(spot #22) al menos la presencia de C3 en la fracción retenida ha sido descrita
previamente por Hardouin et al. (2007). C3 es un factor del complemento muy
interesante desde el punto de vista clínico, ya que tanto la activación de la vía clásica
(mediada por anticuerpos), la de la lectina (mediada por la MBL/”mannose-binding
lectin”) como la alternativa del complemento, desembocan en una vía común que
comienza por el procesamiento de C3 por una convertasa. El otro factor de
complemento, C4, también es muy interesante, porque participa tanto en la vía clásica
de activación del complemento como en la de la lectina.

152
 Resultados & Discusión

Figura 28. Caracterización del proteoma del inmunoglobulinoma. Proteínas identificadas al analizar
mediante electroforesis bidimensional la FR de la columna T-Gel. La 2D-PAGE se resolvió en la carcasa
Ettan Dalt six (0.5 mg, tiras 11 cm pH 3-10NL). Los geles fueron teñidos con Coomassie G-250 Blue Silver.
Todas las proteínas fueron identificadas mediante PMF (Tabla 15). albúmina (spot #2), α1-antitripsina (spot
#5), α2-macroglobulina (spot #11), Apo-AI (spot #14), complemento C3 (spot #20), complemento C4a (spot
#21), complemento C4b (spot #22), CD5L (spot #23), complemento Cr1 (spot #27), haptoglobina (spot #29),
IgA cadena pesada (spot #31), IgG cadena pesada (spot #32), IgG cadena ligera (spot #33), kininσgeno (spot
#34), plasminσgeno (spot #36), proteína de unión al retinol (spot #38), transferrina (spot #42) y zinc-α2-
glucoproteína (spot #51).

153
 Resultados & Discusión

Tanto C3 como C4 pueden haber sido capturados por la fase sólida de la cromatografía a
través de las inmunoglobulinas, si bien no se puede excluir su interacción directa con la
matriz tiofílica.

Por otro lado, CR1/CD35 (spot #27) es un receptor de tipo I que se encuentra en
eritrocitos, monocitos, neutrófilos, células B, algunos linfocitos T CD4 +, células
dendríticas foliculares y en podocitos glomerulares. Se trata de un potente regulador
negativo de la cascada del complemento. Además, se une a los factores de
complemento C3 y C4 activados (C3b y C4b, respectivamente), favoreciendo el proceso
de fagocitosis por macrófagos y neutrófilos y el aclarado de las partículas opsonizadas
junto con las integrinas CR3 (CD11b/CD18) y CR4 (CD11c/CD18). Existen cuatro variantes
alélicas codominantes (CR1-A, CR1-B, CR1-C y CR1-D), que se diferencian en el número
de dominios LHR (“long homologous repeats”) y que generan ostensibles diferencias de
tamaño (190-300 kDa). Los alelos más frecuentes en la población caucásica son CR1-A
(0.87) y CR1-B (0.11), con tamaños intermedios. Por otro lado, CR1 también presenta
variaciones debidas al procesamiento alternativo del mRNA, y procesamientos
proteólíticos que generan formas secretadas presentes en el plasma sanguíneo con un
peso molecular inferior en 5 kDa al de las formas de membrana (Wong 1990; Vik &
Wong 1993; Danielsson et al., 1994; Crehan et al., 2012).

La α2-macroglobulina (spot #11) fue descrita por Lihme et al., ya en 1991, y más
recientemente por Hardouin et al., en 2007. Este último empleó 1-DE/MS para detectar
qué proteínas contaminantes aparecían en la fracción retenida de la cromatografía
tiofílica, comprobando que la α2-macroglobulina se unía con gran afinidad a la matriz
tiofílica. Otra de las proteínas principales capturadas por las matrices tiofílicas fue la
albúmina (spot #2), especialmente si las inmunoglobulinas habían sido eliminadas del
suero previamente (Hardouin et al., 2007). Esto último parece apuntar hacia dos
cuestiones relevantes: a) la existencia de una interacción directa de proteínas como la
albúmina o la α2-macroglobulina con la fase estacionaria y b) la presencia de un
fenómeno competitivo entre las inmunoglobulinas y otras proteínas del suero, que hace
que la eliminación de las primeras favorezca la interacción de otras proteínas séricas con

154
 Resultados & Discusión

la matriz y, por ello, una menor selectividad de la cromatografía de afinidad. Como

consecuencia, si uno intenta optimizar la eficiencia en la eliminación de
inmunoglobulinas mediante el aumento del volumen de resina utilizado en relación a la
cantidad de muestra, esto podría incrementar la retención de proteínas séricas “no
esperadas”, como la albúmina o la α2-macroglobulina (Hardouin et al., 2007).

Aparte de ser retenida por la columna tiofílica, la albúmina es una proteína que
interacciona con numerosas proteínas y péptidos (Kragh-Hansen, 1990), como por
ejemplo la transferrina (Andaç et al., 2012), apoA-I (Steel et al., 2003), α2-
macroglobulina (Steel et al., 2003), plasminógeno (Steel et al., 2003), kininógeno (Steel
et al., 2003), α1-antitripsina (Steel et al., 2003) y el péptido β amiloide (Aβ; Steel et al.,
2003) (Figura 29).

Figura 29. Proteínas del plasma sanguíneo que interaccionan con la albúmina (ALB). Para la elaboración
del mapa de interacciones se empleó el programa String, versión 9.05 ([Link] Jensen et al.
Nucleic Acids Res. 2009, 37:D412-6). Se introdujo el nombre de algunas de las proteínas detectadas en el
inmunoglobulinoma (APOA1, apolipoproteína A-I; TF, transferrina; KNG1, kininógeno 1; PLG,
plasminógeno; A2M, α2-macroglobulina; SERPINA1, α1-antitripsina; HP, haptoglobina, AZGP1, zinc-α2-
glicoproteína; RBP4, proteína de unión al retinol; CD5L), omitiendo las inmunoglobulinas (IgA, IgG, IgM) y
los factores del complemento (C3, C4, Cr1) para facilitar la compresión del esquema. Se incorporó,
además, la transtirretina (TTR) y la ceruloplasmina (CP), dado que fue descrita su presencia en la fracción
retenida por la cromatografía tiofílica por Hardouin et al. (2007). Como fuentes de información el software
empleó tres tipos: experimentales (BIND, DIP, GRID, HPRD, IntAct, MINT, PID), bases de datos (Biocarta,
BioCyc, GO, KEGG, Reactome) y bibliográficas. Las líneas azules gruesas representan interacciones con
elevado grado de confianza (0.900).

155
 Resultados & Discusión

De hecho, muchas de estas interacciones en las que la albúmina participa tienen lugar
durante el proceso de la amiloidosis (Bohrmann et al., 1999), del mismo modo que
ocurre con otra proteína presente en el inmunoglobulinoma, la α1-antitripsina
(SERPINA1 o A1AT; spot #5). A su vez, esta α1-globulina, también detectada por
Hardouin et al., (2007) en fracciones retenidas de la cromatografía tiofílica, se une al
péptido β amiloide (Bohrmann et al. 1999), si bien su función más importante es inhibir
irreversiblemente serinproteasas como la elastasa, trombina y plasmina (cuyo precursor
es el plasminógeno) a través de la formación de complejos altamente estables con ellas
(Koj et al., 1978; Topic et al., 2009). De hecho, la α1-antitripsina forma un cluster en la
Figura 28 junto con la albúmina y otros dos inhibidores de proteasas, el kininógeno (tiol-
proteasas) y la α2-macroglobulina (amplio espectro), y un precursor de un enzima que
es inhibido por todas ellas: el plasminógeno, cuyo procesamiento genera el enzima
plasmina. El kininógeno, por otra parte, es una proteína que juega un papel importante
en el proceso de coagulación, como se puede vislumbrar, pero también actúa como
mediador de procesos inflamatorios aumentando la permeabilidad vascular (Umemura
et al., 2011).

Otro ejemplo de proteína también detectada en el inmunoglobulinoma e

importante en amiloidosis es la apo A-I (spot #14), quizás gracias a sus interacciones con
otras proteínas del plasma como la albúmina, la α2-macroglobulina y la transtirretina
(Torricelli et al., 2004). Esta apolipoproteína A-I está presente en las lipoproteínas de
alta densidad (HDL), cuya función es transportar el colesterol desde los tejidos hasta el
hígado y esterificarlo (interacción apo A-I/lecitina colesterol aciltransferasa) (Nguyen et
al., 2013). Otra proteína que se encuentra asociada a la albúmina y a la apo A-I es la
transferrina (spot #42), una β-Globulina cuyo principal cometido es transportar dos
iones Fe+3 desde los sitios de absorción (enterocitos) o de degradación del grupo hemo
(sistema retículoendotelial; macrófagos) hasta los lugares de utilización (médula ósea) o
almacenaje (hígado). Es probable que la interacción directa de albúmina y α2-
macroglobulina con la matriz del gel tiofílico arrastre a ciertas proteínas asociadas, como
es el caso de la apo A-I o la transferrina. A su vez, la interacción de la apo A-I con la
haptoglobina (una α2-globulina) puede explicar su presencia en el inmunoglobulinoma

156
 Resultados & Discusión

(spot #29) (Liau et al., 2003; Salvatore et al., 2007). La haptoglobina (Hp) es una proteína
sintetizada en el hígado (Wang et al., 2001) formada por cadenas ligeras (α) y pesadas
(β) unidas de forma covalente por puentes disulfuro (Wejman et al., 1984) y cuya
función principal consiste en fijar la hemoglobina plasmática y transportarla hasta el
hígado, evitando así la pérdida de la hemoglobina libre a través de la filtración
glomerular (Rodríguez et al., 2006). Tanto apo A-I como transferrina forman complejos
con la transtirretina/prealbúmina (TTR), una proteína de unión a hormonas tiroideas que
no hemos detectado en el inmunoglobulinoma pero que, sin embargo, Hardouin et al.
(2007) sí ha descrito su presencia en la fracción retenida por la cromatografía tiofílica.
Como muchas proteínas plasmáticas, la transtirretina se encuentra asociada a otras
proteínas, lo que explica perfectamente la presencia de la proteína de unión al retinol
(“retinol binding protein 4”/RBP4, spot #38) en el inmunoglobulinoma (Figura 28), cuya
función principal es transportar vitamina A (la asociación TTR-RBP4 evita las pérdidas de
retinol por la orina). Otra proteína detectada por en los trabajos de 2007 por Hardouin
et al. (pero no en nuestro estudio) fue la ceruloplasmina (ferroxidasa), una proteína de
unión a cobre que oxida el Fe2+ a Fe3+ y que permite su transporte por la transferrina.

De todas las proteínas séricas detectadas en la fracción retenida por la T-gel, sólo dos
no presentan relación alguna con el resto de proteínas identificadas (Figura 28): la zinc-
α2-glicoproteína (AZGP1, spot #51) y la CD5L (spot #23). Esto sugiere una interacción
directa con la matriz, o bien la existencia de proteínas “puente” no identificadas en el
inmunoglobulinoma que pudiesen favorecer una co-purificación. La zinc-α2-
glicoproteína pertenece al grupo de las α2-globulinas. Estimula la degradación lipídica en
adipocitos y participa en procesos biológicos como el procesamiento y presentación de
antígenos o la adhesión celular (Cabassi &Tedeschi, 2013). CD5L, en cambio, es una
proteína poco abundante que juega un papel importante en el control del sistema
inmune así como inhibidor de la apoptosis (Thadikkaran et al., 2005).

157
 Resultados & Discusión

4.2.- PROTEOMA DEL ALBUMINOMA

La albúmina es codificada por el gen ALB, que forma parte de una superfamilia
junto con otros tres genes organizados en tándem en la región subcentromérica del
brazo largo del cromosoma 4 (Figura 30A): α-fetoproteína (AFP), la α-albúmina/afamina
(AFM) y la proteína de unión a vitamina D (“vitamin D binding protein”, DBP o Gc-
globulina). Todos estos genes presentan una elevada similitud, tanto a nivel del DNA,
secuencia primaria y estructura tridimensional. Además, los cuatro genes se expresan en
hígado de individuos adultos, si bien existen matizaciones. Así, AFP (y en menor grado
ALB) se expresan en el saco vitelino y en el hígado fetal, siendo la principal proteína
sérica fetal, pero el gen es silenciado tras el nacimiento (<10 ng/mL a la edad de 8-12
meses); sólo se detecta α-fetoproteína (>500 ng/mL) en determinadas enfermedades,
como en hepatocarcinoma (Zhang et al., 2007). En cambio, la expresión de los genes
ALB y DBP se inicia mayormente en el hígado fetal, pero continúa después del
nacimiento con altos niveles en plasma (albúmina, 35-55 g/L; DBP, 183-346 mg/L)
(Lauridsen et al., 2001). Finalmente, el gen AFM, que codifica la α-albúmina/afamina,
sólo comienza a expresarse tras el nacimiento, alcanzando niveles en el suero adulto en
el entorno de los 35-116 mg/L (Belanger et al., 1994; Dieplinger et al., 2009).

Teniendo en cuenta los niveles en suero de individuos adultos de albúmina, α-

albúmina/afemina, proteína de unión a vitamina D y α-fetoproteína, así como el
porcentaje de similitud en la secuencia nucleotídica de la región codificadora entre estas
proteínas (ALB-AFP 52.2 %; ALB-ALF 49.4 %; ALB-DBP 30.0 %) (Nishio & Dugaiczyk, 1996),
era posible que la especificidad de la resina empleada para eliminar la albúmina de
nuestras muestras de suero no fuese completamente específica. Por este motivo,
después de analizado el inmunoglobulinoma, decidimos llevar a cabo el estudio
cualitativo de la fracción retenida por la columna de afinidad frente a la albúmina
mediante 2-DE/MS. Como se observa en la Figura 30B, aparte de la albúmina (spot #2) y
una variante de procesamiento más corta, llamada proteína de inhibición del
crecimiento 20 (spot #3), sólo pudimos identificar otra proteína de la misma
superfamilia en el albuminoma: la α-fetoproteína humana (spot #10).

158
 Resultados & Discusión

A) Cromosoma 4

DBP ALB AFP AFM IL8 GRO1

B) 3 pI 10NL
C)
kDa
2
10 -97.4
-66.2
10
3 -45.0

2
14 -31.0

10
15
5
2
2 -21.5
3

-14.4

Figura 30. Caracterización del proteoma del albuminoma. A) Genes que codifican para los distintos
miembros de la familia de las albúminas en el cromosoma 4. ALB, gen de la albúmina; AFP, gen que
codifica la α-fetoproteína; AFM, gen que codifica a la α-albúmina o afamina; DBP, gen que codifica para la
proteína de unión a vitamina D o “vitamin D binding protein”. La figura ha sido adaptada de un trabajo de
White & Cooke, 2000. B) Proteínas presentes en la fracción retenida por la columna de afinidad anti-HSA
(albuminoma). Las muestras (0.5 mg) se resolvieron por IEF (primera dimensión) utilizando tiras de 11 cm
pH 3-10 NL, mientras que la segunda dimensión se llevó a cabo en geles continuos, con 12.5 % de tamaño
de poro, 1.5 mm de grosor (20x24 cm) y cuya composición de acrilamida es 30 % A-0.8 % B; empleando el
sistema Ettan Dalt six. Los geles fueron teñidos empleando Coomassie G-250 Blue Silver. Todas las
proteínas fueron identificadas mediante PMF. Albúmina (spot #2), proteína ALB (spot #3), α-fetoproteína
(spot #10), α1-antitripsina (spot #5) y apolipoproteína A-I (spot #14). C) El mapa de interacciones se
elaboró mediante el programa String, versión 9.05 ([Link] Jensen et al. Nucleic Acids Res.
2009, 37:D412-6), introduciendo el nombre de las proteínas detectadas en el albuminoma. Las líneas
azules gruesas representan interacciones con elevado grado de confianza (0.900).

159
 Resultados & Discusión

Sin embargo, no se detectó la presencia en el albuminoma ni de afamina ni de la

proteína de unión a vitamina D. Sí fueron observadas, en cambio, pequeñas cantidades
de α1-antitripsina (spot #5), apolipoproteína A-I (spot #14) y apolipoproteína A-IV (spot
no señalado) (Gundry et al., 2007). Estos resultados sugieren la existencia de complejos
albúmina-A1AT-apolipoproteínas-AI/AIV en suero, como ilustra la Figura 30C. Este tipo
de complejos ya han sido descritos por otros grupos de investigación (Gundry et al.,
2007). Dichos complejos serían capturados por la resina de afinidad junto con la
albúmina. En cambio, la α-fetoproteína no parece tener ningún tipo de interacción
molecular con la albúmina, α1-antitripsina (spot #5), apolipoproteína A-I (spot #14) o la
apolipoproteína A-IV, por lo que lo más probable es que el anticuerpo policlonal
empleado en la cromatografía de afinidad muestre una cierta avidez por esta proteína
tan poco abundante en el suero de individuos adultos (identidad de secuencia
nucleotídica ALB-AFP 52.2 %) (Nishio & Dugaiczyk, 1996). Debido al número pequeño de
proteínas detectadas en el albuminoma, su análisis en estudios posteriores no fue
acometido. Sin embargo, de acuerdo con Zhou y colaboradores, cuando la albúmina es
eliminada mediante cromatografía de afinidad, una serie de 63 proteínas son
coprecipitadas con ella, una cuestión que puede incrementar la variabilidad
experimental (Zhou et al., 2004). Algunas de estas proteínas son comunes a las de
nuestro estudio, como Apo A-I, A-IV y álbúmina. En cambio otras no lo son, es el caso de
la fibronectina, cadena alpha de la hemoglobina o la protrombina.

4.3.- PROTEOMA DEL SUERO SIN INMUNOGLOBULINAS NI ALBÚMINA

El hecho de trabajar con suero en vez de plasma (desaparición, por ejemplo, de

las cadenas abundantes α y β del fibrinógeno), la eliminación de inmunoglobulinas,
albúmina y otras proteínas mayoritarias de las muestras de suero y el trabajo con geles
bidimensionales preparativos (0.5 mg muestra) permitió identificar, en todos los geles,
una serie de proteínas que hasta ese momento se encontraban “ocultas”, bien debido a
su baja concentración o porque su migración coincidía con la de las proteínas
abundantes que habían sido eliminadas. Ejemplos de estas proteínas del suero puestas
de manifiesto en los geles 2-DE fueron, por ejemplo, la α2-glicoproteína rica en leucina

160
 Resultados & Discusión

(LRG, spot #35), la α1-microglobulina (spot #12), la proteína amiloide P sérica (SAP; spot
#39), la β2-glicoproteína/apo H (spot #18) y el factor B del complemento (spot #26)
(Figura 31). Por distintos motivos, algunas de estas proteínas son muy interesantes
desde un punto de vista clínico, como LRG, α1-microglobulina, SAP o apo H, ya que
muchas de ellas funcionan como “scavengers”.

LRG (spot #35) es una glicoproteína producida por los hepatocitos y neutrófilos
de la cual apenas existen publicaciones hasta la fecha. Su concentración en suero es
<120 μg/mL en donantes sanos (Andersen et al., 2010; Kharbanda et al., 2012), pero el
hecho de presentar diversas isoformas debilita su señal en los geles bidimensionales, lo
que dificulta su detección. Se trata de una proteína de fase aguda positiva, cuya
producción por hepatocitos es aumentada en respuesta a citoquinas típicas como IL-6,
IL-1β y TNFα (Shirai et al., 2009). Contiene 8 dominios ricos en leucina (LRR) con la
secuencia consenso LXXLXLXXNXLXXLPXXLLXXLXX, siendo X cualquier aminoácido. Se
desconoce su función, pero se sabe que LRG interacciona fuertemente con citocromo c,
una proteína mitocondrial crítica en la inducción de apoptosis en las células eucariotas
(Shirai et al., 2010).

El citocromo c es liberado desde el espacio intermembrana de las mitocondrias y

se une a Apaf1, desencadenando la formación del apoptosoma, la activación de las
caspasas y la entrada en apoptosis de las células. Durante este proceso, el citocromo c
también aparece en el plasma sanguíneo, en donde induce apoptosis (linfocitos y células
dendríticas, por ejemplo), actúa como un mediador proinflamatorio y constituye una
señal de peligro que forma parte de los denominados patrones moleculares asociados al
daño o DAPMs (“damage-associated molecular patterns”). Se piensa que la interacción
del citocromo c con LRG en el plasma puede servir para eliminar al citocromo c de la
circulación y servir de factor de supervivencia para células como los linfocitos (Codina et
al., 2010), lo que explicaría el aumento de LRG en el suero de pacientes con disfunción
ventricular/fallo cardiaco (Watson et al., 2011), apendicitis (Kharbanda et al., 2012;
Kentsis et al., 2012) o colitis ulcerativa (Serada et al., 2012).

161
 Resultados & Discusión

La α1-microglobulina (#spot 12) (<50 μg/mL; Takagi et al., 1980) es producida por
varios órganos, como el hígado y páncreas (Berggård et al., 1998). Esta proteína es
sintetizada en el hígado como muchas de las proteínas plasmáticas, y su pequeño
tamaño (26-27 kDa) permite que sea rápidamente distribuida desde la sangre al fluido
intersticial de todos los tejidos, en donde apenas existe proteína, o eliminada desde la
sangre por filtración glomerular, apareciendo sólo en parte en la orina, al ser
parcialmente recuperada a través de un receptor específico en células tubulares
(pudiendo servir así para valorar la función tubular renal del mismo modo que β2-
microglobulina; Moriguchi et al., 2004; Gebrin et al., 2006).

Figura 31. Caracterización del

proteoma de la FNR total.
Proteínas identificadas al
analizar mediante
electroforesis bidimensional
las muestras sin Igs y sin HSA.
La 2D-PAGE se resolvió en la
carcasa Ettan Dalt six (0.5 mg,
tiras 11 cm pH 4-7). Los geles
fueron teñidos con
Coomassie G-250 Blue Silver.
Todas las proteínas fueron
identificadas mediante
espectrometría de masas
(Tabla 15).

162
 Resultados & Discusión

Esta proteína sólo ha sido detectada en el proteoma del suero sin inmunoglobulinas ni
albúmina, a pesar de que α1-microglobulina interacciona con protrombina, α2-
macroglobulina, albúmina e IgA (Vincent et al., 1985; Berggård et al., 1997). Su función
no está clara, aunque se trata de una glicoproteína que tiene propiedades de
reductasa/dehidrogenasa (utilizando NADH, NADPH y ascorbato) y de “scavenger” de
sustancias oxidantes, como el grupo hemo (al cual se une fuertemente), citocromo c,
metahemoglobina o hierro libre (Allhorn et al., 2003, 2005; Åkerström et al., 2007). De
hecho, la presencia de especies de oxígeno reactivas (ROS) incrementa la producción de
esta glicoproteína por las células (Olsson et al., 2007). Por otro lado, tiene funciones
inmunosupresoras, inhibiendo por ejemplo la proliferación y la secreción de citoquinas
por linfocitos (Wester et al., 1998) o las funciones oxidativas de neutrófilos.

El componente P amiloide (#spot 39) (“Serum Amyloid P-Component”/SAP; <40

μg/mL; Bijl et al., 2004) es una proteína pequeña (25-27 kDa) pentamérica de la familia
de las pentraxinas (o pentaxinas) codificada por el gen APCS. SAP es idéntica a las formas
tisulares del componente amiloide P. Se encuentra en el suero y también en todos los
depósitos amiloides, por lo que es una proteína clave, dada su relación con un grupo de
enfermedades en las que se produce amiloidosis (Koenig, 2013). Une varios ligandos de
apolipoproteínas (Apo A-I y Apo A-IV) en una manera dependiente de calcio. SAP une,
entre otras, transtirretina (TTR), β2-microglobulina, cadena α del fibrinógeno, receptor
de baja afinidad FcRIIa de IgG (CD32), cistatina c, proteína precursora amiloide b,
polipéptido amiloide de los islotes, TGFb, participando en la resolución de enfermedades
infecciosas, autoinmunidad y amiloidosis (Agrawal et al., 2009).

Dentro de la familia de las pentraxinas se encuentran otra proteína sérica de gran

relevancia, la proteína C reactiva (CRP), muy parecida estructuralmente a SAP (66 %
homología; Koenig, 2013). Considerada proteína de fase aguda positiva por excelencia,
juega un papel importante dentro de la enfermedad cardiovascular y aterosclerosis
(Pepys & Hirschfield, 2003). Se une a varios ligandos como: fosfolipidos y compuestos
relacionados (Clos, 1989), membranas celulares dañadas (Volanakis & Wirtz, 1979) y

163
 Resultados & Discusión

células apoptóticas (Gershov et al., 2000) mostrando una especial afinidad por los
residuos de fosfocolina (Pepys & Hirschfield, 2003).

La mayoría de las funciones de estas pentraxinas cortas (CPR y SAP) se basan en

sus patrones de reconocimiento altamente conservados, desde el punto de vista
evolutivo; PRRs (“Pattern recognition receptors”). Como ya mencionamos con
anterioridad en este apartado, CPR y SAP se unen a sus respectivos ligandos en una
forma dependiente de calcio. Ambos juegan un papel de gran importancia dentro de la
inmunidad innata, desencadenando la vía clásica del complemento (Agrawal et al., 2009;
Pepys & Hirschfield, 2003).

La β2-glicoproteína I / apoliproteína H (spot #18), es una proteína de

aproximadamente 50 kD (Lozier et al., 1984). El gen Apoh esta localizado en el
cromosoma 17 q23-qter y se expresa predominantemente en el hígado (Steinkasserer et
al., 1991; Mehdi et al., 1991). Se asocia con diversas clases de lipoproteínas, y se cree
que participa en el metabolismo de los triglicéridos (Polz & Kostner 1979; Kamboh &
Ferrell, 1991).También se ha demostrado la implicación de Apo H en el proceso de
coagulación de la sangre (Schousboe, 1985) y la agregación plaquetaria (Nimpf et al.,
1986).

El factor B del complemento (#spot 26), es una glicoproteína de cadena simple

rica en Glicina y termolábil, que circula en el suero en forma de zimógeno inactivo. Juega
un papel crucial dentro del sistema de inmunidad innata ya que contribuye a la
formación de la convertasa C3 de la via alternativa (C3bBb), implicada en procesos de
inflamación e infección (Ricklin et al., 2010). El fragmento Bb, que aparece cuando el
factor D rompe al factor B (Ba y Bb), es la molécula responsable de la actividad
proteolítica quedando anclado en el complejo C3bBb, mientras que Ba difunde hacia el
plasma. (Nonaka & Yoshizaki, 2004; Fujita et al., 2004; Carroll, 2004; Ricklin et al., 2010).

164
 Resultados & Discusión

5.- LA ELIMINACIÓN DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA ALBÚMINA DE LAS MUESTRAS

DE SUERO FACILITA LA DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS Y VARIACIONES
POSTRADUCCIONALES

La eliminación de las Igs y de la HSA de las muestras de suero también facilita la

localización de mutaciones y variaciones postraduccionales en muchos loci a la vez
(Anderson & Anderson, 1977).

Haptoglobinas

Un ejemplo de esto es la haptoglobina (Hp), una proteína compuesta por cadenas

ligeras (α) y pesadas (β) unidas por puentes disulfuro (Figura 32A). Estas cadenas están
codificadas por dos loci genéticos: HPα y HPβ. La haptoglobina es una proteína
polimórfica, dicho polimorfismo se encuentra en las cadenas ligeras α, ya que la cadena
pesada β está codificada por un gen que no presenta variación alélica conocida, aunque
sí numerosos residuos oligosacarídicos de tipo N con residuos de ácido siálico
terminales, que aumentan la heterogeneidad de la propia molécula. El gen que codifica
la cadena α (gen HPα; 16q22) presenta tres alelos, denominados HP2, HP1F y HP1S. Los
dos últimos codifican para polipéptidos de igual longitud (a1F y a1S; aproximadamente
8.9 kDa) pero que difieren en un par de aminoácidos. La cadena a1F, de mayor pI,
presenta un Asp y una Lys en posiciones 52 y 53, mientras que esas posiciones son
ocupadas por un Asn y un Glu en la cadena a1S, de menor pI. En cambio, el alelo HP2 se
origina a partir de una duplicación intragénica de alelos HP 1 producida por un
entrecruzamiento desigual (no homólogo) durante la meiosis, lo que genera
polipéptidos de gran tamaño (16 kDa). Estos alelos HP2 pueden ser de tres subtipos:
HP2SS, HP2SF, HP2FF. En Europa, el alelo HP2SF es el más frecuente, mientras que los otros
dos sólo suponen un 1-5 % de la frecuencia alélica (Langlois & Delanghe, 1996).
Combinando los alelos HP2, HP1F y HP1S se pueden obtener hasta seis
genotipos/fenotipos diferentes: Hp1F-1F, Hp1S-1S, Hp1F-1S, Hp2-1F, Hp2-1S y Hp2-2 (Rodríguez et
al., 2006). En las muestras de suero analizadas hemos observado todos estos fenotipos,
tres de los cuales son representados en la Figura 32B. Además, todas las cadenas α están

165
 Resultados & Discusión

A) Cadenas  y  de la haptoglobina

3 pI 10
kDa

B
97.4
66.2

45.0
Hpβ

31.0
Apo A1

Hp2α

21.5
Hp1α

B) Polimorfismo de la cadena  de la haptoglobina

# Apo A1 # ApoA1
1 2 3 Deamidación Asn5Asp5
Arg adicional en c-terminal
Hp2
Hp2α (16 kDa)
# Transtirretina # Transtirretina 1 2 3
Hp1 # Transtirretina
4 5,4´ 6,5´ 6´ 4 5 6
Hp2-2 Hp1s-1f Hp1s
8.9 kDa
Hp1f
4´ 5´ 6´
# Apo A1 # Apo A1
Arg adicional en c-terminal
1 2 3 Deamidación Asn5Asp5
Hp2* Hp2

# Transtirretina # Transtirretina
Hp1 Hp1
4 5 6 Hp2*-1s 4 5 6 Hp2-1s

Figura 32. Análisis del polimorfismo de la haptoglobina. (A) Detección de las cadenas α y β de la haptoglobina en los
geles de electroforesis 2D. se muestra un esquema también de las diferencias estructurales de los distintos fenotipos de
1
las haptoglobinas. Los individuos homocigotos Hp1-1 presentan una pequeña proteína de 86 kDa con fórmula (α β)2,
1 2
mientras que el heterocigoto Hp2-1 tiene un peso molecular de 86-300 kDa y una fórmula (α β)2 + (α β)n, en donde n
puede tomar el valor 3, 4, 5 etc. Finalmente, el homocigoto Hp2-2 presenta un peso molecular aún mayor (170-900
2
kDa) y una estructura (α β)n, en donde nuevamente n puede tomar el valor 3, 4, 5 etc. (Langlois & Delanghe, 1996). (B)
Polimorfismo de las cadenas ligeras α de la Hp, en donde se identifican tres de los seis fenotipos posibles: Hp2-2, Hp1s-
1f y Hp2-1s. El asterisco (*) indica la presencia de una variante más acidica muy poco común de la cadena α Hp2. En el
esquema se observa como todas las cadenas α están formadas por tres spots, de los cuales el central es el más
intensolos dos spots laterales de las cadenas α se corresponden con formas con menor o mayor pI derivadas,
respectivamente, de la desamidación Asn→Asp en posición 5 (N5D) o de la presencia de una Arg adicional en el
carboxilo terminal (Pavón et al., 2006). En el esquema de la derecha los spots 4, 5 y 6 de la cadena Hp1sα y 4´, 5´, y 6´de
la cadena Hp1fα aparecen a distintas alturas (a pesar de tener el mismo peso molecular; 8.9 kDa) para facilitar su
comprensión.

166
 Resultados & Discusión

formadas por tres spots, uno central más intenso que constituye la variante más
abundante y otros dos spots laterales con menor o mayor pI en relación al primero. El
más acídico es fruto de la desamidación AsnAsp en posición 5 (N5D), mientras que el
más básico surge de la presencia de una Arg adicional en el extremo carboxilo terminal.
Estas variaciones están presentes tanto en la cadenas α Hp2 como en las cadenas Hp1s o
Hp1f (Figura 32B) (Pavón et al., 2006).

Otros polimorfismos

Además de la Hp, otras proteínas polimórficas fueron detectadas en otras

regiones de nuestro mapa 2D, como por ejemplo en la región correspondiente a la α1-
antitripsina. En dicha región (Figura 33A) aparecen varias proteínas de conocido
polimorfismo, como la α2-HS glicoproteína/AHSG, la Gc-globulina/proteína de unión a
vitamina D, la antitrombina III, la α1-antiquimotripsina y la propia α1-antitripsina. Así, el
gen que codifica la proteína AHSG presenta dos alelos, AHSG*1 (Thr230, Thr238) y
AHSG*2 (Met230, Ser238) (Anderson & Anderson, 1977; Osawa et al., 2001), siendo
ambas variantes detectadas en nuestro estudio. Como se puede observar (Figura 33A),
de los tres individuos presentados dos muestran un fenotipo heterocigoto
(AHSG*1/AHSG*2) mientras que el tercero es homocigoto para el alelo AHSG*1. Por otro
lado, la eliminación de la cadena α de las IgA facilita la detección de otra proteína
polimórfica, la antitrombina III (ATIII, Figura 33B). La ATIII es un inhibidor de la
coagulación sanguínea con variantes genéticas y modificaciones postraduccionales
(ATIII-α y ATIII-β) (Kremser et al., 2003). También encontramos en esta misma región,
cuatro spots que fueron identificados como la proteína de unión a vitamina D o Gc-
globulina.

En el estudio proteómico también se identificaron algunas apolipoproteínas

importantes como apo A-I, apo A-IV, apo E, apo J y apo H (β-2glicoproteína). Muchas
apolipoproteínas presentan dos o más isoformas con base genética, como es el caso de
la apo E (E2, E3 y E4), apo A-IV (variantes 0, 1, 2 y 3) y la apo H (β2-glicoproteína I). Un
buen ejemplo de cómo la eliminación de la albúmina y las inmunoglobulinas pueden
facilitar el estudio de estos polimorfismos es precisamente la apo H, ya que esta región
167
 Resultados & Discusión

se encuentra enmascarada por la cadena pesada de la IgG. La eliminación de la IgG

mediante cromatografía tiofílica hace posible la detección de la apo H mediante 2-DE. En
función del alelo detectado (apoH*1, apoH*2 y apoH*3), migrará a una región diferente
en el gel. Debido a la alta frecuencia del alelo apoH*2 (~0.9) (Kamboh et al., 1988), la
mayoría de los individuos de nuestro estudio fueron apoH*2-2, aunque también
observamos patrones correspondientes a los fenotipos apoH*2-3 y apoH*3-3, como se
puede observar en la Figura 33B. Por otro lado la Apo A-I presenta diferentes alelos
(apoA-I 1 y apoA-I 2), por lo que existen tres genotipos posibles para dicha proteína
(apoA-I 1, apoA-I 2-1 y apoA-I 2) (Schamaun et al., 1983).

Respecto a la transferrina decir que, según la secuencia de aminoácidos

(polimorfismo genético), composición de la cadena de carbohidratos de la misma o
grado de saturación de hierro, diferenciamos varios tipos de isoformas. Entre las
variantes genéticas descritas, la isoforma Tf C es la más importante dentro de la
población caucasiana. Tf C a su vez, presenta hasta dieciséis subtipos, de los cuales Tf C1
presenta una prevalencia del 95 %. Por otro lado, Tf C2 puede estar asociado a
diferentes patologías, entre las que está descrita la AR. Otras isoformas son Tf B y Tf D
(Namekata et al., 1997).

El estudio de estos polimorfismos resulta interesante, pues puede explicar los

niveles alterados de estas proteínas. Por ejemplo, se sabe que en el caso de la Gc-
globulina la concentración en el suero de la misma es muy dependiente del fenotipo:
Gc2-2 < Gc2-1 < Gc1-1 (Constans et al., 1983; Daiger et al., 1984; Lauridsen et al., 2001)

168
 Resultados & Discusión
A) α2-HS glicoproteína, gc-globulina, antitrombina III,
α1- anti-tripsina y α1-antiquimotripsina

-1-antiquimotripsina
antitrombina III
A1 AT

Gc-globulina
2-HS glicoproteína

B) ApoH

ApoH 2-2

ApoH 2-3

ApoH 3-3

Figura 33. Análisis de varios polimorfismos genéticos presentes en el suero tras el fraccionamiento del
mismo. (A) Representación esquemática de la región A1AT, donde podemos observar diferentes
fenotipos para la Gc-Globulina (proteína de unión a vitamina D) y la α2-HS glicoproteína. (B)
Polimorfismos de la Apo H detectados en nuestro estudio. Se han descubierto dos alelos (ApoH*2 y 3). En
la imagen podemos observar tres individuos fenotípicamente diferentes: Un homocigoto para ApoH 2-2,
un homozigoto para ApoH 3-3 y un heterozigoto ApoH 2-3.

6.- REDUCCIÓN DEL RANGO DINÁMICO DE ABUNDANCIA DE PROTEÍNAS MEDIANTE

LIBRERÍAS PEPTÍDICAS: PROTEOMINER™

Como acabamos de ver, una de las estrategias de reducción del rango dinámico
de concentraciones de proteínas en el suero es la eliminación de las proteínas más
abundantes mediante distintas metodologías basadas bien en filtración, precipitación o,
como ha sido nuestro caso, cromatografía de afinidad. Una segunda posibilidad para
acceder al proteoma “oculto” de los fluidos biológicos consiste en incrementar el
número relativo de copias de las proteínas de baja abundancia a la par que se reduce el
número de copias de las más abundantes. Esta tecnología, introducida por el grupo de
Boschetti en el año 2005 (Thulasiraman et al., 2005; Righetti et al., 2005a; Righetti et al.,

169
 Resultados & Discusión

2005b), no está demasiado explorada todavía, a tenor del bajo número de publicaciones
con muestras de fluidos biológicos humanos como el plasma, suero, fluido
cerebroespinal, leche u orina. La metodología se basa en el uso de bibliotecas de
ligandos peptídicos combinatorios (CPLL; “combinatorial peptide ligand library”) unidos
a una fase sólida (“beads”), también denominada tecnología “Equalizer” por el grupo de
Boschetti. Esta tecnología se basa en beads cromatográficas con una estructura porosa,
un diámetro promedio de 60 μm y con una densidad de ligandos de 40-60 μmoles por
cada ml de volumen empaquetado de resina. Estos últimos son hexapéptidos formados
a través de 64 millones de combinaciones aleatorias de los 20 aminoácidos que
constituyen las proteínas (Número de ligandos disponibles= Nn, en donde N = número
de aminoácidos y n el número de ciclos de síntesis. Cuando N=20 aminoácidos y n=6
ciclos (hexapéptidos; 6 aa), Nn= 206= 64,000,000 ligandos peptídicos diferentes). Cada
esfera contendrá, por tanto, millones de ligandos con una determinada secuencia
primaria y una estructura concreta que puede ser empleada para capturar una o varias
especies proteicas. Como en la matriz hay millones de esferas, el resultado es un elevado
número de hexapéptidos diferentes en la matriz cromatográfica, lo que significa que,
empleando un volumen apropiado de dicha matriz, habrá siempre alguna esfera
particular portando un hexapéptido específico capaz de interactuar con cualquiera de las
proteínas presentes en un proteoma complejo como el de un fluido biológico. Es más, es
probable que haya especies proteicas interactuando con más de una esfera/hexapéptido
a la vez o diferentes esferas que interactúen con la misma proteína. En cualquier caso, si
tenemos en cuenta que el número de genes en el ser humano oscila entre 20,000-
25,000 (“International Human Genome Sequencing Consortium”, 2004), los 64 millones
de combinaciones de los hexapéptidos parecen suficientes. En palabras del grupo de
Boschetti, estas bibliotecas de ligandos peptídicos “aceptan y adoptan todos los tipos de
fe, colores, razas y credos” (Boschetti et al., 2007).

La tecnología se comercializa bajo el nombre de ProteoMinerTM beads o Equalizer

beads. ProteoMinerTM ha sido combinado, por ejemplo, con SELDI-TOF-MS (Sihlbom et
al., 2008; Fröbel et al., 2010) o 2-DE DIGE (Sihlbom et al., 2008), y es una metodología de
gran simpleza. El protocolo del ProteoMinerTM fue llevado a cabo de acuerdo con las

170
 Resultados & Discusión

instrucciones del manufacturador, partiendo de 1 mL de suero con una concentración

de ≥50 mg/mL (≥50 mg de proteína total). De este modo, cuando la matriz es
sobresaturada con una mezcla compleja de proteínas como es el suero, cada esfera
específica por una proteína abundante como la albúmina se verá saturada y la mayor
parte de dicha proteína no se unirá a la matriz. En cambio, las proteínas poco
abundantes o con una riqueza intermedia serán capturadas completamente por las
esferas, y no se perderán en la fracción no retenida por la cromatografía de afinidad; es
decir, se enriquece en proteínas “traza” al mismo tiempo que se empobrece el fluido
biológico en proteínas inicialmente abundantes. En este sentido es una tecnología
diferente a los aptámeros de DNA y RNA, que están diseñados para la eliminación de
una proteína concreta de cada vez (Tuerk & Gold, 1990). Las interacciones entre los
hexapéptidos y las proteínas son fuertes y basadas en enlaces ión-ión, puentes de
hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, dipolo-dipolo o fuerzas de van-der-Waals. Se ha
descrito también la unión de proteínas a los polímeros que constituyen las beads
(Hartwig et al., 2009).

En cuanto a la elución existen varias opciones de deshacer estas interacciones.

Puede realizarse en un solo paso con un tampón agresivo o bien en varios pasos con un
único tampón o con varios. Algunos de estos tampones son soluciones caotrópicas
neutrales basadas en urea (y en algunas ocasiones tiourea), como por ejemplo los
siguientes: 1) 2M tiourea, 7M urea, 4 % CHAPS
(tampón TUC; Righetti et al., 2006; Martins de Souza et al., 2007); 2) 4M urea, 1 %
CHAPS (Righetti et al., 2006; Bandow et al., 2010); 3) 4M urea, 1 % CHAPS, 5 % ácido
acético (Righetti et al., 2006; Dwivedi et al., 2010; Ernoult et al., 2010; Fakelman et al.,
2010; Beseme et al., 2010); 4) 8M urea, 2 % CHAPS, 5 % ácido acético (Righetti et al.,
2006; Fröbel et al., 2010; De Bock et al., 2010). Este tipo de tampones deshacen las
interacciones hidrofóbicas y los puentes de hidrógeno y, más importante, son
compatibles con 2-DE. Otros, de elevada fuerza iónica y efecto
caotrópico/desnaturalizante, como 6M guanidine HCl pH ó 200 mM glicina-HCl pH 2.5
(Righetti et al., 2006; Wang et al., 2010), permiten eluir proteínas en un solo paso,
incluidas las más tenazmente unidas. Otra opción de elevada eficacia probada sería el

171
 Resultados & Discusión

hervido de las muestras en 4 % SDS, 25 mM DTT (Righetti et al., 2006; Bandhakavi et al.,
2009; Candiano et al., 2009). Sin embargo, todo este tipo de tampones requieren un
desalado posterior de las muestras por diálisis, cromatografía o precipitación si uno
quiere analizar la fracción retenida por electroforesis bidimensional.

En nuestros ensayos las esferas fueron lavadas varias veces en condiciones

fisiológicas con tampón PBS (150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, pH 7.4), para eliminar
todas aquellas proteínas no unidas a la matriz, y después de un lavado adicional con
agua desionizada, la fracción retenida, por la matriz, fue eluída con una solución que
contenía 8 M urea y 2 % CHAPS en 5 % ácido acético durante 15 min. Este proceso de
elución fue elegido en principio por ser el más compatible con la primera dimensión (IEF)
de la electroforesis bidimensional. Sin embargo, como muestra la figura 34A, cuando las
muestras fueron analizadas directamente mediante 2-DE se produjo una compresión
artefactual de algunas de las proteínas hacia el extremo acídico del gradiente de pH. Este
tipo de problemas ya han sido detectados previamente, y probablemente se deben a
sustancias interferentes procedentes del suero que han permanecido (lípidos y sales) y
sobre todo por la naturaleza acídica del reactivo de elución del kit, que impide la
focalización de las proteínas (Bellei et al., 2011). Por este motivo, las muestras tuvieron
que ser tratadas finalmente con el kit 2-D Clean-Up de Amersham, con el fin de eliminar
estos problemas antes de poder analizarlas. Aún así, y como se puede observar en la
Figura 34B, existe un notable “streaking” vertical en los geles en el caso de algunas
proteínas. La cantidad de proteína en la fracción eluída oscilaba entre 1.75 y 1.86 mg
(Tabla 16), lo que condicionaba notablemente el número de réplicas a realizar y la
cantidad de proteína a cargar en la primera dimensión. En estos ensayos se
seleccionaron tiras de isoelectroenfoque de 11 cm (pH lineal 5-8, BIO-RAD®), que fueron
cargadas con 0.1 mg de proteína de la fracción retenida. Estas condiciones fueron un
poco distintas de las empleadas para las muestras de suero sin
inmunoglobulinas/albúmina, no sólo en el rango de pH (11 cm, pH 4-7 de GE
Healthcare®) sino sobre todo en la cantidad de proteína cargada (0.5 mg). Por este
motivo, en esta serie de ensayos los geles bidimensionales fueron teñidos con SYPRO
Ruby, un fluoróforo que se une de forma no covalente a un gran número de proteínas

172
 Resultados & Discusión

(sobre todo acídicas), que tiene una elevada sensibilidad (0.25-1 ng) y reproducibilidad y
puede ser reutilizado (un factor muy importante teniendo en cuenta su elevado precio;
Lopez et al., 2000). La digitalización de los geles se llevó a cabo en el LAS 3000
(analizador de imágenes luminiscentes con cámara fuji).

TM
Figura 34. (ProteoMiner ).
A) Poll de muestra Sin
clean-up B) Con clean-up.
Tiras de IEF (11 cm, pH 5-8).
100 µg proteína/tira. 2-DE.

Tabla 16. Porcentaje de recuperación tras el ProteoMiner™.

Muestra Proteína cargada Proteína eluida (mg) % Recuperación

(mg)
Sueros 79.53 1.75 2.20

SAR 72.25 1.86 2.57

De la observación del gel representativo de la Figura 34B (suero tratado con

CPLL) se deduce que existe una notable disminución de proteínas abundantes como la
albúmina y las inmunoglobulinas así como un enriquecimiento en proteínas menos
abundantes, especialmente de peso molecular pequeño (Righetti et al., 2006). Esto se
traduce en una mayor uniformidad en la intensidad de los spots que en el suero inicial
(Figura 34A), así como en una mejor separación de las proteínas. No obstante, a pesar de
lo que indican ciertos autores (Léger et al., 2011), el número de spots (21) en los geles
de 2-DE no fue más elevado que el obtenido con los protocolos de fraccionamiento
mediante geles tiofílicos/anti-HSA (51) partiendo de un volumen de 1 mL de suero.
Además, proteínas de elevada abundancia como albúmina, α1-antitripsina, apo A-I, apo

173
 Resultados & Discusión

A-IV y apo E siguen estando todavía presentes en los sueros tratados con CPLL. Algunos
autores señalan que la presencia de estas proteínas puede ser debido a una aparente
mayor afinidad de las librerías peptídicas por especies de mediana abundancia como las
apolipoproteínas (Pitteri & Hanash, 2007). También pueden haber influido otros
aspectos en el número de spots detectados. El primero, la proporción suero: matriz. En
nuestro caso hemos empleado volúmenes de 1 mL de suero, pero una mayor cantidad
de muestra inicial (ej., 2, 5, 10 mL) podría ser importante para generar un mejor
rendimiento de proteína en la fracción retenida, ya que la limitada cantidad de proteínas
en la fracción eluída (Tabla 16) restringía a sólo 0.1 mg la carga de las tiras de IEF y el
número de réplicas. También, porque de ese modo hay una mayor cantidad de partida
de proteínas de baja abundancia para concentrar y así una mayor probabilidad de
detectarlas por 2-DE (Guerrier et al., 2006). El segundo, el proceso de captura de los
péptidos a pH neutral, ya que ciertos autores señalan que un pH acídico (pH 4.0) por
ejemplo, incrementa el número de proteínas fijadas a las librerías peptídicas (Guerrier et
al., 2006; Fasoli et al., 2010). También la fuerza iónica del tampón en este paso parece
influir (Guerrier et al., 2006). Por último, la elución de las proteínas en un único paso y
con un tampón basado en urea y CHAPS. De este modo, aunque este es un tampón
eficaz, es probable que hubiesen quedado proteínas fijadas todavía a la matriz y que
requiriesen una elevada fuerza iónica para su elución. De hecho, se estiman pérdidas
que llegan hasta el 20 % del total del proteoma analizado cuando se emplea este
tampón (Di Girolamo et al., 2011). Por este motivo, un proceso de elución secuencial
podría ser una mejor alternativa futura para lograr un mayor fraccionamiento de la
muestra e incrementar así el número de proteínas detectadas en nuestros geles
(Guerrier et al., 2006). Un ejemplo sería el propuesto por BioRad para el ProteoMiner:
Reactivo 1: 1M cloruro sódico, 20 mM HEPES; reactivo 2: 200 mM glicina pH 2.4; reactivo
3: 60 % etilen glicol en agua; reactivo 4: 33.3 % 2-propanol, 16.7 % acetonitrilo, 0.1 %
ácido trifluoroacético. El problema de este tipo de protocolos de elución secuencial es su
incompatibilidad con la electroforesis bidimensional. Aparte de la todavía baja
recuperación de proteína, otro problema de las CPLLs es su naturaleza no reutilizable y
el coste por cada mL de suero procesado, sobre todo en comparación con el uso de la
cromatografía tiofílica /cromatografía de afinidad anti-HSA (Tabla 17). En compensación,
174
 Resultados & Discusión

las CPLLs proporcionan una buena reproducibilidad técnica y un tiempo de

procesamiento corto, lo que ayuda a la hora de realizar estudios clínicos de medio
tamaño (e.j., N=100 muestras; Léger et al., 2011). Además, no están limitadas a
muestras procedentes de una especie en concreto, como ocurre con las matrices de
inmunoafinidad, de modo que la misma librería peptídica puede servir para tratar
muestras de suero humano, de ratón o de rata.

Algunos spots presentes en la fracción eluída de ProteoMinerTM fueron seleccionados

para la identificación mediante MS. Dicha identificación se realizó mediante
tripsinización y análisis de la huella peptídica (MASCOT), empleando como bases de
datos NCBI y MSDB.

Tabla 17. Comparativa costes/características de las dos aproximaciones (Adaptada de Millioni et al., 2011)

Fraccionamiento Reutilización Capacidad Recuperación Coste Coste Tiempo (h) requeridas

de proteína (€) por (€) por para procesar 1000 μL de
/específico de kit 1000 µL suero
muestra (2013) suero

(2013)

TM
ProteoMiner No/No 1000 µL ~3.7 % 100 € 100 € ~3h

(alta capacidad) (~70 mg de (~2.6 mg)

proteína)

Eliminación de parcialmente/ 1000 µL ~30 % 467 € 467 € ~5h

proteínas
abundantes parcialmente (~70 mg de
mediante T-gel y proteína)
anti-HSA

ProteoPrep20 100 veces/si 8 µL ~3 % (~17 µg) 1090 € 1300 € 0.5h x 125 = 62.5h

175
 Resultados & Discusión

La mayoría de los spots (los más prominentes), fueron identificados por

comparación con mapas de referencia, sobre todo los proporcionados por los trabajos
de Sihlbom et al., 2008, Beseme et al., 2010, Lorkova et al., 2011 y Bellei et al., 2011,
que emplearon suero (o plasma) y un sistema de elución similar (salvo el trabajo de
Sihlbom et al., que utilizó un proceso de elución secuencial) (Figura 35A). En total, y a
falta de una caracterización más exhaustiva de las proteínas retenidas por la librería
peptídica y de las confirmaciones pertinentes, se han identificado 18 proteínas no
redundantes en los geles bidimensionales. Dicho número podría llegar fácilmente al
doble, dado que existen numerosos spots de los que todavía se desconoce su naturaleza
(Figura 35A). No obstante, si asumimos dicho número y lo comparamos con el número
de proteínas detectadas conjuntamente en el albuminoma, inmunoglobulinoma y
fracción no retenida en la técnica de eliminación selectiva de proteínas mediante
cromatografía tiofílica y cromatografía anti-HSA (N=40), podemos decir que las CPLLs no
son más eficaces a la hora de permitir el acceso al proteoma profundo del suero que las
aproximaciones más clásicas de eliminación selectiva de proteínas partiendo de un
volumen de 1 ml de suero. Es más, si comparamos nuestros estudios (Figura 35B, A y B)
con los realizados por diversos autores en suero (o plasma) tratado con CPLLs y
analizado por 2-DE (Figura 35B; C, Sihlbom et al., 2008; D, Beseme et al., 2010; E, Bellei
et al., 2011) podemos deducir que el número de proteínas detectadas e identificadas
utilizando CPLLs oscila entre 18 y 35, que de 7-14 proteínas van a ser coincidentes entre
los diferentes trabajos (comparados de dos en dos), y que tan sólo tres proteínas son
comunes a todos los estudios: curiosamente dos apolipoproteínas, apo A-I y apo A-IV, y
un factor de complemento, el C4.

176
 Resultados & Discusión

pI
5 8L

A) ITIH4

AT-III
PLMN
MW (kDa)
AT-III

C4BP
Gelsolina
97.4
HSA
66.2
A1AT VDBP
PON1
IGHG1
45.0
APOA4 FHR1

ApoE FCN 2

CLUS FCN 3
CO4
CO4
CO4
APOA1
APOA4
31.0
SAP

APOA1

RBP4

21.5
B) TTHY

14.4

Figura 35. Mapa de referencia de las proteínas séricas humanas retenidas por la tecnologia de librerías
TM
peptídicas ProteoMiner (A) Proteínas séricas capturadas por CPLL (0.1 mg) seguido por IEF (tiras 11 cm, pH
lineal 5-8, BIO-RAD®) y electroforesis % SDS-PAGE. Las proteínas señaladas en negro fueron seleccionadas para su
identificación mediante MS. Las proteínas señaladas en azul fueron identificadas en bases a los mapas de
referencia publicados por Sihlbom et al., 2008 (plasma), Beseme et al., 2010, Bellei et al., 2011 (suero) y Lorkova et
al., 2011. (B) Diagrama de Venn que represente las proteínas identificadas en la FNR/FR y en la FR por
Proteominer.

177
 Resultados & Discusión

7.- ESTUDIO PRELIMINAR DE LOS NIVELES SÉRICOS DE PROTEÍNAS EN EL DIAGNÓSTICO

PRECOZ DE PACIENTES CON AR Y DONANTES SANOS

El siguiente paso dado fue validar el protocolo desarrollado de eliminación de

inmunoglobulinas y albúmina mediante cromatografía tiofílica/afinidad utilizando
muestras de 1 mL de suero de pacientes con artritis reumatoide recientemente
diagnosticada o cuyo tratamiento había cesado. El proteoma de estas muestras fue
comparado con el de muestras de suero de personas que no presentaban ningún signo o
síntoma de enfermedad ni aguda ni crónica (sanos). El proceso se llevó en dos etapas:
una primera preliminar, en las que se trabajo con un tamaño muestral muy pequeño
(N=3) a la búsqueda de grandes variaciones en la cantidad de las denominadas proteínas
o reactantes de fase aguda, y una segunda etapa en la que el tamaño muestral fue más
elevado (N=9) con el objetivo de realizar un estudio de expresión diferencial e identificar
variaciones más sutiles en la presencia de isoformas/variantes genéticas que pudiesen
estar ligadas a esta enfermedad.

En el primer estudio realizado se seleccionaron tres pacientes, dos mujeres y un

hombre, todos ellos con signos de artrosis, inflamación y dolor, pero con niveles
diferentes de proteína C reactiva (CRP), tasa de eritrosedimentación (ESR) y factor
reumatoide. Como grupo control se empleó el suero de tres voluntarios anónimos
sanos, de características similares respecto a rango de edad y sexo. La Tabla 18 resume
los parámetros clínicos de estos tres pacientes involucrados en este estudio preliminar.

Cada muestra (3 procedentes de individuos sanos y otras 3 de enfermos) fue

analizada por triplicado, de modo que se generó un número total de 18 tiras de IEF. Para
reducir la variabilidad técnica, se empleó la carcasa Ettan DALT Six para la segunda
dimensión. Con este sistema se pueden analizar al mismo tiempo hasta un número total
de doce muestras, ya que en cada uno de los geles de gran formato son acomodadas dos
tiras de IEF (11 cm); para facilitar la comparación, estas dos tiras se correspondían con
muestras de donantes sanos (S) y pacientes (SAR).

178
 Resultados & Discusión

Tabla 18. Características de los pacientes con AR (estudio preliminar).

Número Sexo Edad ESR* CRP* Factor Número de Número de Escala Signos
(años) reumatoide articulaciones articulaciones VAS* de
afectadas dolorosas (mm) artrósis

SAR0 m 74 5 - - 20 n.d 70 +
SAR1 f 81 51 16.8 + 6 6 30 +
SAR4 f 69 43 18.7 + 12 25 73 +

-1 -1
* ESR, ratio de sedimentación de eritrocitos (mm h ); CRP, proteína C reactiva (mg L ); Escala VAS, escala analógica
visual.

Con el mismo propósito, se utilizaron tiras de IEF de pH 4-7, ya que muy pocas
proteínas del suero tienen un punto isoeléctrico fuera de este rango de pH. La presencia
de las proteínas en los geles fue revelada mediante el uso del protocolo “Blue silver”
(Coomassie G-250 micelar), de sensibilidad algo menor a la tinción de plata pero mayor
compatibilidad con masas (Candiano et al., 2004). La Figura 36A (scatter plot; donantes
sanos vs. donantes enfermos) muestra la presencia en los geles de 266 spots, con un
excelente coeficiente de correlación entre los dos tipos de muestras (0.969) y una
pendiente de 1. Para refutar la hipótesis nula de concentraciones inalteradas de
concentraciones de proteínas (media ± SD) en las muestras de pacientes al compararlas
con las de donantes sanos los resultados fueron sometidos al test no paramétrico
Mann–Whitney (intervalo de confianza al 95 %), incluido dentro del programa
PDQuestTM y que no depende de la distribución de los datos.

Los resultados (Figuras 36B y Tabla 19) señalan la presencia de una serie de spots
significativamente reducidos en artritis reumatoide (p≤0.05), que se corresponden con
proteínas de fase aguda negativa como la albúmina, A1AT, α2-HS-glicoproteina,
antitrombina III, hemopexina, proteína de unión al retinol, tetranectina, transtirretina y
varias proteínas no identificadas. Del mismo modo, también fueron detectados en los
pacientes niveles significativamente (p≤0.05) elevados de la proteína de fase aguda
positiva haptoglobina y la LRG (Figura 37). De este modo, la reproducibilidad de la
cromatografía tiofílica, en combinación con la cromatografía de inmunoafinidad frente a
albúmina, permite detectar la respuesta de fase aguda subyacente en este tipo de

179
 Resultados & Discusión

pacientes, que no es distorsionada por el método de reducción del rango dinámico de la

muestra.

Las proteínas cuya expresión alterada ha sido detectada en nuestros geles están
inmersas en un complejo patrón en donde proteínas como por ejemplo la apo A-I, la
proteína de unión a vitamina D, la α2-macroglobulina, la α1-β-glicoproteina, la apo A-IV,
la apo E o el factor de complemento C1s están reducidas de manera concertada,
mientras que otras como el fibrinógeno, la α1-antiquimotripsina, la ceruloplasmina, la
proteína amiloide sérica A o el factor C3 están aumentadas.

Figura 36. Análisis comparativo sanos (n=3) vs enfermos (n=3). Se compararos 0.5 mg de proteína en tiras
de 11 cm, pH 4-7 para la 1D, la 2D se resolvió en la carcasa Ettan Dalt six. Los geles fueron teñidos con
Coomassie G-250 Blue Silver. Análisis estadístico llevado a cabo gracias al software PDQuest™, se
establecieron dos clases SANOS y ENFERMOS (A), cada clase tres individuos y cada individuo tres réplicas,
en total se analizaron 9 geles. La variabilidad inter e intramuestral fue calculada mediante la herramienta
“scater plot” del PDQuest. Se identificaron hasta 16 spots que presentaban diferencias significativas
(p≤0.05, Mann-Whitney, 95 %) mediante EM (B).

180
 Resultados & Discusión

Tabla 19. Spots significativos del análisis (p≤0.05).

SANOS AR

Número spot ssp Nombre proteína Intensidad del spot cv Intensidad del spot cv Ratio

2 6804 Álbumina 558523.1 53.4% 233135.9 71.2% 0.42 disminuida

5 1510 α1-antitripsina 2569628.0 42.0% 1241969.1 112.5% 0.48 disminuida

5 1512 α1-antitripsina 4826798.5 48.6% 2864055.3 152.2% 0.59 disminuida

5 2504 α1-antitripsina 4286870.0 20.1% 2600052.5 83.9% 0.61 disminuida

5 2704 α1-antitripsina 4269439.5 95.6% 1916439.3 84.4% 0.45 disminuida

5 3716 α1-antitripsina 3549737.8 90.3% 1672164.5 158.7% 0.47 disminuida

9 515 α2HS-glicoproteína 181317072.0 26.2% 109593952.0 26.1% 0.60 disminuida

13 4505 Antitrombina III 42670528.0 27.6% 25310356.0 17.9% 0.59 disminuida

13 4508 Antitrombina III 23376402.0 32.1% 13934679.0 46.4% 0.60 disminuida

13 5401 Antitrombina III 3045072.5 38.2% 1567074.0 39.8% 0.51 disminuida

29 1215 Haptoglobina cadena β 9777729.0 130.5% 91299472.0 73.2% 9.34 aumentada

29 2208 Haptoglobina cadena β 5881880.0 84.1% 12482924.0 41.2% 2.12 aumentada

29 6004 Haptoglobina cadena β 340042.0 88.1% 863209.8 58.6% 2.54 aumentada

30 7 Hemopexina 619800.3 56.7% 257991.1 71.9% 0.42 disminuida

35 208 LRG 2441945.5 48.8% 6496081.5 42.2% 2.66 aumentada

35 302 LRG 1596791.1 61.2% 4603481.5 56.4% 2.88 aumentada

35 304 LRG 409688.3 79.7% 1615957.0 72.8% 3.94 aumentada

38 4010 Retinol BP 1966487.0 51.2% 742569.4 120.7% 0.38 disminuida

40 4009 Tetranectina 615996.4 84.3% 221736.8 59.7% 0.36 disminuida

41 4008 Transtirretina 15946162.0 34.5% 5383894.0 36.0% 0.34 disminuida

43 6903 desconocida 392372.4 53.8% 226828.9 86.9% 0.58 disminuida

44 7908 desconocida 1008919.4 54.0% 402722.4 81.2% 0.40 disminuida

45 8317 desconocida 4437155.0 25.0% 2817992.5 35.4% 0.64 disminuida

46 8318 desconocida 3522495.0 28.5% 2113195.5 59.0% 0.60 disminuida

47 5021 desconocida 485981.5 51.1% 208038.4 44.6% 0.43 disminuida

48 6009 desconocida 230285.6 98.9% 119169.1 10.7% 0.52 disminuida

Los coeficientes de variación; CV % se calcularon como desviación estándar (SD)/media x 100, de cada spot.

Dicha respuesta de fase aguda es dependiente de la producción de citoquinas

proinflamatorias (IL-1, IL-6, TNF-α o IL-12) por parte de células presentadoras de
antígeno. Ayuda al cuerpo a opsonizar y fagocitar ciertas macromoléculas procedentes
del tejido dañado, como es el caso de la CRP o los factores del complemento. También
181
 Resultados & Discusión

bloquea la acción de enzimas proteolíticas (ej., α1-antitripsina y α1-antiquimotripsina),

captura moléculas de hemoglobina (ej., Haptoglobina o hemopexina), regula la
fibrinolisis (ej., Tetranectina) o simplemente sirven de almacén de aminoácidos que son
movilizados en el momento que se requiera realizar síntesis de otras proteínas (ej.,
albúmina y transtiretina). De otras, en cambio, se desconoce su función (ej., α2-HS-
glicoproteína).

Figura 37. Proteínas significativas de nuestro análisis. Proteínas como la

haptoglobina o la LRG se encuentran aumentadas en pacientes de AR, mientras
que otras como la tetranectina o la ATIII están reducidas.

182
 Resultados & Discusión

De acuerdo con nuestros datos de variabilidad intermuestral (CV = 49.1±28.2 %) y

datos publicados por Molloy et al. en 2003, un tamaño muestral de n= 3–4 podría ser
suficiente para detectar, con un 80 % de poder estadístico (sensibilidad) y un valor p de
0.05, un cambio de cómo mínimo 2-veces (100 %) en el valor de intensidad de un spot.
Por tanto, existe en nuestro estudio un nivel de confianza estadística razonable para
mostrar diferencias cuantitativas de proteínas como LRG, con aumentos de 2.66–3.94
veces (150-300 %) (Tabla 19). Sin embargo, en esta primera fase nuestro objetivo no era
identificar proteínas expresadas diferencialmente en pacientes, sino probar que el
protocolo es adecuado para la realización de estudios proteómicos cuantitativos. Por lo
tanto, los datos referidos a la abundancia diferencial de LRG, ATIII o la proteína de unión
al retinol (Figura 37) fueron, en este punto, tomados como preliminares. Además, se
habían observado diferencias cuantitativas, aunque no siginificativas, en los niveles de
otras proteínas séricas como la transferrina, ApoAI, SAP o α1-microglobulina. Por ese
motivo, el número de muestras fue ampliado de 3 a 8 donantes en cada grupo muestral.

8.- ESTUDIO PROTEÓMICO CUANTITATIVO EN SUEROS DE PACIENTES CON ARTRITIS

REUMATOIDE
Para este nuevo estudio hemos tenido en cuenta una variabilidad intermuestral
promedio en nuestros datos del 49 % (S), y asumido un riesgo de falsos positivos del 5 %
(T) para poder elegir un tamaño de muestra (n) que nos controle el riesgo de falsos
negativos. Para ello hemos establecido una sensibilidad del 80 % (poder estadístico; Z),
que es la probabilidad de que una proteína expresada diferencialmente nos aparezca
con niveles aumentados (o reducidos) en el grupo de pacientes, y un valor de expresión
diferencial (D) que queremos detectar de por lo menos 125 % (2.25 veces). Con estos
datos, se puede hacer una estimación bastante buena del tamaño muestral (n) necesario
a través de la expresión:
S2
n  2Z  T 
2

D2

Teniendo en cuenta un poder estadístico del 80 % y un nivel de significación del 5

% esta expresión puede ser simplificada y nos genera un tamaño muestral de
aproximadamente n= 8 (Horgan et al., 2007). Por este motivo, el segundo grupo de
183
 Resultados & Discusión

estudio consistió en 8 individuos control sanos y 8 enfermos no medicados o de reciente

diagnóstico. El rango de edad del grupo control osciló entre 24 y 59 años, y contuvo 3
hombres y 5 mujeres. En cuanto al grupo de pacientes, su media de edad fue algo
superior (entre 19 y 81 años), y estaba formado por 2 hombres y 6 mujeres. Las
características de los pacientes se resumen en la Tabla 20. Aunque la replicación
biológica es siempre mejor que la replicación técnica (Horgan et al., 2007), la cantidad
de muestra obtenida nos permitió analizar por triplicado tanto los sueros sin
inmunoglobulinas ni albúmina como el inmunoglobulinoma. Se utilizaron (0.5 mg
proteína/tira), generando un montante total de 96 geles bidimensionales. Cada muestra
fue emparejada, de modo que en cada gel se analizó una muestra de un donante sano
(S) y una muestra de un paciente (SAR). Dado que por debajo de pH 4 o por encima de
pH 7 apenas se visibilizaban proteínas, se trabajó con un rango de pH 4-7NL para el
suero sin Ig/HSA. En cambio, se empleó un rango de pH 3-10NL para el
inmunoglobulinoma. Una vez teñidos los geles, digitalizados y analizadas las imágenes
mediante el software PDQuest, se obtuvieron un conjunto de datos de intensidad para
cada uno de los spots. Cabe destacar, a primera vista, que los patrones de spots
visualizados en los geles de los controles sanos en comparación con los observados en
enfermos son muy similares, lo que se corresponde con los altos coeficientes de
correlación (0.943, inmunoglobulinoma; 0.949, FNR total) obtenidos mediante la
herramienta Scatter Plot de PDQuestTM (Figura 38).

184
 Resultados & Discusión

Tabla 20. Características de los pacientes con AR

Número sexo Edad ESR* CRP* Factor Número de Número de Escala Signos de
(años) reumatoide articulaciones articulaciones VAS* artrósis
afectadas dolorosas (mm)
SAR0 m 74 5 - - 20 n.d 70 +
SAR1 f 81 51 16.8 + 6 6 30 +
SAR4 f 69 43 18.7 + 12 25 73 +
SAR5 f 53 72 n.d n.d 5 5 90 -
SAR6 f 19 n.d n.d n.d 15 22 75 -
SAR7 m 67 n.d n.d n.d 16 22 70 -
SAR8 f 64 n.d n.d n.d 22 35 n.d n.d
SAR9 f 46 n.d n.d + 15 21 60 -

* ESR, ratio de sedimentación de eritrocitos (mm h-1); CRP, proteína C reactiva (mg L-1); Escala VAS, escala analógica
visual.

Figura 38. Imagen Scatter Plot sanos vs SAR. Podemos observar unos altos coeficientes de correlación tanto
para el inmunoglobulinoma (A) como para la FNR total (B). A demás podemos apreciar en número total de
spots analizados en cada uno de los análisis, 220 spots en el caso de las inmunoglobulinas (A) y 253 spots para
las muestras sin Igs ni HSA (B).

185
 Resultados & Discusión

8.1.- ESTUDIO ESTADÍSTICO UNIVARIANTE

Para un análisis más pormenorizado de las diferencias en composición proteica

entre las muestras de individuos sanos y las de los pacientes, los datos de intensidad
fueron sometidos a análisis estadístico empleando el programa R ([Link]
[Link]/). Con el fin de detectar diferencias significativas entre los dos grupos
independientes (sanos y enfermos) el primer tipo de análisis estadístico fue de tipo
univariante, aplicando dos tipos de contrastes: a) Un test t de Student para aquellas
variables que seguían una distribución normal; b) un test basado en rangos como la U de
Mann-Whitney (generalización del test de Wilcoxon) para realizar contraste de
diferencias en aquellas variables cuya distribución no era normal. Para evaluar la
normalidad de las distribuciones se aplicó el test de Shapiro-Wilks, un contraste más
permisivo que el Kolmogorov-Smirnov; se fijó un nivel de significación del 5 %.

Suero sin inmunoglobulinas/albúmina

En el caso de las muestras de suero a las que se les había eliminado las
inmunoglobulinas y la albúmina se identificaron 30 spots cuya distribución era normal.
Aplicamos el contraste de diferencias de medias (T-test) considerando como hipótesis
nula (H0) que los valores medios en los dos grupos eran iguales, y como hipótesis
alternativa (Ha) que los valores medios en los grupos eran distintos. Como se muestra en
la Tabla 21, se encontraron reducciones significativas (5 %) en el grupo de pacientes para
8 de esos 30 spots: albúmina, apo A-I, apo A-IV, apoH, ATIII y transtirretina. En cambio,
la cadena β de la haptoglobina estaba significativamente aumentada en artritis
reumatoide.
El siguiente paso fue realizar un contraste de igualdad de distribuciones basado
en rangos de las variables para evaluar si existían diferencias significativas entre los
grupos. Se realizaron dos contrastes. En el primero se tomó como hipótesis nula (H0)
que la distribución de los spots en sanos y enfermos era la misma, y como hipótesis
alternativa (Ha) que la distribución de los spots en sanos y enfermos era diferente.

186
 Resultados & Discusión

TABLA 21. Resultados del T-test correspondientes al suero sin inmunoglobulinas ni albúmina
CANTIDAD EN Nº SPOT ASIGNADO EN
PROTEÍNA BIBLIOGRAFÍA P-VALOR EN T-TEST
PACIENTES PDQuestTM

Albúmina* Reducida Spot 7604 Niwa et al., 1990 0.008

Apo A-I Reducida Spot 4004 Doherty et al., 1998 0.003

Apo A-IV Reducida Spot 3204 Doherty et al., 1998 0.011

ApoH Reducida Spot 7506 (**) 0.034

ATIII Reducida Spot 5504 Kamper et al., 1998 0.004

Doherty et al., 1998;

Haptoglobina,  Aumentada Spot 3205 0.009
Kantor et al., 2004

Doherty et al., 1998;

Haptoglobina,  Aumentada Spot 3210 0.006
Kantor et al., 2004

Transtirretina Doherty et al., 1998

Reducida Spot 6009 0.017
tetramérica * (monomérica)

(*) Proteínas séricas cuya concentración ya se había encontrado modificada en el estudio preliminar. No se pudieron confirmar la
α2-HS-glicoproteína, la proteína fijadora de retinol y la tetranectina. (**) Bibliografía no encontrada.

Dado que existían datos repetidos (ties) debidos al valor del background se utilizó
una modificación de la U de Mann-Whitney, encontrando que 41 de ellos presentaban
diferencias significativas en los valores de intensidad (Tabla 22). Posteriormente, se
realizó un nuevo contraste utilizando el test U de Mann-Whitney, si bien esta vez se
modificó el planteamiento de la hipótesis inicial: H0, distribución del spot en sanos está
“por encima” o es igual que en enfermos; Ha: distribución del spot en sanos está por
debajo que en enfermos. En la Tabla 22 se muestran los spots para los que rechazamos
H0; es decir, aquellas proteínas aumentadas en enfermos. De este modo, se confirmaron
elevaciones en pacientes de proteínas de fase aguda positivas ya detectadas en el
estudio preliminar, como la haptoglobina, así como incrementos en una serie de
proteínas no identificadas (Tabla 22). Por otro lado, se siguieron observando reducciones
en las mismas proteínas de fase aguda negativa que en el estudio preliminar (albúmina,
A1AT, antitrombina III, hemopexina y transtirretina), ampliando dicho número al factor
C2 del complemento, tres apolipoproteínas (apo A-I, apo A-IV y apo H) y una serie de
proteínas todavía no identificadas. No fueron confirmadas, sin embargo, las alteraciones
en las proteínas séricas α2-HS-glicoproteina, la proteína de unión al retinol o la
tetranectina, si bien estudios de otros autores han observado modificaciones en estas
proteínas (Doherthy et al., 1998; Camafeita et al., 2009; Kamper et al., 1998; Sato et al.,
2007 y Honkanen et al., 1989).

187
 Resultados & Discusión

TABLA 22. Resultados del test U- de Mann-Whitney correspondientes al suero sin

inmunoglobulinas ni albúmina
P-VALOR EN U-DE MANN-
Nº SPOT
CANTIDAD EN WHITNEY
PROTEÍNA ASIGNADO EN BIBLIOGRAFÍA
PACIENTES
PDQuestTM Contraste 1§ Contraste 2#

A1AT* Reducida Spot 1604 Doherty et al., 1998; 0.01965 n.s.

Albúmina* Reducida Spot 6804 Niwa et al., 1990 0.01216 n.s.

Albúmina* Reducida Spot 7604 Niwa et al., 1990 0.00823 n.s.

Albúmina* Reducida Spot 7805 Niwa et al., 1990 0.01952 n.s.

Doherty et al., 1998; Serada 0.00633 n.s.

Apo A-I Reducida Spot 4004
et al., 2010

Apo A-IV Reducida Spot 3204 Doherty et al., 1998 0.00482 n.s.

ApoH Reducida Spot 7506 0.02541 n.s.

ApoH Reducida Spot 8510 (**) 0.02404 n.s.

ATIII Reducida Spot 4605 Kamper et al., 1998 0.03941 n.s.

ATIII Reducida Spot 5504 Kamper et al., 1998 0.00553 n.s.

ATIII Reducida Spot 5505 Kamper et al., 1998 0.03900 n.s.

Complemento C2 Reducida Spot 6707 (**) 0.03797 n.s.

Complemento C2 Reducida Spot 7802 0.03981 n.s.

Complemento C2 Reducida Spot 7806 0.00298 n.s.

Complemento C2 Reducida Spot 8807 0.00444 n.s.

Complemento C2 Reducida Spot 8808 0.00055 n.s.

Complemento C2 Reducida Spot 8809 0.00025 n.s.

Complemento C2 Reducida Spot 8813 0.03156 n.s.

Haptoglobina,  Aumentada Spot 6011 Doherty et al., 1998; 0.00976 0.00488

Doherty et al., 1998; Kantor et 0.00592 0.00296

Haptoglobina,  Aumentada Spot 2204
al., 2004

Doherty et al., 1998; Kantor et 0.00592 0.00296

Haptoglobina,  Aumentada Spot 3205
al., 2004

Doherty et al., 1998; Kantor et 0.00771 0.00386

Haptoglobina,  Aumentada Spot 3210
al., 2004

Doherty et al., 1998; Kantor et 0.01626 0.00813

Haptoglobina,  Aumentada Spot 5204
al., 2004

Haptoglobina,  Reducida Spot 7006 0.04361 n.s.

Hemopexina* Reducida Spot 6 Doherty et al., 1998 0.01294 n.s.

Hemopexina* Reducida Spot 7 Doherty et al., 1998 0.02014 n.s.

188
 Resultados & Discusión

Dwivedi et al., 2009; Zheng et 0.03941 0.01970

LRG* Aumentada Spot 1305
al., 2009; Serada et al., 2010

Sin identificar Aumentada Spot 2202 n.s. 0.02665

Sin identificar Aumentada Spot 2409 n.s 0.03985

Sin identificar Aumentada Spot 5106 n.s. 0.03231

Sin identificar Aumentada Spot 2907 0.03194 0.01597

Sin identificar Aumentada Spot 2908 0.00051 0.00025

Sin identificar Aumentada Spot 3906 0.00214 0.00107

Sin identificar Reducida Spot 5802 0.00707 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 5803 0.00540 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 6305 0.02532 n.s.

Sin identificar Aumentada Spot 7203 0.01202 0.00601

Sin identificar Reducida Spot 7507 6,00E-05 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 7509 0.03930 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 8408 0.00782 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 8512 0.02016 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 8705 0.00048 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 8707 0.00129 n.s.

Transtirretina Doherty et al., 1998

Reducida Spot 6009 0.01937 n.s.
tetramérica * (monomérica)

(*) Proteínas séricas cuya concentración ya se había encontrado modificada en el anterior estudio. No se pudieron confirmar
la a2HS-glicoproteína, la proteína fijadora de retinol y la tetranectina. (§) Contraste 1: H0, distribución del spot en sanos y
pacientes es la misma; Ha, distribución del spot en sanos y pacientes es diferente. (#) Contraste 2: H0, distribución del spot en
sanos está “por encima” o es igual que en pacientes; Ha, distribución del spot en sanos está por debajo que en enfermos. (**)
Bibliografía no encontrada.

Inmunoglobulinoma

En el caso de inmunoglobulinoma también se comprobó la hipótesis de

normalidad mediante un test de Shapiro-Wilk con una significación del 5 % para los
distintos spots, distinguiendo los grupos de sanos y enfermos. Trece spots tuvieron una
distribución normal, tanto en sanos como enfermos, pero al aplicar un test T de
comparación de medias tan sólo se encontró un aumento significativo (media en sanos,
3,693.558; media en enfermos, 6,439.225) en el grupo de pacientes (p-valor= 0.00062)
189
 Resultados & Discusión

para una proteína todavía sin identificar (SPOT 8118). El siguiente paso fue, por tanto,
ver si existían diferencias entre las distribuciones de los spots en los grupos de sanos y
enfermos sin suponer la hipótesis de normalidad. Para ello se utilizó el test de Mann-
Whitney (o de Wilcoxon, ya que se trataba de un contraste de distribuciones entre dos
grupos), con una significación del 5 %. Los resultados de aquellos spots en donde se
encontraron diferencias en las distribuciones de los valores entre los grupos son
resumidos en la Tabla 23 (contraste 1). Una vez detectadas dichas diferencias, al igual
que se hizo anteriormente, se aplicó el test de Mann-Whitney modificando el
planteamiento de las hipótesis y considerando como hipótesis nula (H0) que la
distribución del spot en sanos estaba “por encima o era igual” que en el grupo de
pacientes; es decir, que de rechazarse dicha hipótesis y aceptar la hipótesis alternativa el
valor de intensidad en el spot sería significativamente más alto en pacientes RA que en
sanos.

TABLA 23. Resultados del test U- de Mann-Whitney correspondientes al inmunoglobulinoma

P-VALOR EN U-DE MANN-
Nº SPOT
CANTIDAD EN WHITNEY
PROTEÍNA ASIGNADO EN BIBLIOGRAFÍA
PACIENTES
PDQuestTM Contraste 1§ Contraste 2#

Sin identificar Aumentada Spot 112 0.01062 0.00531

Sin identificar Reducida Spot 118 0.00016 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 119 0.00946 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 212 0.00085 n.s.

Kininógeno Reducida Spot 410 (**) 0.00978 n.s.

Kininógeno Reducida Spot 411 0.00708 n.s.

Kininógeno Reducida Spot 413 0.0044 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 708 0.00543 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 1010 0.0389 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 1208 0.04883 n.s.

Sin identificar Aumentada Spot 1408 0.00013 6 x 10-5

Sin identificar Aumentada Spot 2008 0.03194 0.01597

Sin identificar Aumentada Spot 2014 0.02867 0.03716

190
 Resultados & Discusión

Sin identificar Reducida Spot 2104 0.03059 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 3307 0.00637 n.s.

Sin identificar Aumentada Spot 4005 0.00036 0.00018

Sin identificar Reducida Spot 5103 0.04632 n.s.

Sin identificar Reducida Spot 5104 0.03683 n.s.

Sin identificar Aumentada Spot 5206 0.04592 0.02296

Sin identificar Aumentada Spot 6003 0.01828 0.00914

Sin identificar Reducida Spot 6107 0.04069 n.s.

Sin identificar Aumentada Spot 7005 0.04592 0.02296

-4
Sin identificar Aumentada Spot 7119 1 x 10 5 x 10-5

Sin identificar Reducida Spot 7206 0.00045 n.s.

Sin identificar Aumentada Spot 7515 0.03742 0.01871

Sin identificar Aumentada Spot 8009 0.00757 0.00378

Sin identificar Aumentada Spot 8118(*) 0.00051 0.00026

Complemento C3 Aumentada Spot 8512 Doherty et al., 1998 0.00188 0.00094

(*) Para el SPOT 8118 se aceptaba la hipótesis de normalidad y se veían diferencias significativas entre las medias de los
grupos, encontrándose aumentada en pacientes. El test de rangos también encuentra diferencias significativas entre las
distribuciones y un aumento en pacientes. (§) Contraste 1: H0, distribución del spot en sanos y pacientes es la misma; Ha,
distribución del spot en sanos y pacientes es diferente. (#) Contraste 2: H0, distribución del spot en sanos está “por encima o
es igual” que en pacientes; Ha, distribución del spot en sanos está “por debajo” en relación a los enfermos. (**) Bibliografía
no encontrada.

Nuestros resultados en el contexto de otros estudios proteómicos con sueros/plasmas

de pacientes con artritis reumatoide

Como se desprende de la Tabla 24, algunos estudios proteómicos comparativos

han buscado cambios específicos en el proteoma de suero, plasma o fluido sinovial de
pacientes con artritis reumatoide, con el fin de encontrar biomarcadores diagnósticos de
esta patología. El primero de estos estudios fue realizado por Doherty et al. en 1998,
quien puso de manifiesto mediante electroforesis bidimensional la alteración de
diversas proteínas plasmáticas consecuencia de la respuesta de fase aguda presente en
estos pacientes. En nuestros análisis (Salgado et al., 2010) hemos detectado dicha
respuesta de fase aguda, con una serie de proteínas aumentadas (APP+) y reducidas

191
 Resultados & Discusión

(APP-) que concuerda perfectamente con los trabajos de Doherty. Estos resultados
demuestran que la eliminación de inmunoglobulinas y albúmina no desvirtúa los
cambios en el proteoma producidos por la enfermedad.
Una de estas proteínas aumentada en el plasma de pacientes RA encontrada por
Doherty fue SAA, un hallazgo confirmado por otros investigadores (Sinz et al., 2002; De
Seny et al., 2008 y Zheng et al., 2009). En nuestro estudio no hemos sido capaces de
detectar la presencia de dicha proteína debido a su pequeño tamaño (104 amino ácidos;
Lakota et al., 2011). SAA existe como proteína de fase aguda (A-SAA; isotipos 1,2) y
como proteína constitutiva (C-SAA; isotipo 4). La síntesis hepática de A-SAA se produce
por un aumento de citoquinas inflamatorias, mientras que la forma constitutiva se
produce de una manera más constante, en ausencia de inflamación. A-SAA es una
proteína, que está relacionada con procesos de migración célular y reorganización del
citoesqueleto en tejido sinovial (Connolly et al., 2011). También se ha visto, que SAA
colocaliza con filamentos de actina, vimentina y microtúbulos (Lakota et al., 2011). Esto
apoyaría el estudio realizado por Zheng y colaboradores, donde vieron aumentos de
actina, vimentina, tubulina además de otras proteínas del citoesqueleto en plasma de
pacientes con RA (Tabla 24). El papel del citoesqueleto en RA también ha sido destacado
por otros autores (Schulz et al., 2007), que identificaron una serie de proteínas como la
actina y la EBP50 (ezrin-moesin binding protein 50), que estaban reducidas en PBMCs de
pacientes. Curiosamente, en dicho trabajo también se identificaron reducidas una serie
de proteínas (Hsp60, GRP78/BiP) que han sido descritas por varios autores como
autoantígenos en RA. Por ejemplo, Blass et al. (2001) Hueber et al. (2005) y
posteriormente Göeb et al. (2009) sugirieron el papel de los autoanticuerpos frente a la
chaperona BiP, como un marcador diagnóstico de RA (Tabla 24). Estos dos últimos
autores, así como otros (Saulot et al., 2002; Kinloch et al., 2005, 2008) también
describen la presencia de autoanticuerpos en RA, frente a: i) otras chaperonas (o
proteínas adaptadoras que modulan la actividad de las chaperonas) como HSPs 60, 65,
70 y 90, calreticulina, fosfoproteína 1 inducida por estrés; ii) enzimas de la glucolísis
como la glucosa-6-fosfato isomerasa, PGK1 (fosfoglicerato quinasa 1) y α-enolasa (Tabla
24). Se ha visto que algunos de estos autoantígenos (ej., BiP) se encuentran también,
aumentados en saliva de RA (Giusti et al., 2010).
192
 Resultados & Discusión

Algunas modificaciones post-traduccionales como fosforilación, proteolisis,

glicosilación, citrulinización y oxidación, parecen ser las responsables de la generación
de nuevos antígenos, y por lo tanto autoanticuerpos, como es el caso de la
citrulinización en RA (Eggleton et al., 2008). El primer autoantígeno citrulinado
detectado en suero de pacientes con RA fue α-enolasa, que es la proteína frente a la que
realmente van dirigidos los autoanticuerpos (Kinloch et al., 2005).Diversos autores
(Hueber et al., 2005; Kinloch et al., 2005, 2008; Matsuo et al., 2006; Skriner et al., 2006,
Tabushi et al., 2008 y Chang et al., 2013) han confirmado la presencia de
autoanticuerpos frente a otras proteínas citrulinadas, siendo además un factor de peor
prognóstico de la enfermedad. No obstante, se sabe que los autoanticuerpos también
reconocen proteínas no citrulinadas (Hueber et al., 2005).
Otra modificación post-traduccional importante en la enfermedad de RA es la
proteólisis. Colágeno, gelatina, elastina, fibronectina, proteoglicanos y vitronectina
forman parte de la matriz extracelular (ECM). Diferentes proteasas han sido implicadas
en la remodelación de la ECM en RA; por ejemplo, metaloproteinasas como
MPP9/gelatinasa B (Van den Steen et al., 2002). Las metaloproteinasas tales como las
MMPs (metaloproteinasas de matriz) han sido implicadas en la destrucción patológica
de las articulaciones en RA y OA. Estas enzimas no solo degradan macromoléculas de la
ECM, sino que también podrían estar implicadas en reparación tisular. Aparte de la
MPP9 citada anteriormente, son importantes también en RA la MPP1, 2, 3 y 13 además
de otras proteasas como la elastasa, producida por macrófagos. El colágeno, la gelatina,
fibronectina y la elastina son degradadas por todos estos enzimas y su acción es
contrarrestada por inhibidores naturales como la α-2 macroglobulina (Zheng et al.,
2009) o la α-1 antitripsina (Kantor et al., 2004)
([Link] La α-1 antitripsina es considerada una
proteína de fase aguda positiva, por lo que es normal observarla aumentada durante un
proceso inflamatorio (Swedlund et al., 1974; Robinson et al., 1981), sin embargo aparece
reducida en nuestro estudio (Salgado et al., 2010). Esto podría deberse al hecho de que
se haya descubierto, recientemente que dicha proteína se encuentra citrulinada (Chang
et al., 2013) y por lo tanto sea reconocida por los autoanticuerpos y eliminada de la
circulación. Otra explicación posible, de la reducción de A1AT sería un “agotamiento”
193
 Resultados & Discusión

por el aumento de proteasas tipo elastasas, caspasas, trombina, plasmina, en RA. Tanto
la citrulinización como los altos niveles de proteasas estarían relacionados con un estado
de mayor gravedad. En cualquier caso, el aumento de la actividad proteolítica afectaría a
algunas de las proteínas de la ECM citadas anteriormente (colágeno, la gelatina,
fibronectina, etc.), las cuales a su vez sufrirían modificaciones post-traduccionales, como
oxidaciones y citrulinizaciones, que darían lugar a la generación de autoanticuerpos
(Hueber et al., 2005; Skriner et al., 2006; Kim et al., 2006; Tabla 24). Estos datos apoyan
la tesis de que la proteólisis extracelular y otras modificaciones postraduccionales de los
péptidos antigénicos, pueden ser críticos en el establecimiento y la perpetuación de los
procesos autoinmunes (Van den Steen et al., 2002).
Las calgranulinas están producidas por las células polimorfonucleares
(neutrofilos, basofilos y eosinofilos) de ahí que los niveles de estas proteínas se disparen
durante los procesos inflamatorios. Presentan una función reguladora sobre neutrofilos,
monocitos, macrófagos, mastocitos y condrocitos, participando además en la migración
celular, quimiotaxis, desarrollo tisular y de reparación. Baillet y colaboradores (Baillet et
al., 2010) las proponen como biomarcadores discriminatorios entre RA y otras
enfermedades reumáticas. Se han visto aumentos de calgranulinas B (S100A9) y C
(S100A12) en el fluido sinovial de pacientes RA, pero no así de calgranulina A (S100A8)
(Sinz et al., 2002). Sin embargo, este mismo año, el equipo de Uchida y colaboradores
detectaron aumentos de esta ultima proteína en fluido sinovial (Tabla 24; Uchida et al.,
2002). Un estudio posterior llevado a cabo por Drynda y col. (Drynda et al., 2004)
confirmó el incremento de calgranulina B/S100A9 también en el plasma de pacientes RA.
Posteriormente otros investigadores (Liao et al., 2004; De seny et al., 2008; Zheng et al.,
2009 y Giusti et al., 2010) reafirmaron que, efectivamente, había un incremento de estas
proteínas en RA.
Las células dañadas son eliminadas normalmente por apoptosis de una manera
rápida y eficiente. En algunas enfermedades autoinmunes, este mecanismo de
aclaramiento es defectuoso (Herrmann et al., 1998; Baumann et al., 2002) lo que
provoca la acumulación en la circulación, durante largos períodos, de células apoptóticas
que favorecen el desarrollo de autoanticuerpos. Estas células pueden liberar "señales de
peligro" que potencian la respuesta del sistema inmunológico. Algunas de estas señales
194
 Resultados & Discusión

de peligro pueden ser interleuquinas (IL-33, IL-1α), chaperonas (Hsp), adenosina y

citocromo c. Como veremos más adelante en este estudio, el citocromo c está
fuertemente relacionado con una proteína que tanto nuestro grupo (Salgado et al.,
2010) como otros investigadores (Dwivedi et al., 2009; Zheng et al., 2009; Serada et al.,
2010) hemos encontrado aumentada en RA: Leucine-Rich α2-Glycoprotein; LRG.

Tabla 24. Cronología de los principales estudios proteómicos con biofluidos en artritis reumatoide
(ampliada de Camafeita et al., 2009).
Autores Muestras Metodología Resultados más importantes
Doherty et al., 1998 P 2-DE Abundancia relativa de proteínas del plasma de pacientes con RA
con respecto a donantes sanos. APP+: SAA, α1-antiquimotripsina,
C3 proactivator, haptoglobina (α1, α2 y β). APP-: Apo A-I, Apo A-
IV, α2-macroglobulina, transtirretina, Gc-globulina, α2-HS-
glicoproteína, α1-B-glicoproteína.
Blass et al., 2001 S SDS-PAGE, Sobrexpresión de la proteína BiP (“binding innmmunoglobulin
EDMAN, protein”) en tejido sinovial de pacientes con AR. Un porcentaje
MALDI, WB elevado de pacientes presentaron autoanticuerpos frente a dicha
proteína y células T autorreactivas.
Smith et al., 2001 SF 2-DE, MALDI, Efecto del tratamiento con anti-CD4 en la respuesta de fase
ESI aguda APP+: haptoglobina (α2), CRP. APP-: Gc-globulina,
transtirretina.
Van den Steen et al., SF SDS-PAGE, Incremento de la actividad de MPP9/Gelatinasa B.
2002 HPLC,
Edman, ESI
Saulot et al., 2002 S SDS-PAGE, 2- Detección de autoanticuerpos frente a α-enolasa en suero de
DE, MALDI, pacientes con RA, que no detectaban en su mayoría la forma
WB recombinante.
Robinson et al., 2002 S Microarray Primer trabajo que detectó autoanticuerpos en RA utilizando la
metodología de microarrays.
Sinz et al., 2002 SF, P 2-DE, MALDI Detección en SF de pacientes RA (pero no en plasma) de
productos de degradación de la cadena β del fibrinógeno
causados por la actividad de la plasmina. Aumento de
calgranulinas B (S100A9) y C (S100A12) en el SF de pacientes RA,
pero no de calgranulina A (S100A8). Aumento de SAA1 en SF y
plasma de pacientes RA.
Uchida et al., 2002 SF SEC, SDS- Se detectó la proteína calgranulina A/S100A/MRP8 (“Myeloid-
PAGE, SELDI, related protein 8” implicada en la AR juvenil.
MALDI
Drynda et al., 2004 SF, P 2-DE, MALDI Aumento de S100A9 (calgranulina B) en plasma de pacientes RA
Kantor et al., 2004 S LC-MS Marcadores de inflamación, APP+: α1-antiquimotripsina, α1-
antitripsina, α2-glicoproteína, α1-ácido-glicoproteína,
ceruloplasmina, haptoglobina. APP-: transferrina, Gc-globulina,
inter-α-tripsina inhibidor H2.
Liao et al., 2004 SF, S LC-MS Aumento de CRP y proteínas S100A8 (calgranulina A), S100A9
(calgranulina B) y S100A12 (calgranulina C), “Neutrophil
gelatinase associated lipocalin”, catepsina B, defensina α3 de
neutrofilos en RA erosiva.

195
 Resultados & Discusión

Kuhn et al., 2004 S SEC, LC-MS Aumento de CRP en RA erosiva.

Kinloch et al., 2005 S 2-DE, LC-MS Detección de la citrulinización de α-enolasa y de su naturaleza
autoantigénica.
Hueber et al., 2005 S Microarray Detección heterogénea de autoanticuerpos frente a proteínas
citrulinadas (queratina, fibrinógeno, vimentina y filagrina) y no
citrulinadas (Hsp60, 65, 70 y 90, Bip, GPI, colágenos I, II, III, VI y V,
hnRNP-A2/B1, gp39). A mayor inflamación (CRP, FR+) y peor
prognosis, mas presencia de autoanticuerpos frente a proteínas
citrulinadas.
De Seny et al., 2005 S SELDI Aumento de calgranulina A/S100A/MRP8 “Myeloid-related
protein 8” en el suero de RA. MPR8 como biomarcador de
procesos inflamatorios.
Matsuo et al., 2006 S SDS-PAGE, Perfil de autoantígenos citrulinados. Proteínas citrulinadas
MALDI, WB detectadas: asporina, catepsina D, albúmina, receptor de
histamina, CapZα-1, PDI (“protein disulfide-isomerase”), EC
(“enzyme comision number, 5, 3, 4 y 1), precursor ER60 y ALDH2
(“mitochondrial aldehyde dehydrogenase”).
Skriner et al., 2006 Exosomas 2-DE, MS, Perfil de autoantígenos citrulinados en exosomas. Detección de
WB proteínas citrulinadas como: fibrinógeno, CD5L (“CD5 antigen-
like protein”), fibrina cadena β y fragmentos de fibrina cadena α.
Kim et al., 2006 SF 1-DE, 2-DE, Proteínas que forman inmunocomplejos con autoanticuerpos en
MALDI, WB SF: Fibronectina, semaforina 7A (CD108), nucleósido trifosfato
fosforilasa 1, proteína de unión al receptor del factor de
crecimiento (GRB7), cadena pesada de IgM (μ).
Takeuchi et al., 2007 S 2-DE, MALDI Cambios en marcadores en respuesta al tratamiento con anti-
TNF. Se produce una reducción de CRP, C3 y Apo J y un aumento
de Apo A-I, RBP y TTR.
Tabushi et al., 2008 SF 1-DE, WB, Detección de citrulinización en fibrinógeno, fibronectina, y
MALDI vimentina en fluido sinovial de pacientes con RA.
De Seny et al., 2008 S SELDI, LC-MS, Aumento de SAA, S100A8 (calgranulina A), S100A9 (calgranulina
WB B) y S100A12 (calgranulina C) en RA. Proteínas S100 como
biomarcadores de RA.
Sekigawa et al., 2008 S, P LC-MS Alteraciones en proteínas relacionadas con la activación de NFkB
mediada por TNF.
Kinloch et al., 2008 SF Zoom IEF, 1- Detección de polipéptidos citrulinizados y de citrulinización de α-
DE enolasa en SF de pacientes RA y en menor medida en SpA. El
enzima PAD-2 como responsable de la citrulinización.
Dwivedi et al., 2009 S LC-MS Cambios en las proteínas séricas en pacientes RA que responden
a terapia de 12 semanas (T12) con anti-TNF (infliximab) con
respecto al basal (T0). Aumentos (T0T12): ATIII, queratinas (1,
2, 10), cistatina c, y transtirretina. Reducciones (T0T12):
ceruloplasmina, factores de complemento (C3, C5, C7, C1s, H),
ORM1 y 2, plasminógeno, albúmina, Apo A-I, C1 inhibidor,
IGFBP, ITIH, LRG1, transferrina, Gc-globulina, vitronectina.
Zheng et al., 2009 P LC-MS Cambios en el proteoma plasmático de pacientes con RA.
Aumento de Timosina β4, actina, tubulina, vimentina,
Calgranulinas (A, B, C), CRP, LRG, tropomiosina α4, atractina,
SAA, SAP, α-macroglobulina, α2-HS-glicoproteina. Reducción de
fibronectina.
Göeb et al., 2009 S 1-DE, 2-DE, Detección de autoanticuerpos en suero de pacientes con RA
WB, MALDI, temprana no tratados frente a enzimas de la ruta glicolítica como
FT-ICR α-enolasa y fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1), chaperonas (o
proteínas adaptadoras que modulan la actividad de las

196
 Resultados & Discusión

chaperonas) como HSP60, calreticulina, BiP o fosfoproteína 1

inducida por estrés, y proteínas nucleares como la
ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2/B1 o las proteínas
FUSE-BP (1 y 2). Detección de deiminación en aldolasa, α-
enolasa, calreticulina, HSP60, PGK1 y FUSE-BP1.
Serada et al., 2010 S LC-MS, ELISA Aumento de LRG en pacientes RA antes de terapia con anti-TNF.
Correlación de los niveles de LRG con la actividad de la
enfermedad.
Salgado et al., 2010 S 2-DE, MALDI Detección de la abundancia relativa de proteínas del suero de
pacientes con RA con respecto a donantes sanos. APP+:
haptoglobina (β), LRG. APP-: Albúmina, α1-antitripsina, α2-HS-
glicoproteína, ATIII, hemopexina, RBP, tetranectina y
transtirretina.
Giusti et al., 2010 Saliva 2-DE, MS Estudio proteómico comparativo de la saliva de pacientes RA.
Incremento en saliva de pacientes RA de calgranulinas A y B,
apoA1, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, peroxiredoxina 5
(PRX5), proteína epidérmica de unión a ácidos grados (E-FABP),
proteína precursora regulada por glucosa de 78 kDa (GRP78/BiP),
y proteínas 14-3-3.
Ortea et al., 2012 s LC-MS/MS Proteínas que se ven reducidas debido al tratamiento con
infliximab (anti-TNF), gc-globulina, ceruloplasmina, fibronectina,
ITIH, ApoB100 y ApoA-II.
Yanagida et al., 2012 S LC-MS/MS Identificación de nuevos biomarcadores de respuesta a anti-TNF
en pacientes RA. Reducción de β-actina, kininógeno y colágeno
tipo II.
Ni et al., 2013 S ELISA, WB, Investigar los niveles de TTR y las modificaciones
MALDI postraduccionales en pacientes con RA. Niveles de TTR elevados
en pacientes con RA temprana.
Chang et al., 2013 SF 2-DE, WB Detección de A1AT y tubulina (cadena β) citrulinadas. A1AT
aumentada en SF.

ATIII, LRG y enfermedades cardiovasculares en RA

La RA se asocia con un aumento de la mortalidad y una reducción de la esperanza
de vida, siendo la causa más frecuente de ello las enfermedades cardiovasculares
asociadas a la ateroesclerosis/aterogénesis y a la inflamación sistémica (Stevens et al.,
2005). En RA existe una disfunción en las células endoteliales caracterizada por la menor
producción de óxido nítrico (NO, un inhibidor de la producción de TNF-α), la expresión
de moléculas de adhesión y de quimioquinas como MCP-1 (“monocyte chemotactic
protein 1”). Esto provoca la adquisición por el endotelio de un fenotipo pro-coagulante y
pro-inflamatorio y una mayor permeabilidad endotelial que favorece la entrada de
lipoproteínas en la íntima (Vaudo et al., 2004). Estas lipoproteínas (sobre todo LDL,
197
 Resultados & Discusión

debido a su pequeño tamaño y una mayor vida media de 4 días, pero también VLDL e
IDL –T½ 6 horas-) son oxidadas debido al estrés oxidativo, lo que favorece su deposición
en las paredes arteriales, el surgimiento de una respuesta humoral frente a ellas
(Cavagna et al., 2012; Frostegård, 2013) y su fagocitosis por macrófagos activados. Este
último proceso genera las denominadas “células espumosas”, lo que es clave en el
proceso de ateroesclerosis/aterogénesis en RA y en el surgimiento de enfermedades
cardiovasculares y cerebrovasculares, especialmente de tipo isquémico (Cavagna et al.,
2012). Al mismo tiempo, se produce el reclutamiento mediado por MCP-1 de más
células mononucleares, como monocitos y linfocitos T (especialmente CD4 +), y la
liberación de citoquinas TH1/TH17/ proinflamatorias (IFNγ, IL-2, TNFα, IL-1). Otros
leucocitos localizados en las placas son los mastocitos (Willems et al., 2013) y
neutrófilos, que se pueden relacionar con la presencia de especies reactivas de oxígeno
(ROS) y proteasas (e.j., metaloproteinasas de matriz/MMPs). Dentro de la lesión también
se produce la migración y proliferación de células de la musculatura lisa vascular,
productoras de matriz extracelular. Y que contribuyen junto con el resto de células y
mediadores a generar una lesión en la pared vascular, la placa ateroesclerótica. Dichas
placas, cuya formación está acelerada en pacientes con RA (Cavagna et al., 2012), llevan
a una reducción significativa de la luz vascular (estenosis) y contienen un núcleo
formado por tejido necrótico y abundantes lípidos rodeado periféricamente de una
vaina de tejido fibroso. Ciertas citoquinas TH2 y/o antiinflamatorias como IL-4, IL-5, IL-10
y TGFβ también son producidas en las lesiones y contrarrestan estos efectos. TGFβ, por
ejemplo, una citoquina inmunosupresora producida por los linfocitos activados (Kehrl et
al., 1986; Assoian et al., 1987; Wahl et al., 1988), induce la síntesis de colágeno y
favorece la formación de esa cubierta fibrosa y la estabilidad de la placa, a lo que se
contrapone el efecto de la citoquina TH1 IFNγ (Amento et al., 1991). Así, la
preponderancia de un tipo de citoquinas u otras puede dar como resultado un estado
proinflamatorio/procoagulatorio local, con una mayor producción de MMPs por
macrófagos (que debilitaría la matriz extracelular y generaría la inestabilidad de la
placa), una exposición del factor tisular, la agregación de plaquetas, la formación de
trombos locales y la aparición de cuadros agudos como el infarto de miocardio (Aviña-
Zubieta et al., 2008; Meune et al., 2009).
198
 Resultados & Discusión

El estado procoagulatorio en RA encajaría con el aumento de la velocidad de

eritrosedimentación/fibrinógeno o con la reducción de ATIII (nuestros datos en Figura
39B, Tabla 25; Kamper et al., 1998) y TN (Kamper et al., 1998), que provocaría un
desequilibrio entre la formación de fibrina y la degradación de fibrina que llevaría a una
acumulación de esta última tanto en la articulación como en las placas ateromatosas
(Salvi et al., 2000). ATIII es una glicoproteína sintetizada en el hígado y el inhibidor
principal de la trombina y de diversos factores de coagulación como Xa, IXa, XIa o XIIa
(Opal et al., 2002; Rublee et al., 2002). La deficiencia en ATIII (Tabla 25) generaría un
riesgo incrementado de tromboembolismo y coincidiría con las tasas mayores de
actividad coagulatoria y trombosis tanto venosa como arterial en RA. Sin embargo, a
pesar del claro sentido biológico de nuestros resultados, otros investigadores (Seriolo et
al. 1999) han encontrado niveles normales de ATIII, incluso aumentos de ésta en
pacientes RA (Jones et al., 1998; Zorina et al., 2008). Está claro que harán falta más
estudios para confirmar la reducción de los niveles de ATIII en pacientes.
En RA se produce una inflamación sistémica de alto grado caracterizada por un
aumento de la velocidad de eritrosedimentación y de los niveles de proteína C reactiva
(CRP) en plasma (Poole et al., 2008). En concierto tanto con factores de riesgo no
modificables (edad, sexo masculino, historial personal o familiar de cardiopatía, etc.) o
modificables (tabaquismo, sedentarismo, hipertensión y dislipemia/dieta/índice de masa
corporal/adiposidad), dicha inflamación parece estar involucrada en el proceso de la
formación de placas de ateroma y en las enfermedades cardiovasculares (Stevens et al.,
2005) y es un marcador emergente de riesgo cardiovascular. Así, niveles basales más
elevados de CRP parecen asociarse a una mayor tasa de transcripción del gen en el
hígado vinculada a un incremento de la concentración de citoquinas como IL-1, TNF o IL-
6 en plasma (producidas, por ejemplo, por el tejido adiposo, las células de la
musculatura lisa o los macrófagos). Del mismo modo que otra proteína incrementada en
RA, la proteína amiloide sérica (SAP; Tabla 15), CRP es un miembro de la familia de
proteínas denominadas pentatraxinas, llamada así por estar formada por cinco unidades
idénticas (Kunes et al., 2012). Estas son proteínas de reconocimiento de patrones (PRRs)
que son importantes en la respuesta innata del organismo. En presencia de calcio, esta

199
 Resultados & Discusión

CRP se une a fosforilcolina, fosfatidilcolina (ej., lecitina) y polianiones (ej., ácidos

nucleicos).

Sano RA Sano RA

A B

Figura 39. Gráficas de densidad para los spots 1305 (LRG) y 5504 (ATIII). (A) Regiones del gel 2D
donde se localizan las proteínas de interés. (B) Gráficas de densidad de probabilidad. En estas
figuras se muestran estimaciones no paramétricas de la densidad de los spots 1305 y 5504 para
sanos (s; línea continua) vs pacientes (SAR; línea discontinua) La banda azul es una banda de
variabilidad: si las estimaciones en ambos grupos se encuentra dentro de la banda, es “indicativo”
de que no hay diferencias significativas entre las distribuciones de los spots en cada grupo.

200
 Resultados & Discusión

En ausencia de calcio la CRP se une a policationes como las histonas. Esta CRP se
deposita en las placas ateroscleróticas y, mediante las interacciones antes citadas,
favorecen la opsonización de las LDLs oxidadas, su fagocitosis por macrófagos y la
activación de la vía clásica del complemento (a través de C1q). Además, CRP tiene un
efecto procoagulante (al aumentar PAI-1) e induce la expresión de moléculas de
adhesión en el endotelio capilar, de modo que los aumentos de CRP se correlacionan
con un incremento del riesgo cardiovascular (Hirschfield &Pepys, 2003).

Una situación muy parecida podría darse con LRG. Nuestros datos (Figura 39A;
Tabla 25) indican que esta proteína está aumentada significativamente en pacientes con
RA. LRG (Figura 39A) es una proteína de fase aguda positiva cuya producción por
hepatocitos es aumentada en respuesta a citoquinas típicas como IL-6, IL-1β y TNFα
(Shirai et al., 2009). Curiosamente también es sintetizada por neutrófilos (O'Donnell et
al., 2002), un grupo de fagocitos de la respuesta innata reclutados por quimioquinas
(e.j., IL-8), generadas por células estromales y epiteliales en respuesta a citoquinas
producidas por linfocitos TH17 como IL-17 o IL-22. Se desconoce su función, pero se
piensa que LRG podría funcionar como un receptor de reconocimiento de patrones que
podría activar las funciones de neutrófilos (Shirai et al., 2010). Esta hipótesis está basada
en la fuerte interacción de LRG con citocromo c (Cummings et al., 2006; Weivoda et al.,
2008; Codina et al., 2010; Shirai et al., 2010), una proteína mitocondrial crítica en la
inducción de apoptosis en las células eucariotas. Esta última es liberada desde el espacio
intermembrana de las mitocondrias al citosol, en donde une a Apaf1 y desencadena la
formación del apoptosoma, la activación de las caspasas y la entrada en apoptosis de las
células (Liu et al., 1996; Li et al., 1997). Durante este proceso, el citocromo c también
aparece en el plasma sanguíneo, en donde induce apoptosis (linfocitos y células
dendríticas, por ejemplo), actúa como un mediador proinflamatorio y constituye una
señal de peligro que forma parte de los denominados patrones moleculares asociados al
daño o DAPMs (“damage-associated molecular patterns”). Se piensa que la interacción
del citocromo c con LRG en el plasma podría servir para eliminar al citocromo c de la
circulación y como factor de supervivencia para células como los linfocitos (Codina et al.,
2010) o de activación para neutrófilos (Shirai et al., 2010). Ello explicaría el aumento de

201
 Resultados & Discusión

LRG en suero/plasma de pacientes con RA (datos de la presente tesis publicados en

Salgado et al., 2010; Serada et al., 2010), puesto que en esta enfermedad están
incrementados los niveles de apoptosis (Li & Wan, 2013). La concentración de LRG en
suero, además, parece estar correlacionada con la actividad de la enfermedad en RA
(Serada et al., 2010). Sin embargo, este aumento de LRG en RA no ha sido encontrado
por otros investigadores (Weivoda et al., 2008) ni tampoco parece ser específico, ya que
dicho aumento también se produce en la enfermedad de Crohn (Serada et al., 2010),
disfunción ventricular/fallo cardiaco (Watson et al., 2011), colitis ulcerativa (Serada et
al., 2012), infecciones bacterianas (Weivoda et al., 2008) o pacientes sometidos a cirujía
(Banfi et al., 2010).
Parece existir, además, una intrigante conexión entre LRG, la señalización a
través del receptor de TGFβ (una citoquina con funciones antagónicas, dependiendo del
contexto) y la proliferación/migración celular (Sun et al., 1995; Lynch et al., 2012). Esta
conexión podría tener un papel importante en situaciones en donde existe una clara
inmunosupresión asociada a elevados niveles de LRG, como infecciones virales (HIV;
Weivoda et al., 2008) o en algunas clases de cáncer: cáncer colorrectal (Ladd et al.,
2012), cáncer de pulmón de células no pequeñas (Liu et al., 2012), cáncer de tracto biliar
(Sandanayake et al., 2011), cáncer gástrico (Uen et al., 2013) y cáncer de ovario
(Andersen et al., 2010; Wu et al., 2013). Finalmente también han sido observados,
aumentos patológicos de LRG en orina, como por ejemplo en pacientes con apendicitis
aguda (Kharbanda et al., 2012; Kentsis et al., 2012), en cáncer de vejiga (Lindén et al.,
2012) o en exosomas urinarios de cáncer de pulmón de células no pequeñas (Li et al.,
2011).

202
 Cobertura de secuencia Mowse m/z; péptidos
Score
1 msswsrqrpk spggiqphvs rtlfllllla asawgvtlsp kdcqvfrsdh gssiscqppa
61 eipgylpadt vhlaveffnl thlpanllqg asklqelhls sngleslspe flrpvpqlrv
121 ldltrnaltg lppglfqasa tldtlvlken qlevlevswl hglkalghld lsgnrlrklp
181 pgllanftll rtldlgenql etlppdllrg plqlerlhle gnklqvlgkd lllpqpdlry
241 lflngnklar vaagafqglr qldmldlsnn slasvpeglw aslgqpnwdm rdgfdisgnp
301 wicdqnlsdl yrwlqaqkdk mfsqndtrca gpeavkgqtl lavaksq

LRG1 968.4616 [Link].L

989.5285 [Link].Q
1152.5900 [Link].L
+(79-88) 1712.8930 [Link].S
1818.0360 [Link].Y
2037.0852 [Link].G
2485.1331 [Link].W
2959.7098 [Link].V

203
1211.5800 [Link].E
1232.6650 [Link].E
1340.6253 [Link].L
1389.7471 [Link].V
1405.7297 [Link].V + Oxidation (M)
1441.6395 [Link].S + 2 Oxidation (M)
Tabla 25. Identificación de LRG y ATIII mediante espectrometría de masas.

ATIII 1528.7152 [Link].N

1674.8612 [Link].A
+(107-160) 1848.8849 [Link].S
1864.8820 [Link].S + Oxidation (M)
Resultados & Discusión

1 hgspvdicta kprdipmnpm ciyrspekka tedegseqki peatnrrvwe lskansrfat 2202.1171 [Link].A

61 tfyqhladsk ndndniflsp lsistafamt klgacndtlq qlmevfkfdt isektsdqih 2291.1509 [Link].S
121 fffaklncrl yrkanksskl vsanrlfgdk sltfnetyqd iselvygakl qpldfkenae 2315.0969 [Link].L + Oxidation (M)
3080.5160 [Link].S
181 qsraainkwv snktegritd vipseainel tvlvlvntiy fkglwkskfs pentrkelfy
3096.5196 [Link].S + Oxidation (M)
241 kadgescsas mmyqegkfry rrvaegtqvl elpfkgddit mvlilpkpek slakvekelt
301 pevlqewlde leemmlvvhm prfriedgfs lkeqlqdmgl vdlfspeksk lpgivaegrd
361 dlyvsdafhk aflevneegs eaaastavvi agrslnpnrv tfkanrpflv firevplnti
421 ifmgrvanpc vk
 Resultados & Discusión

Lipoproteínas, apolipoproteína E, modificaciones postraduccionales y amiloidosis

La activación de la respuesta de fase aguda (APR) no sólo altera los niveles de los
reactantes de fase aguda, sino que también modifica el perfil lipídico de los pacientes
(dislipemia), otro factor y marcador clásico de riesgo cardiovascular. Así, en RA activas se
producen modificaciones variables de triacilglicéridos, colesterol total y LDL-colesterol,
pero siempre están acompañados de aumentos de lipoproteínas similares a las LDL,
como la lipoproteína a (Lp[a]), y de reducciones de los niveles de HDL (Svenson et al.,
1987; Lakatos & Hárságyi, 1988; Lazarevic et al., 1992; Situnayake & Kitas,
1997).Recordemos que una reducción de las HDL se relaciona con un mayor riesgo
cardiovascular, ya que estas lipoproteínas realizan el transporte reverso de colesterol y
previenen por ello la ateroesclerosis (Rye & Barter, 2013).

Aparte de la reducción de los niveles de HDL, su composición también cambia

durante una respuesta de fase aguda. Se modifican, por ejemplo, sus fosfolípidos,
ganando en colesterol, triacilglicéridos y ácidos grasos libres y empobreciéndose en
ésteres de colesterol, para generar lo que se ha denominado HDL de fase aguda (“acute
phase HDL” o AP-HDL). En cuanto a sus apolipoproteínas, algunas típicamente presentes
en las HDL como la apo A-I (Doherty et al., 1998; Tanimoto et al., 2003; nuestros datos),
apo A-II (Tanimoto et al., 2003), apo A-IV (Doherty et al., 1998; nuestros datos), apo C-I,
apo C-II , apo C-III (Rye & Barter, 2013 )y apo E (Mendivil et al., 2013) se encuentran
reducidas en RA (o en enfermedades inflamatorias), mientras que otras como la proteína
sérica amiloide A (SAA) se vuelven más abundantes (Cabana et al., 2004). Lo mismo pasa
con enzimas asociados a las HDL. Así, las paraoxonasas 1 y 3 (PON; EC [Link];
cromosoma 7), una familia de arilesterasas séricas codificadas por tres genes (PON1,
PON2 y PON3) y con propiedades antioxidantes, se encuentran junto con apo A-I y apo
J/clusterina en una subclase de partículas HDL. Sin embargo, como parte de una
respuesta inflamatoria en RA, esta subclase de partículas HDL pierde actividad
paraoxonasa (Tanimoto et al., 2003; Cabana et al., 2003; Baskol et al., 2005; Isik et al.,
2007). Otro enzima asociado a HDL que reduce su actividad en RA es la lecitina-
colesterol-aciltransferasa (LCAT) (Tanimoto et al., 2003). Todos estos cambios

204
 Resultados & Discusión

anteriormente señalados en las HDL tienen consecuencias. Así, la menor presencia de

apo A-I (desplazada por la SAA) se relaciona con una reducción de los niveles de HDL
durante la inflamación y también con la menor actividad catalítica de la LCAT, de la que
Apo A-I es un cofactor necesario para su funcionamiento (Glomset, 1968; Van den
Bogaard et al., 2012) Esta LCAT es responsable de la esterificación del colesterol, que
será luego transferido desde las HDL a las lipoproteínas con apo B-100 como las VLDL y
LDL por medio de la proteína de transferencia de ésteres de colesterol (CETP). Así, se
puede decir que las HDL de fase aguda son menos eficientes a la hora de captar el
colesterol de las células de los tejidos periféricos (e.j., a través del receptor ABC1 de
macrófagos) y devolverlo al hígado, un proceso mediado por receptores de HDL
(“Scavenger Receptors class B type 1”/SR-B1; disminuidos en los hepatocitos durante la
inflamación). Por otro lado, la pérdida de paraoxonasa 1 en las HDL debido bien al
incremento en la generación de especies reactivas de oxigeno (ROS) o a una menor
producción por el hígado (dependiente de IL-1 y TNFα) se traduce en un mayor estrés
oxidativo que favorece la oxidación de las LDL y por ello la ateroesclerosis. El gen APOE
(MIM: 107741) está ubicado en una región (19q13) con alto desequilibrio de ligamiento
(Abraham et al., 2008; Takei et al., 2009). Codifica una proteína con un extremo amino
terminal que contiene una región de unión al receptor de LDL (residuos 136-150; con
mayor afinidad cuando la proteína está asociada a lípidos que cuando está libre), una
región bisagra y un extremo carboxilo terminal que alberga un centro de unión a
lipoproteínas (residuos 244-272). La proteína codificada por APOE (Apo E), aparte de en
HDL, se puede encontrar en quilomicrones, VLDL y LDL (Tabla 26). Los trabajos con
modelos murinos de RA (CIA; “collagen-induced artritis”) arrojan resultados
contradictorios en relación a si apo E podría tener o no un papel en RA. Así, Asquith et
al., (2010) señala que los ratones C57BL/6 deficientes de apo E inmunizados con
colágeno II de pollo y coadyuvante completo de Freud (CFA) son resistentes al desarrollo
de artritis, mientras que una investigación posterior de Postigo et al., (2011) describe
que la deficiencia de apo E en ratones [Link] inoculados con colágeno bovino tipo
II/CFA genera una exacerbación de los síntomas de la artritis en los roedores

205
 Resultados & Discusión

acompañada de la expansión de células TH1 y [Link] razones para estas discrepancias

no son claras, pero podrían deberse a las cepas de ratones empleadas y la fuente de
colágeno utilizada para inducir la artritis (van Beers et al., 2013). El gen APOE es
polimórfico, y este hecho también podría jugar un cierto papel a la hora de exacerbar
ciertas comorbilidades presentes en RA, como la amiloidosis (Maury et al., 2001), la
osteoporosis (Peter et al., 2011), o las alteraciones en el metabolismo del colesterol
relacionadas con el proceso inflamatorio y las patologías cardiovasculares. El gen APOE
codifica una proteína rica en arginina, pero dicho contenido se altera debido a dos SNPs
presentes en el exón 4 muy estudiados (rs429358 y rs7412; Hatters et al., 2006) que dan
origen a tres alelos codominantes con las siguientes frecuencias alélicas en la población
española (Tabla 26): APOE2 (Cys112, Cys158; 3.3-7.05 %), APOE3 (Cys112, Arg158;
84.25-92.8 %) y APOE4 (Arg112, Arg158; 3.9-8.7 %). Junto con APOE2, APOE4 es el alelo
de menor frecuencia, y dicha frecuencia es incluso menor en las poblaciones del sur de
Europa en comparación con el norte, oscilando desde el 20 % en Suecia/Finlandia hasta
el 7 % en Grecia /Italia (Bullido et al., 1998; Corella et al., 2001; Singh et al., 2006; Ariza
et al., 2010; Crean et al., 2011). Como señala la Tabla 26, existen una serie de diferencias
estructurales y funcionales entre las tres isoformas. La proteína Apo E4, por ejemplo, se
une fundamentalmente a lipoproteínas grandes de bajo peso molecular como las VLDL o
las LDL, mientras que Apo E2 y Apo E3 prefieren lipoproteínas más pequeñas de alta
densidad como las HDL. Este hecho depende de la presencia de la arginina en posición
112 en Apo E4, la cual también permite la interacción entre los dominios amino-terminal
y carboxilo terminal de la proteína (Hatters et al., 2006). Apo E4 es también la más
sensible a la desestabilización de la estructura proteica en presencia de lípidos producida
tanto por estrés químico como termal, mientras que Apo E3 y sobre todo Apo E2 son
más resistentes.

Consecuentemente, los niveles basales de la proteína apo E son menores en

individuos portadores de la variante Apo E4. En nuestro estudio (Tabla 26 y Figura 40), el
reducido tamaño muestral (8 sanos y 8 pacientes RA) no permite realizar observaciones
estadísticamente significativas a este respecto, si bien también parece apuntar hacia una
reducción de la frecuencia alélica de APOE3 y un aumento de la
206
 Resultados & Discusión

Tabla 26. Frecuencias alélicas del gen APO E

(Adaptada de Hatters et al., 2006)

Diferencias funcionales Diferencias Enfermedades asociadas

estructurales

Alelo Frecuencia Variación Afinidad por Lipoproteína Estabilidad

alélica (%)§ aminoacídica receptor LDL a la que está conformacional
asociada

APOE*2 3.3% (n=330) Cys112 Cys158 Baja HDL Alta Hiperlipoproteinemia de

tipo III
6.3% (n= 627)

7.05% (n=242)

18.75% (n=8) S

18.75%(n=8) RA

APOE*3 92.8% (n=330) Cys112 Arg158 Alta HDL Media Desconocida

85% (n=627)

84.25% (n= 242)

81.25% (n=8) S

68.75%(n=8) RA

APOE*4 3.9% (n=330) Arg112 Arg158 Alta VLDL, LDL Baja Alzheimer de inicio
tardío,
8.5% (n=627)
Ateroesclerosis
8.7% (n= 242)

0% (n=8) S

12.5% (n=8) RA
§
Los datos de frecuencias alélicas son los proporcionados por Corella et al., 2000 en una población valenciana de 330 individuos sanos,
Cervantes et al., 2011 en una población española de n= 627 o n=242 individuos sanos, y los procedentes de nuestro estudio con 8 donantes
sanos y 8 pacientes con artritis reumatoide. S= sanos, RA= enfermos de artritis reumatoide.

frecuencia del alelo APOE4 en RA, con aparición de spots adicionales no esperados en
dos pacientes RA portadores del alelo APOE4 que podrían relacionarse con la presencia
de modificaciones postraduccionales de la proteína (Figura 40; ver más adelante). Una
mayor frecuenca alélicas de APOE4 podría estar relacionada con un mayor riesgo de

207
 Resultados & Discusión

desarrollo de RA o con la presencia de ciertas complicaciones, como la amiloidosis,

osteoporosis o la ateroesclerosis.
En el primer caso, se sabe que Apo E tiene capacidad antiinflamatoria
dependiente de isoforma (Hatters et al., 2006), relacionándose el alelo APOE4 con
mayores respuestas inflamatorias en RA (Toms et al., 2012). Ya que el mRNA codificado
por APO E está presente en tejido sinovial (por ejemplo en macrófagos), esto favorecería
una inflamación local en el sinovio que podría ser más intensa o severa en los pacientes
con el alelo E4. No obstante, en algunos estudios se ha detectado que los niveles de CRP
pueden ser menores en personas portadoras de dicho alelo (Mänttäri et al., 2001) y,
para complicar el asunto, algunos trabajos previos también indican que la incidencia de
RA es menor en pacientes con Alzheimer de comienzo tardío (en donde la presencia de
APOE4 es un factor de riesgo) que en individuos control (Jenkinson et al., 1989; Beard et
al., 1991; Myllykangas-Luosujärvi et al., 1994). Otra enfermedad autoinmune con
componente sistémico es el Síndrome de Sjögren (pSS). En esta patología no se ha
demostrado una mayor susceptibilidad a esta enfermedad en pacientes portadores del
alelo APOE4, pero sí una asociación entre la presencia de ApoE4 y un inicio más
temprano de la enfermedad (Pertovaara et el., 2004). En cambio, los individuos con
artritis reactivas causadas por la presencia en el líquido sinovial de C. pneumoniae
poseen una frecuencia alélica (34 %) significativamente mayor a la de la población
general en Pensilvania (12 %), por lo que se piensa que el alelo APOE4 confiere un riesgo
incrementado de infección sinovial y de inflamación en la articulación (Gérard et al.,
1999).
En relación a los depósitos amiloides, el alelo APOE4 podría ser un factor de
riesgo para su desarrollo no sólo en el cerebro de personas con Alzheimer de comienzo
tardío, sino también a nivel sistémico en RA. Así, Hasagawa et al., (1996), trabajando con
tres grupos de individuos (individuos sanos, n=63; pacientes RA sin amiloidosis, n=65;
pacientes RA con amiloidosis, n=35), señaló que la frecuencia del alelo E4 era
significativamente mayor en los pacientes RA con amiloidosis que en los pacientes sin
amiloidosis o en los individuos sanos. Por otro lado, Maury et al. (2001), trabajando con
una población finlandesa, no encontró esa mayor frecuencia del alelo E4 en los
pacientes con RA con amiloidosis en relación a pacientes con amiloidosis o sujetos
208
 Resultados & Discusión

control, pero sí una reducción significativa en la frecuencia de apo E4 entre los pacientes
RA sin amiloidosis y los sujetos sanos. Estos datos parecen indicar que la presencia de
Apo E4 en un paciente con RA podría representar un riesgo relativo en el desarrollo de
amiloidosis (Cardona et al., 2003).
Con respecto a la osteoporosis, la presencia del alelo APOE4 podría también
incrementar el riesgo de sufrir este problema en pacientes RA. Así, en un estudio
realizado con 110 mujeres españolas postmenopáusicas con RA sometidas a genotipado
de APOE, se encontró una mayor frecuencia de genotipos APOE3/E4 y APOE4/E4 en
aquellas pacientes que presentaban osteoporosis y masa ósea reducida en comparación
con las pacientes que no tenían este tipo de problemas (Lee et al., 2005).
Se sabe que APOE4 está asociado a la ateroesclerosis y a un riesgo moderado de
enfermedades arteriales coronarias (Hatters et al., 2006), y este hecho podría estar
conectado con la amiloidosis y la citrulinización. La citrulinización (es decir, la conversión
de arginina en citrulina dentro de las proteínas mediada por el enzima peptidil-arginina
deiminasa/PAD) es un hecho bastante específico de la RA, aunque no exclusivo, ya que
es un fenómeno presente en SpA y curiosamente también en Alzheimer, en donde Apo
E4 tiene un importante papel (Ishigami et al., 2005). La citrulinización es un proceso que
ocurre en la mayoría de los tejidos inflamados, y por ello el fluido sinovial de pacientes
con RA presenta un gran número de estas proteínas citrulinadas. Pero además, en RA
esta citrulinización induce la ruptura de la tolerancia e inicia una respuesta inmunológica
en la que las células B, productoras de autoanticuerpos y las células TH17 y TH1
generadoras de citoquinas proinflamatorias tienen un papel importante. La presencia de
autoanticuerpos (ACPA) específicos de dichos autoantígenos citrulinados y la formación
de inmunocomplejos parece esencial en la patogénesis de RA, sirviendo además como
un marcador de detección temprana de la enfermedad, ya que su aparición se anticipa
varios años a los signos clínicos de la RA.
El listado de proteínas citrulinadas que reconocen estos ACPA está
constantemente creciendo (>50), afectando tanto a proteínas celulares como
plasmáticas. Dentro de las primeras tenemos ribonucleoproteínas como la
ribonucleoproteína nuclear heterogénea A2/B1, enzimas como la gliceraldehido 3P
deshidrogenasa, la aldolasa, la hexoquinasa 3, la piruvato quinasa o la α-enolasa o
209
 Resultados & Discusión

proteínas nucleares como las histonas. Otro grupo de proteínas que se expresan de
forma inducible en respuesta a estímulos como el estrés oxidativo o citoquinas
inflamatorias, que están presentes en las lesiones ateromatosas (Kleindienst et al.,
1993), que se citrulinan (Göeb et al., 2009) y frente a las que aparecen autoanticuerpos
en RA (Göeb et al., 2009), son las chaperonas moleculares como calreticulina, HSP60 o
BiP, o proteínas como la β-actina, vimentina o la vinculina. Otros grupos de proteínas
citrulinadas lo constituyen los factores del complemento como el C3, B o H, las proteínas
como la albúmina, el fibrinógeno o el kininógeno, las apolipoproteínas como Apo A-I,
Apo A-IV, Apo B-100, Apo J o SAA4 o los inhibidores de proteasas como la α1-
antitripsina, la α2-macroglobulina, el inhibidor de tripsina inter-α o la anti-trombina III
(van Beers et al., 2013). En general, se puede decir que las proteínas citrulinadas se
corresponden sobre todo con proteínas que participan en la respuesta inmune,
coagulación sanguínea, movilidad/estructura/integridad celular o transporte de lípidos
(van Beers et al., 2013).
El proceso de citrulinización cambia las propiedades físico-químicas e
inmunológicas de las proteínas. Por ejemplo, como fruto de la sustitución de la arginina
por la citrulina, se espera en MS una reducción de las masas teóricas de los péptidos de
0.98-1 Da, así como un aumento de los cortes perdidos con tripsina, de modo que a
medida que se citrulina una proteína el número de péptidos trípticos detectados se
reduce. La citrulinización causa además una acidificación del punto isoeléctrico de la
proteína debido a la pérdida de grupos amino. Como normalmente sólo una fracción de
la proteína sufre citrulinización en un sitio específico, ello genera “trenes de spots” que
pueden ser detectados por electroforesis bidimensional (Ej., aldolasa en Göeb et al.,
2009). En nuestros análisis no hemos detectado este tipo de alteraciones en el caso de
antitrombina III, una proteína citrulinada en RA (van Beers et al., 2013) y cuya
abundancia podría verse reducida en el suero de pacientes (Figura 40) como
consecuencia de la generación de ACPA e inmunocomplejos. Por otro lado, en relación a
Apo E (Figura 40) hemos detectado en la mayoría de las muestras de uno (homocigotos)
o dos spots (heterocigoto) tanto en donantes sanos como en pacientes RA. Sin embargo,
en algunos pacientes (presumiblemente con fenotipo apo E3/E4) se ha detectado la
presencia de hasta tres spots de diferente intensidad (ver donantes SAR6 y SAR8 en
210
 Resultados & Discusión

Figura 40). Dichos spots adicionales podrían explicarse teniendo en cuenta que
apolipoproteína E parece ser una diana del proceso de citrulinización en el fluido sinovial
de pacientes con RA (van Beers et al., 2013). De acuerdo con este mismo autor, los
residuos de arginina (R185, R190, R196) que cambian a citrulina en apolipoproteína E
pertenecen a la región bisagra de apo E (residuos 192-222), una región muy expuesta de
la proteína que sirve de puente entre el N-terminal y el C-terminal (Hatters et al., 2006),

 monosiálico
S14 (E3/E3)

S17 (E2/E3)

(¿E3/E4?)

(E2/E3)
SAR9
SAR6
 bisiálico

E4
E2 E3
TTR
S11 (E3/E3)

S19 (E3/E3)
S16 (E2/E3)

(¿E3/E4?)
(E3/E3)

(E2/E3)
SAR1

SAR5

SAR8
S10 (E3/E3)

S18 (E3/E3)
S15 (E2/E3)

(E3/E3)

(E3/E3)

(E2/E3)
SAR0

SAR4

SAR7

Figura 40. Análisis mediante 2-DE del polimorfismo de Apo E en artritis

reumatoide. S, donantes sanos; SAR, donantes con artritis reumatoide. (Richard
et al., 1995) .

211
 Resultados & Discusión

y no a las posiciones polimórficas CysArg112, CysArg158, presentes en el dominio

amino terminal (sitio de unión a LDL-R). Además, el patrón de citrulinización de Apo E es
heterogéneo (van Beers et al., 2013), lo cual quiere decir que sólo se produce en menos
de la mitad de los pacientes RA (40 %) (van Beers et al., 2013). Dicho patrón de
citrulinización heterogéneo también produce una respuesta heterogénea de ACPA (<30
% pacientes RA positivos para ACPA específicos de Apo E; baja sensibilidad diagnóstica),
si bien muy específica (presentes en RA, pero no en pSS, MS, SLE o T1D; especificidad
diagnóstica del 96 %) (van Beers et al., 2013). Estos datos, por tanto, plantean una serie
de interrogantes: ¿Es dependiente el proceso de citrulinización de Apo E en RA de las
variantes alélicas? ¿Es favorecida la citrulinización de Apo E por la conformación
desestabilizada de Apo E4 y su mayor propensión a la desnaturalización y, con ello, su
degradación y fragmentación proteolítica en RA? ¿Existe una relación entre el genotipo y
los niveles de autoanticuerpos frente a Apo E en plasma? ¿Influye la citrulinización sobre
la concentración de Apo E en plasma y los problemas cardiovasculares detectados en
estos pacientes? Todas estas cuestiones deberán ser contestadas en un futuro
inmediato.

9.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO MULTIVARIANTE

9.1.- ANÁLISIS DE COMPONENTES PRINCIPALES
Dado que el número de individuos observados es menor que el número de variables
(n<p) hemos utilizado una técnica de reducción de la dimensión para realizar un análisis
conjunto de todas las variables: el análisis de componentes principales o PCA. El PCA es
un método no paramétrico simple que permite extraer información de un conjunto de
datos procedentes del análisis de múltiples variables en N individuos, como es el caso de
los experimentos proteómicos. Se emplea cuando las variables que tenemos están
altamente correlacionadas, y el objetivo es obtener las componentes (variables latentes)
que no están correlacionadas entre sí y que resumen la información de las variables
originales con el fin de reducir la dimensionalidad de los datos.

212
 Resultados & Discusión

Estas variables latentes permiten visualizar la existencia de patrones proteicos y explicar

de este modo el origen de la mayor parte de la variabilidad de nuestros datos. En estos
análisis se ha omitido el spot correspondiente a la transferrina. Se calculó la matriz de
correlaciones entre los spots, detectándose la presencia de correlaciones elevadas. La
componente principal número 1 (PC1) está asociada con la mayor varianza en los datos,
PC2 con el segundo valor de varianza más elevado y así sucesivamente. De la
observación de la Tabla 27 podemos concluir que necesitamos un número elevado de
componentes principales (PC1-PC7) para poder explicar un 80 % de la variabilidad de
nuestros datos. Este hecho ahonda en la infuencia de distintos factores en la
patogénesis de la RA, incluyendo factores medioambientales (ej., tabaco), hormonales
(ej., hormonas sexuales femeninas) o genéticos (ej., HLA-DRB1 “shared-epitope alleles”).

Tabla 27. Componentes principales que explicarían

la variabilidad de nuestros datos.

Componente % varianza acumulada explicada

PC1 30.28

PC2 45.20

PC3 55.47

PC4 63.19

PC5 69.56

PC6 74.66

PC7 78.93

213
 Resultados & Discusión

Componente Principal 1(PC1): Reactantes de fase aguda positivos y negativos

A pesar de que la interpretación del análisis PCA implica un cierto grado de
subjetividad, se puede decir que PC1 es una componente de tamaño, y por tal
entendemos el nivel de inflamación. El signo de los coeficientes de correlación de cada
una de las variables que forman parte del componente 1 es coherente.
Así, dentro del grupo de proteínas con pesos positivos, la apo A-I (Doherty et al.,
1998), albúmina (Lebreton et al., 1979), la proteína de unión a vitamina D (Doherty et
al., 1998), la α2-HSglicoproteína (Doherty et al., 1998, Lebreton et al., 1979), el
orosomucoide (Lebreton et al., 1979) y la hemopexina (Doherty et al., 1998) son todas
ellas proteínas cuya concentración se encuentra coordinadamente reducida en los
pacientes con AR; es decir, son proteínas de fase aguda negativa. En cambio, dentro de
las proteínas con pesos negativos tenemos el complemento factor B, las cadenas β y α
de la haptoglobina (Doherty et al., 1998), la α1-quimotripsina (Doherty et al., 1998) y la
ceruloplasmina (Doherty et al., 1998), todas ellas proteínas de fase aguda positivas
aumentadas en pacientes con artritis reumatoide.
A pesar de que los signos de los coeficientes de cada variable que forma parte del
componente principal 1 son contrarios a los que obtiene Lebreton et al., (1979), quien
también realizó un análisis PCA con datos de pacientes con respuestas inflamatorias, la
primera de las componentes también venía definida por la α2-HS-glicoproteína y la
albúmina, ambas proteínas de fase aguda negativas y con coeficientes positivos, y por la
haptoglobina, la A1AT y el orosomucoide, todas proteínas de fase aguda positivas y con
coeficientes negativos.

Componente Principal 2 (PC2): Polimorfismo en las haptoglobinas

Si la componente principal 1 era el tamaño/inflamación, la segunda componente
podemos definirla como la forma, que puede ser equivalente al genotipo/fenotipo de los
individuos en cuanto a las haptoglobinas, ya que tanto las variables/proteínas con
mayores coeficientes positivos (Haptoglobina, cadena α, Hp2) como las
variables/proteínas con mayor peso negativo (Haptoglobina, cadena β y Haptoglobina
cadena α, Hp1s/f) dentro del componente principal 2 son cadenas de las haptoglobinas.

214
 Resultados & Discusión

La haptoglobina (gen HP, cromosoma 16q22) es una proteína de fase aguda

positiva cuyos niveles plasmáticos oscilan entre 0.08–1.97 g/L en hombres y 0.08–2.19
g/L en mujeres (Langlois & Delangue, 1996; Shahabi et al., 2012). Esta variabilidad
intermuestral en la concentración sérica basal de haptoglobina está correlacionada con
el sexo, la edad, ciertos hábitos de vida como el tabaquismo, el genotipo y con los
niveles basales de marcadores inflamatorios como IL-6, CRP, fibrinógeno o α1-
glicoproteína (Maes et al., 1995; Shahabi et al., 2012). Haptoglobina es una α2-
sialoglicoproteína plasmática muy abundante producida sobre todo por el hígado, pero
también en las paredes arteriales (de Kleijn et al., 2002). Su función más conocida es la
de la captación de dímeros de hemoglobina libre en el plasma sanguíneo para que no se
pierda a través de la filtración glomerular en el riñón y se dañe este órgano (Robert,
2013). Dicha unión es de gran afinidad (1 x 10-15 mol/L; Okazaki et al., 1997). Proteínas
que contienen grupos hemo (como la hemoglobina) pueden ser liberadas de células (ej.,
eritrocitos) debido a procesos inflamatorios/inmunológicos, cambios en el
pH/osmolalidad o procesos infecciosos. Una vez liberado de la apoproteína, el grupo
hemo puede ser transferido hasta ambientes lipofílicos como las membranas celulares o
las lipoproteínas LDL, en donde se intercala y donde su hierro hemínico favorece la
producción de radicales hidroxilo vía la reacción de Fenton (H2O2 + Fe2+  Fe3+ + OH- +
OH), lo que impulsa la oxidación de los lípidos. El grupo hemo libre también es captado a
través de receptores celulares y transportado a la mitocondria, en donde también
favorece la formación de ROS (Robert, 2013). En cualquiera de los dos casos,
cooperando con señales proinflamatorias como TNFα o Fas (presentes en RA), estos ROS
promueven un tipo especial de muerte necrótica programada/regulada denominada
necroptosis y la pérdida de la tolerancia (Christofferson & Yuan, 2010; Dunai et al.,
2011). Por este motivo, la unión de la hemoglobina libre a la haptoglobina y la captación
del complejo mediante el receptor CD163 de monocitos/macrófagos anula dicha
capacidad oxidativa del grupo hemo y protege a la vasculatura de la agresión oxidativa
(Carter & Worwood, 2007). También inhibe la producción de óxido nítrico (NO), la
síntesis de prostaglandinas y parece tener un efecto negativo sobre la proliferación de
los linfocitos (Baskies et al., 1980; Kudo, 1982). Haptoglobina, presenta además una
actividad inhibidora sobre proteasas como catepsina B, una proteína lisosomal liberada
215
 Resultados & Discusión

al fluido extracelular durante los procesos inflamatorios (Snellman & Sylvén, 1967).
También, al igual que apoJ/clusterina (ver más adelante, apartado 10), interacciona e
inhibe la actividad de ciertas metaloproteinasas como MMP2/gelatinasa A y
MMP9/gelatinasa B (de Kleijn et al., 2002), unos enzimas importantes en la degradación
de matriz, en la remodelación tisular y en procesos de migración/invasión cuya
expresión en sinoviocitos de pacientes con RA es potenciada a través de la vía NF-
κB/HIF-1α por IL-17A (Li et al., 2013). Ambas metaloproteasas tienen un papel protector
en un modelo murino de artritis inducida por anticuerpos (Itoh et al., 2002). Finalmente,
haptoglobina favorece la angiogénesis (Cid et al., 1993; Langlois & Delangue, 1996).
Todas estas funciones de haptoglobina son dependientes de sus niveles plasmáticos, los
cuales, como ya hemos indicado, están vinculados al genotipo del individuo (tipos de
cadena α de la haptoglobina presentes) y a los niveles de factores proinflamatorios.
Como ya vimos anteriormente, haptoglobina es sintetizada como un polipéptido
de cadena sencilla que es cortado en cadenas α y β (Ko et al., 2013). Ambas cadenas se
unirán posteriormente mediante puentes disulfuro (Ko et al., 2013). La cadena α de la
haptoglobina es polimórfica (alelos Hp2, Hp1s y Hp1f), y dicho polimorfismo sólo existe
en humanos (Ko et al., 2013). En cambio, apenas se ha descubierto hasta la fecha
variabilidad alélica para la cadena β (Ko et al., 2013), responsable de unir el dímero αβ
de hemoglobina con una elevada estabilidad (Kd≈10-15). Esto explicaría que la afinidad
por la hemoglobina sea en principio la misma para Hp1-1, Hp2-1 y Hp2-2, aunque hay
autores que señalan una mayor afinidad de Hp1-1 (Quaye et al., 2008). CD163 une
hemoglobina libre con baja afinidad y el complejo haptoglobina-hemoglobina con
elevada afinidad. En el último caso, los complejos de hemoglobina-haptoglobina exhiben
una mayor afinidad funcional por CD163 si el fenotipo es Hp2-2 que si es Hp1-1
(Graversen et al., 2002; Carter & Worwood, 2007), a pesar de que el SRCR (“scavenger
receptor cystein-rich domain”) de CD163 interacciona con los residuos Glu 261, Lys 262 y
Thr 264 de la cadena monomórfica β de la haptoglobina (Nielsen & Moestrup, 2009).
Este hecho, sin embargo, se ve compensado por una internalización más rápida del
complejo haptoglobina-hemoglobina en individuos Hp1-1 debido a un menor tamaño
del complejo (la proteína Hp1-1 es una molécula pequeña de 86 kDa con fórmula (αβ)2)
lo que reduce el impacto oxidativo de la hemoglobina libre (Carter & Worwood, 2007).
216
 Resultados & Discusión

Apoyando esto último tenemos la presencia dentro de las variables con peso negativo
en la componente 2 de la hemopexina, una proteína relacionada con la captación del
grupo hemo libre que, a diferencia de la haptoglobina, se comporta como una proteína
de fase aguda negativa. La proteína Hp1-1 tiene además mayor capacidad antioxidativa y
más eficacia inhibidora sobre la síntesis de prostaglandinas, lo que reduce la inflamación
(Quaye et al., 2008). Los macrófagos humanos secretan mayores cantidades de IL-10
cuando son incubados con el complejo Hp1-1/Hb que con el complejo Hp2-2/Hb, lo que
indica que el fenotipo Hp1-1 favorecería un ambiente más antiinflamatorio o
inmunosupresor. En este sentido, resulta relevante la mayor frecuencia del alelo Hp1 en
pacientes con distintas malignidades como el cáncer de mama y cérvix, adenocarcinoma
de pulmón o carcinoma de vejiga (Langlois & Delanghe, 1996). En conclusión, la cadena
α1 favorecería la captación de la hemoglobina por las células y la disminución de los
procesos inflamatorios, lo que podría estar relacionado con el gran peso negativo de
esta variable/proteína en la componente principal 2.
La otra variable/proteína con mayor peso negativo dentro de la componente 2 es
la cadena β de la haptoglobina. Esta proteína contiene oligosacáridos de tipo N
caracterizados por la presencia de residuos de ácido siálico terminales α2-6. Esta
glicosilación de la cadena β, alterada en RA (Saroha et al., 2011), permite que
haptoglobina se una a CD22 (Hanasaki et al., 1995), un receptor inhibidor (contiene 1
ITIM que recluta la fosfatasa inhibidora SHP) de la familia de las inmunoglobulinas
presente en linfocitos B maduros que inhibe la señalización vía BCR. CD22 intermedia al
mismo tiempo en procesos de adhesión intercelular, ya que reconoce sialoproteínas
presentes en otras células como eritrocitos, linfocitos T (vía CD45RO; Law et al., 1994),
monocitos, neutrófilos y células endoteliales (Stamekowic & Seed, 1990; Engel et al.,
1993). La haptoglobina bloquearía estos procesos adhesivos, del mismo modo que
modularía también las funciones de células del sistema immune innato como neutrófilos
(Oh et al., 1990) o macrófagos (Jeney et al., 2013). Como hemos comentado al principio,
las variables con mayor peso negativo dentro de la componente 2 son la cadena β
(necesaria para la unión a la hemoglobina libre) y las cadenas α1 (Hp1s/f) de la
haptoglobina. En conclusión, tanto la cadena α1 como la cadena β de haptoglobina

217
 Resultados & Discusión

(peso negativo en la componente principal 2) favorecerían mayores niveles de

haptoglobina y menores respuestas inflamatorias dentro de los pacientes con RA.
En cambio, en la componente 2 de nuestro análisis PCA, la cadena α Hp2 es una
de las variables con mayor coeficiente positivo. Se sabe que el genotipo Hp2-2 está más
representado en enfermedades autoinmunes, en donde existe una mayor reactividad
del sistema inmunológico del individuo (Langlois & Delanghe, 1996). Esto incluiría, por
ejemplo, un estudio con pacientes con historia familiar de poliartritis, sobre todo
hombres (Dahlqvist & Fröhlander, 1985), y también otras enfermedades como el lupus
eritematoso sistémico (SLE) (Dahlqvist & Fröhlander, 1985). También parece ser peor el
pronóstico en enfermedades como la tuberculosis (Kaminskaia et al., 1989; Fedoseeva et
al., 1993) o la infección por HIV (Langlois & Delanghe, 1996). Por otro lado, tanto en
modelos de diabetes con ratones transgénicos como en estudios en pacientes diabéticos
(pero no en ausencia de enfermedad) se ha demostrado un incremento del riesgo de
desarrollar enfermedades cardiovasculares (Goldenstein et al., 2012) o mayor gravedad
del daño al tejido cardiaco/peor pronóstico si el genotipo en el momento del infarto de
miocardio es Hp2-2 (Chapelle et al., 1982) El mecanismo que subyace a esta asociación
es un decrecimiento de la capacidad antioxidante de Hp2-2 frente a Hp1-1, ya que es
menos eficaz impidiendo la transferencia del hemo desde la hemoglobina libre hasta las
lipoproteínas y su oxidación. Esto depende de una menor eficiencia de la eliminación de
la circulación de los complejos Hp2-2/hemoglobina por varios motivos: En primer lugar,
porque pueden existir menores niveles del receptor CD163 en la superficie de
monocitos/macrófagos y una mayor concentración de CD163 soluble en plasma de
individuos con genotipo Hp2-2 (Asleh et al., 2008). En segundo, debido a una
internalización más lenta del complejo Hp2-2-Hemoglobina por el receptor CD163 en
monocitos/macrófagos (Levy et al., 2007), lo que incrementa los niveles de hierro en
plasma, tejidos y placas ateroescleróticas, fomentando así la oxidación de lípidos y
proteínas en LDL (oxLDL) y HDL (oxHDL) (Moreno et al., 2008; Lioupis et al., 2011;
Goldenstein et al., 2012). La formación de oxHDL también es favorecida por la unión del
complejo hemoglobina-haptoglobina (Hp2-1 y Hp2-2, pero no Hp1-1) a apolipoproteína
A-I en la superficie de las HDL, lo que desplaza e inhibe la actividad LCAT. Otra razón de
esta inhibición de la actividad LCAT en oxHDL es la oxidación de apoA-I en Tyr166 (Wu et
218
 Resultados & Discusión

al., 2007b), lo que unido a la oxidación y reducción de actividades enzimáticas

antioxidantes asociadas a HDL (paraoxonasa y glutatión peroxidasa; Navab et al., 2006)
bloquea la esterificación del colesterol y su transporte reverso (Liau et al., 2003, Asleh et
al., 2006; Goldenstein et al., 2012). Finalmente, otra de las razones de la menor
capacidad antioxidante de Hp2-2 frente a Hp1-1 es que la difusión del polímero Hp2-2
dentro de compartimentos como el fluido sinovial podría estar dificultada debido a su
gran tamaño (Langlois & Delanghe, 1996). En conjunto, todos estos datos explicarían el
porqué la cadena α2 de la haptoglobina (peso positivo en la componente principal 2)
favorecería mayores respuestas inflamatorias dentro de los pacientes con RA.
Además de su función como proteína de unión a hemoglobina, que hace que sus
niveles se reduzcan cuando existe lisis intravascular de eritrocitos (Carter & Worwood,
2007), los niveles de haptoglobina se modifican al alza en muchas enfermedades, como
en infecciones, neoplasias (leucemia mieloide crónica, carcinoma hepatocelular, cáncer
de ovario), embarazo, trauma e infarto agudo de miocardio (Chapelle et al., 1982). La
concentración de haptoglobina en plasma se incrementa un 200-500 % durante los 7
días que median después del establecimiento de una inflamación (Carter & Worwood,
2007) y, dado que su vida media es de 5.4 días, el retorno a los valores normales es lento
(2-4 semanas) (Gabay & Kushner, 1999). La haptoglobina también está aumentada en el
plasma/suero de pacientes con RA (nuestros datos en Tablas 21 y 22, Figura 37; Doherty
et al., 1998) como parte de la respuesta de fase aguda, lo que genera un proceso de
retroalimentación negativa (Arredouani et al., 2005). Sin embargo, se sabe que los
mayores niveles de haptoglobina no sólo dependen de la presencia de citoquinas como
IL-6 o TNFα en la respuesta de fase aguda, sino también del genotipo (Langlois &
Delangue, 1996; Shahabi et al., 2012). Así, el alelo Hp1 está vinculado con mayores
niveles de haptoglobina en plasma, mientras que el alelo Hp2 conduce a una menor
concentración (nuestros datos en Figura 38; Langlois & Delangue, 1996;). De este modo,
es posible que dicho aumento en los niveles de haptoglobina debido a la respuesta de
fase aguda sea más acusado en pacientes RA con fenotipo Hp2-2 que en pacientes Hp2-1
o Hp1-1, como parece desprenderse de la Figura 41, por lo que estos últimos estarían
mucho más protegidos de las agresiones oxidativas. Por ello, una pregunta pertinente
sería ¿en pacientes RA se producen cambios en las frecuencias genotípicas/fenotípicas y
219
 Resultados & Discusión

alélicas?. La combinación de los tres alelos da lugar a seis fenotipos (Hp2-2, Hp2-1s, Hp2-
1f, Hp1s-1s, Hp1s-1f y Hp1f-1f), cuya frecuencia tiene una marcada diferenciación
geográfica (Van Vlierberghe et al., 2004), hasta el punto de tener utilidad en estudios de
genética de poblaciones. Así, la mayor frecuencia del alelo Hp1 se sitúa en África y
Sudamérica (0.5-0.7), mientras que la frecuencia alélica más baja se da en el sudeste de
Asia (<0.3).

sanos enfermos

20000,0
18000,0
16000,0
14000,0
12000,0
10000,0
8000,0
6000,0
4000,0
2000,0 enfermos
0,0
sanos
Hp2-2
Hp2-1
Hp1-1

Figura 41. Niveles de haptoglobina en individuos sanos y pacientes RA en función del fenotipo.

Esto último está conectado con el surgimiento del alelo Hp2 en la India hace
aproximadamente 2 millones de años. Este alelo Hp2 se ha ido expandiendo y
desplazando al Hp1 debido a una posible ventaja selectiva, de forma que en la
actualidad se puede decir que nos encontramos con un estado de polimorfismo
transitorio (Langlois & Delangue, 1996).

En la población europea la frecuencia del alelo Hp 1 se incrementa ligeramente

con respecto a las de la India hasta situarse en el entorno del 0.36-0.4, generando una
frecuencia genotípica/fenotípica de aproximadamente 16 % (Hp 1-1), 48 % (Hp 2-1), y 36
% (Hp 2-2). Las frecuencias alélicas obtenidas para la población gallega por Carracedo et
al., en 1987 (Hp1 0.426 y Hp2 0.573) y el rango de los diversos trabajos realizados con

220
 Resultados & Discusión

otras regiones españolas (Hp1, 0.37-0.44; Hp2, 0.56-0.63; Tabla 28) encajan con los
datos europeos (Moral & Panadero, 1983). En nuestros estudios, el grupo control
empleado es de un tamaño muestral demasiado bajo (N=8) como para calcular dichas
frecuencias de forma fiable (Tabla 28). No obstante, los datos en este grupo arrojan unos
valores de frecuencias alélicas (Hp1 0.437 y Hp2 0.563) muy similares a los que
acabamos de citar para la población española y europea. En cambio, en el grupo de
pacientes parece observarse, un cierto aumento de la frecuencia del alelo Hp1 (0.5) y,
sobre todo, un incremento de la frecuencia del fenotipo heterocigótico Hp 2-1 (Tabla
28), si bien nuestro bajo tamaño muestral nuevamente no permite confirmar si dichas
diferencias son o no significativas mediante un test de χ 2. No obstante, un estudio
realizado en la población belga por Baeten et al., en 2004 parece reforzar esa idea, ya
que encontró una mayor frecuencia del alelo Hp1 y de individuos Hp 2-1 dentro del
grupo de pacientes RA en comparación con donantes sanos (Tabla 28). Sin embargo, su
bajo tamaño muestral (N= 20) tampoco permitió alcanzar la suficiente significación
estadística.

La limitación de nuestro estudio nos llevó a realizar un metaanálisis con datos de

frecuencias alélicas y genotípicas/fenotípicas acumuladas de diferentes investigaciones
en poblaciones control y pacientes RA tanto de España como de Bélgica, que hemos
resumido en la Tabla 28. Como se muestra, ambas poblaciones (sanos y enfermos)
presentan frecuencias alélicas y genotípicas/fenotípicas que cumplen el equilibrio de
Hardy-Weinberg. Cuando se comparó la frecuencias del alelo Hp1 en las dos poblaciones
(sanos y enfermos) con los datos acumulados se generó un dato que χ 2 (1 g.L.) algo más
elevado, aunque todavía alejado del valor tabulado de 3.84 para p= 0.05, indicando así
que los dos factores (pertenencia a la población de enfermos y ser portador del alelo
Hp1) seguían siendo independientes. Del mismo modo, en este estudio de asociación
genética también se encontró que eran independientes la posesión de un fenotipo Hp2-
1 y el pertenecer a la población de enfermos con RA (χ 2 (1 g.L.) = 1.9). Sin embargo, como
el tamaño de muestra en el metanálisis no se encontraba bien balanceado en las
distintas categorías (sanos y enfermos) se decidió utilizar un test exacto de Fisher para
comparar las frecuencias fenotípicas/genotípicas o las frecuencias alélicas absolutas

221
 Resultados & Discusión

entre los dos grupos, si bien en ambos casos tampoco hubo evidencias para rechazar la
hipótesis nula (H0, OR=1).

Tabla 28

Fenotipo/genotipos de haptoglobina en individuos sanos y en pacientes con RA

Sanos Pacientes RA

(1)
Frecuencia (%)/valor absoluto (n)

(2) (3)
(A) (B) (C) (D) (E) (F) Media (G) Media
Nuestros

Nuestros
datos

datos
Hp2-2 37.5/3 39.5/19 29/30 43.75/7 38.2/121 32.2/242 35.9/79 36.6%/501 25/2 17/4 21%/6

Hp2-1 37.5/3 37.5/18 45/46 37.5/6 47.6/151 51.2/385 48.2/106 43.5%/715 50/4 65/15 58%/19

Hp1-1 25/2 23/11 26/26 18.75/3 14.2/45 16.6/125 15.9/35 19.9%/247 25/2 17/4 21%/6

(1)
Frecuencia (%)/valor absoluto (n)

Hp2 56.3/9 58.3/56 51.5/106 62.5/20 62/393 57.8/869 60/264 58.3%/1717 50/8 50/23 50%/31

Hp1 43.7/7 41.7/40 48.5/98 37.5/12 38/241 42.2/635 40/176 41.7%/1209 50/8 50/23 50%/31

(4)
Ratios

Hp2/Hp1 1.3 1.4 1.1 1.7 1.6 1.4 1.5 1.4 1 1 1

(1) (A) Rodríguez et al., 2006. 2-DE. Población española. n= 48 individuos sanos; Quero et al., 2011. 2-DE. Población española.
n= 48 individuos sanos; (B) Álvarez-Blasco et al., 2009. PCR. Población española. n=102 individuos sanos; (C) Pavón et al.,
2006. 2-DE. Población española. n= 16 individuos sanos; (D) Datos de Moral et al., 1983. Purificación de haptoglobina y
electroforesis en geles de poliacrilamida-urea. Población española (Barcelona). n=317 individuos sanos; (E) de Pacorbo &
García-Orad, 1987. Electroforesis en geles de almidón. n=752 individuos sanos procedentes de 9 poblaciones españolas; (F)
Datos de la población belga procedentes del estudio de Louagie et al., 1996. Electroforesis en geles de almidón de muestras
de suero suplementadas con hemoglobina. n= 220 individuos sanos; (G) Baeten et al., 2004. Población Belga. Electroforesis
en geles de almidón. n= 23 pacientes RA
(2) La distribución de frecuencias fenotípicas en la población de individuos sanos está en consonancia con la esperada según el
equilibrio de Hardy-Weinberg. χ2 (1 g.L.) = 0.262
(3) La distribución de frecuencias fenotípicas en enfermos parece estar en consonancia con la esperada según el equilibrio de
Hardy-Weinberg. χ 2 (1 g.L.) = 1.58
(4) En un polimorfismo equilibrado la ratio Hp2/Hp1 debería de permanecer constante, pero en este momento la especie
humana se encuentra en un estado de polimorfismo transitorio (Langlois & Delanghe, 1996). Ratio Hp2/Hp1 sanos: 1.4.
Ratio Hp2/Hp1 enfermos: 1

222
 Resultados & Discusión

A la vista de estos resultados se necesitan más datos experimentales que

confirmen la reducción de la ratio Hp2/Hp1 así como el aumento de la frecuencia de
individuos Hp2-1 en RA). Es interesante resaltar la existencia de datos de otros
investigadores en EEUU que apuntaban ya en 1963 hacia un aumento tanto de la
frecuencia del alelo Hp1 (36.5 %43.6 %) como del fenotipo Hp2-1 (49 %67 %) en RA
(Cohen & Chasen, 1963).
También se ha encontrado una mayor frecuencia de individuos heterocigotos
Hp2-1 en la enfermedad de Crohn (Papp et al., 2008), aneurisma aórtico abdominal
(Wiernicki et al., 2010), Parkinson (Costa-Mallen et al., 2008) o en carcinoma de ovario
(Fröhlander & Stendahl, 1988). ¿Cuál podría ser el sentido biológico de este aumento
potencial en la frecuencia del alelo Hp1 y de la proporción de fenotipos heterocigotos
Hp2-1 en la población RA? Esta cuestión resulta difícil de explicar, pero podría
relacionarse con un proceso de heterosis o vigor híbrido, una especie de equilibrio entre
los mayores niveles basales de haptoglobina y la habilidad superior de Hp1 para eliminar
hemoglobina libre y difundir (debido a su pequeño tamaño) dentro de compartimentos
como el fluido sinovial y por otro lado la mayor capacidad de Hp2 para potenciar las
respuestas inmunológicas. Esta combinación podría hacer a los heterocigotos superiores
con respecto a la supervivencia o a la fecundidad. Eso parece estar dándose en la
población en general, pero podría ser más acusado en la población de pacientes con RA
(Tabla 28). Independientemente de cuál sea la explicación, parece claro que la
representación de los valores de puntuación en PC1 (inflamación) y PC2 (haptoglobinas)
para cada uno de los donantes (sanos o enfermos) es capaz de generar un agrupamiento
de las dos clases de muestras de suero (Figura 42).

223
 Resultados & Discusión

Hp2-2
Figura 42. Agrupamiento
Hp2-2
de los pacientes con artritis
reumatoide (SAR) y de los
donantes sanos (S). El
análisis de componentes
principales identifica 2
Hp2-1
grupos de individuos en
función de las componentes
principales 1 (PC1; nivel de
Hp1-1 inflamación) y 2 (PC2;
Hp2-1
genotipo/fenotipo de las
haptoglobinas), que explican
Hp2-2 Hp1-1
Hp1-1
Hp2-1 conjuntamente el 45% de la
Hp2-1 Hp2-1 variabilidad.
Hp2-2 Hp2-1
Hp1-1 Hp2-1
Hp2-2

Componente Principal 3 (PC3)

La producción de proteínas de fase aguda (APPs) en el hígado se desencadena
por citoquinas proinflamatorias como IL-1, IL-6 o TNFα. A pesar de este estímulo común,
que afecta a los hepatocitos, las proteínas de fase aguda individuales no se incrementan
(APPs+) o se reducen (APPs-) de forma simultánea, sino que lo hacen siguiendo distintas
cinéticas. Así, podemos hablar de proteínas de fase aguda positiva de respuesta rápida
(<24h), como la proteína C reactiva, la α1-antiquimotripsina o la α1-glucoproteína ácida
(orosomucoide), proteínas de fase aguda positiva de respuesta intermedia (24-48h),
como la α1-antitripsina, la haptoglobina, el factor C4 del complemento, el fibrinógeno o
la α2-macroglobulina, y finalmente proteínas de fase aguda positiva de respuesta lenta
(>48h), como la ceruloplasmina y el factor C3 del complemento (Tabla 29).

224
 Resultados & Discusión

Tabla 29. Cinética de Reactantes de fase aguda*

<24h CRP, α1-antiquimotripsina, α1-glucoproteína
ácida
24-48h α1-antitripsina, haptoglobina, factor C4 del
complemento, fibrinógeno, α2-
macroglobulina
>48 h Ceruloplasmina, factor C3 del complemento
*Adaptada de Álvaro González Hernández, Principios de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Editorial
Elsevier, 2010. (capítulo 15, proteínas)

En el análisis de componentes principales, α1-antiquimotripsina y orosomucoide,

dos APPs+ de respuesta rápida, aparecen con un gran peso negativo dentro de la
componente 3. Se sabe que los niveles de estos dos marcadores muestran una buena
correlación con la proteína C reactiva (Chard et al., 1988), un indicador de la actividad de
la enfermedad (como la velocidad de sedimentación de eritrocitos/ESR) que aumenta de
manera significativa durante los primeros días de la inflamación. Esto quiere decir que
los pacientes con aumentos en plasma de proteína C reactiva, pero sobre todo α1-
antiquimotripsina y orosomucoide (que tienen una mayor vida media que la proteína C
reactiva y una tasa de decaimiento más lenta) estarán en el entorno de cuando se está
produciendo una exacerbación del proceso inflamatorio asociado a la RA (Chard et al.,
1988). Ambas proteínas, la α1-antiquimotripsina y el orosomucoide, son inhibidores de
proteasas. Así, la última de ellas es una glicoproteína que inhibe la actividad colagenasa
3 y cuya concentración aumenta durante la inflamación en RA. Esta actividad inhibitoria
de colagenasa 3 parece estar reducida cuando el orosomucoide está excesivamente
fucosilado, algo que ocurre durante la RA y que podría desencadenar actividades más
elevadas de colagenasa. La α1-antiquimotripsina es también inhibidora de proteasas, en
este caso de MMP-9, catepsina G, colagenasa y elastasas pancreáticas (Van't Wout et al.,
2012).

En cuanto a la proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas α1B-

glicoproteína (A1BG), esta es la que más peso positivo tiene dentro del componente 3.
Doherty et al., (1998) la encontró reducida en el suero de personas con RA, algo que en
cambio nosotros no hemos detectado en nuestros geles. Sin embargo, esta proteína

225
 Resultados & Discusión

también se encuentra reducida en infarto agudo de miocardio (Cubedo et al., 2013), y

una disminución de A1BG en RA también puede tener sentido a la luz de su naturaleza
autoantigénica (Biswas et al., 2013). Se trata de una proteína polimórfica (3 genotipos
frecuentes: 1-1, 2-2- y 1-2) que se reduce mucho durante la regeneración del hígado en
rata (Wang et al., 2009). También es una proteína que aumenta con la edad en ratones
(si bien, parece que el genotipo del ratón influye), y que en humanos está incrementada
en mujeres premenopáusicas, por lo que se piensa que los niveles de esta proteína
dependen de la edad (hay una relación directamente proporcional con la hormona del
crecimiento), del sexo (hay influencia en sus niveles de las hormonas sexuales) y del
fondo genético. A1BG une CRISP-3/SGP-28, una proteína abundante en el plasma y de
pequeño tamaño (28 kDa) presente en las secreciones exocrinas y en los gránulos
secretores de neutrófilos. Se cree que CRISP-3 juega un papel importante en la
respuesta inmune innata. Probablemente CRISP-3 se une a A1BG para evitar sus
pérdidas en la filtración glomerular, pero parece ser también que dicha interacción
tiene que ver con evitar los efectos nocivos que CRISP-3 libre podría tener sobre otras
proteínas, dado que se le ha descrito una actividad similar a las metaloproteinasas (Udby
et al., 2004).

Clasificación de los donantes en función de los componentes principales: Hierarchical

clustering
Para cada individuo se calculó la mediana de las tres mediciones (se repitió el
análisis con la media, el mínimo y el máximo, con resultados similares) y se realizó
nuevamente un análisis de componentes principales con estos datos, obteniendo que
con 7 componentes principales se explicaba un 88.8 % de la variabilidad (con 8
componentes, se daba cuenta del 92.01.
Una vez reducidas las variables a un conjunto más manejable que explicaba la
mayor parte de la variabilidad de nuestros datos, el siguiente paso fue analizar cómo los
donantes de este estudio se agrupaban en función de dichas nuevas variables o
componentes principales. Para realizar dicho agrupamiento realizamos un análisis de
agrupamiento jerárquico basado en el valor de cada donante para cada una de las 7
primeras componentes principales. En este proceso tanto los donantes sanos como los
226
 Resultados & Discusión

pacientes fueron organizados en una estructura en forma de árbol en la que

predominaban dos clusters: uno formado mayormente por individuos del grupo control
(4 sanos y 2 enfermos) y otro formado principalmente por el grupo de pacientes con
artritis reumatoide (6 enfermos y 4 sujetos control) (Figura 43A). No obstante, los
valores de sensibilidad (75 %), especificidad (50 %), eficiencia diagnóstica (62.5 %) y
valor predictivo positivo (60 %), estaban alejados en general del óptimo (>80 %).

Dado que la ganancia en variabilidad explicada por cada componente decrecía bastante
a partir de la tercera, realizamos un nuevo estudio de clustering, en este caso sólo
considerando las tres primeras componentes (66.7 % de variabilidad explicada) (Figura
43B). Nuevamente, dos clusters se pudieron distinguir. El primero de ellos englobaba
principalmente a los individuos sanos (7 individuos control y 3 pacientes), mientras que
el segundo se correspondía mayormente con el grupo de pacientes (5 donantes con RA y
1 individuo control). Los valores de sensibilidad (62.5 %), especificidad (87.5 %), eficacia
diagnóstica (75 %) y valor predictivo positivo (83.3 %) fueron, como se puede ver,
bastante razonables, salvo en el caso de la sensibilidad. No podemos explicar el porqué
algunos de los pacientes se agrupan en el grupo de los individuos sanos generando esta
reducción de la sensibilidad diagnóstica, pero hay que tener en cuenta que algunos de
estos pacientes se encuentran en etapas iniciales de la enfermedad, de modo que
muchas de las magnitudes bioquímicas agrupadas en cada uno de los componentes
principales, presentarán resultados similares a los existentes en individuos control.

227
 Resultados & Discusión

Figura 43. Análisis de clustering. A) Empleando las componentes principales PC1-PC7; B) Utilizando las
tres primeras componentes principales (PC1-PC3). S, donantes sanos; SAR, donantes com artritis
reumatoide.

Una baja sensibilidad, acompañada de valores superiores de especificidad y

valores predictivos positivos, es un factor compartido también con otras magnitudes
bioquímicas empleadas de forma clásica en el diagnóstico de la RA. Un ejemplo es el
factor reumatoide (RF), cuya sensibilidad diagnóstica es del 59-79 %, con una
especificidad del 80-84 % (Niewold et al., 2007). Otro ejemplo es la detección de
anticuerpos frente a péptidos citrulinados (ACPA). Dicha detección fue realizada

228
 Resultados & Discusión

inicialmente mediante el uso de varios péptidos sintéticos que contenían citrulina, si

bien la estandarización era difícil y los niveles de sensibilidad diagnóstica alcanzados
fueron bajos. Sin embargo, el diseño de un ensayo que utilizaba un péptido citrulinado
cíclico (CCP) permitió una mayor reproducibilidad, sensibilidad (44-56 %) y especificidad
diagnóstica (90-97 %) surgiendo así los denominados tests anti-CCP1 (Niewold et al.,
2007). Más recientemente, la selección de péptidos citrulinados óptimos mediante un
proceso de screening de librerías peptídicas empleando suero de pacientes RA, permitió
el desarrollo de una segunda generación de ELISAS (anti-CCP2). Estos test anti-CCP2 son
los más empleados actualmente, y sus niveles de sensibilidad en pacientes con RA ya
establecida son algo mayores a los anti-CCP1, aunque variables (60-90 %) (Avouac et al.,
2006; Niewold et al., 2007; Pruijn et al., 2010; Kim et al., 2010). Sin embargo, estos
niveles de sensibilidad de los test anti-CCP2 se reducen en pacientes RA recién
diagnosticados (Pruijn et al., 2010). La especificidad diagnóstica de los test anti-CCP2 es
siempre muy alta (>95 %) (Avouac et al., 2006; Niewold et al., 2007), lo mismo que el
valor predictivo positivo (90-98 %) (Vander Cruyssen et al., 2005). Dicha elevada
especificidad se mantiene incluso aunque la población control incluya individuos con
enfermedades inflamatorias como lupus eritematoso sistémico (SLE) o síndrome de
Sjögren (SS) (Kim et al., 2010). El surgimiento de tests de tercera generación con un
nuevo péptido (anti-CCP3) no parece haber mejorado sustancialmente el problema de la
sensibilidad diagnóstica (Coenen et al. 2007; Luis Caro-Oleas et al., 2007; Santiago et al.,
2008), de modo que este tipo de pruebas siguen siendo interesantes en las poblaciones
heterogéneas de pacientes de Reumatología de los hospitales, pero no en la población
general, en donde el valor predictivo positivo se reducirá drásticamente, debido a la baja
prevalencia de la enfermedad en dicha población (1-2 %).
Una baja sensibilidad también está presente en los criterios de clasificación de la
ACR (1987), que incluyen al factor reumatoide y de los que se sabe desde hace tiempo
(Saraux et al., 2001) que no son útiles para diagnosticar esta enfermedad dentro del
primer año desde su comienzo. Esto se debe a que dichos criterios fueron desarrollados
como una herramienta para clasificar a los pacientes que ya habían sido identificados
por el reumatólogo como personas con una RA, y no como un método de diagnóstico.
Los nuevos criterios de la ACR/EULAR de 2010, comparados con los de la ACR de 1987,
229
 Resultados & Discusión

incluyen un mayor número de pruebas serológicas/hematológicas: factor reumatoide,

ACPA, CRP, ESR. Consecuentemente, estos criterios tienen una mayor sensibilidad
diagnóstica (79-84 %), lo que favorece un mejor pronóstico, si bien a costa de una menor
especificidad (59-64 %; sobre todo en pacientes ≥60 años) y por lo tanto de un acusado
sobrediagnóstico (Sakellariou et al., 2013; Vonkeman & van de Laar, 2013; Radner et al.,
2013; Berglin et al., 2013). De este modo, podemos decir que sigue existiendo una
necesidad real de nuevas metodologías de evaluación que permitan un diagnóstico más
simple y rápido de esta enfermedad con una elevada sensibilidad, especificidad, valores
predictivos y eficacia diagnóstica.

10.- USO DE BIBLIOTECAS DE LIGANDOS PEPTÍDICOS COMBINATORIOS

TM
(PROTEOMINER ) EN LA DETECCIÓN DE BIOMARCADORES DE DIAGNÓSTICO
TEMPRANO DE ARTRITIS REUMATOIDE

De lo comentado en anteriores apartados se puede deducir que las bibliotecas de

ligandos peptídicos combinatorios, y más en concreto el kit comercial ProteoMinerTM,
constituyen una eficaz herramienta para enriquecer, de forma rápida, las muestras de
suero en proteínas de pequeña o mediana abundancia empleando grandes volúmenes
de suero de partida (e.j., 10 mL). Sin embargo, no hay que olvidar que este tipo de
técnicas se basan en “igualar” diferencias de concentración (“equalization”), por lo que
la comprensión del rango dinámico suscita una cuestión inmediatamente: ¿Son este tipo
de tecnologías adecuadas para la búsqueda de biomarcadores de patologías? no parece
fácil dar una respuesta a esta pregunta. En principio esto debería ser posible, con la
única condición que el biomarcador potencial estuviese en una concentración tan
mínima, que no saturase el péptido de las beads y se pudiesen así ver diferencias entre
el control y la muestra patológica (Righetti et al., 2006). En este sentido, Hartwig et al.,
2009 realizó un análisis cualitativo y cuantitativo de muestras de suero tratadas con
ProteoMiner mediante 2-DE, demostrando que las intensidades de los spots
correspondientes a proteínas de E. coli incorporadas deliberadamente (“spikes”) a las
muestras de suero, eran directamente proporcionales a la cantidad inicial de proteína
bacteriana (3-300 μg). Otro ejemplo son los trabajos de Léger et al. (2011), quienes

230
 Resultados & Discusión

indicaron que los niveles relativos de proteína C reactiva endógena (CRP) se mantenían
en las muestras de plasma de algunos pacientes del estudio, a pesar del tratamiento con
librerías hexapeptídicas.

Debido al elevado coste de esta tecnología se decidió preparar dos pooles de

muestras de un volumen de 1 mL cada uno (Figura 44). El primero de ellos se generó a
partir de los sueros de 8 donantes sanos, mientras que el segundo se preparó juntando
los sueros de los 8 pacientes con artritis reumatoide. El rango dinámico de
concentración proteica de cada uno de los pooles fue reducido utilizando una colección
combinatoria de hexapéptidos (ProteMinerTM) especialmente formulada para análisis
mediante 2-DE (BioRad). Se siguieron las instrucciones del fabricante y las proteínas
eluidas de las columnas se separaron en geles bidimensionales. Para la primera
dimensión se utilizó el sistema Protean IEF (BioRad) (0.1 mg, tiras 11 cm pH 5-8),
mientras que para la segunda se empleó la carcasa Ettan DALT Six. Con el fin de facilitar
la comparación, en cada gel de la segunda dimensión se dispuso una muestra del grupo
control (sanos) y una del grupo de pacientes (enfermos). Debido a la pequeña cantidad
de proteína cargada en cada tira de isoelectroenfoque (0.1 mg), los geles fueron teñidos
con SYPRO Ruby.

Figura 44. Pool sanos vs pool pacientes RA.

231
 Resultados & Discusión

El análisis diferencial fue realizado utilizando el software LUDESI (Anova ≤0.05,

fold ±2). La identificación de proteínas se llevó a cabo mediante MALDI-TOF, y
confirmada mediante posterior secuenciación de péptidos específicos por MS/MS
(Figura 45; Tabla 30). Los resultados obtenidos en el análisis diferencial de expresión de
este primer abordaje mostraron aumentos significativos en pacientes de apo A-I (spot
#32), apo A-IV (spot #72), apo A-J (spot #343) y el factor del complemento C4a (spot
#239), mientras que se observaron reducciones en antitrombina III (spot #92) y la
cadena pesada de la inmunoglobulina G (spot #344) (Figura 45; Tabla 30). Estos
resultados, por tanto, confirman la reducción de antitrombina III en suero de pacientes
con RA (Tabla 31), pero entran en conflicto con la reducción observada de apoA-I o
apoA-IV (Tabla 31), dos apolipoproteínas que tanto en nuestros análisis proteómicos de
sueron sin Ig/HSA (Tabla 31) como en los trabajos de otros investigadores (Doherty et
al., 1998) aparecen infrarepresentadas en el suero de pacientes con RA. Una explicación
posible es que los spots #32 y #72 (Figura 45) no se corresponden con los spots #4004
(apoA-I) y #3204 (apo A-IV) (Tabla 21 y 22), de modo que aunque se trate de las mismas
proteínas (apo A-I y apo A-IV) podrían ser variantes minoritarias cuyo incremento podría
corresponderse con la reducción de otros spots de las mismas proteínas. Otra razón
podría tener que ver con el uso de “pools” en estos ensayos. Por último, una explicación
podría tener que ver con el hecho que el uso de bibliotecas de ligandos peptídicos
combinatorios tampoco está exento de problemas.

232
 Resultados & Discusión

Figura 45. Análisis pool de sanos vs pool de enfermos. (A) Proteinas significativas. (B) Se identificaron 7 spots
(Tabla 30) que presentaban diferencias significativas (Anova ≤ 0.05, fold ±2) mediante espectrometría de masas.

233
 Tabla 30. Análisis de masas
Peptídos
Número Puntuación Covertura
Proteína Base de datos Nº de acceso reconocidos/valor Pm (Kda) pI
de spot de Mowse (%)
esperado
#32 Apolipoproteína A-I NCBI APOA1_HUMAN 63 9/0.01 31 30.759 5.56
#72
Apolipoproteína A-IV NCBI APOA4_HUMAN 81 11/0.00016 23 45.371 5.28
#343 Apolipoproteína J NCBI CLUS_HUMAN 77 12/0.0004 25 53.031 5.89
#92 e-006
Antitrombina III NCBI ANT3_HUMAN 94 12/8.1 34 53.025 6.32
#239 C4A Complemento NCBI CO4A_HUMAN 67 1/n.d 0 194.247 6.65

234
#344 Inmunoglobulina G
Cadena pesada NCBI IGHG2_HUMAN 38 1/n.d 3 36.505 7.66
#314 Vitamina D BP NCBI VTBD_HUMAN 38 1/n.d 2 54.526 5.40
Resultados & Discusión
 Resultados & Discusión

TABLA 31

Compilación de las proteínas encontradas modificadas en pacientes RA dentro de las fracciones

retenidas por la cromatografía tiofílica (inmunoglobulinoma) o en sueros tratados mediante
inmuno-sustracción o librerías peptídicas

Proteína Inmunoglobulinoma Suero sin Ig/HSA ProteoMinerTM

Albúmina n.d. Reducida n.d.

Antitrombina III n.d. Reducida Reducida

Apolipoproteína A-I n.d. Reducida Aumentada

Apolipoproteína A-IV n.d. Reducida Aumentada

Apolipoproteína J n.d. n.d. Aumentada

Ceruloplasmina n.d. Aumentada n.d.

Complemento C2 n..d Reducido n.d.

Complemento C4a n.d. n.d. Aumentado

Glicoproteína α2 rica en n.d. Aumentada n.d.

leucina

Haptoglobina n.d. Aumentada n.d.

Hemopexina n.d. Reducida n.d.

IgG, cadena pesada Aumentada n.d. Reducida

Precursor amiloide n.d. Aumentada n.d.

sérico

Proteína de unión a n.d. Reducida n.d.

retinol

Proteína de unión a n.d. Reducida Aumentada

vitamina D

Kininógeno Aumentado n.d. n.d.

Tetranectina n.d. Reducida n.d.

Transtirretina n.d. Reducida n.d.

α1-antiquimotripsina n.d. Aumentada n.d.

α1-antitripsina Reducida Reducida n.d.

α2-HS glicoproteína n.d. Reducida n.d.

235
 Resultados & Discusión

En primer lugar, porque aunque la fuerza de la interacción entre los péptidos de la

librería peptídica y las proteínas capturadas es elevada (Righetti et al., 2012), el
tratamiento del suero con librerías peptídicas parecen eliminar mayormente proteínas
<26 kDa (Fernández et al., 2011). Además, aunque efectivamente comprime el rango de
concentraciones de proteínas dentro de la fracción no retenida, permitiendo así la
visualización de especies proteicas minoritarias, todavía se detectan proteínas séricas
pertenecientes al grupo de las 20 proteínas más abundantes, con presencia relevante de
inmunoglobulinas y apolipoproteínas (Fernández et al., 2011). En el caso de las
apolipoproteínas (Apo A-I, Apo A-IV, Apo D, Apo E, o Apo J), esto podría deberse a una
cierta selectividad por este tipo de proteínas, capaces de interaccionar con los lípidos y
con el medio acuoso gracias a sus propiedades anfipáticas (pueden permanecer libres en
solución pero también asociarse a lipoproteínas). De hecho, de los 16 aminoácidos que
forman la librería de hexapéptidos aleatorios, 8 de ellos (Phe, Trp Tyr, Arg, Lys, His, Ile,
Val) son capaces de capturar por si sólos una gran cantidad de proteínas, especialmente
los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr y Trp), mientras que dicho número se reduce en el
caso del resto de aminoácidos (Boschetti & Righetti, 2008). Esto indica que los dos tipos
de interacciones dominantes que se dan entre los péptidos unidos a la matriz
cromatográfica y las proteínas del suero son las interacciones carga-carga y, sobre todo,
las hidrofóbicas (Boschetti & Righetti, 2008). De este modo, es posible que dichas
interacciones hidrofóbicas, así como una gran número de sitios de unión, favorezca la
interacción entre apolipoproteínas como apoJ y los hexapéptidos de la librería (Righetti
& Boschetti, 2007; D´Ambrosio et al., 2008), siendo así preferentemente enriquecidas.
Keidel et al., (2010) va incluso más allá, indicando que la eliminación de proteínas
mediante el uso de bibliotecas de ligandos peptídicos combinatorios no está basada en
la interacción entre dichos ligandos hexapéptídicos aleatorios y las proteínas sino en “un
mecanismo hidrofóbico general, en donde la diversidad de ligandos de superficie juega
sólo un papel sin importancia“. Sean los péptidos los responsables o la matriz
cromatografíca, este tipo de interacciones hidrofóbicas podría dar lugar a resultados
inesperados en relación con los niveles de apolipoproteínas como apo A-I, Apo D, Apo J,
Apo E o Apo A-IV en ciertas patologías. Un ejemplo podría ser el aumento de Apo A-I
(spot #32) y Apo A-IV (spot #72) que hemos detectado en sueros tratados con
236
 Resultados & Discusión

ProteoMinerTM de pacientes con RA, pero no en aquellos tratados mediante inmuno-

sustracción. Otro sería el aumento en Apo A-I en pacientes de cáncer de pulmón de
células no pequeñas con pobre pronóstico acompañado de un incremento en proteínas
de fase aguda positivas como SAA1 (Milan et al., 2012). De este modo, estos datos
sugieren que la integración de la tecnología de bibliotecas de ligandos peptídicos
combinatorios (ProteoMinerTM) con la 2-DE/MS o con otras tecnologías como LC-MS/MS
es muy simple y resulta útil para la búsqueda de nuevos biomarcadores en distintas
enfermedades. Sin embargo, esta tecnología debería de ser complementada con otras
de reducción de la complejidad de las muestras como la inmuno-sustracción (Selvaraju &
Rassi, 2011), o bien con metodologías que permitan detectar cambios en los niveles del
biomarcador de una manera muy específica y dirigida como el ELISA o el western blot.

El análisis en LUDESI de nuestros geles bidimensionales apunta a que Apo

J/clusterina (spot #343; 35.7-39.5 kDa y pI 4.7-4.9 de acuerdo con Swiss-2DPAGE)
presenta niveles aumentados en suero en pacientes RA, lo que coincide con su papel
como marcador de inflamación (Falgarone & Chiocchia, 2009) y con la reducción de Apo
J en el suero de pacientes RA tratados con terapia anti-TNF (infliximab) (Takeuchi et al.,
2007). Clusterina también se encuentra aumentada en suero de pacientes con otra
enfermedad autoinmune, la esclerosis múltiple (Fiorini et al., 2013). Por el contrario, la
comparación de los niveles de clusterina en fluido sinovial en pacientes con RA y
osteoartritis (OA) no ha mostrado diferencias significativas (Devauchelle et al., 2006).
Para complicar este cuadro aún más, estos mismos autores sí han detectado reducciones
significativas tanto de mensajeros como de proteína intracelular en tejido sinovial de
pacientes con RA en comparación con tejido sinovial de pacientes con OA o pacientes
que han sufrido un trauma en la articulación (Devauchelle et al., 2004, 2006). Otras
enfermedades autoinmunes en donde se han observado modificaciones de
apoJ/clusterina ha sido en lupus eritematoso sistémico (SLE; Newkirk et al., 1999) y en
psoriasis (García-Rodríguez et al., 2013), en ambos casos con concentraciones reducidas
en suero/plasma.

237
 Resultados & Discusión

Clusterina es una glicoproteína con isoformas nucleares, extracelulares e

intracelulares. La forma predominante de la clusterina es una proteína heterodimérica
de 80 kDa (sCLU) producida a partir de un mRNA de tamaño completo, mientras que la
forma nuclear (nCLU; 55 kDa) se produce mediante procesamiento alternativo. Las
funciones variadas (en general antiinflamatorias y citoprotectoras) que dependen de su
maduración y localización son: inhibidor del complemento (Tschopp & French, 1994),
inhibidor de la proliferación (Shannan et al., 2006), anti- (la forma soluble; Shannan et
al., 2006; Trougakos, 2013) y proapoptóticas (la forma nuclear; Shannan et al., 2006; Kim
& Choi, 2011), chaperona (Trougakos, 2013), inhibidor de metaloproteinasas de matriz
(MMP-2, MMP-3, MMP-7 y MMP-9; Jeong et al., 2012) e inhibidora de la activación de
NF-κB mediada por TNF en sinoviocitos (Devauchelle et al., 2004, 2006; Falgarone &
Chiocchia, 2009; Falgarone et al., 2012), de ahí que su reducción favorezca la producción
de citoquinas proinflamatorias como IL-6 y la sinovitis. De hecho, la ausencia de
clusterina en modelos murinos de artritis reumatoide genera una enfermedad más
acelerada y de mayor duración (Falgarone & Chiocchia, 2009), o aumenta la severidad de
la miocarditis autoinmune en modelos murinos de esta enfermedad (McLauhlin et al.,
2000).

Como hemos visto anteriormente, las enfermedades autoinmunes presentan una

ateroesclerosis acelerada. La clusterina secretada (sCLU) se encuentra asociada con
lipoproteínas de alta densidad (HDL; Mackness et al., 1997; Poulakou et al., 2008) a
demás de formar complejos con apolipoproteína A-I (Jenne et al., 1991; Poulakou et al.,
2008) y la paraoxonasa humana (Kelso et al., 1994; Poulakou et al., 2008). Apo A-I, Pon
(paraxonasa) y clusterina se acumulan en la placa ateroesclerótica como consecuencia
del atrapamiento de HDL en la pared arterial. Estos componentes se asocian con una
subespecie específica de HDL en la circulación, que se cree previene la peroxidación
lipídica. Por lo tanto es posible, que el aumento de Pon, clusterina, y Apo A- I durante el
desarrollo de la aterosclerosis puede representar una respuesta protectora, al estrés
oxidativo asociado con el desarrollo de la enfermedad (Mackness et al., 1997).

238
 Resultados & Discusión

11.- DESARROLLO DEL PROYECTO A CORTO PLAZO

Dada la naturaleza preliminar de algunos de los resultados presentados en el final

de esta tesis, se ha considerado conveniente incluir un pequeño apartado final en el que
se describen algunos de los ensayos que se van a acometer en el corto plazo con el fin de
lograr un mayor soporte experimental y confirmar algunas de las hipótesis barajadas.
Así, la idea sería validar estos datos analizando un mayor número de sueros de
individuos sanos y pacientes RA en combinación con nuevas técnicas.

Un primer paso sería intentar confirmar el aumento de LRG1 y la reducción de

ATIII en el suero de pacientes RA. Para ellos se plantearía realizar bien una cuantificación
absoluta por ELISAS comerciales o bien una cuantificación relativa por western blot. En
este último caso se cargarían volúmenes iguales de suero en cada uno de los pocillos del
gel y, después de la transferencia, se emplearían anticuerpos monoclonales anti-AT-III y
anti-LRG1 en combinación con anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos y
detección de la fluorescencia en equipos de captación de imagen adecuados. El
resultado esperado sería la observación de una banda de LRG1 (45-50 kDa) más intensa
en individuos RA (y lo contrario en el caso de AT-III; 59-60 kDa) en comparación con los
controles sanos. α1-antiquimiotripsina u orosomucoide.

Por otro lado, para poder comparar las frecuencias alélicas y genotípicas de los
genes HP y APOE en las dos poblaciones (sanos y pacientes RA) y confirmar la mayor
frecuencia de los alelos HP*1 y APOE*4 en pacientes con RA se plantea una purificación de
DNA genómico a partir de un número elevado de muestras de sangre de controles y
pacientes combinada con dos posibilidades analíticas: 1) Amplificación mediante PCR de
la región de interés en los genes HP y APOE seguida de piro-secuenciación; 2) Uso de
PCRs específicas de alelo (“allele-specific oligonucleotide polymerase chain reaction” o
ASO-PCR).

Finalmente, para comprobar si existe un vínculo entre el riesgo de citrulinización

de la proteína Apo E y el genotipo en el gen APOE la idea sería seleccionar varios grupos
de individuos en función del genotipo (E2/E2, E3/E3, E4/E4, etc.) y capturar

239
 Resultados & Discusión

específicamente esta apolipoproteína a partir de las muestras de suero

correspondientes por inmunoprecipitación mediante un anticuerpo anti-apo E. Para
analizar el grado de citrulinización se plantean dos posibilidades: 1) Análisis mediante 1-
DE y 2-DE, en combinación con western blot (empleando anticuerpos específicos anti-
apoE y anti-citrulina), de la proteína apo E inmunoprecipitada y de los niveles de
citrulinización de esta apolipoproteína; 2) Uso de espectrometría de masas y para la
detección de los niveles de citrulinización e identificar los péptidos dentro de la proteína
apoE que sufren esta modificación postraduccional aplicando reglas de identificación
como el incremento del peso molecular de los péptidos en 0.98 Da o la pérdida de cortes
trípticos (MS1) o cambios en la secuencia de los péptidos parentales (ArgCit; MS2).

240
CONCLUSIONES
 Conclusiones

Basándonos en los resultados presentados y discutidos a lo largo de esta tesis

podemos establecer una serie de conclusiones que a continuación pasamos a enumerar:

Tanto la combinación de cromatografía tiofílica/inmunodepleción de HSA como el uso de librerías

1 peptídicas permiten la eliminación de un gran número de proteínas abundantes de suero y la

reducción de la complejidad y del rango dinámico de las muestras, facilitando los estudios de
abundancia diferencial de proteínas partiendo de altos volúmenes de muestra inicial y con una mínima
preparación, relativo bajo coste y gran rapidez de análisis.

Los estudios proteómicos de abundancia diferencial de proteínas en el suero de pacientes con RA

2
y controles sanos han mostrado cambios significativos en numerosas proteínas del suero, entre
ellas una reducción de ATIII y un aumento de LRG1. El estado procoagulatorio en RA encajaría con
la reducción de ATIII, que provocaría un desequilibrio en la formación/degradación de fibrina que llevaría
a su acumulación en articulaciones y placas ateromatosas. El aumento de LRG1 en RA podría servir para
eliminar al citocromo c de la circulación (señal de peligro), o como factor de supervivencia para linfocitos o
de activación para neutrófilos.

El análisis multivariante de los datos proteómicos (PCA) apunta nuevamente que la artritis

3 reumatoide es una enfermedad articular autoimune y sobre todo multifactorial, ya que muchos
son los factores involucrados en la causa esta enfermedad. El factor que más contribuye a la
variabilidad en el proteoma causada por esta patología parece ser el nivel de inflamación, mientras que un
segundo factor hace referencia al fenotipo de los individuos en cuanto a las haptoglobinas, una molécula
antioxidativa y un antagonista natural de la inflamación y de la activación del sistema inmune. Nuestros
datos apuntan hacia una mayor frecuencia del alelo Hp1 y del fenotipo Hp 2-1 en pacientes con RA, a
pesar de que nuestro tamaño muestral no permite confirmar si dichas diferencias son significativas.
Finalmente, un tercer factor en importancia a la hora de explicar la variabilidad en los datos proteómicos
de pacientes RA es el nivel de actividad de la enfermedad en ese momento, indicado por la presencia de
mayores niveles de reactantes de fase aguda de respuesta rápida como α1-antiquimiotripsina u
orosomucoide.

241
 Conclusiones

Aunque APOE4 es el alelo de menor frecuencia en la población europea, ésta podría estar

4 aumentada en los pacientes con RA y favorecer una desestabilización de la estructura proteica de

apoE (en respuesta al estrés químico o termal) y la citrulinización y generación de
autoanticuerpos frente a esta apolipoproteína, lo que podría relacionarse con mayores respuestas
inflamatorias, amiloidosis, osteoporosis o complicaciones cardiovasculares.

Utilizando una colección combinatoria de hexapéptidos (ProteoMiner™) hemos conseguido

5
reducir el rango dinámico de concentración proteica en las muestras de suero y confirmar la
reducción de ATIII en suero de pacientes con RA. Sin embargo, se han detectado aumentos
inesperados de apoA-I o apoA-IV en pacientes RA, posiblemente porque los hexapéptidos de las librerías
tienen una interacción preferencial con este tipo de proteínas séricas. De este modo, esta tecnología
podría introducir artefactos en los estudios proteómicos cuantitativos.

242
BIBLIOGRAFÍA
 Bibliografia

- Abraham R, Moskvina V, Sims R, Hollingworth P, Morgan A, Georgieva L, Dowzell K, Cichon S, Hillmer AM,
O'Donovan MC, Williams J, Owen MJ, Kirov G, A genome-wide association study for late-onset Alzheimer's
disease using DNA pooling, BMC Med. Genomics. (2008) 1:44. doi: 10.1186/1755-8794-1-44.
- Agrawal A, Singh PP, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A, Pattern recognition by pentraxins, Adv. Exp.
Med. Biol. 653 (2009) 98-116.
- Aho K, Heliövaara M, Does the characterization of risk factors improve our understanding on the etiology
of rheumatoid arthritis? Duodecim. 120 (2004) 265-267.
- Akerström B, Maghzal GJ, Winterbourn CC, Kettle AJ, The lipocalin alpha1-microglobulin has radical
scavenging activity, J. Biol. Chem. 282 (2007) 31493-31503.
- Alcalde E, Cantero Blanco S, Sánchez García FJ, Gómez Castillo JJ, Nuevas expectativas en el tratamiento de
la artritis reumatoide, Farm. Hosp. 27 (2003) 360-370.
- Aletaha D, Neogi T, Silman AJ, Funovits J, Felson DT, Bingham CO, Birnbaum NS, Burmester GR, Bykerk V,
Cohen MD, Combe B, Costenbader KH, Dougados M, Emery P, Ferraccioli G, Hazes JMW, Hobbs K, Huizinga
TWJ, Kavanaugh A, Kay J, Kvien TK, Laing T, Mease P, Menard HA, Moreland LW, Naden RL, Pincus T,
Smolen JS, Stanislawska-Biernat E, Symmons D, Tak PP, Upchurch KS, Vencovsky J, Wolfe F, Hawker G,
2010 Rheumatoid Arthritis Classification Criteria, Arthritis Rheum. 62 (2010) 2569–2581.
- Allhorn M, Klapyta A, Akerström B, Redox properties of the lipocalin alpha1-microglobulin: reduction of
cytochrome c, hemoglobin, and free iron, Free Radic. Biol. Med. 38 (2005) 557-567.
- Allhorn M, Lundqvist K, Schmidtchen A, Akerström B, Heme-scavenging role of alpha1-microglobulin in
chronic ulcers, J. Invest. Dermatol. 121 (2003) 640-646.
- Alvarez-Blasco F, Martínez-García MA, Luque-Ramírez M, Parraza N, San Millán JL, Escobar-Morreale HF,
Role of haptoglobin in polycystic ovary syndrome (PCOS), obesity and disorders of glucose tolerance in
premenopausal women, PLoS One 4 (2009):e5606. doi: 10.1371/[Link].0005606.
- Amento EP, Ehsani N, Palmer H, Libby P, Cytokines and growth factors positively and negatively regulate
interstitial collagen gene expression in human vascular smooth muscle cells, Arterioscler. Thromb. 11
(1991) 1223-1230.
- Amett CF, Arthritis reumatoide, Tratado de medicina interna 20 ed. México: Nueva Editorial
Iberoamericana 3 (2000) 1685-1693.
- Andersen JD, Boylan KL, Jemmerson R, Geller MA, Misemer B, Harrington KM, Weivoda S, Witthuhn BA,
Argenta P, Vogel RI, Skubitz AP, Leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1 is upregulated in sera and tumors of
ovarian cancer patients, J. Ovarian Res. 3 (2010) 2-14.
- Andersen JD, Boylan KL, Jemmerson R, Geller MA, Misemer B, Harrington KM, Weivoda S, Witthuhn BA,
Argenta P, Vogel RI, Skubitz AP, Leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1 is upregulated in sera and tumors of
ovarian cancer patients, J. Ovarian. Res. (2010) 3:21 doi: 10.1186/1757-2215-3-21.
- Anderson NL, Anderson NG, High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5421-5425.

243
 Bibliografia

- Anderson NL, Anderson NG, Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words,
Electrophoresis 19 (1998) 1853–1861.
- Anderson NL, Anderson NG, The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects,
Mol. Cell Proteomics 1 (2002) 845-867.
- Angles-Cano E, Structural basis for the pathophysiology of lipoprotein(a) in the athero-thrombotic process,
Braz J. Med. Biol. Res. 30 (1997)1271-1280.
- Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, Maggi L, Liotta F, Phenotypic and functional features of human Th17
cells, J. Exp. Med. 204 (2007) 1849–56.
- Arhett FC, Edworty SM, Bloch DA, The American Rheumatic Association 1987 revised criteria for the
classification of Rheumatoid Arthritis, Arthritis Rheum. 31 (1998) 315-324.
- Ariza MJ, Sánchez-Chaparro MA, Barón FJ, Hornos AM, Calvo-Bonacho E, Rioja J, Valdivielso P, Gelpi JA,
González-Santos P, Additive effects of LPL, APOA5 and APOE variant combinations on triglyceride levels
and hypertriglyceridemia: results of the ICARIA genetic sub-study, BMC Med. Genet. (2010) 11:66. doi:
10.1186/1471-2350-11-66.
- Arredouani MS, Kasran A, Vanoirbeek JA, Berger FG, Baumann H, Ceuppens JL, Haptoglobin dampens
endotoxin-induced inflammatory effects both in vitro and in vivo, Immunology 114 (2005) 263-271.
- Arteaga González MA, Díaz González F, Mecanismos efectores de daño tisular en artritis reumatoide, Ed.
Sociedad Española de Reumatología (2003) 117-118.
- Asleh R, Blum S, Kalet-Litman S, Alshiek J, Miller-Lotan R, Asaf R, Rock W, Aviram M, Milman U, Shapira C,
Abassi Z, Levy AP, Correction of HDL dysfunction in individuals with diabetes and the haptoglobin 2-2
genotype, Diabetes 57 (2008) 2794-800.
- Asleh R, Miller-Lotan R, Aviram M, Hayek T, Yulish M, Levy JE, Miller B, Blum S, Milman U, Shapira C, Levy
AP, Haptoglobin genotype is a regulator of reverse cholesterol transport in diabetes in vitro and in vivo,
Circ. Res. 99 (2006) 1419-1425.
- Asquith DL, Miller AM, Hueber AJ, Liew FY, Sattar N, McInnes IB, Apolipoprotein E-deficient mice are
resistant to the development of collagen-induced arthritis, Arthritis Rheum. 62 (2010) 472-477.
- Assoian RK, Fleurdelys BE, Stevenson HC, Miller PJ, Madtes DK, Raines EW, Ross R, Sporn MB, Expression
and secretion of type beta transforming growth factor by activated human macrophages, Proc. Natl. Acad.
Sci. 84 (1987) 6020-6024.
- Aviña-Zubieta JA, Choi HK, Sadatsafavi M, Etminan M, Esdaile JM, Lacaille, D. Risk of cardiovascular
mortality in patients with rheumatoid arthritis: a meta-analysis of observational studies. Arthritis Care and
Research 59 (2008) 1690-1697.
- Avouac J, Gossec L, Dougados M, Diagnostic and predictive value of anticyclic citrullinated protein
antibodies in rheumatoid arthritis: a systematic literature review, Ann. Rheum. Dis. 65 (2006) 845-851.
- Badui E, El corazón y la artritis reumatoide, Arch. Del. Int. 69 (1999) 159-167.

244
 Bibliografia

- Baillet A, Trocmé C, Berthier S, Arlotto M, Grange L, Chenau J, Quétant S, Sève M, Berger F, Juvin R, Morel
F, Gaudin P, Synovial fluid proteomic fingerprint: S100A8, S100A9 and S100A12 proteins discriminate
rheumatoid arthritis from other inflammatory joint diseases, Rheumatology 49 (2010) 671-682.
- Bandhakavi S, Stone MD, Onsongo G, Van Riper SK, Griffin TJ, A dynamic range compression and three-
dimensional peptide fractionation analysis platform expands proteome coverage and the diagnostic
potential of whole saliva, J. Proteome Res. 8 (2009) 5590-5600.
- Bandow JE, Comparison of protein enrichment strategies for proteome analysis of plasma, Proteomics 10
(2010) 1416-1425.
- Banfi C, Parolari A, Brioschi M, Barcella S, Loardi C, Centenaro C, Alamanni F, Mussoni L, Tremoli E,
Proteomic analysis of plasma from patients undergoing coronary artery bypass grafting reveals a
protease/antiprotease imbalance in favor of the serpin alpha1-antichymotrypsin, J. Proteome Res. 9
(2010) 2347-2357.
- Bartok B, Firestein GS, Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis, Immunol.
Rev. 233 (2010) 233-255.
- Baskies AM, Chretien PB, Weiss JF, Makuch RW, Beveridge RA, Catalona WJ, Spiegel HE, Serum
glycoproteins in cancer patients: first report of correlations with in vitro and in vivo parameters of cellular
immunity, Cancer 45 (1980) 3050-3060.
- Baskol G, Demir H, Baskol M, Kilic E, Ates F, Kocer D, Muhtaroglu S, Assessment of paraoxonase 1 activity
and malondialdehyde levels in patients with rheumatoid arthritis, Clin. Biochem. 38 (2005) 951-955.
- Bauer J, Carrier Free Electrophoresis, Electrophoresis 19 (1998)1057-1233.
- Baumann I, Kolowos W, Voll RE, et al. Impaired uptake of apoptotic cells into tingible body macrophages in
germinal centers of patients with systemic lupus erythematosus, Arthritis Rheum. 46 (2002) 191-201.
- Bayley JP, Bakker AM, Kaijzel EL, Huizinga TW, Verweij CL, Association of polymorphisms of the tumour
necrosis factor receptors I and II and rheumatoid arthritis, Rheumatology, 42 (2003) 969-971.
- Beard CM, Kokman E, Kurland LT, Rheumatoid arthritis and susceptibility to Alzheimer's disease, Lancet
337 (1991) 1426.
- Bedar M, Alternative medicine: glucosamine, Can. Pharm. J. 133 (2000) 22-23.
- Bedran Z, Quiroz C, Rosa J, Catoggio LJ, Soriano ER, Validation of a prediction rule for the diagnosis of
rheumatoid arthritis in patients with recent onset undifferentiated arthritis, Int. J. Rheumatol. (2013)
2013:548502. doi: 10.1155/2013/548502.
- Bélanger L, Roy S, Allard D, New albumin gene 3' adjacent to the alpha 1-fetoprotein locus, J. Biol. Chem.
269 (1994) 5481-5484.
- Bellei E, Bergamini S, Monari E, Fantoni LI, Cuoghi A, Ozben T, Tomasi A, High-abundance proteins
depletion for serum proteomic analysis: concomitant removal of non-targeted proteins, Amino Acids 40
(2011) 145-156.
- Bellei E, Monari E, Bergamini S, Ozben T, Tomasi A, Optimizing protein recovery yield from serum samples
treated with beads technology, Electrophoresis 32 (2011) 1414-1421.

245
 Bibliografia

- Berggård T, Oury TD, Thogersen IB, Akerström B, Enghild JJ, Alpha1-microglobulin is found both in blood
and in most tissues, J. Histochem. Cytochem. 46 (1998) 887-894.
- Berggård T, Thelin N, Falkenberg C, Enghild JJ, Akerström B, Prothrombin, albumin and immunoglobulin A
form covalent complexes with alpha1-microglobulin in human plasma, Eur. J. Biochem. 245 (1997) 676-
683.
- Berggren K, Chernokalskaya E, Steinberg TH, Kemper C, Lopez MF, Diwu Z, Haugland RP, Patton WF,
Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex, Electrophoresis 21 (2000) 2509-2521.
- Berglin E, Dahlqvist S, Comparison of the 1987 ACR and 2010 ACR/EULAR classification criteria for
rheumatoid arthritis in clinical practice: a prospective cohort study, Scand J. Rheumatol. (2013).
- Beseme O, Fertin M, Drobecq H, Amouyel P, Pinet F, Combinatorial peptide ligand library plasma
treatment: Advantages for accessing low-abundance proteins, Electrophoresis 31 (2010) 2697-2704.
- Bijl M, Bootsma H, Van Der Geld Y, Limburg PC, Kallenberg CG, Van Rijswijk MH, Serum amyloid P
component levels are not decreased in patients with systemic lupus erythematosus and do not rise during
an acute phase reaction, Ann. Rheum. Dis. 63 (2004) 831-835.
- Biron DG, Brun C, Lefevre T, Lebarbenchon C, Loxdale HD, Chevenet F, Brizard JP, Thomas F, The pitfalls of
proteomics experiments without the correct use of bioinformatics tools, Proteomics 6 (2006) 5577-5596.
- Bischoff R, Luider TM, Methodological advances in the discovery of protein and peptide disease markers, J.
Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 803 (2004) 27-40.
- Biswas S, Sharma S, Saroha A, Bhakuni DS, Malhotra R, Zahur M, Oellerich M, Das HR, Asif AR,
Identification of novel autoantigen in the synovial fluid of rheumatoid arthritis patients using an
immunoproteomics approach, PLoS One. 8 (2013):e56246. doi: 10.1371/[Link].0056246.
- Blumberg SN, Fox DA, Rheumatoid arthritis: guidelines for emerging therapies, Am. J. Manag. Care. 7
(2001) 617-626.
- Bodolay E, Koch AE, Kim J, Szegedi G, Szekanecz Z, Angiogenesis and chemokines in rheumatoid arthritis
and other systemic inflammatory rheumatic diseases, J. Cell Mol. Med. 6 (2002) 357-376.
- Boers M, Understanding the window of opportunity concept in early rheumatoid arthritis, Arthritis
Rheum. 48 (2003) 1771-1774.
- Bohrmann B, Tjernberg L, Kuner P, Poli S, Levet-Trafit B, Näslund J, Richards G, Huber W, Döbeli H,
Nordstedt C, Endogenous proteins controlling amyloid beta-peptide polymerization. Possible implications
for beta-amyloid formation in the central nervous system and in peripheral tissues, J. Biol. Chem. 274
(1999) 15990-15995.
- Bondarenko PV, Chelius D, Shaler TA: Identification and relative quantitation of protein mixtures by
enzymatic digestion followed by capillary reversedphase liquid chromatography-tandem mass
spectrometry, Anal. Chem. 74 (2002) 4741-4749.
- Boonen A, Severens JL, The burden of illness of rheumatoid arthritis, Clin. Rheumatol. 30 (2011) 3 -8.

246
 Bibliografia

- Boschetti E, Chung MC, Righetti PG, "The quest for biomarkers": are we on the right technical track?
Proteomics Clin. Appl. 6 (2012) 22-41
- Boschetti E, Lomas L, Citterio A, Righetti PG, Romancing the "hidden proteome", Anno Domini two zero
zero seven, J. Chromatogr A. 1153 (2007) 277-90.
- Boschetti E, Righetti PG, The ProteoMiner in the proteomic arena: a non-depleting tool for discovering
low-abundance species, [Link] 71 (2008) 255-264.
- Bottazzi B, Doni A, Garlanda C, Mantovani A, An integrated view of humoral innate immunity: pentraxins
as a paradigm, Annu Rev. Immunol. 28 (2010) 157-183.
- Boura E, Rózycki B, Herrick DZ, Chung HS, Vecer J, Eaton WA, Cafiso DS, Hummer G, Hurley JH, Solution
structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy, Proc. Natl.
Acad. Sci. 108 (2011) 9437-9442.
- Brief report: citrullination within the atherosclerotic plaque: a potential target for the anti-citrullinated
protein antibody response in rheumatoid arthritis.
- Bucala R, Fibrocytes in rheumatoid pannus: seed and soil? Arthritis Rheum. 64 (2012) 3491-3493.
- Bullido MJ, Artiga MJ, Recuero M, Sastre I, García MA, Aldudo J, Lendon C, Han SW, Morris JC, Frank A,
Vázquez J, Goate A, Valdivieso F, A polymorphism in the regulatory region of APOE associated with risk for
Alzheimer's dementia, Nat. Genet. 18 (1998) 69-71.
- Cabana VG, Feng N, Reardon CA, Lukens J, Webb NR, de Beer FC, Getz GS, Influence of apoA-I and apoE on
the formation of serum amyloid A-containing lipoproteins in vivo and in vitro, J. Lipid Res. 45 (2004) 317-
325.
- Cabana VG, Reardon CA, Feng N, Neath S, Lukens J, Getz GS, Serum paraoxonase: effect of the
apolipoprotein composition of HDL and the acute phase response, J. Lipid Res. 44 (2003) 780-92.
- Cabassi A, Tedeschi S, Zinc-α2-glycoprotein as a marker of fat catabolism in humans, Curr. Opin. Clin. Nutr.
Metab. Care. 16 (2013) 267-271.
- Camafeita E, Lamas JR, Calvo E, López JA, Fernández-Gutiérrez B, Proteomics: new insights into rheumatic
diseases, Proteomics Clin. Appl. 3 (2009) 226-241.
- Cañas B, López-Ferrer D, Ramos-Fernández A, Camafeita E, Calvo E, Mass spectrometry technologies for
proteomics, Brief Funct. Genomic Proteomic 4 (2006) 295-320.
- Candiano G, Bruschi M, Musante L, Santucci L, Ghiggeri GM, Carnemolla B, Orecchia P, Zardi L, Righetti PG,
Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis, Electrophoresis 25
(2004) 1327-1333.
- Candiano G, Dimuccio V, Bruschi M, Santucci L, Gusmano R, Boschetti E, Righetti PG, Ghiggeri GM,
Combinatorial peptide ligand libraries for urine proteome analysis: investigation of different elution
systems, Electrophoresis 30 (2009) 2405-2411.
- Cañete JD, Biopathology of the synovial membrane in psoriatic arthritis, Reumatol. Clin. 8 (2012) 10-14.
- Carbonell J, Cobo T, Balsa A, Descalzo MA, et al. The incidence of rheumatoid arthritis in Spain: Results
from a nationwide primary care registry, Rheumatology 47 (2008) 1088-1092.

247
 Bibliografia

- Cardona F, Tinahones FJ, Collantes E, Escudero A, García-Fuentes E, Soriguer FJ, The elevated prevalence
of apolipoprotein E2 in patients with gout is associated with reduced renal excretion of urates,
Rheumatology 42 (2003) 468-472.
- Carmona L, Ballina J, Gabriel R, Laffon A, The burden of musculoskeletal disease in the general population
of Spain: results from a national survey, Ann. Rheum. Dis. 60 (2001) 1040-1045.
- Carmona L, Villaverde V, Hernandez-García C, Ballina J, Gabriel R, Laffon A, The prevalence of Rheumatoid
arthritis in the general population os Spain, Rheumatology 41 (2002) 793-800.
- Carracedo A, Concheiro L, Rodriguez-Calvo MS, Montiel MD, Plasma protein and red cell enzyme groups in
Galicia (north west Spain), Z. Rechtsmed 98 (1987) 133-140.
- Carroll MC, The complement system in regulation of adaptive immunity, Nat. Immunol. 5 (2004) 981-986.
- Carter DC, Ho JX, Structure of serum albumin, Adv. Protein Chem. 45 (1994) 153-203.
- Carter K, Worwood M, Haptoglobin: a review of the major allele frequencies worldwide and their
association with diseases, Int. J. Lab. Hematol. 29 (2007) 92-110.
- Cascão R, Rosário HS, Souto-Carneiro MM, Fonseca JE, Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than
simple final effectors, Autoimmun Rev. 9 (2010) 531-535.
- Catrina AI, Ulfgren AK, Lindblad S, Grondal L, Klareskog L, Low levels of apoptosis and high FLIP expression
in early rheumatoid arthritis synovium, Ann. Rheum. Dis. 61 (2002) 934-936.
- Cavagna L, Boffini N, Cagnotto G, Inverardi F, Grosso V, Caporali R, Atherosclerosis and rheumatoid
arthritis: more than a simple association, Mediators Inflamm. (2012) 2012:147354.
- Cervantes S, Samaranch L, Vidal-Taboada JM, Lamet I, Bullido MJ, Frank-García A, Coria F, Lleó A, Clarimón
J, Lorenzo E, Alonso E, Sánchez-Juan P, Rodríguez-Rodríguez E, Combarros O, Rosich M, Vilella E, Pastor P,
Genetic variation in APOE cluster region and Alzheimer's disease risk, Neurobiol. Aging. 32 (2011):2107.e7-
17. doi: 10.1016/[Link].2011.05.023.
- Challapalli KK, Zabel C, Schuchhardt J, Kaindl AM, Klose J, Herzel H, High reproducibility of large-gel two-
dimensional electrophoresis, Electrophoresis 25 (2004) 3040-3047.
- Chamrad DC, Korting G, Stuhler K, Meyer HE, Klose J, Bluggel M: Evaluation of algorithms for protein
identification from sequence databases using mass spectrometry data, Proteomics 4 (2004) 619-628.
- Chang DJ, Paget SA, Neurologic complications of rheumatoid arthritis, Rheum. Dis. Clin. 19 (1993) 955-973.
- Chang X, Zhao Y, Wang Y, Chen Y, Yan X, Screening citrullinated proteins in synovial tissues of rheumatoid
arthritis using 2-dimensional western blotting, J. Rheumatol. 40 (2013) 219-227.
- Chapelle JP, Albert A, Smeets JP, Heusghem C, Kulbertus HE, Effect of the haptoglobin phenotype on the
size of a myocardial infarct, N. Engl. J. Med. 307 (1982) 457-463.
- Chard MD, Calvin J, Price CP, Cawston TE, Hazleman BL, Serum alpha 1 antichymotrypsin concentration as
a marker of disease activity in rheumatoid arthritis, Ann. Rheum. Dis. 47 (1988) 665-671.
- Chavele KM, Ehrenstein MR, Regulatory T-cells in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis,
FEBS Lett. 585 (2011) 3603-3610.

248
 Bibliografia

- Chen YY, Lin SY, Yeh YY, Hsiao HH, Wu CY, Chen ST, Wang AH, A modified protein precipitation procedure
for efficient removal of albumin from serum, Electrophoresis 26 (2005) 2117-27.
- Chou RC, Kim ND, Sadik CD, Seung E, Lan Y, Byrne MH, Haribabu B, Iwakura Y, Luster AD, Lipid-cytokine-
chemokine cascade drives neutrophil recruitment in a murine model of inflammatory arthritis, Immunity
33 (2010) 266-278.
- Christofferson DE, Yuan J, Necroptosis as an alternative form of programmed cell death, Curr. Opin. Cell
Biol. 22 (2010) 263-268.
- Chu K, Zheng H, Li H, Zhang Y, Zhang X, Xu W, Chen L, Shuangtengbitong tincture treatment of collagen-
induced arthritis via downregulation of the expression of IL-6, IL-8, TNF-α and NF-κB, Exp. Ther. Med. 5
(2013) 423-428.
- Cid MC, Grant DS, Hoffman GS, Auerbach R, Fauci AS, Kleinman HK, Identification of haptoglobin as an
angiogenic factor in sera from patients with systemic vasculitis, J. Clin. Invest. 91 (1993) 977-985.
- Clauser KR, Baker P, Burlingame AL: Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein
identification strategies employing MS or MS/MS and database searching, Anal. Chem. 71 (1999) 2871-
2882.
- Codina R, Vanasse A, Kelekar A, Vezys V, Jemmerson R, Cytochrome c-induced lymphocyte death from the
outside in: inhibition by serum leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1, Apoptosis. 15 (2010) 139-152.
- Coenen D, Verschueren P, Westhovens R, Bossuyt X, Technical and diagnostic performance of 6 assays for
the measurement of citrullinated protein/peptide antibodies in the diagnosis of rheumatoid arthritis, Clin.
Chem. 53 (2007) 498-504.
- Cohen AS, Chasen W, Serum haptoglobin types in rheumatoid spondylitis, Proc Soc Exp. Biol. Med. 114
(1963) 698-700.
- Colby T, Pulmonary pathology in patients with system autoimmune diseases, Clin. Chest. Med. 19 (1998)
587-612.
- Colinge J, Masselot A, Giron M, Dessingy T, Magnin J: OLAV: towards highthroughput tandem mass
spectrometry data identification, Proteomics 3 (2003) 1454-1463.
- Connolly M, Veale DJ, Fearon U, Acute serum amyloid A regulates cytoskeletal rearrangement, cell matrix
interactions and promotes cell migration in rheumatoid arthritis, Ann Rheum. Dis. 70 (2011) 1296-1303.
- Constans J, Cleve H, Dykes D, Fischer M, Kirk RL, Papiha SS, Scheffran W, Scherz R, Thymann M, Weber W,
The polymorphism of the vitamin D-binding protein (Gc); isoelectric focusing in 3 M urea as additional
method for identification of genetic variants, Hum. Genet. 65 (1983) 176-180.
- Corella D, Guillén M, Portolés O, Sabater A, Cortina S, Folch J, Sáiz C, Apolipoprotein E gene polymorphism
and risk of hypercholesterolemia: a case control study in a working population of Valencia, Med. Clin. 115
(2000) 170-175.
- Corthals GL, Exploitation of specific properties of trifluoroethanol for extraction and separation of
membrane proteins, Proteomics forum (2003).

249
 Bibliografia

- Costa-Mallen P, Checkoway H, Zabeti A, Edenfield MJ, Swanson PD, Longstreth WT Jr, Franklin GM, Smith-
Weller T, Sadrzadeh SM, The functional polymorphism of the hemoglobin-binding protein haptoglobin
influences susceptibility to idiopathic Parkinson's disease, Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet.
147 (2008) 216-222.
- Costes asociados a la Artritis Reumatoide. ReES Sept-Oct (2003)
- Craig R, Beavis RC: TANDEM: matching proteins with tandem mass spectra, Bioinformatics 20 (2004) 1466-
1467.
- Crean S, Ward A, Mercaldi CJ, Collins JM, Cook MN, Baker NL, Arrighi HM, Apolipoprotein E ε4 prevalence
in Alzheimer's disease patients varies across global populations: a systematic literature review and meta-
analysis, Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 31 (2011) 20-30.
- Crehan H, Holton P, Wray S, Pocock J, Guerreiro R, Hardy J, Complement receptor 1 (CR1) and Alzheimer's
disease, Immunobiology. 217 (2012) 244-250.
- Crook MA, Ch'ng SI, Lumb P, Serum apolipoprotein H and its relationship to lipids and other
apolipoproteins in normal human men and women, Blood Coagul. Fibrinolysis 10 (1999) 197-200.
- Crowson CS, Rahman MU, Matteson EL, Which measure of inflammation to use? A comparison of
erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein measurements from randomized clinical trials of
golimumab in rheumatoid arthritis, J. Rheumatol. 36 (2009) 1606-1610.
- Crowther DC, Belorgey D, Miranda E, Kinghorn KJ, Sharp LK, Lomas DA, Practical genetics: alpha-1-
antitrypsin deficiency and the serpinopathies, Eur. J. Hum. Genet. 12 (2004) 167-172.
- Cubedo J, Padró T, Badimon L, Coordinated proteomic signature changes in immune response and
complement proteins in acute myocardial infarction: The implication of serum amyloid P-component, Int.
J. Cardiol. 168 (2013):5196-204. doi: 10.1016/[Link].2013.07.181.
- Cummings C, Walder J, Treeful A, Jemmerson R, Serum leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1 binds
cytochrome c and inhibits antibody detection of this apoptotic marker in enzyme-linked immunosorbent
assay, Apoptosis 11 (2006) 1121-1129.
- Cunha TM, Barsante MM, Guerrero AT, Verri WA Jr, Ferreira SH, Coelho FM, Bertini R, Di Giacinto C,
Allegretti M, Cunha FQ, Teixeira MM, Treatment with DF 2162, a non-competitive allosteric inhibitor of
CXCR1/2, diminishes neutrophil influx and inflammatory hypernociception in mice, Br. J. Pharmacol. 154
(2008) 460-470.
- Dahlqvist SR, Fröhlander N, Haptoglobin groups and rheumatoid arthritis, Hum. Hered. 35 (1985) 207-211.
- Daiger SP, Miller M, Chakraborty R, Heritability of quantitative variation at the group-specific component
(Gc) locus, Am. J. Hum. Genet. 36 (1984) 663-676.
- D'Ambrosio C, Arena S, Scaloni A, Guerrier L, Boschetti E, Mendieta ME, Citterio A, Righetti PG, Exploring
the chicken egg white proteome with combinatorial peptide ligand libraries, J. Proteome Res. 7 (2008)
3461-3474.
- Danielsson C, Pascual M, French L, Steiger G, Schifferli JA, Soluble complement receptor type 1 (CD35) is
released from leukocytes by surface cleavage, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 2725-2731.

250
 Bibliografia

- De Almeida DE, Ling S, Holoshitz J, New insights into the functional role of the rheumatoid arthritis shared
epitope, FEBS Lett. 585 (2011) 3619-3626.
- De Bock M, de Seny D, Meuwis MA, Servais AC, Minh TQ, Closset J, Chapelle JP, Louis E, Malaise M,
Merville MP, Fillet M, Comparison of three methods for fractionation and enrichment of low molecular
weight proteins for SELDI-TOF-MS differential analysis, Talanta 82 (2010) 245-254.
- De Clerck LS, B lymphocytes and humoral immune response in rheumatoid arthritis, Clin. Rheumatol. 14
(1995) 14-18.
- De Kleijn DP, Smeets MB, Kemmeren PP, Lim SK, Van Middelaar BJ, Velema E, Schoneveld A, Pasterkamp
G, Borst C, Acute-phase protein haptoglobin is a cell migration factor involved in arterial restructuring,
FASEB J. 16 (2002) 1123-1125.
- De Seny D, Fillet M, Meuwis MA, Geurts P, Lutteri L, Ribbens C, Bours V, Wehenkel L, Piette J, Malaise M,
Merville MP, Discovery of new rheumatoid arthritis biomarkers using the surface-enhanced laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry ProteinChip approach, Arthritis Rheum. 52 (2005)
3801-3812.
- De Seny D, Fillet M, Ribbens C, Marée R, Meuwis MA, Lutteri L, Chapelle JP, Wehenkel L, Louis E, Merville
MP, Malaise M, Monomeric calgranulins measured by SELDI-TOF mass spectrometry and calprotectin
measured by ELISA as biomarkers in arthritis, Clin. Chem. 54 (2008) 1066-1075.
- Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A, Pentraxins in innate immunity: lessons from PTX3,
Cell. Tissue Res. 343 (2011) 237-249.
- Debaugnies F, Servais G, Badot V, Noubouossie D, Willems D, Corazza F, Anti-cyclic citrullinated peptide
antibodies: a comparison of different assays for the diagnosis of rheumatoid arthritis, Scand J. Rheumatol.
42 (2013) 108-114.
- Delanghe JR, Langlois MR, Hemopexin: a review of biological aspects and the role in laboratory medicine,
Clin. Chim. Acta. 312 (2001) 13-23.
- Deodhar SD, C-reactive protein: the best laboratory indicator available for monitoring disease activity.
Clin. J. Med. 56 (1989) 126-130.
- Deschamps E, Miña A, Ciegues M, isoformas de la transferrina: utilidad cínica de su determinación, Rev.
Digan Biol. 52 (2003) 22-25.
- Desiderio C, Rossetti DV, Iavarone F, Messana I, Castagnola M, Capillary electrophoresis--mass
spectrometry: recent trends in clinical proteomics, J. Pharm. Biomed. Anal. 53 (2010) 1161-1169.
- DeSouza LV, Siu KW, Mass spectrometry-based quantification, Clin. Biochem. 46 (2013) 421-431
- Devauchelle V, Essabbani A, De Pinieux G, Germain S, Tourneur L, Mistou S, Margottin-Goguet F, Anract P,
Migaud H, Le Nen D, Lequerré T, Saraux A, Dougados M, Breban M, Fournier C, Chiocchia G,
Characterization and functional consequences of underexpression of clusterin in rheumatoid arthritis, J.
Immunol. 177 (2006) 6471-6479.
- Devauchelle V, Marion S, Cagnard N, Mistou S, Falgarone G, Breban M, Letourneur F, Pitaval A, Alibert O,
Lucchesi C, Anract P, Hamadouche M, Ayral X, Dougados M, Gidrol X, Fournier C, Chiocchia G, DNA

251
 Bibliografia

microarray allows molecular profiling of rheumatoid arthritis and identification of pathophysiological

targets, Genes Immun. 5 (2004) 597-608.
- Di Bona D, Montalto G, Clemenza L, Bascone F, Accardo P, Bellavia D, Craxì A, Brai M, Soluble complement
receptor type 1 (sCR1) in chronic liver diseases: serum levels at different stages of liver diseases, Clin. Exp.
Immunol. 114 (1998) 102-105.
- Di Girolamo F, Bala K, Chung MC, Righetti PG, "Proteomineering" serum biomarkers. A study in scarlet,
Electrophoresis 32 (2011) 976-980.
- Dieplinger H, Ankerst DP, Burges A, Lenhard M, Lingenhel A, Fineder L, Buchner H, Stieber P, Afamin and
apolipoprotein A-IV: novel protein markers for ovarian cancer, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18
(2009) 1127-1133.
- Doherty NS, Littman BH, Reilly K, Swindell AC, Buss JM, Anderson NL, Analysis of changes in acute-phase
plasma proteins in an acute inflammatory response and in rheumatoid arthritis using two-dimensional
electrophoresis, Electrophoresis 19 (1998) 355-363.
- Dolnik V, Hutterer KM, Capillary electrophoresis of proteins 1999-2001, Electrophoresis 22 (2001) 4163-
4178.
- Dorner T, Egerer K, Feist E, Burmester GR, Rheumatoid factor revisited, Curr. Opin. Rheumatol. 16 (2004)
246-253.
- Dowsey AW, English JA, Lisacek F, Morris JS, Yang GZ, Dunn MJ, Image analysis tools and emerging
algorithms for expression proteomics, Proteomics. 10 (2010) 4226-4257.
- Drynda S, Ringel B, Kekow M, Kühne C, Drynda A, Glocker MO, Thiesen HJ, Kekow J, Proteome analysis
reveals disease-associated marker proteins to differentiate RA patients from other inflammatory joint
diseases with the potential to monitor anti-TNFalpha therapy, Pathol. Res. Pract. 200 (2004) 165-171.
- Du Clos TW, C-reactive protein reacts with the U1 small nuclear ribonucleoprotein, J. Immunol. 143 (1989)
2553-2559.
- Dunai Z, Bauer PI, Mihalik R, Necroptosis: biochemical, physiological and pathological aspects, Pathol.
Oncol. Res. 17 (2011) 791-800.
- Duncan MW, Hunsucker SW, Comments on standards in proteomics and the concept of fitness-for-
purpose, Proteomics 6 (2006) 45-47.
- Dwivedi RC, Dhindsa N, Krokhin OV, Cortens J, Wilkins JA, El-Gabalawy HS, The effects of infliximab
therapy on the serum proteome of rheumatoid arthritis patients, Arthritis Res. Ther. 11 (2009):R32. doi:
10.1186/ar2637.
- Dwivedi RC, Krokhin OV, Cortens JP, Wilkins JA, Assessment of the reproducibility of random hexapeptide
peptide library-based protein normalization, J. Proteome Res. 9 (2010) 1144-1149.
- Edwards JC, Cambridge G, B-cell targeting in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases, Nat.
Rev. Immunol. 6 (2006) 394-403.
- Eggleton P, Haigh R, Winyard PG, Consequence of neo-antigenicity of the 'altered self', Rheumatology 47
(2008) 567-571.

252
 Bibliografia

- Eidhammer I, Barsnes H, Egil-Eide G, Martens L, Computational and statistical methods for protein
quantification by mass spectrometry, John Wiley & Sons, Ltd, United Kingdom (2013). ISBN 978-1-119-
96400-1.
- Eng J, McCormack A, Yates JR: An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino
acid sequences in a protein database, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5 (1994) 976-989.
- Engel P, Nojima Y, Rothstein D, Zhou LJ, Wilson GL, Kehrl JH, Tedder TF, The same epitope on CD22 of B
lymphocytes mediates the adhesion of erythrocytes, T and B lymphocytes, neutrophils, and monocytes, J.
Immunol. 150 (1993) 4719-4732.
- Ernoult E, Bourreau A, Gamelin E, Guette C, A proteomic approach for plasma biomarker discovery with
iTRAQ labelling and OFFGEL fractionation, J. Biomed Biotechnol (2010):2010:927917. doi:
10.1155/2010/927917.
- Escalante A, del Rincón I, How much disability in rheumatoid arthritis is explained by rheumatoid arthritis,
Arthritis Rheum. 42 (1999) 1712-1721.
- Esensten JH, Wofsy D, Bluestone JA, Regulatory T cells as therapeutic targets in rheumatoid arthritis,
Nature Reviews Rheumatology 5 (2009) 560-565.
- Ettorre A, Rösli C, Silacci M, Brack S, McCombie G, Knochenmuss R, Elia G, Neri D, Recombinant antibodies
for the depletion of abundant proteins from human serum, Proteomics 6 (2006) 4496-4505.
- Everitt B, An R and SPLUS Companion to Multivariate Analysis, Springer. (2004).
- Eyles JL, Roberts AW, Metcalf D, Wicks IP, Granulocyte colony-stimulating factor and neutrophils forgotten
mediators of inflammatory disease, Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2 (2006) 500-510.
- Faca V, Pitteri S, Newcomb L, Glukhova V, Phanstiel D, Krasnoselsky A, Zhang Q, Struthers J, Wang H, Eng
J, Fitzgibbon M, McIntosh M, Hanash S, Contribution of protein fractionation to depth of analysis of the
serum and plasma proteomes, J. Proteome Res. 6 (2007) 3558-3565.
- Fakelman F, Felix K, Büchler MW, Werner J, New pre-analytical approach for the deep proteome analysis
of sera from pancreatitis and pancreas cancer patients, Arch. Physiol. Biochem. 116 (2010) 208-217.
- Falgarone G, Chiocchia G, Chapter 8: Clusterin: A multifacet protein at the crossroad of inflammation and
autoimmunity, Adv. Cancer Res. 104 (2009) 139-170.
- Falgarone G, Essabbani A, Dumont F, Cagnard N, Mistou S, Chiocchia G, Implication of clusterin in TNF-α
response of rheumatoid synovitis: lesson from in vitro knock-down of clusterin in human synovial
fibroblast cells, Physiol. Genomics 44 (2012) 229-235.
- Farrah T, Deutsch EW, Omenn GS, Campbell DS, Sun Z, Bletz JA, Mallick P, Katz JE, Malmström J, Ossola R,
Watts JD, Lin B, Zhang H, Moritz RL, Aebersold R, A high-confidence human plasma proteome reference
set with estimated concentrations in PeptideAtlas, Mol. Cell Proteomics 10 (2011):M110.006353. doi:
10.1074/mcp.M110.006353.
- Fattahi MJ, Mirshafiey A, Prostaglandins and rheumatoid arthritis, Arthritis (2012) 2012:239310. doi:
10.1155/2012/239310.

253
 Bibliografia

- Fedoseeva SV, Iusopova MM, Chukanova VP, Pospelov LE, Course of infiltrating pulmonary tuberculosis
depending on the patient's genotype, Probl. Tuberk. 2 (1993) 8-10.
- Feinberg BB, Jack RM, Mok SC, Anderson DJ, Low erythrocyte complement receptor type 1 (CR1, CD35)
expression in preeclamptic gestations, Am. J. Reprod. Immunol. 54 (2005) 352-357.
- Feldmann M, Maini RN, Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? Annu. Rev.
Immunol. 19 (2001) 163-196.
- Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM, Electrospray ionization for mass spectrometry of
large biomolecules, Science 246 (1989) 64-71.
- Fenyo D, Qin J, Chait BT: Protein identification using mass spectrometric information, Electrophoresis 19
(1998) 998-1005.
- Ferguson RE, Hochstrasser DF, Banks RE, Impact of preanalytical variables on the analysis of biological
fluids in proteomic studies, Proteomics Clin. Appl. 1 (2007) 739-746.
- Field HI, Fenyo D, Beavis RC: RADARS, a bioinformatics solution that automates proteome mass spectral
analysis, optimises protein identification, and archives data in a relational database, Proteomics 2 (2002)
36-47.
- Finnegan A, Ashaye S, Hamel KM, B effector cells in rheumatoid arthritis and experimental arthritis,
Autoimmunity 45 (2012) 353-363.
- Fiorini A, Koudriavtseva T, Bucaj E, Coccia R, Foppoli C, Giorgi A, Schininà ME, Di Domenico F, De Marco F,
Perluigi M, Involvement of oxidative stress in occurrence of relapses in multiple sclerosis: the spectrum of
oxidatively modified serum proteins detected by proteomics and redox proteomics analysis, PLoS One 8
(2013):e65184. doi: 10.1371/[Link].0065184.
- Firestein GS, Evolving concepts of rheumatoid arthritis, Nature 423 (2003) 356-361.
- Fountoulakis M, Juranville JF, Jiang L, Avila D, Röder D, Jakob P, Berndt P, Evers S, Langen H, Depletion of
the high-abundance plasma proteins, Amino Acids 27 (2004) 249-259.
- Fregonese L, Stolk J, Hereditary alpha-1-antitrypsin deficiency and its clinical consequences, Orphanet J.
Rare Dis. (2008)3:16. doi: 10.1186/1750-1172-3-16.
- Fröbel J, Hartwig S, Passlack W, Eckel J, Haas R, Czibere A, Lehr S, ProteoMiner™ and SELDI-TOF-MS: a
robust and highly reproducible combination for biomarker discovery from whole blood serum, Arch.
Physiol. Biochem. 116 (2010) 174-180.
- Fröhlander N, Stendahl U, Haptoglobin groups in ovarian carcinoma, Hum. Hered. 38 (1988) 180-182.
- Frostegård J, Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease, BMC Med. (2013); 11:117. doi:
10.1186/1741-7015-11-117.
- Fuentes-Arderiu X, What is a biomarker? It's time for a renewed definition, Clin. Chem. Lab. Med. 51
(2013) 1689-1690.
- Fujita T, Endo Y, Nonaka M, Primitive complement system--recognition and activation, Mol. Immunol. 4
(2004) 103-11.

254
 Bibliografia

- Furneri G, Mantovani LG, Belisari A, Mosca M, Cristiani M, Bellelli S, Cortesi PA, Turchetti G, Systematic
literature review on economic implications and pharmacoeconomic issues of rheumatoid arthritis, Clin.
Exp. Rheumatol. 30 (2012) 72-84.
- Gabay C, Kushner I, Acute-phase proteins and other systemic responses to inflammation, N. Engl. J. Med.
340 (1999) 448-54.
- Gabriel SE, Crowson CS, Kremers HM, Doram MF, Turesson C, O´Fallon WM et al, survival in Rheumatoid
arthritis: a population-based analysis of trends over 40 years, Arthritis Rheum. 48 (2003) 54-58.
- Gabriel SE, et al. Heart disease and rheumatoid arthritis: understanding the risks, Ann Rheum Dis. 69
(2010) 61-64.
- García de Vicuña R, A Ortiz García, Mediadores de inflamación. Monografía SER de Técnicas de
Investigación básica en Reumatología. Editorial Médica Panamericana, SA. (2006).
- Garcia-Rodriguez S, Arias-Santiago S, Perandrés-López R, Castellote L, Zumaquero E, Navarro P, Buendía-
Eisman A, Ruiz JC, Orgaz-Molina J, Sancho J, M Zubiaur, Increased gene expression of Toll-like receptor 4
on peripheral blood mononuclear cells in patients with psoriasis, J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 27
(2013) 242-250.
- García-Vadillo A, Castañeda S, Carrasco AL, Jimeno A, Costes económicos de la artritis reumatoide de corta
evolución, Rev. Esp. Reumatol. 28 (2001) 4-11.
- Garlanda C, Bottazzi B, Moalli F, Deban L, Molla F, Latini R, Mantovani A, Pentraxins and atherosclerosis:
the role of PTX3, Curr. Pharm. Des. 17 (2011) 38-46.
- Gasparyan AY, Stavropoulos-Kalinoglou A, Mikhailidis DP, Douglas KM, Kitas GD, Platelet function in
rheumatoid arthritis: arthritic and cardiovascular implications, Rheumatol Int. 31 (2011) 153-164.
- Gast MC, Van Gils CH, Wessels LF, Harris N, Bonfrer JM, Rutgers EJ, Schellens JH, Beijnen JH, Serum protein
profiling for diagnosis of breast cancer using SELDI-TOF MS, Oncol. Rep. 22 (2009) 205-213.
- Gebrin AC, Bottini PV, Garlipp CR, Glomerular proteinuria: urinary excretion of alpha1-microglobulin and
its correlation to selectivity index, Clin. Chim. Acta. 374 (2006) 163-164.
- Gérard HC, Wang GF, Balin BJ, Schumacher HR, Hudson AP, Frequency of apolipoprotein E (APOE) allele
types in patients with Chlamydia-associated arthritis and other arthritides, Microb. Pathog. 26 (1999) 35-
43.
- Gérard HC, Wang Z, Wang GF, El-Gabalawy H, Goldbach-Mansky R, Li Y, Majeed W, Zhang H, Ngai N,
Hudson AP, Schumacher HR, Chromosomal DNA from a variety of bacterial species is present in synovial
tissue from patients with various forms of arthritis, Arthritis Rheum. 44 (2001) 1689-1697.
- Gerasimova YV, Erchenko IA, Shakirov MM, Godovikova TS, Interaction of human serum albumin and its
clinically relevant modification with oligoribonucleotides, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 4511-4514.
- Gershov D, Kim S, Brot N, Elkon KB, C-reactive protein binds to apoptotic cells, protects the cells from
assembly of the terminal complement components, and sustains an antiinflammatory innate immune
response: implications for systemic autoimmunity, J. Exp. Med. 192 (2000) 1353-1363.
- Glomset JA, The plasma lecithins:cholesterol acyltransferase reaction. J. Lipid Res 9 (1968) 155-167.

255
 Bibliografia

- Goëb V, Thomas-L'Otellier M, Daveau R, Charlionet R, Fardellone P, Le Loët X, Tron F, Gilbert D, Vittecoq

O, Candidate autoantigens identified by mass spectrometry in early rheumatoid arthritis are chaperones
and citrullinated glycolytic enzymes, Arthritis Res. Ther. 11 (2009):R38. doi: 10.1186/ar2644.
- Goldenstein H, Levy NS, Levy AP, Haptoglobin genotype and its role in determining heme-iron mediated
vascular disease, Pharmacol. Res. 66 (2012) 1-6.
- Gómez A, Anticuerpos anti-PCC: nuevos autoanticuerpos en la artritis reumatoide, Revista Española de
Reumatología 32 (2005) 85.
- Gómez Rodríguez N, Repercusión socioeconómica de la artritis reumatoide, An. Med. Interna 20 (2003)
111-113.
- González-Hernández A, Principios de Bioquímica clínica y Patología molecular, ELSEVIER, Barcelona (2010).
- Goodson NJ, Symmons DP, Scott DG, Bunn D, et al. Baseline levels of C-reactive protein and prediction of
death from cardiovascular disease in patients with inflammatory polyarthritis: A ten-year follow-up study
of a primary care-based inception cohort, Arthritis Rheum. 52 (2005) 2293-2299.
- Goodson NJ, Wiles NJ, Lunt M, Barrett EM, et al. Mortality in early inflammatory polyarthritis:
Cardiovascular mortality is increased in seropositive patients, Arthritis Rheum. 46 (2002) 2010-2019.
- Görg A, Boguth G, Obermaier C, Posch A, Weiss W. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis
with immobilized pH gradients in the first dimension (IPG-Dalt): the state of the art and the controversy of
vertical versus horizontal systems, Electrophoresis 16 (1995) 1079-1086.
- Görg A, Obermaier GB, Boguth G, Harder A, Scheibe B, Wildgruber R, Weiss W, The current state of two-
dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients, Electrophoresis 21 (2000) 1037-1053.
- Görg A, Weiss W, Dunn MJ, Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics,
Proteomics 4 (2004) 3665-3685.
- Gravallese EM, Bone destruction in arthritis, Ann. Rheum. Dis. 61 (2002) 84-86.
- Graversen JH, Madsen M, Moestrup SK, CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin
complexes from plasma, Int. J. Biochem. Cell Biol. 34 (2002) 309-314.
- Guerrier L, Righetti PG, Boschetti E, Reduction of dynamic protein concentration range of biological
extracts for the discovery of low-abundance proteins by means of hexapeptide ligand library, Nat. Protoc.
3 (2008) 883-890.
- Guillemin F, Briancon S, Klein JM, Saulean E, Pourel J, Low incidence of rheumatoid arthritis in France,
Scand J. Rheumatol. 23 (1994) 264-268.
- Gullick NJ, Scott DL, Co-morbidities in established rheumatoid arthritis, Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol.
25 (2011) 469-483.
- Gundry RL, Fu Q, Jelinek CA, Van Eyk JE, Cotter RJ, Investigation of an albumin-enriched fraction of human
serum and its albuminome, Proteomics Clin. Appl. 1 (2007) 73-88.
- Guzmán MR, Artritis reumatoide, bases inmunológicas para la terapia biológica, Revista colombiana de
reumatología 10 (2003) 119-134.

256
 Bibliografia

- Gygi SP, Rist B, Gerber SA, Turecek F, Gelb MH, Aebersold R, Quantitative analysis of complex protein
mixtures using isotope-coded affinity tags, Nat. Biotechnol. 17 (1999) 994-999.
- Halliwell B, Oxygen radicals, nitric oxide and human inflammatory joint disease, Ann. Rheum. Dis. 54
(1995) 505-510.
- Hanasaki K, Powell LD, Varki A, Binding of human plasma sialoglycoproteins by the B cell-specific lectin
CD22. Selective recognition of immunoglobulin M and haptoglobin, J. Biol. Chem. 270 (1995) 7543-7550.
- Hanash SM, Pitteri SJ, Faca VM, Mining the plasma proteome for cancer biomarkers, Nature 452 (2008)
571-579.
- Hannaford PC, Kay CR, Hirsch S, Oral contraceptives and rheumatoid arthritis: new data from the Royal
College of General Practitioners' oral contraception study, Ann. Rheum. Dis. 49 (1990) 744-746.
- Hardouin J, Duchateau M, Canele L, Vlieghe C, Joubert-Caron R, Caron M, Thiophilic adsorption revisited. J.
Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed, Life Sci. 845 (2007) 226-231.
- Harris LR, Churchward MA, Butt RH, Coorssen JR, Assessing detection methods for gel-based proteomic
analyses, J. Proteome Res. 6 (2007) 1418-1425.
- Hartwig S, Kotzka J, Müller H, Müller-Wieland D, Eckel J, Lehr S, Enhancing mass spectrometry based
serum profiling by a combination of free flow electrophoresis and ClinProt, Arch. Physiol. Biochem. 115
(2009) 259-266.
- Hasegawa H, Nishi S, Ito S, Saeki T, Kuroda T, Kimura H, Watababe T, Nakano M, Gejyo F, Arakawa M, High
prevalence of serum apolipoprotein E4 isoprotein in rheumatoid arthritis patients with amyloidosis,
Arthritis Rheum. 39 (1996) 1728-1732.
- Hatters DM, Peters-Libeu CA, Weisgraber KH, Apolipoprotein E structure: insights into function, Trends
Biochem. Sci. 31 (2006) 445-454.
- Heck AJ, Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology, Nat. Methods.
5 (2008) 927-933.
- Heliövaara M, Aho K, Reunanen A, Knekt P, Aromaa A, Parity and risk of rheumatoid arthritis in Finnish
women, Br. J. Rheumatol. 34 (1995) 625-628.
- Hernandez P, Muller M, Appel RD: Automated protein identification by tandem mass spectrometry: issues
and strategies, Mass Spectrom. Rev. 25 (2006) 235-254.
- Herrmann M, Voll RE, Zoller OM, Hagenhofer M, Ponner BB, Kalden JR. Impaired phagocytosis of apoptotic
cell material by monocyte-derived macrophages from patients with systemic lupus erythematosus,
Arthritis Rheum. 41 (1998) 1241-1250.
- Hirschfield GM, Pepys MB, C-reactive protein and cardiovascular disease: new insights from an old
molecule, Q J Med. 96 (2003) 793-807.
- Hitchon CA, Peschken CA, Shaikh S, El-Gabalawy HS, Early undifferentiated arthritis, Rheum. Dis. Clin. 31
(2005) 605-626.
- Honkanen V, Konttinen YT, Mussalo-Rauhamaa H, Vitamins A and E, retinol binding protein and zinc in
rheumatoid arthritis, Clin. Exp. Rheumatol. 7 (1989) 465-469.

257
 Bibliografia

- Hoppe B, Dörner T, Coagulation and the fibrin network in rheumatic disease: a role beyond haemostasis,
Nat. Rev. Rheumatol. 8 (2012) 738-746.
- Horgan GW, Sample size and replication in 2D gel electrophoresis studies, J. Proteome Res. 6 (2007) 2884-
2887.
- Hozumi H, Nakamura Y, Johkoh T, Sumikawa H, Colby TV, Kono M, Hashimoto D, Enomoto N, Fujisawa T,
Inui N, Suda T, Chida K, Acute exacerbation in rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease: a
retrospective case control study, BMJ 3 (2013): e003132. doi: 10.1136/bmjopen-2013-003132.
- Hu S, Loo JA, Wong DT, Human body fluid proteome analysis, Proteomics 6 (2006) 6326-6353.
- Huber LC, Distler O, Tarner I, Gay RE, Gay S, Pap T, Synovial fibroblasts: key players in rheumatoid arthritis,
Rheumatology 45 (2006) 669-675.
- Hueber W, Kidd BA, Tomooka BH, Lee BJ, Bruce B, Fries JF, Sønderstrup G, Monach P, Drijfhout JW, van
Venrooij WJ, Utz PJ, Genovese MC, Robinson WH, Antigen microarray profiling of autoantibodies in
rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum. 52 (2005) 2645-2655.
- Hunt SM, Thomas MR, Sebastian LT, Pedersen SK, Harcourt RL, Sloane AJ, Wilkins MR, Optimal replication
and the importance of experimental design for gel-based quantitative proteomics, J. Proteome. Res. 4
(2005) 809-819.
- Hürlimann D, Enseleit F, Ruschitzka F, Rheumatoid arthritis, inflammation, and atherosclerosis, Herz. 29
(2004) 760-768.
- Hyung SJ, Ruotolo BT, Integrating mass spectrometry of intact protein complexes into structural
proteomics, Proteomics 12 (2012) 1547-164.
- International Human Genome Sequencing Consortium, Finishing the euchromatic sequence of the human
genome, Nature 431 (2004) 931-945.
- Isaacs JD, The changing face of rheumatoid arthritis: sustained remission for all?, Nature Reviews
Immunology 10 (2010) 605-611.
- Ishigami A, Ohsawa T, Hiratsuka M, Taguchi H, Kobayashi S, Saito Y, Murayama S, Asaga H, Toda T, Kimura
N, Maruyama N, Abnormal accumulation of citrullinated proteins catalyzed by peptidylarginine deiminase
in hippocampal extracts from patients with Alzheimer's disease, J. Neurosci. Res. 80 (2005) 120-128.
- Ishihama Y, Oda Y, Tabata T, Sato T, Nagasu T, Rappsilber J, Mann M: Exponentially modified protein
abundance index (emPAI) for estimation of absolute protein amount in proteomics by the number of
sequenced peptides per protein, Mol. Cell Proteomics 4 (2005) 1265-1272.
- Isik A, Koca SS, Ustundag B, Celik H, Yildirim A, Paraoxonase and arylesterase levels in rheumatoid arthritis,
Clin. Rheumatol. 26 (2007) 342-348.
- Islander U, Jochems C, Stubelius A, Andersson A, Lagerquist MK, Ohlsson C, Carlsten H, Combined
treatment with dexamethasone and raloxifene totally abrogates osteoporosis and joint destruction in
experimental postmenopausal arthritis, Arthritis Res. Ther. 13 (2011):R96. doi: 10.1186/ar3371.
- Islinger M, Eckerskorn C, Völkl A, Free-flow electrophoresis in the proteomic era: a technique in flux,
Electrophoresis 31 (2010) 1754-1763.

258
 Bibliografia

- Itoh T, Matsuda H, Tanioka M, Kuwabara K, Itohara S, Suzuki R, The role of matrix metalloproteinase-2 and
matrix metalloproteinase-9 in antibody-induced arthritis, J. Immunol. 169 (2002) 2643-2647.
- Jadue N, Anticuerpos anti-péptido citrulinado cíclico en artritis reumatoide, artritis psoriática y otras
enfermedades, Reumatología 23 (2007) 142-150.
- James P. Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. Quarterly reviews of
biophysics 30 (1997) 279–331.
- Jeney V, Eaton JW, Balla G, Balla J, Natural history of the bruise: formation, elimination, and biological
effects of oxidized hemoglobin, Oxid. Med. Cell Longev. (2013)2013:703571. doi: 10.1155/2013/703571.
- Jenkinson ML, Bliss MR, Brain AT, Scott DL, Rheumatoid arthritis and senile dementia of the Alzheimer's
type, Br. J. Rheumatol. 28 (1989) 86-88.
- Jenne DE, Lowin B, Peitsch MC, Bottcher A, Schmitz G and Tschopp J: Clusterin (complement lysis inhibitor)
forms a high density lipoprotein complex with apolipoprotein A-I in human plasma, J. Biol. Chem. 266
(1991) 11030-11036.
- Jeong S, Ledee DR, Gordon GM, Itakura T, Patel N, Martin A, Fini ME, Interaction of clusterin and matrix
metalloproteinase-9 and its implication for epithelial homeostasis and inflammation, Am. J. Pathol. 180
(2012) 2028-2039.
- JiJ A, Chakraborty M, Geng X, Zhang A, Amini M, et al., Strategy for qualitative and quantitative analysis
in proteomics based on signature peptides, J. Chromatogr. 745 (2000), 197-210.
- Jirka M, Blanický P, Srajer J, Zwinger A, Jirásek JE, Human serum Zn-alpha2-glycoprotein in amniotic fluid,
Clin. Chim. Acta. 85 (1978) 107-110.
- Jones HW, Bailey R, Zhang Z, Dunne KA, Blake DR, Cox NL, Morris CJ, Winyard PG, Inactivation of
antithrombin III in synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis, Ann. Rheum. Dis. 57 (1998) 162-
165.
- Kahlenberg JM, Kaplan MJ, Mechanisms of premature atherosclerosis in rheumatoid arthritis and lupus,
Annu. Rev. Med. 64 (2013) 249-263.
- Kamboh MI, Ferrell RE, Apolipoprotein H polymorphism and its role in lipid metabolism, Adv. Lipid. Res. 1
(1991) 9-18.
- Kamboh MI, Ferrell RE, Sepehrnia B, Genetic studies of human apolipoproteins. IV. Structural
heterogeneity of apolipoprotein H (β2-glycoprotein I), Am. J. Hum. Genet. 42 (1988) 452-457.
- Kaminskaia GO, Zhukova NL, Naumov VN, Interrelations between genetically determined haptoglobin
types and the course of the postoperative period in chronic forms of pulmonary tuberculosis, Probl.
Tuberk. 8 (1989) 3-7.
- Kamper EF, Kopeikina LT, Koutsoukos V, Stavridis J, Plasma tetranectin levels and disease activity in
patients with rheumatoid arthritis, J. Rheumatol. 24 (1997) 262-268.
- Kamper EF, Kopeikina LT, Trontzas P, Kyriazis NC, Vaiopoulos G, Stavridis J, Comparative study of
tetranectin levels in serum and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis, seronegative
spondylarthritis and osteoarthritis, Clin. Rheumatol. 17 (1998) 318-324.

259
 Bibliografia

- Kantor AB, Wang W, Lin H, Govindarajan H, Anderle M, Perrone A, Becker C, Biomarker discovery by
comprehensive phenotyping for autoimmune diseases, Clin. Immunol. 111 (2004) 186-195.
- Karthikeyan G, Baalasubramanian S, Seth S, Das N, Low levels of plasma soluble complement receptor type
1 in patients receiving thrombolytic therapy for acute myocardial infarction, J. Thromb. Thrombolysis 23
(2007) 115-120.
- Kasturi S, Goldstein BL, Malspeis S, Karlson EW, Costenbader KH, Comparison of the 1987 American
College of Rheumatology and the 2010 American College of Rheumatology/European League against
Rheumatism criteria for classification of rheumatoid arthritis in the Nurses' Health Study cohorts,
Rheumatol Int. (2013).
- Kawakami A, Kubota K, Yamada N, Tagami U, Takehana K, Sonaka I, Suzuki E, Hirayama K, Identification
and characterization of oxidized human serum albumin. A slight structural change impairs its ligand-
binding and antioxidant functions, FEBS J. 273 (2006) 3346-3357.
- Kehrl JH, Wakefield LM, Roberts AB, Jakowlew S, Alvarez-Mon M, Derynck R, Sporn MB, Fauci AS,
Production of transforming growth factor beta by human T lymphocytes and its potential role in the
regulation of T cell growth, J. Exp. Med. 163 (1986) 1037-1050.
- Keidel EM, Ribitsch D, Lottspeich F, Equalizer technology-Equal rights for disparate beads, Proteomics 10
(2010) 2089-2098.
- Keller A, Nesvizhskii AI, Kolker E, Aebersold R: Empirical statistical model to estimate the accuracy of
peptide identifications made by MS/MS and database search, Anal. Chem. 74 (2002) 5383-5392.
- Kellner H, Targeting interleukin-17 in patients with active rheumatoid arthritis: rationale and clinical
potential, Ther. Adv. Musculoskelet Dis. 5 (2013) 141-152.
- Kelso GJ, Stuart WD, Richter RJ, Furlong CE, Jordan-Starck TC and Harmony JA: Apolipoprotein J is
associated with paraoxonase in human plasma, Biochemistry 33 (1994) 832-839.
- Kenneth E, Sack MD, Kenneth HF, Rheumatic Diseases, Medical Immunology (2001) 401.
- Kentsis A, Ahmed S, Kurek K, Brennan E, Bradwin G, Steen H, Bachur R, Detection and diagnostic value of
urine leucine-rich α-2-glycoprotein in children with suspected acute appendicitis, Ann. Emerg. Med. 60
(2012) 78-83.
- Khan S, Greenberg JD, Bhardwaj N, Dendritic cells as targets for therapy in rheumatoid arthritis, Nat. Rev.
Rheumatol. 5 (2009) 566-571.
- Kharbanda AB, Rai AJ, Cosme Y, Liu K, Dayan PS, Novel serum and urine markers for pediatric appendicitis,
Acad. Emerg. Med. 19 (2012) 56-62.
- Kim CW, Cho EH, Lee YJ, Kim YH, Hah YS, Kim DR, Disease-specific proteins from rheumatoid arthritis
patients, J. Korean Med. Sci. 21 (2006) 478-484.
- Kim HH, Kim J, Park SH, Kim SK, Kim OD, Choe JY, Correlation of anti-cyclic citrullinated antibody with hand
joint erosion score in rheumatoid arthritis patients, Korean J. Intern. Med. 25 (2010) 201-206.
- Kim N, Choi WS, Proapoptotic role of nuclear clusterin in brain, Anat. Cell. Biol. 44 (2011) 169-175.

260
 Bibliografia

- Kim YS, Son OL, Lee JY, Kim SH, Oh S, Lee YS, Kim CH, Yoo JS, Lee JH, Miyoshi E, Taniguchi N, Hanash SM,
Yoo HS, Ko JH, Lectin precipitation using phytohemagglutinin-L(4) coupled to avidin-agarose for serological
biomarker discovery in colorectal cancer, Proteomics 8 (2008) 3229-3235.
- Kinloch A, Lundberg K, Wait R, Wegner N, Lim NH, Zendman AJ, Saxne T, Malmström V, Venables PJ,
Synovial fluid is a site of citrullination of autoantigens in inflammatory arthritis. Arthritis Rheum. 58 (2008)
2287-2295.
- Kinloch A, Tatzer V, Wait R, Peston D, Lundberg K, Donatien P, Moyes D, Taylor PC, Venables PJ,
Identification of citrullinated alpha-enolase as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis, Arthritis
Res. Ther. 7 (2005) 1421-1429.
- Kinne RW, Brauer R, Stuhlmuller B, Palombo-Kinne E, Burmester GB, Macrophages in rheumatoid arthritis,
Arthritis Res. 2 (2000) 189-202.
- Kirchner M, Sonnenschein A, Schoofs S, Schmidtke P, Umlauf VN, Mannhardt-Laakmann W, Surface
expression and genotypes of Toll-like receptors 2 and 4 in patients with juvenile idiopathic arthritis and
systemic lupus erythematosus, Pediatr. Rheumato.l Online J. 11 (2013):9. doi: 10.1186/1546-0096-11-9.
- Kleindienst R, Xu Q, Willeit J, Waldenberger FR, Weimann S, Wick G, Immunology of atherosclerosis.
Demonstration of heat shock protein 60 expression and T lymphocytes bearing alpha/beta or
gamma/delta receptor in human atherosclerotic lesions, Am. J. Pathol. 142 (1993) 1927-1937.
- Klose J, Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel
approach to testing for induced point mutations in mammals, Humangenetik. 26 (1975) 231-43.
- Kluger HM, Hoyt K, Bacchiocchi A, Mayer T, Kirsch J, Kluger Y, Sznol M, Ariyan S, Molinaro A, Halaban R,
Plasma markers for identifying patients with metastatic melanoma, Clin. Cancer Res. 17 (2011) 2417-2425.
- Ko DH, Chang HE, Kim TS, Song EY, Park KU, Song J, Han KS, A review of haptoglobin typing methods for
disease association study and preventing anaphylactic transfusion reaction, Biomed. Res. Int. (2013)
2013:390630. doi: 10.1155/2013/390630.
- Koch AE, Angiogenesis as a target in rheumatoid arthritis, Ann. Rheum. Dis. 62 (2003) 60-67.
- Köhnlein T, Welte T, Alpha-1 antitrypsin deficiency: pathogenesis, clinical presentation, diagnosis, and
treatment, Am. J. Med. 121 (2008) 3-9.
- Koj A, Hatton MWC, Wong KL, & Regoeczi E, Biochem. 169 (1978) 589-596.
- Koj A, Initiation of acute phase response and synthesis of cytokines, Biochim. Biophys Acta 1317 (1996) 84-
94.
- Kong X, Zhang Y, Liu C, Guo W, Li X, Su X, Wan H, Sun Y, Lin N, Anti-angiogenic effect of triptolide in
rheumatoid arthritis by targeting angiogenic cascade, PLoS One 8 (2013):e77513. doi:
10.1371/[Link].0077513.
- Kontny E, Prochorec-Sobieszek M, Articular adipose tissue resident macrophages in rheumatoid arthritis
patients: potential contribution to local abnormalities, Rheumatology 52 (2013) 2158-2167.
- Korb A, Pavenstädt H, Pap T, Cell death in rheumatoid arthritis, Apoptosis 14 (2009) 447-454.

261
 Bibliografia

- Kostelansky MS, Sun J, Lee S, Kim J, Ghirlando R, Hierro A, Emr SD, Hurley JH, Structural and functional
organization of the ESCRT-I trafficking complex, Cell. 125 (2006) 113-126.
- Kragh-Hansen U, Structure and ligand binding properties of human serum albumin, Dan. Med. Bull. 37
(1990) 57-84.
- Kremser L, Brückner A, Heger A, Grunert T, Buchacher A, Josic D, Allmaier G, Rizzi A, Characterization of
antithrombin III from human plasma by two-dimensional gel electrophoresis and capillary electrophoretic
methods, Electrophoresis 24 (2003) 4282-4290.
- Kritas SK, Saggini A, Varvara G, Murmura G, Caraffa A, Antinolfi P, Toniato E, Pantalone A, Neri G, Frydas S,
Rosati M, Tei M, Speziali A, Saggini R, Pandolfi F, Theoharides TC, Conti P, Mast cell involvement in
rheumatoid arthritis, J. Biol. Regul. Homeost. Agents 27 (2013) 655-660.
- Kroot EJ, de Jong BA, van Leeuwen MA, Swinkels H, van der Hoogen FH, van´t Hofm, et al. The prognostic
value of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in patients with recent-onset rheumatoid arthritis,
Arthritis Rheum. 43 (2000) 1831-1835.
- Kudo J, Effects of acute phase reactive proteins on lymphocyte functions, Fukuoka Igaku Zasshi 73 (1982)
571-584.
- Kuhn E, Wu J, Karl J, Liao H, Zolg W, Guild B, Quantification of C-reactive protein in the serum of patients
with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide
standards, Proteomics 4 (2004) 1175-1186.
- Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J, Pentraxin 3(PTX 3): an endogenous modulator of the
inflammatory response, Mediators Inflamm. (2012) 2012:920517. doi: 10.1155/2012/920517.
- Kyburz D, Finckh A, The importance of early treatment for the prognosis of rheumatoid arthritis, Swiss
Med Wkly 143 (2013):w13865. doi: 10.4414/smw.2013.13865.
- Ladd JJ, Busald T, Johnson MM, Zhang Q, Pitteri SJ, Wang H, Brenner DE, Lampe PD, Kucherlapati R, Feng Z,
Prentice RL, Hanash SM, Increased plasma levels of the APC-interacting protein MAPRE1, LRG1, and
IGFBP2 preceding a diagnosis of colorectal cancer in women, Cancer Prev. Res. 5 (2012) 655-664.
- Lajas C, Abasolo L, Bellajdel B, Hérnandez-García C, Carmona L; Vargast et al. Costs and predictors of costs
in rheumatoid arthritis: a prevalence- based study, Arthritis Rheum. 49 (2003) 64-70.
- Lakatos J, Hárságyi A, Serum total, HDL, LDL cholesterol, and triglyceride levels in patients with rheumatoid
arthritis, Clin. Biochem. 21 (1988) 93-96.
- Lakota K, Resnik N, Mrak-Poljšak K, Sodin-Šemrl S, Veranič P, Colocalization of serum amyloid a with
microtubules in human coronary artery endothelial cells, J. Biomed. Biotechnol. (2011) 2011:528276. doi:
10.1155/2011/528276.
- Lambert JP, Ethier M, Smith JC, Figeys D: Proteomics: from gel based to gel free, Anal. Chem. 77 (2005)
3771-3787.
- Langlois MR, Delanghe JR, Biological and clinical significance of haptoglobin polymorphism in humans,
Clinical Chemistiy 42 (1996) 1589-1600.

262
 Bibliografia

- Lauridsen AL, Vestergaard P, Nexo E, Mean serum concentration of vitamin D-binding protein (Gc globulin)
is related to the Gc phenotype in women, Clin. Chem. 47 (2001) 753-756.
- Law CL, Sidorenko SP, Clark EA, Regulation of lymphocyte activation by the cell-surface molecule CD22,
Immunol. Today 15 (1994) 442-449.
- Lazarevic MB, Vitic J, Mladenovic V, Myones BL, Skosey JL, Swedler WI, Dyslipoproteinemia in the course
of active rheumatoid arthritis, Semin. Arthritis Rheum. 22 (1992) 172-178.
- Lebreton JP, Joisel F, Raoult JP, Lannuzel B, Rogez JP, Humbert G, Serum concentration of human alpha 2
HS glycoprotein during the inflammatory process: evidence that alpha 2 HS glycoprotein is a negative
acute-phase reactant, J. Clin. Invest. 64 (1979) 1118-1129.
- Lee DM, Kiener HP, Agarwa SK, Noss EH, Watts GFM, Chisaka O, Takeichi M, Brenner MB, Cadherin-11 in
Synovial Lining Formation and Pathology in Arthritis, Science 315 (2007) 1006-1010.
- Lee DM, Weinblatt ME, Rheumatoid arthritis, Lancet 358 (2001) 903-911.
- Lee H, Lee A, Criswell L, Seldin M, Amos C, Several regions in the major histocompatibility complex confer
risk for anti–CCP antibody positive rheumatoid arthritis, independent of the DRB1 locus, Mol. Med. 14
(2008) 293-300.
- Lee SI, Lee SY, Yoo WH, Association of apolipoprotein E polymorphism with bone mineral density in
postmenopausal women with rheumatoid arthritis, Rheumatology 44 (2005) 1067-1068.
- Léger T, Lavigne D, Le Caër JP, Guerrier L, Boschetti E, Fareh J, Feldman L, Laprévote O, Meilhac O, Solid-
phase hexapeptide ligand libraries open up new perspectives in the discovery of biomarkers in human
plasma, Clin. Chim. Acta. 412 (2011) 740-747.
- Lei T, He QY, Wang YL, Si LS, Chiu JF, Heparin chromatography to deplete high-abundance proteins for
serum proteomics, Clin. Chim. Acta. 388 (2008) 173-178.
- Leitner A, Lindner W, Chemistry meets proteomics: the use of chemical tagging reactions for MS-based
proteomics, Proteomics 6 (2006) 5418-5434.
- Lescuyer P, Hochstrasser DF, Sanchez JC, Comprehensive proteome analysis by chromatographic protein
prefractionation, Electrophoresis 25 (2004) 1125-1135.
- Levy AP, Purushothaman KR, Levy NS, Purushothaman M, Strauss M, Asleh R, Marsh S, Cohen O, Moestrup
SK, Moller HJ, Zias EA, Benhayon D, Fuster V, Moreno PR, Downregulation of the hemoglobin scavenger
receptor in individuals with diabetes and the Hp 2-2 genotype: implications for the response to
intraplaque hemorrhage and plaque vulnerability, Circ. Res. 101 (2007) 106-110.
- Li H, Wan A, Apoptosis of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes: possible roles of nitric oxide
and the thioredoxin 1, Mediators Inflamm (2013) 2013:953462. doi: 10.1155/2013/953462.
- Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, et al., Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9
complex initiates an apoptotic protease cascade, Cell 91 (1997) 479-489.
- Li Y, Zhang Y, Qiu F, Qiu Z, Proteomic identification of exosomal LRG1: a potential urinary biomarker for
detecting NSCLC, Electrophoresis 32 (2011) 1976-1983.

263
 Bibliografia

- Liao H, Wu J, Kuhn E, Chin W, Chang B, Jones MD, O'Neil S, Clauser KR, Karl J, Hasler F, Roubenoff R, Zolg
W, Guild BC, Use of mass spectrometry to identify protein biomarkers of disease severity in the synovial
fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum. 50 (2004) 3792-3803.
- Liau CY, Chang TM, Pan JP, Chen WL, Mao SJ, Purification of human plasma haptoglobin by hemoglobin-
affinity column chromatography, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed Life Sci. 790 (2003) 209-216.
- Liepe J, Skapenko A, Lipsky P, Schulze-Koops H, Regulatory T cells in rheumatoid arthritis, Arthritis Res.
Ther. 7 (2005) 93–99.
- Lihme A, Heegaard PM, Thiophilic adsorption chromatography: the separation of serum proteins, Anal
Biochem. 192 (1991) 64-69.
- Lindén M, Lind SB, Mayrhofer C, Segersten U, Wester K, Lyutvinskiy Y, Zubarev R, Malmström PU,
Pettersson U, Proteomic analysis of urinary biomarker candidates for nonmuscle invasive bladder cancer,
Proteomics 12 (2012) 135-144.
- Link AJ, Eng J, Schieltz DM, Carmack E, Mize GJ, Morris DR, Garvik BM, Yates JR, 3rd: Direct analysis of
protein complexes using mass spectrometry, Nat. Biotechnol. 17 (1999) 676-682.
- Liotta LA, Petricoin EF, Mass Spectrometry-Based Protein Biomarker Discovery: Solving the Remaining
Challenges to Reach the Promise of Clinical Benefit, Clin. Chem. 56 (2010) 1641-1642.
- Lioupis C, Barbatis C, Drougou A, Koliaraki V, Mamalaki A, Klonaris C, Georgopoulos S, Andrikopoulos V,
Bastounis E, Association of haptoglobin genotype and common cardiovascular risk factors with the
amount of iron in atherosclerotic carotid plaques, Atherosclerosis. 216 (2011) 131-138.
- Lisitsyna TA, Veltishchev DY, Gerasimov AN, Seravina OF, Kovalevskaya OB, Zeltyn AE, Novikov AA,
Aleksandrova EN, Tallerova AV, Kovalenko LP, Durnev AD, Krasnov VN, Nasonov EL, The magnitude of
fatigue and its association with depression, pain, and inflammatory activity in rheumatoid arthritis, Ter.
Arkh. 85 (2013) 8-15.
- Liu T, Cai B, Feng R, Churg-Strauss syndrome presented as paraneoplastic syndrome with thymic
neuroendocrine carcinoma: a case report, Rheumatol. Int. 32 (2012) 3683-3685.
- Liu T, Qian WJ, Strittmatter EF, Camp DG 2nd, Anderson GA, Thrall BD, Smith RD, High-throughput
comparative proteome analysis using a quantitative cysteinyl-peptide enrichment technology, Anal. Chem.
76 (2004) 5345-5353.
- Liu X, Kim CN, Yang J, Jemmerson R, Wang X, Induction of apoptotic program in cell-free extracts:
requirement for dATP and cytochrome c. Cell 86 (1996) 147-157.
- Lopez MF, Berggren K, Chernokalskaya E, Lazarev A, Robinson M, Patton WF, A comparison of silver stain
and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and
identification by peptide mass profiling, Electrophoresis 21 (2000) 3673-83.
- Louagie HK, Brouwer JT, Delanghe JR, De Buyzere ML, Leroux-Roels GG, Haptoglobin polymorphism and
chronic hepatitis C, J. Hepatol. 25 (1996) 10-14.
- Lovrić J, Introducing Proteomics: from concepts to sample separation, mass spectrometry and data
analysis, John Wiley & Sons, Ltd, Editorial Wiley-Blackwell (2011). ISBN 978-0-470-03523-8.

264
 Bibliografia

- Lozier J, Takahashi N, Putnam FW, Complete amino acid sequence of human plasma b2-glycoprotein I,
Proc. Natl. Acad. 81 (1984) 3640-3644.
- Lubberts E, Koenders MI, van der Berg WB, The role of T-cell interleukin-17 in conducting destructive
arthritis: lessons from animal models, Arthritis Res. Ther. 7 (2005) 29-37.
- Luis Caro-Oleas J, Fernández-Suárez A, Reneses Cesteros S, Porrino C, Núñez-Roldán A, Wichmann Schlipf
I, Diagnostic usefulness of a third-generation anti-cyclic citrulline antibody test in patients with recent-
onset polyarthritis, Clin. Chem. Lab. Med. 45 (2007) 1396-1401.
- Lundblad RL, Considerations for the use of blood plasma and serum for proteomics analysis, The internet
Journal of Gastroenterology 1 (2005) 1-13.
- Lundkvist J, Kastäng F, Kobelt G, The Burden of rheumatoid arthritis and access to treatment: health
burden and costs, The European Journal of Health Economics 8 (2008).
- Luque-Garcia JL, Zhou G, Spellman DS, Sun TT, Neubert TA, Analysis of electroblotted proteins by mass
spectrometry: protein identification after Western blotting, Mol. Cell Proteomics 7 (2008) 308-314.
- Lutzky V, Hannawi S, Thomas R, Cells of the synovium in rheumatoid arthritis. Dendritic cells, Arthritis Res.
Ther. 9 (2007) 219.
- Lynch J, Fay J, Meehan M, Bryan K, Watters KM, Murphy DM, Stallings RL, MiRNA-335 suppresses
neuroblastoma cell invasiveness by direct targeting of multiple genes from the non-canonical TGF-β
signalling pathway, Carcinogenesis. 33 (2012) 976-985.
- Machado Diaz AC, Chico Capote A, Arrieta Aguero CA, Rodríguez Alvarez Y, García Del Barco Herrera D,
Estévez Del Toro M, Guillen Nieto GE, Santos Savio A, Proinflammatory soluble interleukin-15 receptor
alpha is increased in rheumatoid arthritis, Arthritis (2012) 2012:943156. doi: 10.1155/2012/943156.
- Machold KP, Stamm TA, Eberl GJ, Nell VP.K, Dunky A, Uffmann M, Very recent onset rheumatoid arthritis:
Clinical and serological patient characteristics associated with radiographic progression over the first years
of disease, Rheumatology 46 (2007) 342-349.
- Mackness B, Hunt R, Durrington PN, Mackness MI, Increased immunolocalization of paraoxonase,
clusterin, and apolipoprotein A-I in the human artery wall with the progression of atherosclerosis,
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17 (1997) 1233-1238.
- Maes M, Cooreman W, Delanghe J, Scharpé S, Wauters A, Neels H, D'Hondt P, Peeters D, Cosyns P, Ranjan
R, et al, Components of biological variation in plasma haptoglobin: relationships to plasma fibrinogen and
immune variables, including interleukin-6 and its receptor, Clin. Chim. Acta. 239 (1995) 23-35.
- Mann M, Wilm M: Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence
tags, Anal. Chem. 66 (1994) 4390-4399.
- Marco-Ramell A, Bassols A, Enrichment of low-abundance proteins from bovine and porcine serum
samples for proteomics studies, Research in Veterinary Science 89 (2010) 340-343.
- Martínez A, Sánchez E, Valdivia A, Orozco G, López-Nevot MA, Pascual-Salcedo D, Balsa A, Fernández-
Gutiérrez B, de la Concha EG, García-Sánchez A, Koeleman BP, Urcelay E, Martín J, Epistatic interaction

265
 Bibliografia

between FCRL3 and NFkappaB1 genes in Spanish patients with rheumatoid arthritis, Ann. Rheum Dis. 65
(2006) 1188-1191.
- Martins de Souza D, Menezes de Oliveira B, dos Santos Farias A, Horiuchi RS, Crepaldi Domingues C, de
Paula E, Marangoni S, Gattaz WF, Dias-Neto E, Camillo Novello J, The use of ASB-14 in combination with
CHAPS is the best for solubilization of human brain proteins for two-dimensional gel electrophoresis, Brief
Funct. Genomic Proteomic 6 (2007) 70-75.
- Maruotti N, Annese T, Cantatore FP, Ribatti D, Macrophages and angiogenesis in rheumatic diseases,
Vasc. Cell 5 (2013):11. doi: 10.1186/2045-824X-5-11.
- Matsuo K, Xiang Y, Nakamura H, Masuko K, Yudoh K, Noyori K, Nishioka K, Saito T, Kato T, Identification of
novel citrullinated autoantigens of synovium in rheumatoid arthritis using a proteomic approach, Arthritis
Res. Ther. 8 (2006) R175.
- Maury CP, Liljeström M, Tiitinen S, Laiho K, Kaarela K, Ehnholm C, Apolipoprotein E phenotypes in
rheumatoid arthritis with or without amyloidosis, Amyloid. 8 (2001) 270-273.
- McInnes IB, Scheet G, Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis, Nat. Rev. Immunol. 7 (2007)
429-442.
- McInnes IB, Schett G, The pathogenesis of rheumatoid arthritis, N. Engl. J. Med. 365 (2011) 2205-2219.
- McLaughlin L, Zhu G, Mistry M, Ley-Ebert C, Stuart WD, Florio CJ, Groen PA, Witt SA, Kimball TR, Witte DP,
Harmony JA, Aronow BJ, Apolipoprotein J/clusterin limits the severity of murine autoimmune myocarditis,
J. Clin. Invest. 106 (2000) 1105-1113.
- Mehdi H, Nunn M, Steel DM, Whitehead AS, Perez M, Walker L, Peeples ME, Nucleotide sequence and
expression of the human gene encoding apolipoprotein H. Gene 108 (1991) 293-298.
- Meinecke I, Rutkauskaite E, Gay S, Pap T, The role of synovial fibroblasts in mediating joint destruction in
rheumatoid arthritis, Curr. Pharm. Des. 11 (2005) 563-568.
- Mendivil CO, Rimm EB, Furtado J, Sacks FM, Apolipoprotein E in VLDL and LDL With Apolipoprotein C-III is
Associated With a Lower Risk of Coronary Heart Disease, J. Am Heart Assoc. 2 (2013):e000130. doi:
10.1161/JAHA.113.000130.
- Meulenbelt I, Min JL, van Duijn CM, Kloppenburg M, Breedveld FC, Slagboom PE, Strong linkage on 2q33.3
to familial early-onset generalized osteoarthritis and a consideration of two positional candidate genes,
Europ. J. Hum. Genet. 14 (2006) 1280-1287.
- Meune C, Touzé E, Trinquart L, Allanore Y. Trends in cardiovascular mortality in patients with rheumatoid
arthritis over 50 years: a systematic review and meta-analysis of cohort studies. Rheumatology 48 (2009)
1309-1313.
- Mewar D, Wilson AG, Autoantibodies in rheumatoid arthritis: a review, Biomed Pharmacother 60 (2006)
648-655.
- Milan E, Lazzari C, Anand S, Floriani I, Torri V, Sorlini C, Gregorc V, Bachi A, SAA1 is over-expressed in
plasma of non small cell lung cancer patients with poor outcome after treatment with epidermal growth
factor receptor tyrosine-kinase inhibitors, J. Proteomics. 76 (2012) 91-101.

266
 Bibliografia

- Miles LA, Hawley SB, Baik N, Andronicos NM, Castellino FJ, Parmer RJ, Plasminogen receptors: the sine qua
non of cell surface plasminogen activation, Biosci. 10 (2005) 1754-1762.
- Miller I, Crawford J, Gianazza E: Protein stains for proteomic applications: which, when, why?, Proteomics
6 (2006) 5385-5408.
- Millioni R, Tolin S, Puricelli L, Sbrignadello S, Fadini GP, Tessari P, Arrigoni G, High abundance proteins
depletion vs low abundance proteins enrichment: comparison of methods to reduce the plasma proteome
complexity, PLoS One 6 (2011):e19603. doi: 10.1371/[Link].0019603.
- Milton S, Estadística para Biología y Ciencias de la Salud (3ºEd). McGraw-Hill. (2007)
- Minden JS, DIGE: past and future, Methods Mol. Biol. 854 (2012a) 3-8.
- Minden JS, Two-dimensional difference gel electrophoresis, Methods Mol. Biol. 869 (2012b) 287-304.
- Miura N, Kitamura H, Kameko M, Evaluation of the reference range of retinol-binding protein (RBP) levels
by the latex turbidimetric immunoassay, Rinsho Byori 57 (2009) 195-199.
- Miyake K, Kusunoki M, Ueki N, Nagoya H, Kodaka Y, Shindo T, Kawagoe T, Gudis K, Futagami S, Tsukui T,
Nakamura H, Sakamoto C, Implication of antithrombotic agents on potential bleeding from endoscopically
determined peptic ulcers, incidentally detected as surrogate markers for nsaids-associated ulcers
complication, Dig. Endosc. 25 (2013) 25-31.
- Möller B, Scherer A, Förger F, Villiger PM, Finckh A; on behalf of the Swiss Clinical Quality Management
Program for Rheumatic Diseases, Anaemia may add information to standardised disease activity
assessment to predict radiographic damage in rheumatoid arthritis: a prospective cohort study, Ann.
Rheum. Dis. (2013).
- Molloy MP, Brzezinski EE, Hang J, McDowell MT, VanBogelen RA, Overcoming technical variation and
biological variation in quantitative proteomics, Proteomics 3 (2003) 1912-1919.
- Moral P, Panadero AM, Haptoglobin subtypes in Barcelona (Spain), Hum. Hered. 33 (1983) 192-194.
- Moreno JA, López-Miranda J, Pérez-Martínez P, Marín C, Moreno R, Gómez P, Paniagua JA, Pérez-Jiménez
F, A monounsaturated fatty acid-rich diet reduces macrophage uptake of plasma oxidised low-density
lipoprotein in healthy young men, Br. J. Nutr. 100 (2008) 569-575.
- Moriguchi J, Ezaki T, Tsukahara T, Furuki K, Fukui Y, Okamoto S, Ukai H, Sakurai H, Ikeda M, alpha1-
Microglobulin as a promising marker of cadmium-induced tubular dysfunction, possibly better than beta2-
microglobulin, Toxicol. Lett. 148 (2004) 11-20.
- Morley JJ, Kushner I, Serum C-reactive protein levels in disease, Acad Sci. 389 (1982) 406-417.
- Moulder R, Filen JJ, Salmi J, Katajamaa M, Nevalainen OS, Oresic M, Aittokallio T, Lahesmaa R, Nyman TA:
A comparative evaluation of software for the analysis of liquid chromatography-tandem mass
spectrometry data from isotope coded affinity tag experiments, Proteomics 5 (2005) 2748-2760.
- Myllykangas-Luosujärvi R, Isomäki H, Alzheimer's disease and rheumatoid arthritis, Br. J. Rheumatol. 33
(1994) 501-502.
- Nakamura RM, Progress in the use of biochemical and biological markers for evaluation of rheumatoid
arthritis, Journal of Clinical Laboratory Analysis 14 (2000) 305-313.

267
 Bibliografia

- Namekata K, Oyama F, Imagawa M, Ihara Y, Human transferrin (Tf): a single mutation at codon 570
determines Tf C1 or Tf C2 variant, Hum. Genet. 100 (1997) 457-458.
- Narváez García FJ, Qué, cómo, cuándo y hasta cuándo tratar una artritis indiferenciada, Reumatol Clin. 5
(2009) 31–39.
- Nat Liu CC, Kanekiyo T, Xu H, Bu G, Apolipoprotein E and Alzheimer disease: risk, mechanisms and therapy,
Rev. Neurol. 9 (2013) 106-118.
- Navab M, Anantharamaiah GM, Reddy ST, Van Lenten BJ, Ansell BJ, Fogelman AM, Mechanisms of disease:
proatherogenic HDL--an evolving field, Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 2 (2006) 504-511.
- Navarro-Cano G, Del Rincón I, Pogosian S, Roldan JF, Escalante A, Association of mortality with disease
severity in Rheumatoid arthritis, independent of comorbility, Arthritis Rheum. 48 (2003) 2425-2433.
- Nedjai B, Li H, Stroke IL, Wise EL, Webb ML, Merritt JR, Henderson I, Klon AE, Cole AG, Horuk R, Vaidehi N,
Pease JE, Small molecule chemokine mimetics suggest a molecular basis for the observation that CXCL10
and CXCL11 are allosteric ligands of CXCR3, Br. J. Pharmacol. 166 (2012) 912-923.
- Németh T, Mócsai A, The role of neutrophils in autoimmune diseases, Immunol Lett. 143 (2012) 9-19.
- Nesterenko MV, Tilley M, Upton SJ, A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30
minute detection of proteins in polyacrylamide gels, J. Biochem. Biophys. Methods 28 (1994) 239-242.
- Nesvizhskii AI, Aebersold R: Analysis, statistical validation and dissemination of large-scale proteomics
datasets generated by tandem MS, Drug. Discov. Today 9 (2004) 173-181.
- Nesvizhskii AI, Keller A, Kolker E, Aebersold R: A statistical model for identifying proteins by tandem mass
spectrometry, Anal. Chem. 75 (2003) 4646-4658.
- Neuhoff V, Arold N, Taube D, Ehrhardt W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including
isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-
250 and R-250, Electrophoresis 9 (1988) 255-562.
- Newkirk MM, Apostolakos P, Neville C, Fortin PR, Systemic lupus erythematosus, a disease associated with
low levels of clusterin/apoJ, an antiinflammatory protein, J. Rheumatol. 26 (1999) 597-603.
- Nguyen D, Nickel M, Mizuguchi C, Saito H, Lund-Katz S, Phillips MC, Interactions of apolipoprotein A-I with
high-density lipoprotein particles, Biochemistry 52 (2013) 1963-1972.
- Ni M, Wei W, Feng Q, Sun XG, Wang YC, Gu YJ, Zheng F, Transthyretin as a potential serological marker for
the diagnosis of patients with early rheumatoid arthritis, Clin. Exp. Rheumatol. 31 (2013) 394-399.
- Nie H, Zheng Y, Li R, Guo TB, He D, Fang L, Liu X, Xiao L, Chen X, Wan B, Chin YE, Zhang JZ, Phosphorylation
of FOXP3 controls regulatory T cell function and is inhibited by TNF-α in rheumatoid arthritis, Nat. Med. 19
(2013) 322-328.
- Nielen MM, van Schaardenburg D, Reesink HW, van de Stadt RJ, van der Horst-Bruinsma IE, de Koning MH,
et al, Specific autoantibodies precede the symptoms of rheumatoid arthritis: a study of serial
measurements in blood donors, Arthritis Rheumatoid 50 (2004) 380-386.
- Nielsen MJ, Moestrup SK, Receptor targeting of hemoglobin mediated by the haptoglobins: roles beyond
heme scavenging, Blood 114 (2009) 764-771.

268
 Bibliografia

- Nienhuis RLF, Mandema E, Smids C, A new serum factor in patients with rheumatoid arthritis, the
antiperinuclear factor, Ann. Rheum. Dis. 23 (1964) 302-305.
- Niewold TB, Harrison MJ, Paget SA, Anti-CCP antibody testing as a diagnostic and prognostic tool in
rheumatoid arthritis, QJM 100 (2007) 193-201.
- Nigrovic PA, Lee DM, Mast cells in inflammatory arthritis, Arthritis res. Ther. 7 (2005) 1-11.
- Nimpf J, Bevers EM, Bomans PH, Till H, Wurm H, Kostner GM, Zwall RF, Prothrombinase activity of of
human platelets is inhibited by b2-glycoprotein I, Biochem. Biophys. Acta. 884 (1986) 142-149.
- Nishio H, Dugaiczyk A, Complete structure of the human alpha-albumin gene, a new member of the serum
albumin multigene family, Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996) 7557-7561.
- Niwa Y, Iio A, Niwa G, Sakane T, Tsunematsu T, Kanoh T, Serum albumin metabolism in rheumatic
diseases: relationship to corticosteroids and peptic ulcer, J. Clin. Lab. Immunol. 31 (1990) 11-16.
- Nonaka M, Yoshizaki F, Evolution of the complement system, Mol. Immunol. 40 (2004) 897-902.
- Nowak EC, Weaver CT, Turner H, Begum-Haque S, Becher B, Schreiner B, Coyle AJ, Kasper LH, Noelle RJ, IL-
9 as a mediator of Th17-driven inflammatory disease, J. Exp. Med. 206 (2009) 1653-1660.
- O´Dell JR, Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis, [Link]. 350 (2004) 2591-2602.
- O'Donnell LC, Druhan LJ, Avalos BR, Molecular characterization and expression analysis of leucine-rich
alpha2-glycoprotein, a novel marker of granulocytic differentiation, J. Leukoc. Biol. 72 (2002) 478-485.
- O'Farrell PH, High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins, J. Biol. Chem. 250 (1975) 4007-
21.
- Oh SK, Pavlotsky N, Tauber AI, Specific binding of haptoglobin to human neutrophils and its functional
consequences, J. Leukoc. Biol. 47 (1990) 142-148.
- Olsson MG, Allhorn M, Olofsson T, Akerström B, Up-regulation of alpha1-microglobulin by hemoglobin and
reactive oxygen species in hepatoma and blood cell lines, Free Radic. Biol. Med. 42 (2007) 842-851
- Omenn GS, States DJ, Adamski M, Blackwell TW, Menon R, Hermjakob H, Apweiler R, Haab BB, Simpson
RJ, Eddes JS, Kapp EA, Moritz RL, Chan DW, Rai AJ, Admon A, Aebersold R, Eng J, Hancock WS, Hefta SA,
Meyer H, Paik YK, Yoo JS, Ping P, Pounds J, Adkins J, Qian X, Wang R, Wasinger V, Wu CY, Zhao X, Zeng R,
Archakov A, Tsugita A, Beer I, Pandey A, Pisano M, Andrews P, Tammen H, Speicher DW, Hanash SM,
Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: results from the pilot phase with 35 collaborating
laboratories and multiple analytical groups, generating a core dataset of 3020 proteins and a publicly-
available database, Proteomics 5 (2005) 3226-3245.
- Omenn GS, THE HUPO Human Plasma Proteome Project, Proteomics Clin. Appl. 1 (2007) 769-779.
- Ono K, Ohashi S, Tanaka S, Rheumatoid arthritis and bone -periarticular and systemic bone loss-, Clin
Calcium 23 (2013) 249-255.
- Opal SM, Kessler CM, Roemisch J, Knaub S. Antithrombin, heparin, and heparan sulfate, Crit. Care. Med.
30 (2002) 325-31.
- Opiteck GJ, Jorgenson JW, Two-dimensional SEC/RPLC coupled to mass spectrometry for the analysis of
peptides, Anal. Chem. 69 (1997) 2283-2291.

269
 Bibliografia

- Ordovas JM, Litwack-Klein L, Wilson PW, Schaefer MM, Schaefer EJ, Apolipoprotein E isoform phenotyping
methodology and population frequency with identification of apoE1 and apoE5 isoforms, J. Lipid Res. 28
(1987) 371-380.
- Orozco G, Alizadeh BZ, Delgado-Vega AM, González-Gay MA, Balsa A, Pascual-Salcedo D, Fernández-
Gutierrez B, González-Escribano MF, Petersson IF, van Riel PL, Barrera P, Coenen MJ, Radstake TR, van
Leeuwen MA, Wijmenga C, Koeleman BP, Alarcón-Riquelme M, Martín J, Association of STAT4 with
rheumatoid arthritis: a replication study in three European populations, Arthritis Rheum. 58 (2008) 1974-
1980.
- Orozco G, Rueda B, Martín J, Genetic basis of rheumatoid arthritis, Biomed Pharmacother 60 (2006) 656-
662.
- Ortea I, Roschitzki B, Ovalles JG, Longo JL, de la Torre I, González I, Gómez-Reino JJ, González A, Discovery
of serum proteomic biomarkers for prediction of response to infliximab (a monoclonal anti-TNF antibody)
treatment in rheumatoid arthritis: an exploratory analysis, J. Proteomics 77 (2012) 372-382.
- Ortiz B, Vázquez C, Martínez C, Giménez J, Sanmartín O, De los Dolores V, Ortega F, et al., La proteína S100
como marcador tumoral en pacientes con melanoma. Estudio comparativo con ganglio centinela y la
exploración FDG-PET, Rev. Esp. Med. Nuclear 22 (2003) 87-96.
- Ortiz García A, García de Vicuña R, Artritis reumatoide (I). Etiopatogenia, Medicine 28 (2005) 1805-1814.
- Osawa M, Yuasa I, Kitano T, Henke J, Kaneko M, Udono T, Saitou N, Umetsu K, Haplotype analysis of the
human β2-HS glycoprotein (fetuin) gene, Ann. Hum. Genet. 65 (2001) 27-34.
- O'Shea JJ, Paul WE, Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells,
Science. 327 (2010) 1098-1102.
- Østensen M, Villiger PM, Förger F, Interaction of pregnancy and autoimmune rheumatic disease,
Autoimmun. Rev. 11 (2012) 437-446.
- Palagi PM, Hernandez P, Walther D, Appel RD: Proteome informatics I: bioinformatics tools for processing
experimental data, Proteomics 6 (2006) 5435-5444.
- Palagi PM, Lisacek F, Appel RD, Database interrogation algorithms for identification of proteins in
proteomic separations, Methods Mol. Biol. 519 (2009) 515-31.
- Paleolog EM, Angiogenesis in rheumatoid arthritis, Arthritis Res. 4 (2002) 81-90.
- Pancorbo MM, Garcia-Orad A, No evidence for an association between glyoxalase I and haptoglobin in
nine Spanish populations, Hum. Hered. 37 (1987) 157-160.
- Pandey A, Mann M, Proteomics to study genes and genomes, Nature 405 (2000) 837-846.
- Pando-Robles RV, Lanz-Mendoza H, La importancia de la proteómica en la salud pública. Salud Pública
Mex. 51 (2009) 386-394.
- Pando-Robles V, Batista CF, Proteómica: hacia el entendimiento del lenguaje de las proteínas, Instituto de
Biotecnología de la UNAM 25 aniversario 9 (2008) 97-108.
- Pang JX, Ginanni N, Dongre AR, Hefta SA, Opitek GJ, Biomarker discovery in urine by proteomics,
[Link] Res. 1 (2002) 161-169.

270
 Bibliografia

- Papp M, Foldi I, Nemes E, Udvardy M, Harsfalvi J, Altorjay I, Mate I, Dinya T, Varvolgyi C, Barta Z, Veres G,
Lakatos PL, Tumpek J, Toth L, Szathmari E, Kapitany A, Gyetvai A, Korponay-Szabo IR, Haptoglobin
polymorphism: a novel genetic risk factor for celiac disease development and its clinical manifestations,
Clin. Chem. 54 (2008) 697-704.
- Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ: Rapid identification of proteins by peptidemass fingerprinting, Curr. Biol.
3 (1993) 327-332.
- Park H, Li Z, Yang XO, Chang SH, Nurieva R, Wang YH, Wang Y, Hood L, Zhu Z, Tian Q, Dong C, A distinct
lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17, Nat. Immunol. 6 (2005)
1133-1141.
- Pasceri V, Yeh ET. A tale of two diseases: Atherosclerosis and rheumatoid arthritis, Circulation 100 (1999)
2124-2126.
- Pasquali C, Fialka I, Huber LA: Subcellular fractionation, electromigration analysis and mapping of
organelles, J. Chromatogr. B. Biomed. Sc.i Appl. 722 (1999) 89-102.
- Patton WF, A thousand points of light: the application of fluorescence detection technologies to two-
dimensional gel electrophoresis and proteomics, Electrophoresis 21 (2000) 1123-1144.
- Patton WF, Detection technologies in proteome analysis, J. Chromatogr B Analyt technol Biomed Life Sci
771 (2002) 3-31.
- Paulus HE, Ramos B, Wong WK, Ahmed A, Bulpitt K, Park G, Equivalence of the acute phase reactants C-
reactive protein, plasma viscosity, and westergren erythrocyte sedimentation rate when used to calculate
American College of Rheumatology 20 % improvement criteria or the disease activity score in patients
with early rheumatoid arthritis, Western Consortium of practicing Rheumatologists, J. Rheumatol. 26
(1999) 2324-2331.
- Pavón EJ, Muñoz P, Lario A, Longobardo V, Carrascal M, Abián J, Martin AB, Arias SA, Callejas-Rubio JL, Sola
R, Navarro-Pelayo F, Raya-Alvarez E, Ortego-Centeno N, Zubiaur M, Sancho J, Proteomic analysis of plasma
from patients with systemic lupus erythematosus: increased presence of haptoglobin alpha2 polypeptide
chains over the alpha1 isoforms, Proteomics 6 (2006) 282-292.
- Peng J, Elias JE, Thoreen CC, Licklider LJ, Gygi SP: Evaluation of multidimensional chromatography coupled
with tandem mass spectrometry (LC/LC-MS/MS) for large-scale protein analysis: the yeast proteome,
[Link] Res. 2 (2003) 43-50.
- Pepys MB, Hirschfield GM, C-reactive protein: a critical update, Journal of Clinical Investigation 111 (2003)
1805-1812.
- Pertovaara M, Lehtimäki T, Rontu R, Antonen J, Pasternack A, Hurme M, Presence of apolipoprotein E
epsilon4 allele predisposes to early onset of primary Sjogren's syndrome, Rheumatology 43 (2004) 1484-
1487.
- Peter I, Crosier MD, Yoshida M, Booth SL, Cupples LA, Dawson-Hughes B, Karasik D, Kiel DP, Ordovas JM,
Trikalinos TA, Associations of APOE gene polymorphisms with bone mineral density and fracture risk: a
meta-analysis, Osteoporos Int. 22 (2011) 1199-1209.

271
 Bibliografia

- Peters T Jr, Serum albumin, Adv. Protein Chem. 37 (1985) 161-245.

- Peters TJ, All about albumin, San Diego: Academic (1996).
- Piccard H, Van den Steen PE, Opdenakker G, Hemopexin domains as multifunctional liganding modules in
matrix metalloproteinases and other proteins, J. Leukoc. Biol. 81 (2007) 870-892.
- Pieper R, Gatlin CL, Makusky AJ, et al. The human serum proteome: Display of nearly 3700
chromatographically separated protein spots on two-dimensional electrophoresis gels and identification
of 325 distinct proteins, Proteomics 3 (2003) 1345–1364.
- Pierce A, Unwin RD, Evans CA, Griffiths S, Carney L, Zhang L, Jaworska E, Lee CF, Blinco D, Okoniewski MJ,
et al: Eight-channel iTRAQ enables comparison of the activity of six leukemogenic tyrosine kinases, Mol.
Cell Proteomics 7 (2008) 853-863.
- Pike RM, Sulkin SE, Coggeshall HC, Serological reactions in rheumatoid arthritis II. Concerning the nature of
the factor in rheumatoid arthritis serum responsible for increased agglutination of sensitized sheep
erythrocytes, J. Immunol. 63 (1949) 447-63.
- Pincus T et al., Premature mortality in patients with rheumatoid arthritis: evolving concepts, Arthritis &
Rheumatism. 44 (2001) 1234-1236.
- Pincus T, Assessment of long-term outcomes of rheumatoid arthritis. How choices of measures and study
designs may lead to apparently different conclusions, Rheum. Dis. Clin. 21 (1995) 619-654.
- Pincus T, Callahan LF, Taking mortality in rheumatoid arthritis seriously-predictive markers,
socioeconomics status and comorbidity, J Rheumatol. 13 (1986) 841-845.
- Pincus T, Callahan OF, The side effects of rheumatoid arthritis: joint destruction, disability and early
mortality, BR. J. Rheumatol. 32 (1993) 28-37.
- Polticelli F, Bocedi A, Minervini G, Ascenzi P, Human haptoglobin structure and function--a molecular
modelling study, FEBS J. 275 (2008) 5648-5656.
- Polz E, Kostner GM, The binding of b2-glycoprotein I to human serum lipoproteins, FEBS Lett 102 (1979)
183-186.
- Poole CD, Conway P, Reynolds A, Currie CJ, The association between C-reactive protein and the likelihood
of progression to joint replacement in people with rheumatoid arthritis: a retrospective observational
study, BMC Musculoskelet Disord (2008) 9:146. doi: 10.1186/1471-2474-9-146.
- Poortmans JR, Schmid K, The level of Zn-alpha 2-glycoprotein in normal human body fluids and kidney
extract, J. Lab. Clin. Med. 71 (1968) 807-811.
- Porath J, Belew M, Maisano F, Olin B, Group specific protein adsorbents based on “thiophilic” interaction,
In Physical Chemistry of Colloids and Macromolecules, Ed. Ranby, B (1984) 137–142.
- Postigo J, Genre F, Iglesias M, Fernández-Rey M, Buelta L, Carlos Rodríguez-Rey J, Merino J, Merino R,
Exacerbation of type II collagen-induced arthritis in apolipoprotein E-deficient mice in association with the
expansion of Th1 and Th17 cells, Arthritis Rheum. 63 (2011) 971-980.
- Poulakou MV, Paraskevas KI, Wilson MR, Iliopoulos DC, Tsigris C, Mikhailidis DP, Perrea D Apolipoprotein J
and leptin levels in patients with coronary heart disease, In Vivo 22 (2008) 537-42.

272
 Bibliografia

- Pruijn GJ, Wiik A, van Venrooij WJ, The use of citrullinated peptides and proteins for the diagnosis of
rheumatoid arthritis, Arthritis Res. Ther. 12 (2010):203. doi: 10.1186/ar2903.
- Quaye IK, Haptoglobin, inflammation and disease, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (2008) 735-742.
- Quero C, Colomé N, Rodriguez C, Eichhorn P, Posada de la Paz M, Gelpi E, Abian J, Proteomics of toxic oil
syndrome in humans: Phenotype distribution in a population of patients, Chem. Biol. Interact. 192 (2011)
129-135.
- R Core Team, R: A language and environment for statisticalcomputing. R Foundation for Statistical
Computing, Vienna, Austria. (2012). ISBN 3-900051-07-0.
- Rabilloud T, Adessi C, Giraudel A, Lunardi J, Improvement of the solubilization of proteins in two-
dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients, Electrophoresis 18 (1997) 307-316.
- Rabilloud T, Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis, Methods Mol Biol. 112 (1999) 9-19.
- Radic M, Martinovic Kaliterna D, Radic J, Overview of vasculitis and vasculopathy in rheumatoid arthritis--
something to think about, Clin. Rheumatol. 32 (2013) 937-942.
- Radner H, Neogi T, Smolen JS, Aletaha D, Performance of the 2010 ACR/EULAR classification criteria for
rheumatoid arthritis: a systematic literature review, Ann. Rheum. Dis. (2013).
- Rai AJ, Gelfand CA, Haywood BC, Warunek DJ, Yi J, Schuchard MD, Mehigh RJ, Cockrill SL, Scott GB,
Tammen H, Schulz-Knappe P, Speicher DW, Vitzthum F, Haab BB, Siest G, Chan DW, HUPO Plasma
Proteome Project specimen collection and handling: towards the standardization of parameters for
plasma proteome samples, Proteomics 5 (2005) 3262-3277.
- Raida M, Schulz-Knappe P, Heine G, Forssmann WG, Liquid chromatography and electrospray mass
spectrometric mapping of peptides from human plasma filtrate, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 10 (1999) 45-
54.
- Rashid T, Ebringer A, Autoimmunity in Rheumatic Diseases Is Induced by Microbial Infections via
Crossreactivity or Molecular Mimicry, Autoimmune Dis. (2012) 2012:539282. doi: 10.1155/2012/539282.
- Ray S, Reddy PJ, Jain R, Gollapalli K, Moiyadi A, et al. Proteomic technologies for the identification of
disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead, Proteomics 11 (2011) 2139–2161.
- Raza K, Buckley CE, Salmon M, Buckley CD, Treating very early rheumatoid arthritis, Best. Pract. Res. Clin.
Rheumatol. 20 (2006) 849-863.
- Rehman AA, Ahsan H, Khan FH, α-2-Macroglobulin: a physiological guardian, J. Cell Physiol. 228 (2013)
1665-1675.
- Reinders J, Lewandrowski U, Moebius J, Wagner Y, Sickmann A, Challenges in mass spectrometry-based
proteomics, Proteomics 4 (2004) 3686-3703.
- Richard P, de Zulueta MP, Beucler I, De Gennes JL, Cassaigne A, Iron A, Identification of a new
apolipoprotein E variant (E2 Arg142-->Leu) in type III hyperlipidemia, Atherosclerosis. 112 (1995) 19-28.
- Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD, Complement: a key system for immune surveillance and
homeostasis, Nat. Immunol. 11 (2010) 785-97.

273
 Bibliografia

- Righetti PG, Boschetti E, Candiano G, Mark Twain: how to fathom the depth of your pet proteome, J.
Proteomics 75 (2012) 4783-4791.
- Righetti PG, Boschetti E, Lomas L, Citterio A, Protein Equalizer Technology : the quest for a "democratic
proteome", Proteomics 6 (2006) 3980-3992.
- Righetti PG, Castagna A, Antonioli P, Boschetti E, Prefractionation techniques in proteome analysis: the
mining tools of the third millennium, Electrophoresis 26 (2005a) 297-319.
- Righetti PG, Castagna A, Antonucci F, Piubelli C, Cecconi D, Campostrini N, Rustichelli C, Antonioli P,
Zanusso G, Monaco S, Lomas L, Boschetti E, Proteome analysis in the clinical chemistry laboratory: myth or
reality?, Clin. Chim. Acta. 357 (2005c) 123-139.
- Righetti PG, Castagna A, Herbert B, Candiano G, How to bring the "unseen" proteome to the limelight via
electrophoretic pre-fractionation techniques, Biosci. Rep. 25 (2005b) 3-17.
- Righetti PG, Castagna A, Herbert B, Reymond F, Rossier JS, Prefractionation techniques in proteome
analysis, Proteomics 3 (2003) 1397-1407.
- Righetti PG, Fasoli E, Boschetti E, Combinatorial peptide ligand libraries: the conquest of the 'hidden
proteome' advances at great strides, Electrophoresis 32 (2011) 960-966.
- Rindfleisch JA, Muller D, Diagnosis and management of Rheumatoir arthritis, American Family Physician 72
(2005) 1037-1047.
- Rioux JD, Abbas AK, Paths to understanding the genetic basis of autoimmune disease, Nature 435 (2005)
584-589.
- Robert L, Serum haptoglobin in clinical biochemistry: Change of a paradigm, Pathol. Biol. 13 (2013) 110-
117.
- Robinson AD, Boyden KN, Hendrickson SM, Muirden KD, Antitrypsin activity and enzyme inhibitors in the
rheumatoid joint, J. Rheumatol. 8 (1981) 547-554.
- Robinson WH, DiGennaro C, Hueber W, Haab BB, Kamachi M, Dean EJ, Fournel S, Fong D, Genovese MC,
de Vegvar HE, Skriner K, Hirschberg DL, Morris RI, Muller S, Pruijn GJ, van Venrooij WJ, Smolen JS, Brown
PO, Steinman L, Utz PJ, Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses,
Nat Med. 8 (2002) 295-301.
- Rodríguez C, Quero C, Domínguez A, Trigo M, Posada de la Paz M, Gelpi E, Abian J, Proteotyping of human
haptoglobin by MALDI-TOF profiling: Phenotype distribution in a population of toxic oil syndrome patients,
Proteomics 6 (2006) S272-S81.
- Romagnani P, Lasagni L, Annunziato F, Serio M, Romagnani S, CXC chemokines: the regulatory link
between inflammation and angiogenesis, Trends Immunol. 25 (2004) 201-209.
- Rose HM, Ragan C, Pearce E, Lipman MO, Differential agglutination of normal and sensitized sheep
erythrocytes by sera of patients with rheumatoid arthritis, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 68 (1948) 1-6.
- Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S,
et al: Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging
reagents, Mol. Cell Proteomics 3 (2004) 1154-1169.

274
 Bibliografia

- Rublee D, Opal SM, Schramm W, Keinecke HO, Knaub S. Quality of life effects of antithrombin III in sepsis
survivors: results from the KyberSept trial, Crit. Care. 6 (2002) 349-56.
- Ruiz-Montesinos M.D, Hernández-Cruz B, Ariza-Ariza R, Carmona L, Ballina J, Navarro-Sarabia F y Grupo
de estudio de Costes y Calidad de Vida en Artritis Reumatoide de la Sociedad Española de Reumatología,
Análisis de costes en una cohorte de enfermos con artritis reumatoide atendidos en área especializada de
reumatología en España, Reumatol. Clin. 4 (2005) 193-199.
- Sacre SM, Andreakos E, Taylor P, Feldmann M, Foxwell BM. Molecular therapeutic targets in rheumatoid
arthritis, Expert. Rev. Mol. Med. 7 (2005) 1-20.
- Sakaguchi S, Yamaguchi T, Nomura T, Ono M. Regulatory Tcells and immune tolerance, Cell (2008) 775-
787.
- Sakellariou G, Scirè CA, Zambon A, Caporali R, Montecucco C, Performance of the 2010 classification
criteria for rheumatoid arthritis: a systematic literature review and a meta-analysis, PLoS One. 8
(2013):e56528. doi: 10.1371/[Link].0056528.
- Salgado FJ, Canda-Sánchez A, Arias MP, Vázquez S, Nogueira M, Rheumatoid arthritis: present and future,
Nova Science Publisher, Inc. 42 (2012) 1-45.
- Salgado FJ, Vázquez S, Iglesias A, Pérez-Díaz A, Mera-Varela A, Arias P, Nogueira M, Application of
thiophilic chromatography to deplete serum immunoglobulins in sample preparation for bidimensional
electrophoresis Anal. Chim. Acta. 658 (2010) 18-31.
- Salvatore A, Cigliano L, Bucci EM, Corpillo D, Velasco S, Carlucci A, Pedone C, Abrescia P, Haptoglobin
binding to apolipoprotein A-I prevents damage from hydroxyl radicals on its stimulatory activity of the
enzyme lecithin-cholesterol acyl-transferase, Biochemistry 46 (2007) 11158-11168.
- Salvi R, Péclat V, So A, Busso N, Enhanced expression of genes involved in coagulation and fibrinolysis in
murine arthritis, Arthritis Res. 2 (2000) 504-512.
- San Miguel-Hernandez A, San Miguel R, Martín-Gil FJ, importancia de las aplicaciones clínicas de la
proteómica, Rev. Lab. Clin. 3 (2010) 40-48.
- Sánchez E, Orozco G, López-Nevot MA, Jiménez-Alonso J, Martín J, Polymorphisms of toll-like receptor 2
and 4 genes in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus, Tissue Antigens 63 (2004) 54-57.
- Sánchez E, Rueda B, Orozco G, Oliver J, Vilchez JR, Paco L, López-Nevot MA, Callejas JL, Sabio JM, Gómez-
Garcia M, Nieto A, Delgado M, Martín J, Analysis of a GT microsatellite in the promoter of the
foxp3/scurfin gene in autoimmune diseases, Hum. Immunol. 66 (2005) 869-873.
- Sandanayake NS, Sinclair J, Andreola F, Chapman MH, Xue A, Webster GJ, Clarkson A, Gill A, Norton ID,
Smith RC, Timms JF, Pereira SP, A combination of serum leucine-rich α-2-glycoprotein 1, CA19-9 and
interleukin-6 differentiate biliary tract cancer from benign biliary strictures, Br. J. Cancer. 105 (2011) 1370-
1378.
- Sanmartí R, Gómez-Puerta JA, Biomarcadores en la artritis reumatoide, Reumatol. Clin. 6 (2011) 25-28.
- Santiago M, Baron M, Miyachi K, Fritzler MJ, Abu-Hakima M, Leclercq S, Bell M, Hudson M, Mathieu JP,
Taillefer S, Jones N, Docherty P, Khraishi M, Markland J, Pope J, Robinson D, Smith D, Sutton E, A

275
 Bibliografia

comparison of the frequency of antibodies to cyclic citrullinated peptides using a third generation anti-CCP
assay (CCP3) in systemic sclerosis, primary biliary cirrhosis and rheumatoid arthritis, Clin. Rheumatol. 27
(2008) 77-83.
- Saraux A, Berthelot JM, Chalès G, Le Henaff C, Thorel JB, Hoang S, Valls I, Devauchelle V, Martin A, Baron
D, Pennec Y, Botton E, Mary JY, Le Goff P, Youinou P, Ability of the American College of Rheumatology
1987 criteria to predict rheumatoid arthritis in patients with early arthritis and classification of these
patients two years later, Arthritis Rheum. 44 (2001) 2485-2491.
- Saroha A, Biswas S, Chatterjee BP, Das HR, Altered glycosylation and expression of plasma alpha-1-acid
glycoprotein and haptoglobin in rheumatoid arthritis, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.
879 (2011) 1839-1843.
- Saroha A, Kumar S, Chatterjee BP, Das HR, Jacalin bound plasma O-glycoproteome and reduced sialylation
of alpha 2-HS glycoprotein (A2HSG) in rheumatoid arthritis patients, PLoS One. 7 (2012):e46374. doi:
10.1371/[Link].0046374.
- Sarrias MR, Roselló S, Sánchez-Barbero F, Sierra JM, Vila J, Yélamos J, Vives J, Casals C, Lozano F, A role for
human Sp alpha as a pattern recognition receptor, J. Biol. Chem. 280 (2005) 35391-35398.
- Sato H, Kazama JJ, Wada Y, Kuroda T, Narita I, Gejyo F, Gao P, Yamashita H, Decreased levels of circulating
alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein/Fetuin-A (AHSG) in patients with rheumatoid arthritis, Intern. Med.
46 (2007) 1685-1691.
- Sato K, Suematsu A, Okamoto K, Yamaguchi A, Morissita Y, Th17 functions as an osteoclastogenic helper T
cell subset that links T cell activation and bone destruction, J. Exp. Med. 203 (2006) 2673-2682.
- Saulot V, Vittecoq O, Charlionet R, Fardellone P, Lange C, Marvin L, Machour N, Le Loët X, Gilbert D, Tron
F. Presence of autoantibodies to the glycolytic enzyme alpha-enolase in sera from patients with early
rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum. 46 (2002) 1196-1201.
- Schamaun O, Olaisen B, Gedde-Dahl T, Teisberg P, Genetic studies of an apoA I lipoprotein variant, Hum.
Genet. 64 (1983) 380-383.
- Scher JU, Abramson SB, The microbiome and rheumatoid arthritis, Nat. Rev. Rheumatol. 7 (2011) 569-578.
- Schett G, Gravallese E, Bone erosion in rheumatoid arthritis: mechanisms, diagnosis and treatment, Nat.
Rev. Rheumatol. 8 (2012) 656-664.
- Schousboe I, b2-glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood
coagulation pathway, Blood 66 (1985) 1086-1091.
- Schroeder JT, Bieneman AP, Chichester KL, Hamilton RG, Xiao H, Saini SS, Liu MC, Decreases in human
dendritic cell-dependent T(H)2-like responses after acute in vivo IgE neutralization, J. Allergy Clin.
Immunol. 125 (2010) 896-901.
- Schulz M, Dotzlaw H, Mikkat S, Eggert M, Neeck G, Proteomic analysis of peripheral blood mononuclear
cells: selective protein processing observed in patients with rheumatoid arthritis, J. Proteome Res. 6
(2007) 3752-3759.

276
 Bibliografia

- Schulze-Koops H, Kalden JR, The balance of Th1/Th2 cytokines in rheumatoid arthritis, Best. Pract. Res.
Clin. Rheumatol. 15 (2001) 677-691.
- Scott DL, Prognostic factors in early rheumatoid arthritis, Rheumatology 39 (2000) 24-29.
- Scott DL, Wolfe F, Huizinga TW, Rheumatoid arthritis, Lancet. 376 (2010) 1094-1108.
- Seibert V, Ebert MP, Buschmann T, Advances in clinical cancer proteomics: SELDI-ToF-mass spectrometry
and biomarker discovery, Brief Funct. Genomic Proteomic 4 (2005) 16-26.
- Sekigawa I, Yanagida M, Iwabuchi K, Kaneda K, Kaneko H, Takasaki Y, Jung G, Sone S, Tanaka Y, Ogawa H,
Takamori K, Protein biomarker analysis by mass spectrometry in patients with rheumatoid arthritis
receiving anti-tumor necrosis factor-alpha antibody therapy, Clin Exp Rheumatol. 26 (2008) 261-267.
- Seldin MF, Amos CI, Ward R, Gregersen PK, The genetics revolution and the assault on rheumatoid
arthritis, Arthritis Rheum. 42 (1999) 1071-1079.
- Serada S, Fujimoto M, Ogata A, Terabe F, Hirano T, Iijima H, Shinzaki S, Nishikawa T, Ohkawara T, Iwahori
K, Ohguro N, Kishimoto T, Naka T, iTRAQ-based proteomic identification of leucine-rich alpha-2
glycoprotein as a novel inflammatory biomarker in autoimmune diseases, Ann. Rheum. Dis. 69 (2010) 770-
774.
- Serada S, Fujimoto M, Terabe F, Iijima H, Shinzaki S, Matsuzaki S, Ohkawara T, Nezu R, Nakajima S,
Kobayashi T, Plevy SE, Takehara T, Naka T, Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity
biomarker in ulcerative colitis, Inflamm. Bowel Dis. 18 (2012) 2169-2179.
- Seriolo B, Accardo S, Garnero A, Fasciolo D, Cutolo M, Anticardiolipin antibodies, free protein S levels and
thrombosis: a survey in a selected population of rheumatoid arthritis patients, Rheumatology 38 (1999)
675-678.
- Serpa JJ, Parker CE, Petrotchenko EV, Han J, Pan J, Borchers CH, Mass spectrometry-based structural
proteomics, Eur. J. Mass Spectrom 18 (2012) 251-267.
- Shahabi P, Siest G, Herbeth B, Ndiaye NC, Visvikis-Siest S, Clinical necessity of partitioning of human
plasma haptoglobin reference intervals by recently-discovered rs2000999, Clin. Chim. Acta. 413 (2012)
1618-1624.
- Shannan B, Seifert M, Boothman DA, Tilgen W, Reichrath J, Clusterin and DNA repair: a new function in
cancer for a key player in apoptosis and cell cycle control, J. Mol. Histol. 37 (2006) 183-188.
- Sheikh N, Abid R, Qureshi AW, Basheer T, Expression of Low Molecular Weight Proteinsin Patients with
Leukaemia, West Indian Med. J. 61 (2012) 235-239.
- Sherer Y, Shoenfeld Y, mechanisms of disease: atherosclerosis in autoimmune diseases, Nat. Clin. Pract.
Rheumatol. 2 (2006) 99-106.
- Shevchenko A, Tomas H, Vorm O, Havlis J, Olsen JV, Mann M, In-gel digestion for mass spectrometric
characterization of proteins and proteomes, Nat. Protoc. 1 (2006) 2856-2860.
- Shirai R, Gotou R, Hirano F, Ikeda K, Inoue S, Autologous extracellular cytochrome c is an endogenous
ligand for leucine-rich alpha2-glycoprotein and beta-type phospholipase A2 inhibitor, J. Biol. Chem. 285
(2010) 21607-21614.

277
 Bibliografia

- Shirai R, Hirano F, Ohkura N, Ikeda K, Inoue S, Up-regulation of the expression of leucine-rich alpha(2)-
glycoprotein in hepatocytes by the mediators of acute-phase response, Biochem. Biophys. Res. Commun.
382 (2009) 776-779.
- Sihlbom C, Kanmert I, Bahr Hv, Davidsson P, Evaluation of the combination of bead technology with SELDI-
TOF-MS and 2-D DIGE for detection of plasma proteins, J. Proteome 7 (2008) 4191-4198.
- Silman A, Bankhead C, Rowlingson B, Brennan P, Symmons D, Gatrell A, Do new cases of rheumatoid
arthritis cluster in time or in space?, Int. J. Epidemiol. 26 (1997) 628-634.
- Singh PP, Singh M, Mastana SS, APOE distribution in world populations with new data from India and the
UK, Ann Hum. Biol. 33 (2006) 279-308.
- Sinz A, Bantscheff M, Mikkat S, Ringel B, Drynda S, Kekow J, Thiesen HJ, Glocker MO, Mass spectrometric
proteome analyses of synovial fluids and plasmas from patients suffering from rheumatoid arthritis and
comparison to reactive arthritis or osteoarthritis, Electrophoresis 23 (2002) 3445-3456.
- Situnayake RD, Kitas G, Dyslipidemia and rheumatoid arthritis, Ann. Rheum. Dis. 56 (1997) 341-342.
- Skapenko A, Leipe J, Lipski PE, Schulze-Koops H, The role of the T cell in autoimmune inflammation,
Arthritis Res. Ther. 7 (2005) 4-14.
- Skriner K, Adolph K, Jungblut PR, Burmester GR, Association of citrullinated proteins with synovial
exosomes, Arthritis Rheum. 54 (2006) 3809-3814.
- Smith JB, Haynes MK, Rheumatoid arthritis a molecular understanding, Ann. Intern. Med. 136 (2002) 908-
922.
- Smith MA, Bains SK, Betts JC, Choy EH, Zanders ED, Use of two-dimensional gel electrophoresis to measure
changes in synovial fluid proteins from patients with rheumatoid arthritis treated with antibody to CD4,
Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (2001) 105-111.
- Smith PH, Khron RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM,
Olson BJ, Klenk DC, Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal. Biochem. 150 (1985) 76-85.
- Smolen JS, Steiner G, Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis, Nature Reviews Drug Discovery 2
(2003) 473-488.
- Snellman O, Sylvén B, Haptoglobin acting as a natural inhibitor of cathepsin B activity, Nature 216 (1967)
1033.
- Sokolove J, Brennan MJ, Sharpe O, Lahey LJ, Kao AH, Krishnan E, Edmundowicz D, Lepus CM, Wasko MC,
Robinson WH, Brief report: citrullination within the atherosclerotic plaque: a potential target for the anti-
citrullinated protein antibody response in rheumatoid arthritis, Arthritis Rheum. 65 (2013) 1719-1724.
- Sorensen K, Brodbeck U. Assessment of coating-efficiency in ELISA plates by direct protein determination,
J. Immunol. Methods. 95 (1986) 291-293.
- Sottrup-Jensen L, Alpha-macroglobulins: structure, shape, and mechanism of proteinase complex
formation. J. Biol. Chem. 264 (1989), 11539–11542.
- Spector TD, Rheumatoid arthritis, Rheum. Dis. Clin. North. Am. 16 (1990) 513-537.

278
 Bibliografia

- Stamenkovic I, Seed B, The B-cell antigen CD22 mediates monocyte and erythrocyte adhesion, Nature 345
(1990) 74-77.
- Steel LF, Trotter MG, Nakajima PB, Mattu TS, Gonye G, Block T: Efficient and specific removal of albumin
from human serum samples, Mol. Cell Proteomics 2 (2003) 262-270.
- Steinkasserer A, Estaller C, Weiss E,Sim RB, Complete nucleotide and deduced amino acid sequence of
human b2-glycoproteinI, Biochem. J. 277 (1991) 387-391.
- Steinman L, A brief history of TH17, the first major revision in the Th1/Th2 hypothesis of T cell–mediated
tissue damage, Nature Medicine 13 (2007) 139-145.
- Stevens RJ, Douglas KM, Saratzis AN, Kitas GD, Inflammation and atherosclerosis in rheumatoid arthritis,
Expert. Rev. Mol. Med. 7 (2005) 1-24.
- Stewart II, Thomson T, Figeys D, 18O labeling: a tool for proteomics, Rapid Commun. Mass Spectrom. 15
(2001) 2456-2465.
- Stinson JN, Luca NJ, Jibb LA, Assessment and management of pain in juvenile idiopathic arthritis, Pain Res.
Manag. 17 (2012) 391-396.
- Subramanian S, Dye-ligand affinity chromatography: the interaction of Cibacron Blue F3GA with proteins
and enzymes, CRC Crit. Rev. Biochem. 16(1984) 169-205.
- Suffredini AF, Fantuzzi G, Badolato R, Oppenheim JJ, O'Grady NP, New insights into the biology of the
acute phase response, J. Clin. Immunol. 19 (1999) 203-214.
- Sun D, Kar S, Carr BI, Differentially expressed genes in TGF-beta 1 sensitive and resistant human hepatoma
cells, Cancer Lett. 89 (1995) 73-79.
- Svendsen AJ, Kyvik KO, Houen G, Junker P, Christensen K, Christiansen L, Nielsen C, Skytthe A, Hjelmborg
JV, On the origin of rheumatoid arthritis: the impact of environment and genes a population based twin
study, PLoS One 8 (2013):e57304. doi: 10.1371/[Link].0057304.
- Svenson KL, Lithell H, Hällgren R, Vessby B, Serum lipoprotein in active rheumatoid arthritis and other
chronic inflammatory arthritides. II. Effects of anti-inflammatory and disease-modifying drug treatment,
Arch. Intern. Med. 147 (1987) 1917-1920.
- Swedlund HA, Hunder GG, Gleich GJ, Alpha 1-antitrypsin in serum and synovial fluid in rheumatoid
arthritis, Ann. Rheum. Dis. 33 (1974) 162-164.
- Szekanecz Z, Besenyei T, Paragh G, Koch AE, Angiogenesis in rheumatoid arthritis, Autoimmunity 42 (2009)
563-573.
- Tabb DL, McDonald WH, Yates JR, 3rd: DTASelect and Contrast: tools for assembling and comparing
protein identifications from shotgun proteomics, J Proteome Res. 1 (2002) 21-26.
- Tabushi Y, et al., Detection of citrullinated proteins in synovial fluids derived from patients with
rheumatoid arthritis by proteomics-based analysis, Ann. Clin. Biochem. 45 (2008) 413-417.
- Takagi K, Kin K, Itoh Y, Enomoto H, Kawai T, Human alpha 1-microglobulin levels in various body fluids, J.
Clin. Pathol. 33 (1980) 786-791.

279
 Bibliografia

- Takei N, Miyashita A, Tsukie T, Arai H, Asada T, Imagawa M, Shoji M, Higuchi S, Urakami K, Kimura H,
Kakita A, Takahashi H, Tsuji S, Kanazawa I, Ihara Y, Odani S, Kuwano R; Japanese Genetic Study Consortium
for Alzheimer Disease, Genetic association study on in and around the APOE in late-onset Alzheimer
disease in Japanese, Genomics 93 (2009) 441-448.
- Takeuchi T, Nakanishi T, Tabushi Y, Hata A, Shoda T, Kotani T, Shimizu A, Takubo T, Makino S, Hanafusa T,
Serum protein profile of rheumatoid arthritis treated with anti-TNF therapy (infliximab), J. Chromatogr. B.
Analyt. Technol. Biomed Life Sci. 855 (2007) 66-70.
- Tanaka K, Waki H, Ido Y, Akita S, Yoshida Y, Yoshida T, Protein and polymer analysis of up to m/z 100, 000
by laser ionization time-of-flight mass spectrometry, Rapid Commun, Mass Spectrom. 2 (1988) 151-153.
- Tang N, Tornatore P, Weinberger SR, Current developments in SELDI affinity technology, Mass Spectrom
Rev. 23 (2004) 34-44.
- Tang N, Tornatore P, Weinberger SR, Current developments in SELDI affinity technology, Mass Spectrom
Rev. 23 (2004) 34-44.
- Tang Y, Zhao L, Wang Y, Fawcett JP, Gu J, Rapid and sensitive liquid chromatography-tandem mass
spectrometry method for the quantitation of levodropropizine in human plasma, J. Chromatogr. B Analyt.
Technol. Biomed Life Sci. 819 (2005) 185-189.
- Tanimoto N, Kumon Y, Suehiro T, Ohkubo S, Ikeda Y, Nishiya K, Hashimoto K, Serum paraoxonase activity
decreases in rheumatoid arthritis, Life Sci. 72 (2003) 2877-2885.
- Taverna M, Marie AL, Mira JP, Guidet B, Specific antioxidant properties of human serum albumin, Ann
Intensive Care. 3 (2013) 4.
- Terpe K, Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial
systems, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 (2003) 523-533.
- Terracciano R, Gaspari M, Testa F, Pasqua L, Tagliaferri P, Cheng MM, Nijdam AJ, Petricoin EF, Liotta LA,
Cuda G, Ferrari M, Venuta S, Selective binding and enrichment for low-molecular weight biomarker
molecules in human plasma after exposure to nanoporous silica particles, Proteomics 6 (2006) 3243-3250.
- Thadikkaran L, Siegenthaler MA, Crettaz D, Queloz PA, et al., Recent advances in blood-related
proteomics, Proteomics 5 (2005) 3019-3034.
- Thiede B, Lamer S, Mattow J, Siejak F, Dimmler C, Rudel T, Jungblut PR, Analysis of missed cleavage sites,
tryptophan oxidation and N-terminal pyroglutamylation after in-gel tryptic digestion, Rapid Commun.
Mass Spectrom. 14 (2000) 496-502.
- Thongboonkerd V, PR, Unwin RJ, Schaub S, Nickerson P, Haubitz M, Mischak H, Nedelkov D, Kiernan UA,
Nelson RW. Proteomics of human urine, Capítulo 11, en: Proteomics of human body fluids: Principles,
methods, and applications. Edited by Visith Thongboonkerd, MD, FRCPT. Humana Press, Totowa, New
Jersey (2007). ISBN 978-1-58829-657-3.
- Thulasiraman V, Lin S, Gheorghiu L, Lathrop J, Lomas L, Hammond D, Boschetti E, Reduction of the
concentration difference of proteins in biological liquids using a library of combinatorial ligands,
Electrophoresis 26 (2005) 3561-71.

280
 Bibliografia

- Tirumalai RS, Chan KC, Prieto DA, Issaq HJ, Conrads TP, Veenstra TD, Characterization of the low molecular
weight human serum proteome, Mol. Cell Proteomics 2 (2003) 1096-1103.
- Tiselius A, Biochem. J. 31 (1937) 313-317.
- Tiss A, Smith C, Camuzeaux S, Kabir M, Gayther S, Menon U, Waterfield M, Timms J, Jacobs I, Cramer R,
Serum peptide profiling using MALDI mass spectrometry: avoiding the pitfalls of coated magnetic beads
using well-established ZipTip technology, Proteomics 7 (2007) 77-89.
- Toms TE, Smith JP, Panoulas VF, Blackmore H, Douglas KM, Kitas GD, Apolipoprotein E gene
polymorphisms are strong predictors of inflammation and dyslipidemia in rheumatoid arthritis, J.
Rheumatol. 39 (2012) 218-225.
- Tong Y, Ren W, Zhao H, Sun L, Zhao Z, Analysis of CD4(+);T cell subsets in peripheral blood of patients with
rheumatoid arthritis, Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 29 (2013) 854-857.
- Topic A, Juranic Z, Jelic S, Golubicic I, Polymorphism of alpha-1- antitrypsin in hematological malignancies,
Genet. Mol. Biol. 32 (2009) 716-719.
- Tornero J, Vidal J, Impacto social y económico de las enfermedades reumáticas: la discapacidad laboral,
Rev. Esp. Reumatol. 26 (1999) 357-366.
- Towbin H, Staehelin T, Gordon J, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (1979) 4350-4354.
- Trougakos IP, The Molecular Chaperone Apolipoprotein J/Clusterin as a Sensor of Oxidative Stress:
Implications in Therapeutic Approaches, Gerontology (2013).
- Tschopp J, French LE, Clusterin: modulation of complement function, Clin Exp Immunol. 97 (1994) 11-14.
- Tuerk C, Gold L, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage
T4 DNA polymerase, Science 249 (1990) 505-510.
- Turesson C, McClelland RL, Christianson TJ, Matteson EL, Severe extra-articular disease manifestations are
associated with an increased risk of first ever cardiovascular events in patients with rheumatoid arthritis,
Ann. Rheum. Dis. 66 (2007) 70-75.
- Turesson C, Wey CM, Matesson EL, Genetics of Rheumatoid arthritis: is there a pattern predicting extra-
articular manifestation?, Arthritis and rheum. 51 (2004) 853-862.
- Uchida T, Fukawa A, Uchida M, Fujita K, Saito K, Application of a novel protein biochip technology for
detection and identification of rheumatoid arthritis biomarkers in synovial fluid, J. Proteome Res. 1 (2002)
495-499.
- Udby L, Sørensen OE, Pass J, Johnsen AH, Behrendt N, Borregaard N, Kjeldsen L, Cysteine-rich secretory
protein 3 is a ligand of alpha1B-glycoprotein in human plasma, Biochemistry 43 (2004) 12877-12886.
- Uen YH, Lin KY, Sun DP, Liao CC, Hsieh MS, Huang YK, Chen YW, Huang PH, Chen WJ, Tai CC, Lee KW, Chen
YC, Lin CY, Comparative proteomics, network analysis and post-translational modification identification
reveal differential profiles of plasma Con A-bound glycoprotein biomarkers in gastric cancer, J. Proteomics.
83 (2013) 197-213.

281
 Bibliografia

- Umemura H, Togawa A, Sogawa K, Satoh M, Mogushi K, Nishimura M et al, Identification of a high

molecular weight kininogen fragment as a marker for early gastric cancer by serum proteome analysis, J.
Gastroenterol. 46 (2011) 577-585.
- Undas A, Gissel M, Kwasny-Krochin B, Gluszko P, Mann KG, Brummel-Ziedins KE, Thrombin generation in
rheumatoid arthritis: dependence on plasma factor composition, Thromb Haemost. 104 (2010) 224-230.
- Van Beers JJ, Schwarte CM, Stammen-Vogelzangs J, Oosterink E, Božič B, Pruijn GJ, The rheumatoid
arthritis synovial fluid citrullinome reveals novel citrullinated epitopes in apolipoprotein E, myeloid nuclear
differentiation antigen, and β-actin, Arthritis Rheum. 65 (2013) 69-80.
- Van den Bogaard B, Holleboom AG, Duivenvoorden R, Hutten BA, Kastelein JJ, Hovingh GK, Kuivenhoven
JA, Stroes ES, van den Born BJ, Patients with low HDL-cholesterol caused by mutations in LCAT have
increased arterial stiffness, Atherosclerosis. 225 (2012) 481-485.
- Van den Steen PE, Proost P, Grillet B, Brand DD, Kang AH, Van Damme J, Opdenakker G, Cleavage of
denatured natural collagen type II by neutrophil gelatinase B reveals enzyme specificity, post-translational
modifications in the substrate, and the formation of remnant epitopes in rheumatoid arthritis, FASEB J. 16
(2002) 379-389.
- Van der Heijde D, How to read radiographs according to the Shap/Van der Heijde method, J. Rheumatol.
27 (2000) 261-263.
- Van der Heijde D, Klareskog L, Singh A, Tornero J, Melo-Gomes J, Codreanu C et al. Patient reported,
outcomes in a trial of combination therapy with etanercept and methotrexate for rheumatoid arthritis:
the TEMPO trial, Ann. Rheum. Dis. 65 (2006) 328-334.
- Van der Helm-van Mil AH, Detert J, le Cessie S, Filer A, Bastian H, Burmester GR, Huizinga TW, Raza K,
Validation of a prediction rule for disease outcome in patients with recent-onset undifferentiated arthritis:
moving toward individualized treatment decision-making, Arthritis Rheum. 58 (2008) 2241-2247.
- Van Gaalen FA, Linn-Rasker SP, Van Venrooij WJ, De Jong BA, Breedveld FC, Verweij CL, et al.
Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with
undifferentiated arthritis: a prospective cohort study, Arthritis Rheum. 50 (2004) 709-715.
- Van Leeuwen MA, van Rijswijk MH, Sluiter WJ, van Riel PL, Kuper IH, van de Putte LB, Pepys MB, Limburg
PC, Individual relationship between progression of radiological damage and the acute phase response in
early rheumatoid arthritis. Towards development of a decision support system, J. Rheumatol. 24 (1997)
20-27.
- Van Linthoudt D, Gerster JC, Baker cyst calcifications in a patient with rheumatoid arthritis, J. Clin.
Rheumatol. 7 (2001) 203-205.
- Van Vlierberghe H, Langlois M, Delanghe J, Haptoglobin polymorphisms and iron homeostasis in health
and in disease, Clin. Chim. Acta. 345 (2004) 35-42.
- Vander Cruyssen B, Peene I, Cantaert T, Hoffman IE, De Rycke L, Veys EM, De Keyser F, Anti-citrullinated
protein/peptide antibodies (ACPA) in rheumatoid arthritis: specificity and relation with rheumatoid factor,
Autoimmun Rev. 4 (2005) 468-474.

282
 Bibliografia

- Van't Wout EF, van Schadewijk A, Savage ND, Stolk J, Hiemstra PS, α1-antitrypsin production by
proinflammatory and antiinflammatory macrophages and dendritic cells, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 46
(2012) 607-613.
- Vaudo G, Marchesi S, Gerli R, Allegrucci R, Giordano A, Siepi D, Pirro M, Shoenfeld Y, Schillaci G,
Mannarino E, Endothelial dysfunction in young patients with rheumatoid arthritis and low disease activity,
Ann. Rheum. Dis. 63 (2004) 31-35.
- Vázquez-Cobos J, Presente y futuro de la Proteómica, disponible en:
[Link]
- Vik DP, Wong WW, Structure of the gene for the F allele of complement receptor type 1 and sequence of
the coding region unique to the S allele, J. Immunol. 151 (1993) 6214-6224.
- Vincent C, Bouic P, Revillard JP, Bataille R, Complexes of alpha 1-microglobulin and monomeric IgA in
multiple myeloma and normal human sera, Mol. Immunol. 22 (1985) 663-673.
- Volanakis JE, Wirtz KWA, Interaction of C-reactive protein with artificial phosphatidylcholine bilayers,
Nature 281 (1979) 155-157.
- Vonkeman HE, van de Laar MA, The new European League Against Rheumatism/American College of
Rheumatology diagnostic criteria for rheumatoid arthritis: how are they performing?, Curr. Opin.
Rheumatol. 25 (2013) 354-359.
- Waaler E, On the occurrence of a factor in human serum activating the specific agglutination of sheep red
corpuscles, Acta Path. Microbiol. Scand.17 (1940) 172-178.
- Wahl SM, Hunt DA, Wong HL, Dougherty S, McCartney-Francis N, Wahl LM, Ellingsworth L, Schmidt JA, Hall
G, Roberts AB, Transforming growth factor-beta is a potent immunosuppressive agent that inhibits IL-1-
dependent lymphocyte proliferation, J. Immunol. 140 (1988) 3026-3032.
- Wallberg-Jonsson S, Ohman ML, Dahlqvist SR, Cardiovascular morbidity and mortality in patients with
seropositive rheumatoid arthritis in Northern Sweden, J. Rheumatol. 24 (1997) 445-451.
- Wang F, Chmil C, Pierce F, Ganapathy K, Gump BB, MacKenzie JA, Metchref Y, Bendinskas K, Immobilized
metal affinity chromatography and human serum proteomics, J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed.
Life Sci. 934 (2013) 26-33.
- Wang WB, Fan JM, Zhang XL, Xu J, Yao W, Serial expression analysis of liver regeneration-related genes in
rat regenerating liver, Mol. Biotechnol. 43 (2009) 221-231.
- Wang Y, Kinzie E, Berger FG, Lim SK & Baumann H, Haptoglobin, an inflammation-inducible plasma
protein, Redox. Rep. (2001) 379-385.
- Ward MM, Recent improvements in survival in patients with rheumatoid arthritis: better outcomes or
different study designs?, Arthritis Rheum. 44 (2001) 1467-1469.
- Washburn MP, Wolters D, Yates JR 3rd. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional
protein identification technology, Nat. Biotechnol. 19 (2001) 242-247.
- Wasserman AM, Diagnosis and management of rheumatoid arthritis, Am. Fam. Physician 84 (2011) 1245-
1252.

283
 Bibliografia

- Watson CJ, Ledwidge MT, Phelan D, Collier P, Byrne JC, Dunn MJ, McDonald KM, Baugh JA, Proteomic
analysis of coronary sinus serum reveals leucine-rich α2-glycoprotein as a novel biomarker of ventricular
dysfunction and heart failure, Circ. Heart Fail. 4 (2011) 188-197.
- Weiner HL, Induction and mechanism of action of transforming growth factor-beta-secreting Th3
regulatory cells, Immunol. Rev. 182 (2001) 207-214.
- Weiss W, Görg A, High-resolution two-dimensional electrophoresis, Methods Mol Biol. 564 (2009) 13-32.
- Weivoda S, Andersen JD, Skogen A, Schlievert PM, Fontana D, Schacker T, Tuite P, Dubinsky JM,
Jemmerson R, ELISA for human leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1 employing cytochrome c as capturing
ligand, J. Immunol. Methods 336 (2008) 22-29.
- Wejman JC, Hovsepian D, Wall JS, Hainfeld JF & Greer J, Structure and assembly of haptoglobin polymers
by electron microscopy, J. Mol. Biol. (1984) 343-368.
- Wester L, Michaëlsson E, Holmdahl R, Olofsson T, Akerström B, Receptor for alpha1-microglobulin on T
lymphocytes: inhibition of antigen-induced interleukin-2 production, Scand J. Immunol. 48 (1998) 1-7.
- Wheelock AM, Buckpitt AR, Software-induced variance in two-dimensional gel electrophoresis image
analysis, Electrophoresis 26 (2005) 4508-4520.
- White P, Cooke N, The multifunctional properties and characteristics of vitamin D-binding protein, Trends
Endocrino.l Metab. 11 (2000) 320-327.
- Wiernicki I, Safranow K, Baranowska-Bosiacka I, Piatek J, Gutowski P, Haptoglobin 2-1 phenotype predicts
rapid growth of abdominal aortic aneurysms, J. Vasc. Surg. 52 (2010) 691-696.
- Wilkins MR, Williams KL: Cross-species protein identification using amino acid composition, peptide mass
fingerprinting, isoelectric point and molecular mass: a theoretical evaluation, J. Theor. Biol. 186 (1997) 7-
15.
- Willems S, Vink A, Bot I, Quax PH, de Borst GJ, de Vries JP, van de Weg SM, Moll FL, Kuiper J, Kovanen PT,
de Kleijn DP, Hoefer IE, Pasterkamp G, Mast cells in human carotid atherosclerotic plaques are associated
with intraplaque microvessel density and the occurrence of future cardiovascular events, Eur Heart J.
(2013).
- Willemze A, Toes RE, Huizinga TW, Trouw LA, New biomarkers in rheumatoid arthritis, Neth. J. Med. 70
(2012) 392-399.
- Wolfe F, Van der Heijde D, Larsen A, Assessing radiographic status of rheumatoid arthritis: introduction of
a short erosion scale, J. Rheumatol. 27 (2000) 2090-2099.
- Wolters DA, Washburn MP, Yates JR 3rd, An automated multidimensional protein identification
technology for shotgun proteomics, Anal. Chem. 73 (2001) 5683-5690.
- Wong WW, Structural and functional correlation of the human complement receptor type 1, J. Invest.
Dermatol. 94 (1990) 64-67.
- Woolf AD, Pfleger B, Burden of major musculoskeletal conditions, Bull World Health Organ 81 (2003) 646-
656.

284
 Bibliografia

- Wu J, Xie X, Nie S, Buckanovich RJ, Lubman DM, Altered Expression of Sialylated Glycoproteins in Ovarian
Cancer Sera Using Lectin-based ELISA Assay and Quantitative Glycoproteomics Analysis, J. Proteome
Res.12 (2013) 3342-3352.
- Wu X, Shih F, Atkinson J, Systemic humoral autoimmunity but joint-specific inflammation: The syndrome
of rheumatoid arthritis, Arthritis and Rheumatism. 56 (2007a) 2823-2828.
- Wu Z, Wagner MA, Zheng L, Parks JS, Shy JM 3rd, Smith JD, Gogonea V, Hazen SL, The refined structure of
nascent HDL reveals a key functional domain for particle maturation and dysfunction, Nat. Struct. Mol.
Biol. 14 (2007b) 861-868.
- Wyatt AR, Constantinescua P, Ecroyda H, Dobsonb CM, Wilsona M, Kumita JR, Yerburya JJ, Protease-
activated alpha-2-macroglobulin can inhibit amyloid formation via two distinct mechanisms, FEBS 587
(2013) 398-403.
- Xie Q, Wang SC, Bian G, Zhan FL, Xie JK, Li J, Association of MIF-173G/C and MBL2 codon 54 gene
polymorphisms with rheumatoid arthritis: a meta-analysis, Hum. Immunol. 73 (2012):966-71. doi:
10.1016/[Link].2012.07.043.
- Yamamoto K, Genetic analyses of rheumatoid arthritis, Nihon Rinsho. 71 (2013a) 1155-1159.
- Yamamoto T, Cutaneous necrobiotic conditions associated with rheumatoid arthritis: important extra-
articular involvement, Mod. Rheumatol. 23 (2013b) 617-622.
- Yamamoto T, Skin manifestation associated with rheumatoid arthritis, J. Dermatol. 22 (2000) 324-329.
- Yanagida M, Jung G, Tanaka Y, Sone S, Fujishiro M, Ikeda K, Nozawa K, Kaneko H, Takasaki Y, Ogawa H,
Takamori K, Sekigawa I, Serum proteome analysis in patients with rheumatoid arthritis receiving therapy
with etanercept, a chimeric tumor necrosis factor-alpha receptor, Int. J. Rheum. Dis. 15 (2012) 486-495.
- Yilmaz S, Simsek I, Early intervention in the treatment of rheumatoid arthritis: focus on tocilizumab, Ther.
Clin. Risk. Manag. 9 (2013) 403-408.
- ymmons DP, Gabriel SE, Epidemiology of CVD in rheumatic disease, with a focus on RA and SLE, Nat Rev
Rheumatol. 7 (2011) 399-408.
- Young BJJ, Mallya RK, Leslie RDG, Clark CJM, Hamblin TJ, Antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis,
BMJ. 297 (1979) 97-99.
- Zendman AJ, van Venrooij WJ, Pruijn GJ, Use and significance of anti-CCP autoantibodies in rheumatoid
arthritis, Rheumatology 45 (2006) 20-25.
- Zhang H, Bai Z, Chen J, Wang Z, Li J, Alpha-fetoprotein-specific transfer factors downregulate alpha-
fetoprotein expression and specifically induce apoptosis in Bel7402 alpha-fetoprotein-positive
hepatocarcinoma cells, Hepatol. Res. 37 (2007) 557-567.
- Zhang H, Kong B, Qu X, Jia L, Deng B, Yang Q, Biomarker discovery for ovarian cancer using SELDI-TOF-MS,
Gynecol Oncol. 102 (2006) 61-66.
- Zhang N, Aebersold R, Schwikowski B: ProbID: a probabilistic algorithm to identify peptides through
sequence database searching using tandem mass spectral data, Proteomics 2 (2002) 1406-1412.

285
 Bibliografia

rd
- Zhang Y, Fonslow BR, Shan B, Baek MC, Yates JR 3 , Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics,
Chem. Rev. 1130 (2013) 2343-2394.
- Zheng X, Wu SL, Hincapie M, Hancock WS. Study of the human plasma proteome of rheumatoid arthritis, J.
Chromatogr. A. 1216 (2009) 3538-3545.
- Zhou M, Lucas DA, Chan KC, Issaq HJ, Petricoin EF 3rd, Liotta LA, Veenstra TD, Conrads TP, An investigation
into the human serum "interactome", Electrophoresis 25 (2004) 1289-1298.
- Zhu J, Yamane H, Paul WE, Differentiation of effector CD4 T cell populations, Annu. Rev. Immunol. 28
(2010) 445-489.
- Zlatanović G, Veselinović D, Cekić S, Zivković M, Dorđević-Jocić J, Zlatanović M, Ocular manifestation of
rheumatoid arthritis-different forms and frequency, Bosn. J. Basic Med. Sci. 10 (2010) 323-327.
- Zorina VN, Zorina RM, Trofimenko NA, Chirikova TS, Arkhipova SV, Zorin NA, Some proteins of acute phase
of inflammation in differential diagnostics of rheumatoid arthritis, Klin. Med. Mosk. 86 (2008) 58-61.
- Zürbig P, Jahn H, Use of proteomic methods in the analysis of human body fluids in Alzheimer research,
Electrophoresis 33 (2012) 3617-3630.

286
 Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31

Contents lists available at ScienceDirect

Analytica Chimica Acta

journal homepage: [Link]/locate/aca

Application of thiophilic chromatography to deplete serum immunoglobulins

in sample preparation for bidimensional electrophoresis夽
Francisco J. Salgado a,∗ , Sara Vázquez a , Alba Iglesias a , Amparo Pérez-Díaz a ,
Antonio Mera-Varela b , Pilar Arias a , Montserrat Nogueira a
a
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biological Research Centre of University of Santiago/CIBUS, University of Santiago de Compostela,
Lope Gómez de Marzoa, 15782 Santiago de Compostela, A Coruña, Spain
b
Rheumatology Service, Clinic University Hospital of Santiago (CHUS), Santiago de Compostela, A Coruña, Spain

a r t i c l e i n f o a b s t r a c t

Article history: Serum is a typical sample for non-invasive studies in clinical research. Its proteome characterization
Received 7 August 2009 is challenging, since requires extensive protein depletion. Methods used nowadays for removal of
Received in revised form 29 October 2009 high-abundance proteins are expensive or show quite often a low loading capacity, which has strong
Accepted 30 October 2009
repercussions on the number of samples and replicates per analysis.
Available online 13 November 2009
In order to deplete immunoglobulins (Igs) and albumin (HSA) from 1 mL serum samples, we have devel-
oped a protocol based on a combination of thiophilic chromatography, not previously used in clinical
Keywords:
proteomics, and a HSA-specific resin. Ig/HSA-depleted samples, immunoglobulinome and albuminone
Albumin
Depletion
were analyzed by 2-DE. Thiophilic chromatography, coupled with HSA-depletion, allows a good 2-DE
Immunoglobulin resolution as well as the visualization of new spots. Moreover, it yields enough protein to evaluate tech-
Serum nical variability and facilitate subsequent protein identification. To validate the protocol, we carried
Thiophilic chromatography out a preliminary comparative study between triplicate Igs/HSA-depleted serum samples from healthy
Bidimensional electrophoresis control individuals and recently diagnosed/untreated rheumatoid arthritis (RA) patients. RA patients
showed several acute phase proteins, as well as additional serum proteins, differentially and significantly
regulated.
Therefore, thiophilic chromatography can be used as an efficient and economical method in 2-DE to
deplete immunoglobulins from large human serum samples before a more extensive fractioning.
© 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

1. Introduction sequently, there is a renewed interest in identifying disease

biomarkers for diagnosis or in investigating the patient response
The emerging fields of proteomics and bioinformatics are to a therapy or the disease progression. Clinical proteomics refers
playing a vital role in many scientific disciplines as tools to to the application of those tools to investigate protein expression
discover molecular mechanisms behind different pathologies. Con- differences in pathological samples. Amongst the last ones, bio-
logical fluids provide clear advantages, like low invasiveness/cost
and easy sample collection/processing. At least in theory, by com-
paring proteins present in healthy and diseased fluid samples, it is
Abbreviations: A1AT, ␣1 antitrypsin; ACR, American College of Rheumatology; possible to identify the specific “proteomic signature” of a disease.
AHSG, ␣2-HS-glycoprotein; ATIII, antithrombin III; BSA, bovine serum albumin;
CCP, cyclic citrullinated peptide; CD5L, CD5 molecule-like Sp-alpha; CRP, C-reactive
Thus, body fluids proteomics has become a promising approach to
protein; CV, coefficient of variation; HDL, high density lipoprotein; Hp, hap- discover new biomarkers for human diseases [1,2].
toglobin; HSA, human serum albumin; IDL, intermediate density lipoprotein; Igs, Classical proteomics-based analysis separates, visualizes,
immunoglobulins; LRG, leucine rich ␣2 glycoprotein; MMP-3, matrix metallopro- identifies and quantifies most of the proteins present in biological
teinase; NRF, non-retained fractions; PON, paraoxonase; SAP, serum amyloid P
samples, and one of the most effective means to undertake this task
component; RA, rheumatoid arthritis; RF, retained fractions; SAA, serum amyloid
A protein; TN, tetranectin; VLDL, very low density lipoprotein; ZAG, zinc-␣-2- is to simplify the starting sample. This is particularly important
glycoprotein. for serum proteome characterization, because of the high dynamic
夽 Xunta de Galicia supported this research with grants PGIDIT04BTF2000014PR range of protein concentrations [1–8]. Different commercial
and PGIDIT05PXIB20001PR. Amparo Perez-Díaz was also a recipient of a grant from methods are available nowadays to eliminate immunoglobulins
the same institution.
∗ Corresponding author. Tel.: +34 981 563100x16936/16941; and albumin from serum samples, but most of them are expen-
fax: +34 981 596904. sive, require instruments not always available at the clinical lab
E-mail address: [Link]@[Link] (F.J. Salgado). or work with small sample volumes (5–180 ␮L; see Table 6 in

0003-2670/$ – see front matter © 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/[Link].2009.10.065
 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31 19

Table 1 disease detection seems crucial, since therapeutic intervention at

Conditions tested for sample preparation and 2-DE analysis.
the initial stages of this disease could be very positive in terms of
Samples Type of samples: serum from o/n fasting healthy obtaining a better disease outcome [11].
or RA caucasian donors; 40–60 years old. Time Current diagnosis of RA is based on rules like the 1987 Ameri-
for sampling: 9–10 a.m. Tubes: 3.5 mL BD
can College of Rheumatology (ACR) classification criteria. However,
Vacutainer® SSTTM II Advance (lot #526629C).
Inverted 5 times and clotting for 30 min (RT).
ACR criteria were developed to classify RA, not for diagnosis
Hemolytic samples discarded. Sample handling: [11]. For that reason, both determination of indicators of acute
4000 × g (15 min, 4 ◦ C) in a swing-head phase response, such as C-reactive protein/CRP or erythrocyte sed-
centrifuge. Protease inhibitor cocktail (BD) w/o imentation rate/ESR, and detection of antibodies against cyclic
AEBSF: added or not to serum. Cell debris
citrullinated peptides (anti-CCP) provide evidences for positive
elimination: 13,000 × g (15 min, 4 ◦ C).
Processing time: up to 1 h post-phlebotomy. RA diagnosis [11,12]. In addition, researchers have also shown:
Sample storage: 1 mL aliquots, −80 ◦ C, no (a) increased levels of pro-inflammatory cytokines like of IL-1,
longer than 4 weeks. Thawing once (2 h on ice). IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 or TNF␣ [13]; (b) negative acute
Igs-depletion: thiophilic chromatography/T-gel
phase reactants like albumin, apoA1, transthyretin, Gc-globulin,
(Pierce). HSA-depletion: immunoaffinity
anti-HSA resin (Sartorious).
␣2-HS-glycoprotein, ␣2-macroglobulin, ␣1B-glycoprotein, apoA1,
Concentration/desalting: Dialysis/acetone ApoA2 or apoA4 [14]; (c) positive acute phase proteins like C-
precipitation or Amicon Ultra-4 (Millipore). reactive protein/CRP, ␣1-antichymotrypsin, serum amyloid A/SAA,
2-DE IEF strips: ReadyStripTM IPG Strips pH 3–10 NL, haptoglobin/Hp, ceruloplasmin, or C3 proactivator [14,15]; (d)
17 cm (BioRad) and IPG Strips pH 4–7 NL or
modulation of proteases like sCD26 [16], matrix metallopro-
3–10 NL, 11 cm (GE Healthcare). Presence or
absence of thiourea in the rehydratation buffer. teinases (MMPs), gelatinase B or calgranulins [15]; (e) reduction
Buffer 1: 7 mol L−1 urea, 2 mol L−1 thiourea, 4% of tetranectin (TN) and paraoxonase (PON) levels or elevation of
CHAPS, 0.3% DTT, 0.5% Bio-lyte 3–10 IPG buffer, calcium binding proteins MRP8/MRP9 [15,17,18]. Unfortunately,
bromphenol blue; buffer 2: 8 mol L−1 urea, 2% the inspecificity of most of these proteins, the moderate sensitivity
CHAPS, 0.9% DTT, 1% Bio-lyte 3–10 IPG buffer,
bromphenol blue. IEF conditions (Protean IEF
(30–70%) of the anti-CCP test and the fact that most of potential
CellTM , BioRad): Active rehydratation (50 V, biomarkers are often low abundance proteins released by tis-
12 h, 20 ◦ C); with or without paper wicks after sues/cells is driving scientific community to look for RA-associated
rehydratation; focusing: 10,000 V, biomarkers by mean of serum proteomics.
60,000 V h−1 . Protein loading (IPG Strips pH
In this paper, we explored in the field of serum proteomics
3–10 NL, 17 cm). Silver staining: 50, 100 and
200 ␮g. Bio-Safe: 350, 750, 1000 and 1500 ␮g. a method based on thiophilic chromatography to remove most
Second dimension electrophoresis units: for IPG of immunoglobulin isotypes from high volumes of initial sample
Strips pH 3–10 NL (17 cm), Protean II XL 2-D (up to 1 mL). This protocol does not need special lab equipments
Cell, BioRad. For IPG Strips pH 4–7 NL (11 cm) and, combined with a rigorous experimental design and bioin-
or 3–10 NL (11 cm), Ettan DALT Six System.
Gels: continuous 12% SDS-PAGE,
formatic tools, allows researchers to create preparative 2-DE gels
20 cm × 20 cm × 0.15 cm (Protean II XL 2-D of depleted serum samples with a reasonable cost and reduced
Cell) or 26 cm × 20 cm × 0.15 cm (Ettan DALT technical variability. In order to provide additional data about the
Six System). Amperages and temperature. For method performance, the present paper also shows a prelimi-
Protean II XL 2-D Cell: 15–18 (∼24 h), 23
nary 2-DE analysis with triplicate Ig/HSA-depleted serum samples
(∼18 h) and 120 mA (∼3 h) at 4 ◦ C (cold room).
For Ettan DALT Six System: 85–90 mA (∼24 h) from early-diagnosed and untreated RA patients and age-matched
at 15 ◦ C (MultiTemp III cooling device). healthy control individuals. Our data describe a pattern of signif-
Staining: Bio-Safe Coomassie G-250 (BioRad), icantly deregulated serum proteins, many of them taking part in
Blue silver [21], Silver Stain Plus (BioRad). the well-known acute inflammatory response of RA. Thus, results
Bioinformatic tools 2-DE gel analysis: PDQuestTM version 7.4.0
(BioRad). Normalization methods tested: total
from this paper clearly demonstrate that future clinical serum stud-
quantity in analysis set, total quantity in valid ies can benefit from the application of T-gels for the purpose of
spots and total density in gel image. Statistic immunoglobulin depletion.
analysis: Mann–Whitney signed rank test.

2. Experimental
supplementary data). The last point is particularly relevant, since it
We carried out all analysis working on human serum samples
means that all the pre-analytical steps will be time consuming and
from healthy or RA Caucasian individuals. Conditions tested, like
the amount of sample rather limiting after the depletion of these
sample handling or storage, protein depletion, 2-DE, protein stain-
highly abundant proteins. Consequently, only a few samples with
ing, bioinformatic analysis, are summarized in Table 1. Section 2
a low number of replicates will be used and optimal bioinformatic
only describes optimal conditions.
or mass spectrometry (MS) analysis will not be achieved (e.g., the
intra- and inter-sample variability will be abnormally high or, more
often, poorly or none estimated) [9,10]. Thus, even though the aim 2.1. Serum sample collection
of a particular study is defined precisely, the above-mentioned
setbacks limit the generation of trustworthy data. We have selected for our analysis Caucasian individuals, with
RA is a common (prevalence of ∼1%) human systemic dis- an age range of 40–80 years. The USC Medical Service or the Clinic
ease that causes a persistent joint inflammation. This chronic University Hospital of Santiago (CHUS) Rheumatology Service (San-
disease is characterized by infiltration of reactive leukocytes able tiago de Compostela, Spain) took blood samples from fasting donors
to mount an intense immune response against own proteins, mak- by venipuncture, roughly at the same hour in the morning. It was
ing macrophage/fibroblasts generate the so-called “pannus” and used 3.5 mL tubes from the same lot (Vacutainer SST II Advance, BD,
secrete enzymes that degrade the extracellular matrix. Both aeti- Spain), that were rapidly processed. After 30 min, clotted blood was
ology and pathogenesis of RA are not fully understood, but the centrifuged at 4000 × g (15 min, 4 ◦ C) to collect serum. Then, follow-
autoimmune response results, in the long term, to cartilage/bone ing HUPO recommendations [19], an AEBSF-free protease inhibitor
destruction, joint damage and loss of function. Consequently, early cocktail (800 ␮g mL−1 benzamidine HCl, 500 ␮g mL−1 phenanthro-
20 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31

line,500 ␮g mL−1 aprotinin, 500 ␮g mL−1 leupeptin, 500 ␮g mL−1 side per gel. Electrophoresis was performed at constant tempera-
pepstatin A, 50 mmol L−1 PMSF; BD) was added, and samples were ture and amperage (for Protean II XL 2-D Cell in cold room at 4 ◦ C
centrifuged at 13,000 × g (15 min, 4 ◦ C). Finally, insoluble mate- and 15 mA; for Ettan DALT Six System at 15 ◦ C, using a MultiTemp III
rial was discarded and serum aliquots were made (1 mL per tube; cooling device from GE, and 85–90 mA) until the tracking dye was
1.5 mL tubes, Daslab® ) and rapidly stored at −80 ◦ C prior to use (up about to leak (∼23–24 h). Protein spots were visualized by either
to 4 weeks; short term storage). Bio-SafeTM Coomassie G-250 stain (BioRad; first part of the paper)
or colloidal Coomassie G-250 Blue silver [21] (2-DE of healthy and
2.2. Sample thawing and protein concentration quantification RA serum samples).

Serum samples, taken through only one freezing–thawing cycle, 2.5. Computer analysis of 2-DE gels
were thawed for 2 h on ice, and protein concentration was mea-
sured by BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, USA), yielding a Gels were digitized (ScanMaker 9800XL with transparency
concentration of 70–80 mg mL−1 . mode adapter TMA1600, Microtek; 300 dpi, 16-bit grey scale)
and analysis performed with PDQuestTM software, version 7.4.0
(BioRad). Briefly, images were edited and cropped, and initial
2.3. Proteome fractionation
spot detection was made with the “spot detection wizard” tool,
with Gaussian fitting and background subtraction. Raw, filtered
2.3.1. Igs depletion
and Gaussian images were generated, and spots manually edited.
T-GelTM purification kit (Pierce) was used to deplete Igs (IgG1,
Irregularly shaped spots (e.g., HSA) were defined using the “spot
IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, and IgA2) [20]. We selected four non-
boundary tool”. In the first part of the study, we generated three
retained fractions (NRF 1–4) and four retained fractions (RF 1–4)
matchset, each one consisting of nine gels (three healthy subjects,
according to the protein content (A280 ). All fractions (NRF and RF)
three replicates/each). We performed manual spot matching across
were desalted/concentrated using Amicon Ultra-4 devices (Milli-
all gels, and protein spots were automatically given a standard spot
pore Iberica, Spain) and either analyzed by 2-DE or stored at −80 ◦ C.
number (SSP). Spot intensity was calculated by integrating the opti-
cal density over the spot area, and normalized by expressing the
2.3.2. HSA depletion value as a proportion of the total intensity of valid spots. Inter- and
To remove albumin from T-GelTM NRF, we used 4 mL of Viva- intra-sample variability was analyzed by mean of the Scatter Plot
pure anti-HSA Affinity resin (Sartorius, Spain), mixed with 12 mg function in PDQuestTM , which provides correlation coefficients for
of T-gel NRF protein and incubated for 15 min (RT). Samples were matched gels, or exporting data to Microsoft Excel to calculate the
centrifuged (4000 × g, 5 min, 10 ◦ C) using a vivaspin 6 column spot intensity variability (measured as coefficient of variation/CV;
(0.2 ␮m, Sartorius). The spin-column was washed 5 times (bind- the SD calculated for the spot expressed as a percentage of the
ing buffer; 20 mmol L−1 Tris, 100 mmol L−1 NaCl), with inserted mean value). The second part of the study (analysis of differen-
centrifugations (4000 × g, 15 min, 10 ◦ C). All flow-through fractions tially expressed proteins in sera from 3 RA patients vs. sera from
(NRF) were collected and immunoaffinity performance followed 3 healthy donors) was performed in a similar way, although 18
at 280 nm. Retained protein (RF) was eluted from the resin by gel images were used in this case and only a single matchset with
washing four times with elution buffer (0.1 M glycine). Collected 2 classes (healthy and RA patients; 9 gels/each) was created. For
RF were neutralized with 1 mol L−1 Tris, and both NRF and RF the comparison of unpaired data and to test the null hypothesis
desalted/concentrated (Amicon Ultra-4, Millipore) to be either (H0 = two independent samples, healthy and RA, were drawn from
stored at −80 ◦ C or analyzed by 2-DE afterwards. the same population) we used non-parametric statistics. We chose
the Mann–Whitney signed rank test since this analysis does not
2.4. 2-DE assume anything about the underlying statistical distribution and
because of the reduced number of samples. Thus, using the analysis
Frozen serum samples (1 mg for 17 cm 3–10 NL IPG strips; set tool in PDQuestTM , a group of proteins, showing quantitative
0.5 mg for 11 cm 4–7 NL or 3–10 NL IPG strips), depleted or not (±2-fold) and statistically significant differences (P < 0.05) when
of HSA and/or Igs, were thawed (2 h on ice), diluted in rehydrata- comparing intensity of the spot in the control and the patient group,
tion buffer (7 mol L−1 urea, 2 mol L−1 thiourea, 4% CHAPS (w/v), was selected.
3% DTT (w/v), 0.5% of either Biolyte® 3/10 or IPG buffer pH 4–7,
and traces of bromophenol) and loaded in either 17 cm IPG strips 2.6. Tryptic digestion and MALDI-TOF analysis
(pH 3–10 NL, BioRad) or 11 cm IPG strips (pH 4–7 NL or 3–10
NL, GE Healthcare). Active hydration (PROTEAN IEF CellTM , BioRad, Protein spots were excised from gels and tryptic peptides
Spain) was carried out with rehydratation buffer containing serum prepared with Trypsin Gold (Promega) and In-Gel Digestzp kit (Mil-
proteins, at 50 V (12 h, 20 ◦ C). Then, wet wicks were placed and lipore), the last one with Zip 96-well C18 plates and zip-tips. Then,
voltage linearly increased up to 10,000 V. Samples were focused peptidic mixtures were analyzed with a Maldi-TOF mass spectrom-
for a total 60,000 V h at 20 ◦ C and stored at −80 ◦ C. Before the eter (Autoflex, Bruker), using CHCA (␣-cyano-4-hydroxy-cinnamic
second dimension, IPG strips were equilibrated in two steps: (1) acid) matrix, TOF analyzer, MCP (Micro Channel Plate) detector,
50 mmol L−1 Tris–HCl pH 8.8, 6 mol L−1 urea, 30% glycerol, 2% SDS SCOUT source and reflector acquisition operation mode. The mass
(w/v), traces of bromophenol blue, 1% DTT; 2 mL, 15 min, RT); (2) spectrometer was calibrated with tryptic peptides from actin and
the same buffer supplemented with 2.5% iodoacetamide instead of albumin as internal standards, and mass range measured with the
DTT (2 mL, 15 min, RT). Equilibrated IPG strips were sealed on top instrument was 800–4200 m/z. Mass data were searched by GPS
of 12% SDS-PAGE vertical gels using a melted 0.5% agarose solution Explorer Software with MASCOT (Matrix Science, London, UK; ver-
(50 mmol L−1 Tris, 0.1% (w/v) SDS, 192 mmol L−1 glycine and bro- sions 2.1 and 2.2) as the database search engine. The following
mophenol blue). Two vertical electrophoresis units were used: a search parameters were used: data base stringency to a specific
Protean II XL 2-D Cell (BioRad), with two 20 cm × 20 cm × 0.15 cm taxonomy Homo sapiens; mass tolerance, ±150 ppm; mass values,
gels and capacity for only one 17 cm IPG strip in each gel, and monoisotopic; protein mass, unrestricted; peptide charge state,
the Ettan DALT Six System (GE Healthcare), with capacity for six 1+; maximum number of missed cleavages, 1; fixed modifications,
26 cm × 20 cm × 0.15 cm gels and two 11 cm IPG strips run side by carbamidomethyl (C); variable modifications, oxidation (M). All
 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31 21

Fig. 1. Thiophilic gel chromatography is an efficient method to deplete immunoglobulins from human serum samples. Serum samples were obtained by venipuncture from
fasting healthy donors and prepared following the HUPO guidelines [19]. Sera (1 mL) were loaded in a T-gel column and four retained fractions (RF) and non-retained fractions
(NRF) collected, concentrated/desalted with Amicon Ultra-4 tubes and protein concentration evaluated by BCA. Then, 1 mg aliquots of initial serum (A), NRF (B) and RF (C;
immunoglobulinome) were separated according to their isolectric point (17 cm 3–10 NL IPG strips) and size (12% SDS-PAGE) by 2-DE (Protean II XL 2-D Cell, Bio-Rad), and
stained with Bio-SafeTM Colloidal Coomassie Blue G-250 (Bio-Rad). Gels were scanned with a ScanMaker 9800XL (Microtek). Serum albumin (HSA) and immunoglobulins (H,
heavy chains; L, light chains) are indicated. (C) T-gel RF proteins were identified according to Thadikkaran et al. [35] and MS; ␮, IgM heavy chains; ␥, IgG heavy chains; ␬–␭,
Ig light chains; ␮–s, IgM heavy chains, fragments of the constant part; ␣, IgA heavy chains.

proteins were searched across UniProt, MSDB and NCBI, and iden- of its simplicity, reproducibility, and sensitivity (∼5 ng/spot mea-
tification was only considered significant (p < 0.05) with MOWSE sured using serial dilutions of bovine serum albumin/BSA and 1-DE;
scores greater than the values given, a large number of peptides data not shown). Table 1 also summarizes all the conditions tested
matched for each protein, a large percentage of protein coverage for protein depletion, 2-DE and computer-assisted data evaluation.
and a low expectation value. Human serum analysis is especially complicated due to the pres-
ence of a few highly represented proteins, making difficult the
detection of less abundant species. The range of protein concentra-
3. Results tions in plasma fluctuates from mg mL−1 (e.g., albumin) to pg mL−1
(e.g., cytokines or proteins released into blood from tissues); this
3.1. T-gel chromatography is an efficient method to deplete means 10 orders of magnitude against only a range of detection of
inmunoglobulins from 1 mL serum samples prior to 2-DE up to 3 orders for 2-DE. Fig. 1A represents a typical 2-DE of unfrac-
tionated serum to illustrate how a handful of abundant serum
Serum is one of the most frequent samples in clinical research. proteins dominate the spectrum of detected proteins and hinder
Since serum contains proteases, degradation of proteins may con- the identification of minority species. The last ones are more likely
tinue ex vivo after sample collection. Therefore, a rigorous analysis to be useful as disease biomarkers, since come mainly from cell and
always needs to consider a number of variables that could alter the tissue “leaking”. Therefore, in order to get to this more interest-
protein content of serum. In our experiments, optimal sampling ing subproteome, we need to remove firstly the layer of abundant
conditions were chosen and serum samples obtained, stored and proteins.
handled always under the conditions described in Section 2. We Immunoglobulins and albumin account for >70% of total serum
evaluated several experimental parameters (Table 1), such as ionic proteins [1–8]. Amongst immunoglobulins, IgA (9–33 g L−1 ), IgG
strength, presence of thiourea in the rehydratation buffer, amper- (7.2–15 g L−1 ) and IgM (0.5–2.5 g L−1 ) are the major isotypes,
age, protein loading or performance of different staining protocols: while IgD (0–0.4 g L−1 ) and IgE (100–200 ␮g L−1 ) are less abun-
Bio-SafeTM Coomassie G-250 stain (BioRad), colloidal Coomassie dant classes. To deplete immunoglobulins (up to 20% of total serum
G-250 Blue silver [21], and silver-staining (BioRad). The Bio-SafeTM proteins), two kinds of protocols are available (see Table 6 in sup-
staining method was chosen for the first set of experiments because plementary data). The first ones are based on specific antibodies
22 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31

Table 2 Table 3
Protein yield of a representative Thiophilic-gel chromatography experiment.a . Protein yield of a representative HSA-affinity chromatography experiment.a .

Protein concentration Total protein (mg) Yield (%) Protein concentration Total protein Yield (%)
(mg mL−1 ) (mg mL−1 ) (mg)

Initial serum protein 56 56 100 Initial Igs-depleted 74.1 12.0 100

NFR 91.60 38.8 68.75 protein
RF 41 14.25 25.44 NFR 8.4 3.4 28.5
a
RF 18.6 7.3 60.5
Whole serum samples (1 mL) were loaded in a T-gel column and protein con-
a
centration of every collected fraction was monitored at 280 nm and subsequently 12 mg of Igs-depleted and concentrated/desalted serum samples were incu-
evaluated by BCA. NRF and RF refer to the protein recovered from pooled 1–4 flow bated with Vivapure anti-HSA Affinity resin. After several centrifugations two kind
through or retained fractions, respectively, after concentrating/desalting with Ami- of fractions, NRF (flow through) and RF (retained) fractions, were collected, moni-
con Ultra-4 tubes. tored at 280 nm, pooled and concentrated/desalted. Protein concentration of every
fraction was measured by BCA.

for IgG (sometimes even IgA or IgM), which are very efficient but
expensive and have a low loading capacity (up to 20–50 ␮L of
low unspecific binding and the possibility of processing large sam-
serum). The second class of protocols uses protein A, protein G or
ple volumes. Therefore, T-gel NRF samples were pooled, desalted,
protein A/G mixtures, which bind IgG strongly but move from weak
concentrated, quantified and incubated with this anti-HSA resin.
to null affinity regarding IgA, IgM or IgD. Traditionally, researchers
After centrifugation, both NRF and RF were collected and monitored
have applied thiophilic matrices (T-gels) for the purification of
at 280 nm. Table 3 shows data from a typical HSA-depletion exper-
immunoglobulins, under mild conditions, from serum, ascites or
iment, where ∼30% of the initial protein content was recovered as
tissue culture supernatants [20]. Thiophilic interaction chromatog-
NRF and ∼60% as RF. Therefore, our method was depleting most of
raphy is based on the capacity of some proteins to bind to a ligand
the albumin and samples were enriched approximately 4–5-fold,
that contains both a sulfone and a thioether group in the presence of
enhancing up to 3 orders of magnitude the range of detection for
salts that interact with water molecules, such as potassium sulfate
this technique and yielding enough amount of protein to carry out
or ammonium sulfate. T-gels have a broad isotype specificity and
several preparative 2-DE analyses.
strong binding to the three major immunoglobulin classes (IgA, IgG
As expected, 2-DE analysis of NRF (Fig. 2A) from HSA-affinity
and IgM), and to all the IgG subclasses (IgG1–IgG4). These proper-
chromatography put in evidence that removal of both Igs and albu-
ties, together with their high protein/gel loading ratio and binding
min yielded a better resolved protein pattern and an enrichment
capacity (1 mL serum; 20 mg of human IgG mL−1 of settled gel), high
of less abundant species. Moreover, even though albumin deple-
protein recovery and method simplicity, make T-gels optimal for
tion was not complete, it was highly specific (RF; Fig. 2B), since
2-DE in principle. To illustrate this idea, human serum was loaded
most of the retained proteins were identified as albumin or albu-
into affinity T-gel columns and, elution of non-retained (NRF) and
min related proteins/fragments; only a few additional proteins,
retained (RF) proteins, followed at 280 nm. The amount of protein
like ␣1-antitrypsin/A1AT (see MS data below), were captured by
within RF samples accounted for the 19–22% of all the recovered
the HSA-specific spin column. This means that immunoaffinity
protein (95–98% of loaded protein), as determined by BCA (Table 2).
chromatography was not removing potentially important proteins
Then, due to the sample dilution and the high potassium sulfate
from Igs-depleted samples, as described for alternative technolo-
concentration, filtration through Amicon Ultra-4 devices was nec-
gies such as Cibracron Blue-based kits [4]. Moreover, albumin and
essary to concentrate and desalt the Ig-depleted samples. Fig. 1B
Igs removal clearly facilitated the visualization of more spots previ-
shows a typical 2-DE gel of NRF, where both heavy (H) and light (L)
ously masked (Fig. 2C). As well, the same figure shows a full removal
immunoglobulin chains were fully depleted after T-gel chromatog-
of Igs heavy chains but still incomplete albumin depletion (MS anal-
raphy. In spite of this high specificity of T-gels for immunoglobulins,
ysis indicated the presence of HSA peptides in two spots; arrows in
thiophilic matrices also bind transferrins and ␣2-macroglobulins
Fig. 2C).
[20]. Indeed, 2-DE of RF (Fig. 1C) shows spots belonging mainly
to IgA, IgG and IgM, but also additional abundant proteins whose
identification by MS will be commented later on this paper. 3.3. Evaluation of intra-sample and inter-sample variability
When applying 2-DE to several samples, both biological
(interindividual variation) and technical variation (intraindividual As commented above, reproducibility is essential in order to
variation caused by sample preparation, fractioning, IEF, SDS-PAGE, detect differentially expressed proteins linked to the “molecular
2-DE software, etc.) affect to some extent the reproducibility of signature” of a disease (or a response to a therapy). Therefore, trip-
protein expression data, which is a major drawback to determine licate samples from nine healthy individuals were depleted of Igs
quantitative and significant changes. To overcome this obstacle, an and HSA and analyzed by 2-DE using a Protean II xi Cell (two sam-
important step in quantitative proteomics is the detailed compila- ples per run). Identical amounts of proteins (1.0 mg) were loaded
tion of expression data from replicated experiments, which allow in 2-DE gels and proteins stained with Bio-SafeTM Coomassie G-
us to determine the inherent biological and technical variation 250. We used the PDQuestTM software to remove background noise
[9,10,22]. Therefore, triplicate Ig-depleted sera from twelve healthy and create filtered and Gaussian representations of all experimental
donors were analyzed by 2-DE, and both intra- and inter-sample gels. To compare spot quantities between gels, normalization was
coefficients of correlation calculated using PD-Quest software. done selecting the total quantity in valid spots option. We gener-
Results (0.90 ± 0.02 and 0.88 ± 0.03, respectively) reflected good ated three matchsets, every one consisting of nine gels (three sera
values for both technical and biological variability. from healthy donors analyzed in triplicate), before detecting and
editing all the spots; we carried out a manual matching. In order
3.2. Albumin depletion by affinity chromatography to determine the intra-sample and inter-sample variability values,
we used the Scatter Plot tool. Thus, in spite of one of the major
Since human albumin (HSA) is the most abundant serum pro- criticisms is the reproducibility level in 2-DE [9], Table 4 shows a
tein (∼50–60% of total protein) an immunoaffinity protocol based high coefficient of correlation between the different pairs of sample
on an antibody fragment covalently coupled to agarose beads was replicates (0.90 ± 0.03) or between samples from different donors
selected due to its high albumin retention capacity (2 mg mL−1 ), (0.88 ± 0.01).
 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31 23

Fig. 2. Combination of thiophilic gel chromatography and HSA-specific immunoaffinity efficiently depletes immunoglobulins and HSA from human serum samples with
good reproducibility. Igs-depleted serum (NRF) from T-gel chromatography was quantified and incubated with an anti-HSA affinity resin. Igs/HSA-depleted samples were
recovered in a Vivaspin 6 spin column as four NRF. Then, the matrix was washed with elution buffer and four HSA-containing fractions (RF) collected. Protein content in NRF
and RF was measured once pooled and concentrated. (A and B) 2-DE experiments where Igs/HSA-depleted serum (NRF; A) or the albumin fraction (RF/albuminome; B) were
separated by 17 cm 3–10 NL IEF gradients and 12% SDS-PAGE (Protean II XL 2-D Cell, Bio-Rad). (C) An increase in the number (upper left table; determined using PDQuestTM
software) and intensity of protein spots (images), as compared with total serum, is observed in Igs- and, especially, Igs/HSA-depleted serum samples. Only two spots contain
albumin peptides after Igs/HSA-depletion (arrows in C). (A–C) proteins were detected with Bio-SafeTM Colloidal Coomassie Blue G-250 (Bio-Rad). (D) Variation in normalized
spot intensity between different gels calculated with data from donors #7, #8 and #9 (third matchset, Table 4). Data were exported to Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft,
Redmond, WA) and average intensity (mean), SD (standard deviation) and CV (SD/mean × 100) calculated for each spot. Figure shows frequency histograms for the resulting
distributions of intra-sample (donors #7, #8 or #9) and inter-sample (considering all the three donors) CVs, as well as the mean CV value ± SD and the number of spots under
study (n).
24 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31

Table 4 ily), A1AT (spot #5) and both apoA-I (spot #14) and apoA-IV (not
Intra- and inter-sample coefficients of correlation.
shown) were detected [23]. These results suggest the existence of
Group Samples (gels) Intra-sample coefficients of correlation albumin–A1AT–apoliprotein–AI/AIV complexes in serum.
1 Serum 1 (A–C) A–B: 0.89; B–C: 0.90; C–A: 0.87 However, we were especially interested in all the proteins
Serum 2 (A–C) A–B: 0.93; B–C: 0.87; C–A: 0.92 retained by T-gel columns, whose selectivity for IgG, IgM and IgA
Serum 3 (A–C) A–B: 0.90; B–C: 0.91; C–A: 0.90 (∼90% of protein bound to the resin) is not absolute. Indeed, it has
2 Serum 4 (A–C) A–B: 0.93; B–C: 0.85; C–A: 0.93 been described a competition between the highly abundant serum
Serum 5 (A–C) A–B: 0.94; B–C: 0.92; C–A: 0.90
immunoglobulins and other less prevalent serum proteins for the
Serum 6 (A–C) A–B: 0.88; B–C: 0.84; C–A: 0.88
3 Serum 7 (A–C) A–B: 0.95; B–C: 0.94; C–A: 0.93 matrix [20]. This competitive phenomenon explains the existence
Serum 8 (A–C) A–B: 0.90; B–C: 0.90; C–A: 0.91 within T-gel RF of proteins like complement factors C3 and B,
Serum 9 (A–C) A–B: 0.90; B–C: 0.93; C–A: 0.91 ␣2-macroglobulin, transferrin, ceruloplasmin, albumin, prealbu-
min/trasthyretin and A1AT [20]. We have also detected the same
Pairs of donors Inter-sample coefficients of
“contaminants” in our analysis (Fig. 3C), but also others not previ-
correlation
ously described like ApoA-I (spot #14), zinc-␣-2-glycoprotein/ZAG
Serum 1 vs Serum 2 0.89 (spot #50), retinol binding protein (spot #37), complement factors
Serum 2 vs Serum 3 0.91
Serum 1 vs Serum 3 0.85
C4b and Cr1 (spots #21 and #26, respectively), plasminogen (spot
Serum 4 vs Serum 5 0.84 #35), kininogen (spot #33) and the CD5 molecule-like Sp-alpha
Serum 5 vs Serum 6 0.88 (CD5L) (spot #22). Thus, even though immunoglobulins are the
Serum 4 vs Serum 6 0.88 main “target” of T-gels, proteins that interact with immunoglob-
Serum 7 vs Serum 8 0.91
ulins, such as complement factors (C3, B, C4b, Cr1), and other
Serum 8 vs Serum 9 0.90
Serum 7 vs Serum 9 0.88 abundant serum proteins, like albumin, transferrin, plasminogen
and ␣2-macroglobulin, are also removed from samples by T-gel
chromatography, which can be useful for a further enrichment
However, even having those satisfactory coefficients of corre- of serum samples in less abundant species. However, Fig. 3C also
lation, gel-to-gel variability could be unacceptable. Therefore, we shows other minor and unidentified spots in T-gel RF, underlining
used data from the third matchset (data group number 3) to ana- the importance of thoroughly examining these interactomes. Thus,
lyze the spot intensity variability in gels from the same or different the more proteins we identify within the immunoglobulinome (or
donors, although this time expressed as CV. As Fig. 2D shows, albuminome), the more potential the present protocol will have for
data variability had reasonably low values for donors #7, #8 and serum proteomics, especially because relevant proteins (and there-
#9 (35.1 ± 32.9%, 39.3 ± 27.9% and 39.5% ± 29.6%, respectively), and fore potential biomarkers) could be detected within those bound
was very similar to intra-sample CVs obtained by others (20–30%) fractions [23].
[9]. Most of the spots in these three donors have intra-sample CVs Removal of immunoglobulins and HSA from serum samples also
ranging from 0 to 50%, which means that <1.7-fold differences enhances the sensitivity to monitor the presence of mutations and
in intensity in a particular spot could be due to, basically, tech- posttranslational variants in many loci at once [24]. A typical exam-
nical aspects of our method, including image analysis [9,22]. On ple is Hp, a tetrameric glycoprotein composed of two light (␣) and
the other hand, inter-sample variation (Fig. 2D) was slightly higher two heavy (␤) chains connected by disulfide bonds. Hp polymor-
(49.1 ± 28.2%), since it depends on both the biological variation and phism lies in ␣-chains, whose gene presents three alleles: Hp1F
pre-, post- and analytical factors (39–47% according to Molloy et al. and Hp1S , which code for polypeptides of equal length differing
[9]). Thus, when all the valid spots were considered (n = 127), most in two aminoacids, and Hp2 , which generates a larger polypeptide
of them showed CV values between 0 and 100%, i.e., <2-fold differ- product. Thus, at least six Hp genotypes (Hp1F–1F , Hp1S–1S , Hp1F–1S ,
ences in spot intensity for a specific protein measured in samples Hp2–1F , Hp2–1S and Hp2–2 ) could arise [25]. Three spots were iden-
from different donors could be expected. tified as Hp2 chains in our 2-DE maps (Hp2␣ in Fig. 5A, additional),
and other three as Hp1 chains (spots #27 in Fig. 3A; indicated as
3.4. Identification of proteins by MS Hp1␣ in Fig. 5A, additional), allowing the detection of all the above
described genotypes. However, new variants for Hp2 (Hp2F and
As commented above, serum proteome analysis is hampered by Hp2S ) have also been found by others, so the number of genotypes
the presence of highly abundant proteins. Depletion of these highly is actually higher; on this regard, we came across as well an alter-
abundant proteins is essential to have access to under represented native acidic allele for Hp2 with the same molecular weight and
species, but the depletion procedure itself may remove also low present in all triplicates from donor 15 (Fig. 5A, additional).
abundance and important proteins. Hence, there is always a need Several polymorphic proteins can be easily detected after
to analyze the protein composition of both the retained and the Ig/HSA-depletion in other 2-DE map regions (Fig. 3A; Fig. 5B,
flow-through fractions. For this reason, Mass Spectrometry (Fig. 3 additional): ␣1-anti-trypsin (spot #5), ␣2-HS glycoprotein/AHSG
and Table 5) and PMF were used to identify the most remarkable (spot #9), gc-globulin/vitamin D binding protein (spots #6 and
spots from 2-DE gels with high MOWSE scores, good sequence cov- #49), anti-thrombin III (spot #13) and apolipoproteins. AHSG
erage and low expectation values; we used comparison with spots genetic polymorphism has two common alleles detected in our
shown in the Swiss-2D database ([Link] in study, AHSG*1 (Thr230, Thr 238) and AHSG*2 (Met230, Ser238)
same cases. [24,26]. Donors S14 and S11 exhibit a heterozygote phenotype
After HSA/Igs-depletion, proteins not initially detected in whole AHSG*1/AHSG*2, while donor S10 is homozygote AHSG*1 (Fig. 3A;
serum samples, like ␣1-microglobulin (spot #12), serum amyloid Fig. 5B, additional). On the other hand, removal of IgA ␣ chain
P/SAP protein (spot #38), leucine-rich ␣2-glycoprotein (spot #34), by thiophilic chromatography (spot #30 in Fig. 3C) facilitates the
␤2-glycoprotein/apoH (spot #18) or complement factor B (spot detection of antithrombin III (ATIII; spot #13 in Fig. 3 and Fig. 5B,
#25) (Fig. 3A), were now identified. As Fig. 3B shows, the anti-HSA additional), an inhibitor of blood coagulation with posttransla-
affinity resin was very specific, since apart from albumin (spots tional (ATIII-␣ and ATIII-␤) [27] and genetic variants. As well, up
#2) and a shorter splicing variant called ALB protein (growth- to four spots (#6 and #49) were identified as vitamin D binding
inhibiting protein 20; spots #3), only human alpha-fetoprotein protein (gc-globulin) in the same region, although spot #6 also
(spots #10; coded by a different gene within the albumin fam- presented peptides from A1AT (Table 5). There are three allelic
 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31 25

MS analysis of protein spots detected by 2-DE.

Table 5
26 Table 5 (Continued) F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31
 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31 27

Table 5 (Continued)
28 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31

Fig. 3. 2-DE pattern and protein spots identification after removal of Igs and HSA. Upon T-gel and HSA-specific chromatography, either Ig/HSA depleted samples (A; 0.5 mg) or
anti-HSA column RF (B, albuminome; 0.5 mg) were subjected to IEF using 11 cm IPG-strips pH 4–7 NL for the first dimension. Second dimension was carried out on a 12% SDS-
PAGE vertical gel using the Ettan DALT Six Electrophoresis System, where two IPG-strips were run at a time in every wide format 2-DE gel. Proteins spots were visualized with
Blue silver staining. (C) 2-DE experiment showing the identification of those serum proteins retained by the T-gel column (immunoglobulinome). The following experimental
conditions were used: 1 mg of protein, 17 cm IPG-strips pH 4–10 NL, 12% SDS-PAGE, Protean II XL 2-D Cell, and Bio-SafeTM Coomassie staining. (A–C) Representative gels
are shown. Spots were excised and subjected to tryptic digestion for MS analysis, and proteins identified by peptide mass fingerprinting using the Mascot software (Matrix
Science, London, UK) as described in Section 2. All the spot numbers in figure match the ones listed in Table 5. Abbreviations: ␮, IgM heavy chains; ␥, IgG heavy chains; ␬–␭,
Ig light chains; ␮–s, IgM heavy chains, fragments of the constant part [35].

variants for gc-globulin: Gc1s, Gc1f and Gc2. Their close pI values polymorphism is only detectable at a protein level by isoelectric
does not allow to distinguish between Gc1s (pI = 4.84–4.94) and focusing followed by immunoblotting [29] because of its concen-
Gc1f (pI = 4.85–4.95), but the presence of a basic shifted pattern in tration in serum (∼0.2 mg mL−1 ) and the presence of IgG heavy
the Gc2 allele (pI = 5.1) make that Gc1/Gc1, Gc1/Gc2 and Gc2/Gc2 chains partially masking the ApoH region (Fig. 1A). Immunoglobu-
genotypes can be readily detected by 2-DE [28]. Finally, the most lins and albumin removal facilitates apoH detection by 2-DE, which
important apolipoproteins detected in our gels were apoA-I (high migrates as four–five major bands that shift from the most acidic
density lipoproteins/HDL, chylomicrons), apoA-IV (chylomicrons), to the most basic regions depending of the allele detected (ApoH*1,
apoC-II (very low density lipoproteins/VLDL and HDL), apoE (VLDL, ApoH*2 or ApoH*3, respectively). Due to the high allelic frequency
chylomicron remnants and intermediate density lipoproteins/IDL), of ApoH*2 allele (∼0.9) [29], almost all individuals in our study
apoJ (clusterin) and ApoH. Several apolipoproteins have two or were ApoH*2-2, but both ApoH*2-3 and ApoH*3-3 patterns were
more isoforms; for example, apoE (E3, E4 and E2), apoA-IV (variants also observed (Fig. 3A, ApoH*3-3 phenotype; Fig. 5C, additional,
0, 1, 2 and 3) or ApoH (␤2-glycoprotein I; Fig. 5C, additional). ApoH different phenotypes).
 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31 29

Fig. 4. Comparative study in levels of serum proteins from patients with rheumatoid arthritis. Triplicate samples from either Ig/HSA-depleted RA sera (n = 3) or Ig/HSA-depleted
healthy donors sera (n = 3) were analyzed by 2-DE. First dimension was carried out using 11 cm IPG-strips pH 4–7, and second dimension was run in an Ettan DALT Six Elec-
trophoresis System. To enhance comparability, two samples (one from a RA patient and one from a healthy donor) were paired in each wide format (26 cm × 20 cm × 0.15 cm)
2-DE gel (i.e., 12 samples per run; 9 gels in total), and Blue silver staining was used instead of Bio-SafeTM Coomassie (Bio-Rad) to enhance protein detection sensitivity.
Bioinformatic analysis was done with PDQuestTM software (BioRad), and one MachSet with two classes (healthy vs. patients) created. (A) Scatter plot, log scale; the intensity
of each spot in healthy donors (X-axis) has been plotted against the intensity in RA patients. (B) Master gel showing all the spots found in the MatchSet. Circles indicate those
proteins with at least ±2-fold quantitative and significant (Mann–Whitney, 95%) differences. Protein numbers correspond with those in figure and Table 5.

3.5. Comparison of the serum levels of proteins in early diagnosed 4. Discussion

RA patients and healthy donors
The high dynamic range of serum proteome makes difficult the
Finally, we compared baseline levels of serum proteins in three efficient identification and quantification of all its constituents. For
recently diagnosed and untreated RA patients with levels in three this reason, one topic of modern proteomics is the depletion of
age-matched normal donors using Ig/HSA-depleted samples and abundant proteins from biological fluids [3–8]. This paper describes
2-DE. Table 7 (supplementary data) summarizes the clinical param- a protocol capable of depleting Ig and HSA from large serum vol-
eters of all RA patients involved in this study. To reduce the degree umes with low sample manipulation. During the first part of the
of technical variation, we used the Ettan DALT Six Electrophoresis work, we have obtained data pointing out that the present pro-
System combined with Blue silver staining to visualize the protein tocol is reproducible. Precision improved slightly after running
patterns [21]. Besides, since very few proteins migrate below pH 4 up to twelve samples at a time, which was facilitated by this
or above pH 7, proteins were separated in IPG-strips ranging from fractioning method that works with 1 mL serum sample volumes.
pH 4 to 7. In addition, we used 11 cm IPG-strips in order to place two Reproducibility of thiophilic chromatography, in combination with
(normal serum sample vs. RA serum sample) in every wide format HSA immunoaffinity, allowed us to detect the well-documented
2-DE gel (i.e., 12 samples per run). Samples from each donor were acute phase response in RA serum samples from early-diagnosed
run in triplicate, and intra- and inter-sample variability determined patients, which gives validity to the depletion method. Thus, ␣2HS-
again. Fig. 4A (scatter plot; healthy donors vs. RA donors) nicely glycoprotein, TN, A1AT, transthyretin, retinol binding protein and
illustrates how, apart from the significant saving in the amount albumin have been reported as negative acute phase response pro-
of work and time, this approach showed slightly improved intra- teins in RA [14,15,17,30,31], while Hp has been presented as a
sample and inter-sample coefficients of correlation as compared positive acute phase protein in patients suffering from RA [14].
with data previously obtained using the Protean II xi Cell (Table 4). Besides, the above described proteins are included in a more com-
To test the null hypothesis of unchanged protein concentra- plex pattern where proteins like apoA1, Gc-globulin/vitamin D
tion (mean ± SD) between RA and healthy donors, we submitted binding protein, ␣2-macroglobulin, ␣1B-glycoprotein, apoA4, apoE
results to Mann–Whitney signed rank test (95% confidence level) or C1s are downmodulated, and fibrinogen, ␣1-antichymotrypsin,
using the statistical analysis set option within the PDQuestTM ceruloplasmin, serum amyloid A or C3 proactivator are upregu-
program. Results, summarized in Table 5 and Fig. 4B (see also lated. This acute phase response is dependent on the increased
Fig. 6 and Table 8, both in supplementary data), show twenty production by APCs of proinflammatory cytokines (IL-1, IL-6, TNF␣
spots significantly (p ≤ 0.05) downregulated, which correspond to or IL-12) [13]. It helps the body to opsonize and phagocyte cer-
proteins like albumin, A1AT, ␣2 -HS-glycoprotein, antithrombin III, tain macromolecules coming from the damaged tissue (e.g., CRP
hemopexin, retinol binding protein, TN, transthyretin and sev- or complement factors), inhibit proteolitic enzymes (e.g., A1AT
eral unknown proteins. On the contrary, seven spots, belonging and ␣1-antichymotrypsin), capture free haemoglobin molecules
to proteins like Hp ␤ chain or leucine rich ␣2 glycoprotein, were (e.g., Hp or hemopexin), regulate fibrinolysis (e.g., TN) or provide
significantly (p ≤ 0.05) upregulated in RA patients. all the aminoacids necessary for protein synthesis (e.g., albumin
30 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31

and transthyretin), amongst others still unknown (e.g., ␣2HS- Appendix A. Supplementary data
glycoprotein).
According to our own inter-sample variation results (subsec- Supplementary data associated with this article can be found, in
tion 3.3.; CV = 49.1 ± 28.2%), and data reported by Molloy et al. [9], the online version, at doi:10.1016/[Link].2009.10.065.
a sample size of 3–4 could be sufficient to detect a 2-fold change
with a 0.05 p-value and 80% statistical power. Therefore, there is in References
our study a reasonable statistical confidence level to show quan-
titative differences in RA patients for proteins like LRG or retinol [1] S. Hu, J.A. Loo, D.T. Wong, Human body fluid proteome analysis, Proteomics 6
binding protein, with ratios of 2.66–3.94 and 0.38-fold, respec- (2006) 6326–6353.
[2] J.M. Jacobs, J.N. Adkins, W.-J. Qian, T. Liu, Y. Shen, R.D. Smith, Utilizing human
tively (Table 8, supplementary data). However, we would like to
blood plasma for protein biomarker discovery, J. Proteome Res. 4 (2005)
underline that our major aim was not the identification of differen- 1073–1085.
tially expressed proteins in RA patients at this stage, but to prove [3] V. Faca, S. Pitteri, L. Newcomb, V. Glukhova, D. Phanstiel, A. Krasnoselsky, Q.
Zhang, J. Struthers, H. Wang, J. Eng, M. Fitzgibbon, M. McIntosh, S. Hanash,
that the protocol is suited for very simple and robust quantitative
Contribution of protein fractionation to depth of analysis of the serum and
proteomic studies, especially when infrastructure (e.g., HPLC) or plasma proteomes, J. Proteome Res. 6 (2007) 3558–3565.
budget are limiting factors. Therefore, we should take data con- [4] D. Hinerfeld, D. Innamorati, J. Pirro, S.W. Tam, Serum/Plasma depletion with
cerning the differential abundance of LRG, ATIII or retinol binding chicken immunoglobulin Y antibodies for proteomic analysis from multiple
Mammalian species, J. Biomol. Tech. 15 (2004) 184–190.
protein as preliminary. In addition, quantitative, but not signifi- [5] A. Ettorre, C. Rösli, M. Silacci, S. Brack, G. McCombie, R. Knochenmuss, G. Elia,
cant differences for proteins like transferrin, ApoA1, SAP or ␣1 D. Neri, Recombinant antibodies for the depletion of abundant proteins from
microglobulin (data not shown), also wait for confirmation. A much human serum, Proteomics 6 (2006) 4496–4505.
[6] R. Pieper, C.L. Gatlin, A.J. Makusky, P.S. Russo, C.R. Schatz, S.S. Miller, Q. Su, A.M.
broader study, still in progress, does yield statistically significant McGrath, M.A. Estock, P.P. Parmar, M. Zhao, S.T. Huang, J. Zhou, F. Wang, R.
differences in most of those proteins (e.g., LRG, ATIII or ApoA1). Esquer-Blasco, N.L. Anderson, J. Taylor, S. Steiner, The human serum proteome:
Leucine rich ␣2 glycoprotein (LRG) is an acute phase serum gly- display of nearly 3700 chromatographically separated protein spots on two-
dimensional electrophoresis gels and identification of 325 distinct proteins,
coprotein produced by liver cells and neutrophils. Bacterial (toxic Proteomics 3 (2003) 1345–1364.
shock syndrome) and viral (HIV) infections as well as some kind of [7] J. Brand, T. Haslberger, W. Zolg, G. Pestlin, S. Palme, Depletion efficiency and
cancers generate increased LRG levels, while patients with inflam- recovery of trace markers from a multiparameter immunodepletion column,
Proteomics 6 (2006) 3236–3242.
matory arthritis have normal LRG concentrations [32]. Our data,
[8] H.L. Huang, T. Stasyk, S. Morandell, M. Mogg, M. Schreiber, I. Feuerstein,
instead, show that LRG is significantly upregulated in RA patients, C.W. Huck, G. Stecher, G.K. Bonn, L.A. Huber, Enrichment of low-abundant
but its biological function is still unknown. serum proteins by albumin/immunoglobulin G immunoaffinity depletion
under partly denaturing conditions, Electrophoresis 26 (2005) 2843–2849.
Finally, antithrombin III (ATIII) is a single chain glycoprotein
[9] M.P. Molloy, E.E. Brzezinski, J. Hang, M.T. McDowell, R.A. VanBogelen, Over-
synthesized by liver, and the main inhibitor of thrombin and blood coming technical variation and biological variation in quantitative proteomics,
coagulation factors, like Xa, IXa, XIa or XIIa. ATIII deficiency results Proteomics 3 (2003) 1912–1919.
in an increased risk of venous thromboembolism, which fits with [10] G.H. Horgan, Sample size and replication in 2D gel electrophoresis studies, J.
Proteome Res. 6 (2007) 2884–2887.
the higher rates of coagulation activity and venous and/or arte- [11] H. Visser, Early diagnosis of rheumatoid arthritis, Best Pract. Res. Clin. Rheuma-
rial thrombosis in RA patients. Therefore, reduced levels of both tol. 19 (2005) 55–72.
ATIII (our data) and TN (our data and [17]), involved in plasmino- [12] W.J. van Venrooij, J.J. van Beers, G.J. Pruijn, Anti-CCP antibody, a marker for the
early detection of rheumatoid arthritis, Ann. N. Acad. Sci. 1143 (2008) 268–285.
gen activation and clot destruction, may give rise to the described [13] S.M. Sacre, E. Andreakos, P. Taylor, M. Feldmann, B.M. Foxwell, Molecular ther-
imbalance between procoagulatory and anticoagulatory activities. apeutic targets in rheumatoid arthritis, Expert Rev. Mol. Med. 7 (2005) 1–20.
Contrary to our data, Seriolo et al. found ATIII in the normal range [14] N.S. Doherty, B.H. Littman, K. Reilly, A.C. Swindell, J.M. Buss, N.L. Anderson,
Analysis of changes in acute-phase plasma proteins in an acute inflammatory
[33], while Jones et al. [34] detected increased levels in RA patients. response and in rheumatoid arthritis using two-dimensional electrophoresis,
Electrophoresis 19 (1998) 355–363.
[15] E. Camafeita, J.R. Lamas, E. Calvo, J.A. López, B. Fernández-Gutiérrez, Pro-
teomics: new insights into rheumatic diseases, Proteomics Clin. Appl. 3 (2009)
5. Conclusions
226–241.
[16] O.J. Cordero, F.J. Salgado, A. Mera, M. Nogueira, Serum interleukin-12,
This work shows that T gel chromatography can be used in com- interleukin-15, soluble CD26, and adenosine deaminase levels in the sera of
rheumatoid arthritis patients, Rheumatol. Int. 21 (2001) 69–74.
bination with anti-HSA spin columns to enhance the detection of
[17] E.F. Kamper, L.T. Kopeikina, P. Trontzas, N.C. Kyriazis, G. Vaiopoulos, J. Stavridis,
less abundant serum proteins in order to search the serum pro- Comparative study of tetranectin levels in serum and synovial fluid of patients
teome for the “molecular signature” of certain pathologies. The with rheumatoid arthritis, seronegative spondylarthritis and osteoarthritis,
main benefits of this new protocol are its high loading capac- Clin. Rheumatol. 17 (1998) 318–324.
[18] A. Isik, S.S. Koca, B. Ustundag, H. Celik, A. Yildirim, Paraoxonase and arylesterase
ity (1 mL serum sample), simplicity, minimal sample preparation, levels in rheumatoid arthritis, Clin. Rheumatol. 26 (2007) 342–348.
good technical reproducibility, low cost and rapid analysis time. [19] A.J. Rai, C.A. Gelfand, B.C. Haywood, D.J. Warunek, J. Yi, M.D. Schuchard, R.J.
Therefore, this efficient prefractioning strategy is suited for a Mehigh, S.L. Cockrill, G.B.I. Scott, H. Tammen, P. Schulz-Knappe, D.W. Speicher,
F. Vitzhum, B.B. Haab, G. Siest, D.W. Chan, HUPO plasma proteome project spec-
first screening of quantitative and/or qualitative differences in imen collection and handling: towards the standardization of parameters for
serum/plasma samples of almost any clinical lab. Further stud- plasma proteome samples, Proteomics 5 (2005) 1–16.
ies headed for describing all the proteins retained by the T-gel [20] J. Hardouin, M. Duchateau, L. Canele, C. Vlieghe, R. Joubert-Caron, M. Caron,
Thiophilic adsorption revisited, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life
columns, reducing sample complexity through the depletion of Sci. 845 (2007) 226–231.
other abundant species, and enhancing protein detection sensitiv- [21] G. Candiano, M. Bruschi, L. Musante, L. Santucci, G.M. Ghiggeri, B. Carnemolla, P.
ity, will surely improve the present protocol. Orecchia, L. Zardi, P.G. Righetti, Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie
G-250 staining for proteome analysis, Electrophoresis 25 (2004) 1327–1333.
[22] Å.M. Wheelock, A.R. Buckpitt, Software-induced variance in two-dimensional
gel electrophoresis image analysis, Electrophoresis 26 (2005) 4508–4520.
Acknowledgements [23] R.L. Gundry, Q. Fu, C.A. Jelinek, J.E. Van Eyk, R.J. Cotter, Investigation of an
albumin-enriched fraction of human serum and its albuminome, Proteomics
Clin. Appl. 1 (2007) 73–88.
We are grateful to the Medical Service at the University of San- [24] L. Anderson, N.G. Anderson, High resolution two-dimensional electrophoresis
tiago, and to the Rheumatology Service, Clinic University Hospital of human plasma proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (1977) 5421–5425.
of Santiago (CHUS), for helping us to collect all the blood sam- [25] C. Rodriguez, C. Quero, A. Domínguez, M. Trigo, M. Posada de la Paz, E. Gelpi, J.
Abian, Proteotyping of human haptoglobin by MALDI-TOF profiling: phenotype
ples. Besides, we would like to express our gratitude to Dr. Esteban distribution in a population of toxic oil syndrome patients, Proteomics 6 (2006)
Guitian for his technical assistance in MS. S272–S281.
 F.J. Salgado et al. / Analytica Chimica Acta 658 (2010) 18–31 31

[26] M. Osawa, I. Yuasa, T. Kitano, J. Henke, M. Kaneko, T. Udono, N. Saitou, K. Umetsu, [31] V. Honkanen, Y.T. Konttinen, H. Mussalo-Rauhamaa, Vitamins A and E, retinol
Haplotype analysis of the human ␣2-HS glycoprotein (fetuin) gene, Ann. Hum. binding protein and zinc in rheumatoid arthritis, Clin. Exp. Rheumatol. 7 (1989)
Genet. 65 (2001) 27–34. 465–469.
[27] L. Kremser, A. Brückner, A. Heger, T. Grunert, A. Buchacher, D. Josic, G. All- [32] S. Weivoda, J.D. Andersen, A. Skogen, P.M. Schlievert, D. Fontana, T. Schacker,
maier, A. Rizzi, Characterization of antithrombin III from human plasma by P. Tuite, J.M. Dubinsky, R. Jemmerson, ELISA for human leucine-rich alpha-
two-dimensional gel electrophoresis and capillary electrophoretic methods, 2-glycoprotein-1 employing cytochrome c as capturing ligand, J. Immunol.
Electrophoresis 24 (2003) 4282–4290. Methods 336 (2008) 22–29.
[28] M. Greco, F. Chiriacò, P. Del Boccio, L. Tagliaferro, R. Acierno, P. Menegazzi, [33] B. Seriolo, S. Accardo, A. Garnero, D. Fasciolo, M. Cutolo, Anticardiolipin
E. Pinca, F. Pignatelli, R. Storelli, G. Federici, A. Urbani, M. Maffia, A pro- antibodies, free protein S levels and thrombosis: a survey in a selected
teomic approach for the characterization of C677T mutation of the human gene population of rheumatoid arthritis patients, Rheumatology 38 (1999) 675–
methylenetetrahydrofolate reductase, Proteomics 6 (2006) 5350–5361. 678.
[29] M.I. Kamboh, R.E. Ferrell, B. Sepehrnia, Genetic studies of human apolipopro- [34] H.W Jones, R. Bailey, Z. Zhang, K.A. Dunne, D.R. Blake, N.L. Cox, C.J. Morris, P.G.
teins. IV. Structural heterogeneity of apolipoprotein H (␤2-glycoprotein I), Am. Winyard, Inactivation of antithrombin III in synovial fluid from patients with
J. Hum. Genet. 42 (1988) 452–457. rheumatoid arthritis, Ann. Rheum. Dis. 57 (1998) 162–165.
[30] H. Sato, J.J. Kazama, Y. Wada, T. Kuroda, I. Narita, F. Gejyo, P. Gao, H. Yamashita, [35] L. Thadikkaran, M.A. Siegenthaler, D. Crettaz, P.A. Queloz, P. Schneider, J.D.
Decreased levels of circulating alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein/Fetuin- Tissot, Recent advances in blood-related proteomics, Proteomics 5 (2005)
A (AHSG) in patients with rheumatoid arthritis, Intern. Med. 46 (2007) 3019–3034.
1685–1691.
In: Advances in Medicine and Biology, Volume 42 ISBN: 978-1- 62100-690-9
Editor: Leon V. Berhardt © 2012 Nova Science Publishers, Inc.

No part of this digital document may be reproduced, stored in a retrieval system or transmitted commercially
in any form or by any means. The publisher has taken reasonable care in the preparation of this digital
document, but makes no expressed or implied warranty of any kind and assumes no responsibility for any
errors or omissions. No liability is assumed for incidental or consequential damages in connection with or
arising out of information contained herein. This digital document is sold with the clear understanding that
the publisher is not engaged in rendering legal, medical or any other professional services.

Chapter I

Rheumatoid Arthritis:
Present and Future

F. J. Salgado, A. Canda-Sánchez, M. P. Arias,

S. Vázquez and M. Nogueira
Department of Biochemistry and Molecular Biology, CIBUS, Centre for Biologigal
Research of the USC, University of Santiago de Compostela,
USC, C/ Lope Gómez de Marzoa, s/n,
Santiago de Compostela, CP:15707, A Coruña, Spain

Abstract
Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease of unknown etiology
that originates a great functional damage, reduction of the quality/ life expectancy and
great economical impact. RA is the most frequent chronic inflammatory disorder,
affecting millions of people worldwide. This heterogeneous disease is characterized by a
fluctuating clinical course, and patients may even experience long periods without
symptoms. Although the RA treatment has radically changed with the advent of the
biological therapies that include conventional as well as biologic agents, a number of
important questions, like optimal dosing, elusive goal of personalized therapy and an
evaluation of the real impact of biologic therapy on patient’s life, are not completely
understood yet. Today, the most challenging issue in RA is the identification of
biomarkers for early disease diagnosis, prognosis of disease outcome and prediction of
therapeutic responses.

1. Introduction
1.1. Rheumatic Diseases

Rheumatic diseases are a broad group of diseases affecting the musculoskeletal system in
general. They can occur with inflammation of one or more joints. There are more than 100
2 F. J. Salgado, A. Canda-Sánchez, M. P. Arias et al.

different types of arthritis that may be caused by autoimmune diseases, bone injury, infection
or general degeneration on joints.
Osteoarthritis (OA) (ICD-M-15 M-19, OMIM 165720), the most common variety, is a
degenerative joint disease, also called arthrosis or degenerative arthritis. The disease process
affects the cartilage, but also it may include the synovium, ligaments, periarticular muscles
and subchondral bone, leading to sclerosis [Meulenbelt et al., 2006]. OA is more common in
the elderly, although it might occur also in young people as a result of joint injuries. The main
symptom of OA is joint pain, which increases with movement and improves with rest.
Although stiffness is common, it is restricted specifically to the affected joint; it normally
precedes a period of inactivity, and usually lasts less than half an hour and disappears quickly
with exercise. Virtually all joints can be affected by this alteration, and occurs more
frequently in the hip, knee and lumbar and cervical spine. It is not usual that this disease
shows any symmetry on the affected joints [Stefansson et al., 2003].

1.2. A Rheumatoid Arthritis (RA) Overview

RA, the second most common type of arthritis, has been classified by The International
Statistical Classification of Disease and Related Health Problems (ICD), provided by the
World Health Organization (WHO), as an Inflammatory polyarthropathy ([Link]
/classifications/apps/icd/icd10online/; OMIM 180300; [Link] [Link]/omim
/180300). RA is a systemic chronic inflammatory autoinmmune disease that characteristically
involves several joints (polyarthritis) symmetrically. Initially it affects some small limb joints,
especially fingers, and larger joins such as shoulder, elbow, knee and ankle. They can also
cause many non-specific general symptoms outside the joints, including haematologic,
cardiovascular and respiratory symptoms [Turesson et al., 2003]. In advanced stages of the
disease, and without proper treatment, RA can cause significant physical limitation, and
therefore a large impairment in the quality of life.
RA has a worldwide distribution, with a prevalence of 1% (between 0.3 and 1.2%).
Women are three to five times more likely to suffer from the disease than men are. The
disease occurs most often after age 40, with a peak for women between 45 and 54, while in
men the incidence increases steadily with age [Kwoh et al., 2002]. RA may also appear at an
early age, and is called Systemic Juvenile Rheumatoid Arthritis (JIA) (ICD-10: M-08.0, and
OMIM 604302). In children, the course of the disease may be different, and shows up as
rashes, fever, pain, and hampering of the development of daily activities [Ringold et al.,
2009].
RA is a disease that causes damage mainly to synovial joints but, unlike OA, it can
spread to tissues and organs. In RA, the most commonly injured joints are the limbs,
especially fingers and toes, ankles, knees, shoulders and elbows; and it occurs symmetrically
on both sides. This arthritis usually develops in the form of symptomatic outbreaks, in which
the joints become swollen and painful and have difficulty moving. It also presents some
generalized rigidity, which is more intense when getting up and lasts for more than half an
hour. The pain is usually most severe at night and at rest, and it might last all day. Frequently,
there are some general symptoms, such as mild fever, malaise, fatigue, poor appetite and
weight loss.
 Rheumatoid Arthritis 3

The different forms of arthritis are often divided into "inflammatory" and "non-
inflammatory". RA is a disease considered "inflammatory", and occurs as a result of the
influx of activated leukocytes, which mediates the joint destruction. As RA is an autoimmune
disease, inflammation is the result of the immune response made against the joint cartilage
and, in some cases, other organs like the heart, eyes, lungs and skin. In contrast, OA is
considered "non-inflammatory": the damage occurs as a result of “wear-and-tear”, trauma or
disease, and there is no significant invasion of leukocytes. The fact that this arthritis is
regarded as non-inflammatory does not mean that there is not an inflammatory mechanism
involved; it just means that inflammation is not the cause of the problem. In the synovial
membrane of OA changes occur that involve inflammation, such as synovial hypertrophy and
hyperplasia, with an increase in the number of lining cells as well as tissue infiltration. Also
in patients with severe OA, the extent of the inflammation can sometimes get to the same
levels as the observed in the clinical phase of RA [Pelletier et al., 2001]. The presence of an
inflamed synovium is reflected in many of the signs and symptoms of OA, including joint
swelling, stroke, stiffness and, sometimes, redness [Attur et al. 2002]. Although synovial
inflammation in OA is not as extensive as the one seen in classic forms of RA, there is
evidence that synovitis plays a role at least in a subgroup of patients with OA [Ayral et al.,
2005; Loeser 2006]. In addition, it has recently been addressed the importance of bones in the
development of OA [Felson et al., 2004]. Therefore, OA and RA have similarities in some of
its manifestations, and that is why differential diagnosis between these two pathologies is
essential; they are different in both the origin and evolution, and they have to be appropriately
treated.
As will be commented later on this chapter, RA diagnosis has relied heavily on medical
history and physical examination supported by laboratory tests. In 1987, the American
College of Rheumatology (ACR) established the criteria for the diagnosis of RA: it will be
considered a positive diagnosis of the disease when four out of the seven symptoms described
are fulfilled, and when they last for at least 6 weeks [Arnett et al., 1988]. RA patients in the
laboratory show: normocytic anemia, high erythrocyte sedimentation rate, acute phase
reactants and various more or less specific autoantibodies. The identification and assessment
of these autoantibodies is one of the aspects taken into account when establishing the
diagnosis, monitoring the progress and even predict the RA prognosis. These criteria have
been used for over 20 years, but they have the limitation that two of these criteria (nodules
and radiographic changes) are changes that must be prevented with an early diagnosis and
treatment [Aletaha et al., 2005]. To avoid these problems, a cooperative working group of the
American College of Rheumatology (ACR) and the European League Against Rheumatism
(EULAR) established a new approach to diagnosis (see section 3.2.).
RA has a highly variable onset form, although there are some patterns more or less
characteristic. In most cases, the first symptoms are a manifestation of joint inflammation,
including morning stiffness, pain and swelling. They may be preceded by non-specific
general symptoms, such as malaise, fatigue, slight fever and loss of appetite. In general,
symptoms that indicate the joint inflammation usually intensify gradually over weeks or
months, but they may also appear, particularly during illness onset, in a sudden and intense
way. Quite often during the initial stages, the disease affects symmetrically the small joints of
hands and feet. It is not very frequent that the disorder begins with an extra-articular
manifestation, such as rheumatoid nodules. However, extra-articular disease is also an
important component of RA when the disease is well established. It includes infections,
4 F. J. Salgado, A. Canda-Sánchez, M. P. Arias et al.

subcutaneous nodules, osteoporosis and consequent susceptibility to fractures, secondary

Sjögren´s syndrome, pulmonary diseases (pulmonary nodules, pleural effusion, fibrosing
alveolitis), atherosclerosis, vasculitis (nail fold, systemic), cardiac diseases (pericarditis,
pericardial effusion, valvular heart disease, conduction defects), ocular diseases (scleritis,
keratoconjunctivitis sicca, episcleritis), neurological diseases (nerve entrapment, cervical
myelopathy, peripheral neuropathy, mononeuritis multiplex), cutaneous diseases (palmar
erythema, pyoderma gangrenosum, vasculitis rashes, leg ulceration), and amyloidosis [Scott
DL et al., 2010]. These extra-articular features affect a maximum of 30% of patients, and they
get worse during active disease. Each of them contributes to the long list of RA symptoms
that people can experiment [Lee et al. 2001]
Apart from the extra-articular disease, it has been described the presence in these patients
of other pathological entities in addition to RA. The interest in the study of comorbidities in
RA has grown mainly because they worsen prognosis for patients. Some RA-related
comorbidities are: cardiovascular (myocardial infarction, heart failure, stroke, peripheral
vascular disease, hypertension), cancer (lymphoma and lymphoproliferative diseases, lung
cancer, skin cancer), infection (general, bacterial), other (depression, gastrointestinal disease,
osteoporosis, psoriasis, renal disease). Some are associated with RA (e.g., cardiovascular),
and some others with treatment. For example, steroids cause osteoporosis and cataract,
NSAIDs induce gastrointestinal disease, and biological agents and steroids raise the number
of infections and melanoma. Finally some comorbid disorders are linked to both disease and
treatment (e.g., infection) [Scott et al., 2010].
The disease usually follows a chronic course and, in most cases, is progressive and
unpredictable. Without treatment, after 10 years of onset around 50% of patients have a
marked deterioration of physical capacity and life quality. In the later stages of the disease
about 10% of patients have difficulty carrying out daily activities.
In terms of prognosis, there are a number of factors involving a more serious disease,
including the presence of rheumatoid factor, anti-CCP antibodies, subcutaneous nodules,
persistent polyarthritis, erosive arthritis, extra-articular manifestations and genetic markers
such as the “shared epitope”. Also, people with RA at a younger age tend to deteriorate faster.
The treatment in the early stages is getting a significant improvement in both evolution and
prognosis of RA. In contrast, if left untreated, RA can lead to a reduction of 3 to 7 years in
life expectancy [Yazici et al., 2009; Deighton et al., 2009].
The early stages of RA are characterized by synovial inflammation, which develops
synovial stromal edema, villous hypertrophy and proliferation of synovial cells (that are
arranged in 6 to 9 layers in contrast with the normal one/two cells thickness of the synovium).
There is also a large infiltration of immune cells, such as monocytes, macrophages and T and
B lymphocytes within the synovial membrane; they even can be found as lymphoid follicles.
In the synovial surface, and to a lesser extent in the stroma, a fibrinous exudate is formed: the
fibrin becomes a granular material, and the synovial fluid contains immune complexes.
Besides, endothelial swelling is formed with small-vessel damage: they show wall thickening,
infiltration of leukocytes, thrombosis, perivascular haemorrhage, and microfocuses of
necrosis [Turesson et al., 2003]
If swelling persists, a second phase starts with the generation of a granulation tissue
called pannus, which extends over the joint surface and is accompanied by the vascularization
of cartilage. Damage in the cartilage and capsule, tendons, ligaments and bone is caused by
the growth of the pannus and the proliferation of synovial cells; direct destruction of articular
 Rheumatoid Arthritis 5

cartilage is dependent on the release of lysosome enzymes by synoviocytes,

polymorphonuclear cells and macrophages. The pannus becomes a fibrous tissue, resulting in
the deformation of the swollen joint; it is characteristic, at this stage, the joint deformation,
forming the so-called crooked fingers. Finally, immobilization or joint ankylosis are due to
the disappearance of joint cartilage and the fibrosis of the articular space [Firestein, 2003].
There are a number of extra-articular manifestations of RA, which vary in frequency.
They include: vasculitis of small vessels, fibrosing alveolitis, Felty Syndrome, pericarditis,
endocarditis, renal compromise and secondary amyloidosis. Association with Sjögren
syndrome has also been described. In 20 to 25% of cases with RA, rheumatoid nodules occur
in the subcutaneous tissue, periarticular tissue and sometimes in viscera [Voskuyl, 2006].

1.2. RA: Morphology and Immunopathology

In recent years a major breakthrough has been made by scientists in the molecular
mechanisms involved in the pathogenesis of RA. This inflammatory process is an
autoimmune disorder in which two events overlap: the first produces the joint inflammation,
and it is mediated by T cells; the second causes its destruction. The damage is produced by
the formation of new blood vessels, and the activation of synovial fibroblastic cells and
macrophages that produce a granulation tissue that affects the cartilage and bone.
Immune processes that explain the symptoms of RA are complex and involve the
presence of autoantibodies, immunocomplex formation and the participation of CD4+
autoreactive T cells, specific for a still unknown synovial antigen. These phenomena cause
the synthesis and release of multiple cytokines, and the activation of various immune
mechanisms of chronic inflammation that cause joint damage [Firesteisn, 2006].
The gradual progression of the development of rheumatoid arthritis can be divided into
three different but interrelated stages [Firesteisn, 2006]. In the first stage, the disease starts in
peripheral lymphoid organs, when dendritic cells present self-antigens in the context of MHC
class II molecules to T cells displaying autoreactive T cell receptors (TCR). The role that T
cells have in the pathogenesis of RA is manifested by the relationship of this pathology with
specific alleles of MHC molecules (HLA) class II, and accounts for 30% to 50% of the
overall genetic susceptibility of RA [Lee, 2008]. The strongest association is with HLA-
DRB1 alleles, particularly between amino acids that encode the conserved sequence
(QKRAA, QRRAA or RRRAA), called the “shared epitope” (SE). This epitope is located in
the third hypervariable region (HVR3) beta chain of the histocompatibility molecules class II,
in an area that produces direct contact with the antigenic peptide presented and the T cell
receptor. There is evidence that suggest that other HLA genes may also contribute to the
genetic risk of developing RA. Outside the HLA region, the strongest association has been
identified with a polymorphism in the gene PTPN22, which encodes the tyrosine phosphatase
Lyp [Gregersen, 2005]. Other genomic studies have identified three additional risk loci for
RA [Bowes et al., 2008], as will be summarized later on.
All RA susceptibility genes have a potential effect on the biology of T lymphocytes:
choice of T cells repertoire, peptide antigen presentation for T cell maturation, thresholds for
activation, or T cell differentiation into effector Th1 and Th17 cells. Until recently, it was
believed that Th1 cells were primarily responsible for tissue damage in autoimmune diseases.
However, clonal expansion of lymphocytes in the synovium has provided controversial data,
6 F. J. Salgado, A. Canda-Sánchez, M. P. Arias et al.

because IFN-γ and other Th1 cytokines have been detected in the RA synovial tissue at a
much lower level than other proinflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6 and IL-1
[Firestein, 2003]. This may indicate that few T cells are needed to initiate and sustain the
process, or that other cytokines, the interactions between cells or all these processes together
are sufficient to amplify the mechanism of inflammation. Nowadays, the leading role in RA
pathogenesis seems to have passed to Th17 cells, which migrate more quickly to injured areas
and organize the inflammatory response by recruiting other cells such as Th1 lymphocytes.
The later group, in its turn, will assist Th17 cells in inflammation and tissue destruction
[Steinman, 2007].
The identification of the Th17 pathway has renewed the interest in the pro-inflammatory
role of T cells in RA. Th17 is an effector T cell lineage whose differentiation is initiated by
IL-6 and transforming growth factor beta (TGF-β), while IL-23 promotes expansion and
survival. Th17 cells produce IL-17, a proinflammatory cytokine with a very high
concentration within the areas affected by RA [Steinman, 2007; Annunziato et al., 2007].
This cytokine induces a wide range of effectors molecules, such as IL-1β, IL-6, TNF-α,
multiple chemokines, cyclooxygenase-2, prostaglandin E2 and matrix metalloproteinases; all
of them have been implicated in joint damage. IL-17 acts on multiple cell types located in the
inflamed joints of RA, as monocytes, macrophages, fibroblasts, osteoclasts, and chondrocytes
[Sato, 2006]; it has a direct action on the development of clinical symptoms, produces the
destruction of cartilage and bone and it also enhances the activity of IL-1 and TNF-α. IL-17
promotes the development of osteoclasts, which are the destructive element in bone erosions
in RA [Imboden, 2009]. In addition to Th17 cells, it has been reported that γδ T lymphocytes
are important secretors of IL-17 [Shichita et al., 2009].
Another hypothesis to explain the pathology of RA could be that alterations in the
number or function of regulatory T (Treg) cells (CD4+CD25+) [Liepe J, et al., 2005]. There
are conflicting data regarding the possibility of altered peripheral blood Treg cells in patients
with RA. These discrepancies may be due to the difficult phenotypic identification of these
cells, as there are other cell types that also express CD25. On the contrary, it appears that
Treg cells are enriched in the synovial fluid of RA patients in relation to the peripheral blood.
It has also been demonstrated their role in the suppression of autoimmunity in rodent models
[Esensten et al., 2009; Van Amelsfort et al., 2004].
In the second phase of the RA, activated T cells respond to the presentation of
autoantigen by secreting various cytokines: IL-4, IL-10 and IL-13. Simultaneously, they
activate autoreactive B cells with the participation of cytokines and costimulatory molecules
(CD40/CD40L). This activation causes the production of autoantibodies, the most
characteristic of which is the rheumatoid factor (RF). The RF corresponds to a set of
antibodies synthesized in part on the synovium, even though these autoreactive
immunoglobulins also appear in the serum. They are usually class M immunoglobulings
(IgM) directed against the Fc fragment of immunoglobulin G (IgG). These antibodies bind to
normal circulating IgG to form IgM / IgG complexes that are deposited in the joints. Such
immune complexes can activate the complement cascade, resulting in chronic inflammation
[Wu et al., 2007]. After the migration of immune cells to the joint, antigen presentation may
also occur in the synovial membrane. Besides, the direct contact of T cells can also activate
other cells in an antigen-independent manner.
The binding of immune complexes by their constant fraction to the Fc receptors on
macrophages, neutrophils and mast cells determines their activation in the synovium, and it
 Rheumatoid Arthritis 7

marks the beginning of the third stage of the disease that occurs in bone and cartilage.
Neutrophils from the synovial fluid are in activated state and releases oxygen-derived free
radicals that depolymerises hyaluronic acid and inactivates endogenous protease inhibitors,
thereby promoting the damage of the joint [Foo et al., 2005]. Macrophages are the main
producer of cytokines in chronic inflammation. When activated, they damage the tissue by
producing reactive oxygen species (ROS), Nitric Oxide (NO) and arachidonic acid. They also
induce the synthesis of matrix-metalloproteases (MMPs), and promote the activation of
coagulation factors. In addition, they also generate fibrosis due to the secretion of growth
factors, like platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor beta (TGF-β),
or fibroblast growth factor (FGF). The last one causes the proliferation of fibroblasts, which
are involved in the generation of new blood vessels via the production of angiogenesis
stimulators (e.g. the vascular endothelial growth factor vascular, VEGF). Finally, they are
also responsible for stimulating collagen deposition, via cytokines like IL-13 and TGF-β.
IL-13 and TGF-β play a very important role in the amplification of the process. IL-13 is
produced by T lymphocytes and enhances fibroblasts migration and myofibroblasts
proliferation. TGF-β is secreted also by the damaged endothelium and it further activates
macrophages. Besides, all these growth factors and the cellular activation by
immunocomplexes trigger the release of IL-1, which in turn activates lymphocytes and
endothelium and promotes the tissue destruction by increasing the expression of MMPs. The
main pathogenic role of these MMPs in experimental models of RA is to difficult tissue
repairing by the inhibition of collagen and proteoglycans synthesis [Buckley et al., 2001].
IL-1 and TNF-α act synergistically to regulate the production of inflammatory mediators
such as IL-6, IL-12 and PGE2 in the rheumatoid joint; they are also responsible for the
expression of adhesion molecules on the endothelium, allowing the migration of
inflammatory cells into the joint space. These two cytokines also activate osteoclasts in the
bone marrow, and stimulate the production of collagenase by chondrocytes [Dayer, 2003]. It
must be highlighted here the role that IL-1 and TNF-α also play in the acute phase response,
because these cytokines induce the production of IL-6; the later suppresses the synthesis of
albumin by the liver, and it is the main mediator and regulator of the hepatic synthesis of
acute phase proteins (APPs). The acute phase response is indicated by the rapid rise of
molecules such as C-reactive protein (CRP) and serum amyloid A (SAA) in blood. It can be
used as a good surrogate marker of disease activity, and contributes significantly to the
elevation of the erythrocyte sedimentation rate (ESR).
In RA, tumor necrosis factor alpha (TNF-α) is a major regulator of the disease
progression. TNF-α is a pro-inflammatory cytokine with a broad spectrum of biological
activities: vasodilatation, increased vascular permeability and platelet activation, promotion
of apoptosis, inhibition of viral replication, etc. It also stimulates the release of molecules
involved in tissue degradation; for example, TNF-α enhances the production of collagenase
while decreases the synthesis of its natural inhibitor. It is also involved in the inhibition of the
synthesis of proteoglycan, thus reducing the osteoblast activity [Feldmann et al., 2001].
The biological activity of TNF-α is triggered after interaction with specific
transmembrane receptors (TNF-R), establishing a cross-linked bond with them to initiate the
cascade leading to the synthesis of various cytokines. Two receptors, called p55 and p75
according to their molecular weight, have being identified. They are expressed in all cell lines
and synovial membrane fibroblasts. The TNF-R is the natural regulator of TNF-α activity,
and it can be released (to act as an antagonist) from the synovial membrane. This event is
8 F. J. Salgado, A. Canda-Sánchez, M. P. Arias et al.

regulated, in turn, by IL-1 and IL-4. In patients with RA, TNF-R is produced in the joints and
it presents high concentrations in the synovial fluid and serum, depending on the stage of
disease activity [Bayley et al., 2003]. In addition, TNF-α is a negative regulator of Treg
function in RA, by increasing the localization of PKC at the immune synapse; furthermore,
blocking of PKCθ enhances Treg function and prevents inhibition by TNF-α. The PKC
pathway could, therefore, provide an important target in diseases characterized by immune
dysregulation [Zanin-Zhorov et al., 2010].
Platelets have a prominent role in RA because their critical role as regulators of the
process of angiogenesis and neovascularization in chronic inflammation. Once the injury
occurs, platelets start to produce chemokines, of which CXCL-4 (PF-4), CXCL-5 (ENA-78)
and CXCL-7 (NAP-2) have the function to recruit neutrophils into the inflammatory focus,
whereas CXCL-1 (GRO-α) and CXCL-8 (IL-8) promote angiogenesis, granulation and tissue
formation; then, the damaged epithelium maintains the production of CXCL-8 to promote the
repairing. Moreover, the chemokines CXCL-9 (Mig), CXCL-10 (IP-10) and CXCL-11 (I-
TAC) inhibit inflammation and immobilize the fibroblasts, which is a way of regulating all
the process [Romagnani et al., 2004].
Activated platelets also generate microparticles in joint fluid from patients with RA; the
collagen receptor glycoprotein VI was identified as the key trigger for their generation.
Platelet microparticles have a proinflammatory effect, eliciting cytokine responses from
synovial fibroblasts via interleukin-1, which in turn stimulates fibroblast to release more
proinflammatory cytokines [Boilard et al., 2010].
Faced with prolonged endothelial damage some cytokines are produced, particularly
those of Th2 type (IL-4, IL-5, IL-13), which activate the fibroblast and promote angiogenesis.
Among the cells that promote the proliferation of fibroblasts are mast cells, through the
production of histamine, serotonin and heparin. Eosinophils, macrophages, epithelial cells and
fibroblasts produce a series of pro-inflammatory substances, and they also generate
extracellular matrix components that lead to repair, such as collagen, elastin, fibronectin and
proteoglycans. This type of cell and tissue infiltration is responsible for the atrophy shown in
some RA cases [Abraham et al., 2005].
All the tissue destruction that occurs in RA leads to the appearance of neoantigens, such
as the type II collagen, a major constituent of cartilage, which contributes to the chronicity of
inflammation. The massive lymphocyte infiltration of the synovium could correspond to cell
recruitment stimulated by the appearance of those new antigens, which may explain the
difficulties in finding oligoclonal expansion of T cells (there would be many antigens
stimulating their proliferation [Nissim et al., 2005]. Fibroblastic synoviocytes may aggravate
the progress of the inflammation by producing more cytokines and other inflammatory
mediators [Lee et al. 2007]. There is also evidence that they are able to organize themselves
within the synovial tissue by cell-cell interactions and cadherin-11. Moreover, it has been
shown that the degeneration of cartilage and bone is regulated by different physiological
pathways. Thus, the abundance of osteoclasts, which is characteristic of rheumatoid
inflammation, directly damages the bone, although it does not seem to affect the cartilage.
Several studies have suggested that fibroblast synoviocytes are involved in the cartilage
damage. The synovium, therefore, works by regulating the entry and the behaviour of
inflammatory cells, but it also has the capacity to damage specific parts of its environment
[Lee et al., 2007].
 Rheumatoid Arthritis 9

A recent work underlines the capacity of these cells to migrate from one joint to another,
which may explain the clinic evolution of RA [Isaacs, 2010] Finally, phosphoinositide 3-
kinase (PI3K), especially PI3K-γ and PI3K-δ, have an important and specific role at all stages
of disease progression: the regulation of the antigen signal in B and T cells, and in the
signaling via FcRs, cytokine and chemokines receptors in mast cells, macrophages,
neutrophils and synoviocytes [Rommel et al., 2007]

2. Rheumatoid Arthritis Treatment

2.1. Families of Drugs

Due to the complicated and diverse ethiology of this pathology there is not specific and
definitive treatment for RA. There are guidelines for management of this disease, as well as
recommendations from ACR or EULAR [Combe et al., 2007; Saag et al., 2008] that describe
several principles that must be followed in RA treatment: RA patients must be detected and
referred as early as possible, there must be a tight control of disease activity, and treatment
must be adapted to the patient considering both risk and benefits [Kiely et al., 2009].
However, despite of all these principles and the existence of notorious advances in diagnosis
and pharmacological treatment of RA, none approach is able to cure this chronic disease so
far.
Failure to apply proper treatment produces a severe deformity in a few years. Instead,
early diagnosis and aggressive treatment to prevent joint damage and co-morbidities is the
current hallmark in RA management, and can lead to a good quality of life. Four families of
drugs are commonly used to treat RA patients: a) analgesics; b) non-steroideal anti-
inflammatory/NSAIDs drugs; c) corticosteroids; d) and disease-modifying anti-rheumatic
drugs/DMARDs. Table 1 summarizes these different drugs classes. The goal of the existing
therapeutic programs is mainly to reduce the intensity of signs and symptoms and to return to
the full functionality of joints. That aim can be achieved with DMARD monotherapy,
combinations of DMARDs (with or without glucocorticoids), and DMARD–biological
combinations.

2.1.1. Analgesics and NSAIDs

Analgesics like acetaminophen (paracetamol), NSAIDs (e.g., non-selective COX
inhibitors, like aspirin, diclofenac, ibuprofen, indomethacin, ketoprofen, naproxen, piroxican,
and selective COX-2-inhibitors, like celecoxib and valdecoxib), opiates and
morphinomimetics (e.g., oxicodone, codeine, fentanyl and morphine), psychotropic agents,
and atypical analgesics help to control different intensities of pain in RA. Acetaminophen and
NSAIDs block prostaglandin synthesis (COX inhibitors), and some of them (selective
NSAIDs) reduce pain by inhibiting COX-2, the expression of which is induced by pro-
inflammatory cytokines (e.g. TNFα and IL-1β) and microbial products (e.g.
lipopolysaccharide). NSAIDs are very important drugs to minimize pain, but also joints
inflammation and stiffness. All these drugs are used, together with corticosteroids, to control
signs of RA, but they do not modify the natural course of this disease. For that reason, they
are used in combination with DMARDs as supplemental therapies to manage this disease.
10 F. J. Salgado, A. Canda-Sánchez, M. P. Arias et al.

Because of several concerns about NSAIDs effectiveness, their low ability to modify the
long-term course of rheumatoid arthritis, and their toxic effects on gastrointestinal (they
should be given with proton-pump inhibitors) and cardiovascular system, these drugs have
lost their role as first-line treatment in favour of DMARDs like methotrexate (MTX)
(reviewed in [Scott et al., 2010]).

2.1.2. Corticosteroids
Corticosteroids are suppressors of the inflammatory response (e.g., COX-2 expression is
inhibited by glucocorticoids), reducing synovitis in the short term and joint damage in the
long-term (reviewed in [Scott et al., 2010]). However, this family of compounds shows a high
toxicity and an elevated number of secondary effects, including infections and osteoporosis.
Despite this unfavourable risk/benefit ratio [Ravindran et al., 2009], the rapid onset of action
of oral or intramuscular corticosteroids makes them useful (with low risk) during disease
outbreaks. As well, they are highly effective in intra-articular treatment of active joints
(reviewed in [Scott et al., 2010]).

2.1.3. DMARDs
DMARDs are key therapeutic agents used to reduce or stop synovitis, joint swelling,
pain, acute-phase reaction/systemic inflammation, progressive joint damage, or disease
progression, and to preserve joint function and improve function. DMARDs are a
heterogeneous class of agents that have been grouped in two different kinds of active
compounds: a) synthetic conventional molecules, as MTX, hydroxichloroquine,
sulphasalazine, leflunomide, or intramuscular gold; b) antibodies for biologic therapies, as
inhibitors of tumour necrosis factor alpha (TNFα; infliximab, etarnercept, adalimumab),
interleukin-1 (IL-1; anakinra), CD20 (rituximab), or IL-6R (tocilizumab); c) fusion proteins
for biologic therapies, as CTLA-4-Ig (Abatacept). This heterogeneous nature also implies
diverse and not fully understood mechanisms of action (reviewed in [Scott et al., 2010])
The first group of DMARDs is inexpensive, and the leading drug is MTX (formerly
known as amethopterin). MTX can be taken orally or administered by injection. Treatment
with MTX should be initiated when the disease is diagnosed for the first time. MTX acts by
inhibiting the metabolism of folic acid, which is given sometimes to limit toxic effects of this
drug. When MTX is contraindicated, sulfasalazine or leflunomide are good alternatives
[Donahue et al., 2008]. MTX can be used as single monotherapy, and is normally the first
DMARD administered to patients for two reasons: because of the high adherence to
treatment, and because is the preferred initial drug if a DMARD combination strategy has to
be initiated following a suboptimal response to monotherapy [Saag et al., 2008]. Different
combinations of MTX with hydroxychloroquine, sulphasalazine, ciclosporin, leflunomide or
parenteral gold (with our without glucocorticoids like prednisolone) have been tested in
double or triple therapies. Thus, MTX is used in the so-called triple therapy together with
sulfasalazine and hydroxychloroquine. Whilst not all combinations work equally well, in
general combination therapy seems slightly more effective than monotherapy, at expense of a
modest increase in adverse effects [Choy et al., 2005]; there are no consensus of clinicians
about the optimal strategy (step-up, step-down or parallel combinations) [Dale & Porter,
2010].
MTX (or leflunomide) is also used, with different strategies, in combination with
biological DMARDs. Biologic agents have become a therapeutic revolution. They are
 Rheumatoid Arthritis 11

routinely used in established RA, especially in situations where one or more conventional
DMARDs (including MTX) have already failed. However, their use in early RA treatment is
not exempt from controversial. Some authors underline that their expensive nature makes
them only suitable, from an effectiveness/cost point of view, when arthritis is uncontrolled or
treatment with other DMARDs shows toxic effects. Other studies, on the contrary, sustain
that they may be cost-effective in addition as first-line treatment (when joints damage is
minimal or absent) if it is finally proved the reduction of long-term medical, health care, and
social expenses; i.e., if future severe disability can be avoided [Scott et al., 2010]. Supporting
the last point of view, it has been found that therapy can be used in a selective way, since its
effectiveness is different in both anti-CCP+ and anti-CCP– groups of patients (see below).
Thus, very early treatment of anti-CCP+ patients (even not fulfilling all criteria for RA yet),
but not anti-CCP- individuals, could be beneficial and cost-effective (reviewed in [Pruijn et
al., 2010]).
One key inflammatory cascade includes overproduction and overexpression of TNF. This
pathway drives both synovial inflammation and joint destruction. For that reason, TNF
inhibitors were the first biological agents used (Table 1). Combination of TNFα inhibitors
(e.g., Adalimumab, etanercept, infliximab) with MTX produces better disease outcomes
(disease activity, radiographic progression, remission rates) than methotrexate alone [St Clair
et al., 2004; Breedveld et al., 2006; Emery et al., 2008], but clinicians have found some
problems. The first one is that there are patients who experience no response to TNFα
inhibitors [Van der Bijl et al., 2007]. Secondly, there are some concerns about long-term
treatments with these biological DMARDs (see below). Alternative biologic agents to TNF-α
blockers are abatacept (CTLA-4-Ig), rituximab (anti-CD20; B-lymphocyte depletion therapy)
or tocilizumab (anti-IL-6R) (Table 1). Like TNFα inhibitors, rituximab and abatacept are
combined with MTX in “step-down” therapy strategies [Rigby et al., 2009; Westhovens et al.,
2009]
Adverse effects of DMARDs are a matter o concern. They include minor setbacks, like
feeling sick, but also some serious problems as increased risk of liver toxicity, interstitial lung
disease, or infection (e.g., tuberculosis, herpes zoster, hepatitis B, hepatitis C, candidiasis).
RA patients seem to have increased risk of infection and malignancy (e.g., lymphoma) [Prior
et al., 1984; Wolfe et al., 1994], and it is known that TNF-α plays an important role in
immune responses against infections and malignancy. Therefore, long-term use of TNFα-
blocking agents may potentially enhance the risk of infection and cancer. Indeed, there is
some evidence of moderate increased risk of soft tissue infections [Bongatz et al., 2006;
Dixon et al., 2007], skin infections and tuberculosis [Wallis et al., 2004; Gomez-Reino et al.,
2003], as well as conflicting data about increased rate of lymphoma [Bongatz et al., 2006;
Geborek et al., 2005]. Caution is also needed with these treatments because of their negative
effects on demyelination, conception and pregnancy, or the acquisition of therapeutic
resistance to biological DMARDs due to the development of endogenous neutralizing
antibodies.
 Table 1. Drugs and biological agents used to treat rheumatoid arthritis

Family Subfamily Generic and commercial name Target/Comment

Aceminophen (ibuprofen)
Analgesics Mild to moderate pain
Opioid (morphine, codeine)
Salicylates: aspirin
Nonsteroideal
Other non-selective NSAIDs: diclofenac, Reduce mild to moderate pain
anti-inflammatory
ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxican and stiffness
/NSAIDs drugs
Selective NSAIDs: celecoxib, valdecoxib
Dexamethasone
Methylprednisolone
Corticosteroids Prednisolone Reduce inflammation
Prednisone
Triamcinolone
Methotrexate (MTX)
Sulphasalazine
Leflunomide
Synthetic
Ciclosporin Reduce disease outcome
molecules
Hydroxychloroquine
Disease-modifying chloroquine
anti-rheumatic drugs Intramuscular gold
/DMARDs Infliximab (anti-TNFα; Remicade®)
TNFαThis cytokine is found in
Etarnercept (soluble TNF receptor; Enbrel®) all disease subsets and is
Antibodies for
Adalimumab (anti-TNFα; Humira®) involved in synovial
biologic therapies
Golimimab (anti-TNFα; Simponi®) inflammation and joint
destruction
Certolizumab pegol (anti-TNFα; Cimzia®)
Family Subfamily Generic an commercial name Target/Comment
Anakinra (antagonist of human IL- IL-1. Proinflammatory cytokine found in
1R) some disease subsets.
IL-6R. IL-6 is found in all disease subsets
and is dependent on TNF production.
Tocilizumab (anti-IL-6R; IL-6 is involved in synovial inflammation
Antibodies for
RoActemra®) and joint destruction. Moderate or serious
biologic therapies
Disease-modifying active RA Monotherapy associated to
(cont.)
anti-rheumatic drugs MTX.
/DMARDs (cont.) CD20 is expressed by B-cells. This
antibody is used to reduce the number of
Rituximab (anti-CD20; Mabthera®)
ACPA-producing lymphocytes.
Associated to MTX.
Fusion proteins CTLA-4 is an inhibitory signal for T-
for biologic Abatacept (CTLA-4-Ig; Orencia®) cells. It blocks CD28-B7 T-cell
therapies costimulation. Associated to MTX.
14 F. J. Salgado, A. Canda-Sánchez, M. P. Arias et al.

To minimize risks of long-term treatment with biological agents, different trials have
used a “step-down” strategy [Quinn et al., 2005; Sheehy et al., 2008; Van der Bijl et al.,
2007]. For example, the use of TNFα inhibitors together with MTX to achieve a rapid clinical
remission before moving toward a less intense maintenance regimen by withdrawing
biological agents and keeping MTX. However, despite the rapid improvements in different
disease outcomes, not all the patients are able to sustain that positive initial response after
discontinuing biological agent. In addition, similar time-limited approaches with lower cost
corticosteroids appear to offer similar clinical and radiographic benefits [Dale et al., 2009].

2.2. Innovative Treatments

2.2.1. New drugs

New biological agents in development include drugs that target proximal effects on the
immune response and growth factors for T-cell subsets (such as IL-17). New conventional
drugs with DMARD-like properties might also have important future roles. Clinical trials
with inhibitors of JAK and SYK kinases have provided promising data. Other targets are also
under investigation (reviewed in [Scott et al., 2010]).

2.2.2. Cellular therapy

Autologous or allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is another
promissing treatment for RA. The aim is to remove the diseased immune system and insert a
brand-new and non-autoreactive immune system. During autologous HSCT, lymphocyte
depletion is achieved by using drugs such as cyclophosphamide. That is followed by the
infusion of T-cell depleted autologous stem cells, initially harvested from the patient’s
peripheral blood. However, several drawbacks can arise during HSCT: a) not complete
eradication of autoreactive lymphocytes during initial conditioning; b) the presence of
autoreactive cells within the autologous stem cell graft; and finally, c) the stem cell graft itself
could predispose to autoimmunity (reviewed in [Cooles & Isaacs, 2010]).
However, due to the plasticity of the immune system, maybe it will not be necessary to
replace it completely to achieve long-term disease remission. For example, malfunctioning
autologous cell types in RA, as natural regulatory T (nTreg) cells maybe are, could be
purified, expanded and reinfused in patients; this approach will suppress any residual disease-
related clones and restore tolerance. Another alternative is to use autologous nTreg during
HSCT (see before), or to employ autologous tolerogenic dendritic cells (TolDCs), which
force conventional T cells in the periphery to turn into inducible regulatory T (iTreg) cells. In
addition, potently immunosuppressive mesenchymal stem cells (MSCs) or myeloid derived
suppressor cells (MDSCs) could provide another means to restore tolerance in RA. However,
one major problem with cellular therapies is that they are expensive and need GMP (Good
Manufacture Practice) conditions to be carried out, which are not available in all centres
(reviewed in [Cooles & Isaacs, 2010]). Purity of these therapeutic populations, when isolated
from patients under GMP conditions, is another drawback. For example, phenotypically,
nTreg cells are CD4+CD25highCD127-/low, but the activated effector/conventional population,
which is present in RA patients, has also a rather similar phenotype (CD4+CD25low/+CD127-
/low
). Therefore, we can hardly separate nTreg cells from activated effector/conventional T
cells by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) or MACS (Magnetic Activated Cell
 Rheumatoid Arthritis 15

Sorting). In addition, since the final number of autologous nTreg cells withdrawn from a
patient is rather reduced, in vitro culture (2-3 weeks) to activate and expand these cells is
mandatory. However, in vitro expansion of this anergic population, together with the low
initial purity of nTreg cells (under RUO, but especially GMP conditions), lead to expanded
cells with phenotypic characteristics of effector instead of regulatory T cells (for example,
low FoxP3 expression) [Esensten et al., 2010]. In conclusion, further improvements in nTreg
separation and/or in vitro culture techniques under GMP specifications are needed before
launching clinical cell therapy trials in RA, which could be done in parallel to develop new
drugs capable of promoting function or increasing numbers of nTreg cells (e.g., IRS 954,
hydroxychloroquine, trichostatin A, MS-275, vorinostat, IL-2) [Esensten et al., 2009].

2.3. Timing

As commented in the beginning of this section, since substantial irreversible joints

damage occurs within the first 2 years after disease outbreak, it is likely that an early
therapeutic intervention would improve clinical outcome and reduce joint damage and
disability [Van der Heide et al., 1996; Bukhari et al., 2003; Finckh, et al., 2006; Van Dongen
et al., 2007]. That is the goal of modern therapies: to prevent individuals with early
undifferentiated synovitis from reaching the chronic/erosive phase. However, clinical trials,
where the efficacy of early interventions to prevent later-stage rheumatoid arthritis is
investigated, have been hampered by the lack of criteria to include or exclude patients from
those studies. In addition, because of infections and high costs, treatment of arthritis with
powerful and expensive therapeutic agents (like biological agents) is only justified when the
risk-benefit or cost-effectiveness ratios are favourable. However, along the next section we
will show that this is difficult because there are no accepted and uniform criteria to date to
detect individuals with undifferentiated or early rheumatoid arthritis (diagnosis), or to predict
the outcome of this disease (prognosis).

3. Genetic/Environmental Risk,
Classification/Diagnosis, Disease Monitoring
and Remission of Rheumatoid Arthritis
3.1. Genetic Predisposition, Environmental Risk, Serum Markers
(RF, ACPA) and Screening

Genetic research has shown that part of the risk of developing this disease depends on
genetic factors, but also that RA is a heterogeneous group of overlapping syndromes. As
previously commented, there are three phases in the development of RA. During the first one
genetic predisposition, interacting with environmental factors, leads to a second stage where
asymptomatic autoantibody production begins. Eventually, during the last phase, clinical
inflammatory arthritis is set [64].
There are many risk alleles (see later on in this chapter), which are rather common in the
population and have only modest effects on the overall sensitivity to suffer RA. However, the
16 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

connection of some of these alleles with other autoimmune diseases (e.g., HLA genes) and
pro- (e.g., C5, TRAF1, STAT4) or anti-inflammatory pathways (e.g., PTPN-22, CTLA-4)
makes them promising for RA research. For example, 30-50% of genetic susceptibility in RA
is linked to class II MHC [Lee, 2008], especially HLA-DRB1 alleles, which has the so-called
“shared epitope”. Antigen citrullination seems to allow antigenic peptides to fit in the HLA
groove and, as a result, tolerance is broken. Environmental factors, like smoking, alcohol
intake, coffee intake, vitamin D status, oral contraceptive use, or low socioeconomic status,
enhance that genetic risk of developing RA. In general, that is not very relevant, except for
smoking. People who smoke have double the likelihood of developing RA, especially in the
context of HLA-DRB1 expression, even though its effect is restricted to ACPA-positive
patients [Pedersen et al., 2006].
Since the available window to treat early RA is narrow, all these data about genetic
predisposition, life style, or new serum biomarkers could be valuable to create multivariate
prediction models to identify all those asymptomatic individuals at risk of developing RA.
These individuals could undergo serial monitoring, allowing initiation of immunomodulatory
therapy upon the appearance of the first signs of disease (pre-emptive therapy) [Dale et al.,
2010]. Nevertheless, DMARDs treatment is only justified when the risk-benefit or cost-
effectiveness ratios are favourable, so it is also mandatory to be able to differentiate between
RA and other forms of arthritis soon. Certainty in clinical practice is seldom reached, so to
make treatment decisions clinicians needs to know the sensitivity, the specificity and mainly
the predictive value of a particular test or prediction model.
Autoantibodies, such as rheumatoid factor (RF) and anti–citrullinated protein antibody
(ACPA) (tested as anti–cyclic citrullinated peptide [anti-CCP]), can precede the clinical
manifestation of RA by many years, so it would be possible to use them to screen for this
disease. Diagnostic value of RF test (sensitivity, specificity, predictive values, ROC curve
AUC) depends on the assay used to detect this autoantibody (classical latex fixation, ELISA,
Rose-Waaler agglutination assay), the RF isotypes studied (IgG, IgA, and IgM), the
characteristics of the population under study (e.g., age), the gold standard chosen for RA, and
the cut-off titre selected. Thus, a recent study has yield the following data for RF in
undifferentiated arthritis: sensitivity (14-73%), specificity (68.8-99.4%), positive predictive
value (PPV; 61.1-85.7%), negative predictive value (NPV; 64-93.1%) [van der Linden et al.,
2011]. The low sensitivity of RF tests, the prevalence of this disease in the general population
(0.3-1.2%; that affects to PPV, NPV and diagnostic efficiency), and also the fact that RF can
be found in normal individuals (especially in the elderly) and other autoimmune (lupus
erythematosus, scleroderma, dermatomyositis) or infectious diseases (rubella, leprosy,
malaria), clearly shows that RF has a limited diagnostic value.
Citrullinated peptides / proteins (e.g., fibrinogen, histones, vimentin), and particularly
autoantibodies directed to them (ACPA), are likely to be involved in the development of this
disease. Thus, exosomes in synovial fluid from RA patients, which are an important means of
communication between immune cells (e.g., T lymphocytes), contain ACPA as well as
citrullinated proteins. ACPA response in RA patients is polyclonal, against a variety of
citrullinated proteins, and varies between different patients.
Initially, ACPA were detected using several synthetic peptides containing citrullin.
Presence of ACPA at early diagnosis has prognostic value, since ACPA+ patients have more
pronounced radiographic progression (bone erosions), higher risk of ischemic heart disease
and worse response to DMARDs In addition, there are conflictive results regarding the effect
 Rheumatoid Arthritis 17

of therapy on ACPA levels (reviewed in [Aggarwal et al., 2009; Pruijn et al., 2010]). When
citrullinated peptides were made cyclic (CCP), the test showed an enhanced sensitivity to
detect this heterogeneous population of RA auto-antibodies.
More recently, selection of novel peptides from libraries has yielded improved
recognition properties and enhanced test sensitivities (second generation or anti-CCP2 test):
75% (60-80%) in long-term established RA patients and 61% in early RA patients [Pruijn et
al., 2010]. That fits with the previously quoted study [van der Linden et al., 2011], where
there are better properties for anti-CCP2 test as compared with RF: sensitivity (40.9-50%),
specificity (88.4-97.1), PPV (67.1-93.2%), NPV (70-94.8%). The anti-CCP2 test has a
superior specificity and, in stratified studies (fixed value of specificity), a much higher
sensitivity than RF (69% vs 30% respectively (reviewed in [Pruijn et al., 2010]). As well,
anti-CCP2 seems to detect the vast majority of ACPA. Indeed, a third generation of anti-CCP
tests (anti-CCP3) has been developed (Inova, San Diego, CA, USA), with no clear diagnostic
value improvement.
Specificity of anti-CCP test is very high, and ACPA can be present years before the first
visit to the clinic (up to 18 years) (reviewed in [Pruijn et al., 2010]). In addition, ACPA
positiveness, no matter what the level of IgM RF is, predicts worse outcome, with higher
radiographic progression and bone erosions [van der Linden, 2009]. However, the low
sensitivity of this test (<70%) in early RA patients makes it only acceptable with mixed
populations of patients visiting early arthritis clinics (where some of them eventually will
develop RA), but not so reliable to use it as single screening test in the general population
(~1% prevalence). Indeed, patients with still undifferentiated arthritis belong to two groups:
individuals who are anti-CCP+ (90% develop RA within 3 years) and those who are anti-CCP-
(only 30% develop RA within 3 years) [van der Helm-van Mil et al., 2005; Pruijn et al.,
2010]. Perhaps, the use of the genetic information together with the use of markers
combinations (e.g., RF and anti-CCP, due to there are RF+/anti-CCP- patients, and/or new
serum biomarkers) in a single analysis may be a significant step forward that could provide
additional predictive accuracy.
Regarding the last point, other tests using various citrullinated proteins (rarely employed
in RA studies) are commercially available nowadays: mutated citrullinated vimentin
(Orgentec, Mainz, Germany), recombinant rat filaggrin (Genesis, Littleport, UK), Aesku
citrullinated IgG peptide (Aesku, Wendelsheim, Germany) or Astra citrullinated Epstein–Barr
virus nuclear antigen derived peptide (Astra, Hamburg, Germany). Apparently, these other
ACPA tests do not perform better than the anti-CCP2 test (Reviewed in [Pruijn et al., 2010]).
On the other hand, anti-Sa antibodies react in immunoblotting with a 50-kDa antigen present
in human placenta. The exact nature of the antigen is not known, but anti-Sa antibodies occur
independently from RF. The sensitivity for RA is 20–68%, and the specificity is 92–99%. It is
clear, therefore, that it is necessary to find new, more specific and, above all, sensitive
biomarkers, something what modern approaches, as Proteomics techniques, can help to (see
section 4.4. in this chapter).

3.2. Classification and Diagnosis

Rheumatoid arthritis is a clinical syndrome where several disease subsets converge on a

final common pathway in which both persistent synovial inflammation and articular
18 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

cartilage/bone damage are present. In fact, genetic studies support the same idea [David L.
Scott et al., 2010]. Therefore, in the face of these complications to define RA, a standard
mean of distinguishing this disease from similar joint disorders are the so-called classification
criteria.
The most extended classification criteria is the 1987 ACR criteria [Arnett et al., 1988]
(Table 2). However, the 1987 ACR criteria have important drawbacks, basically due to they
were set based on the comparison between populations with established RA and patients with
a combination of other definite rheumatologic disorders. One of these drawbacks is that
approximately 15% of patients with persistent arthritis (undifferentiated arthritis) do not fulfil
any of the international classification criteria, even after a follow-up of 2 years; for example,
they do not have structural changes in joints (erosions), which can be visualized by
conventional radiography or other imaging techniques and distinguish RA from other arthritic
disorders [Bohndorf K et al., 1996]. This fact, in addition, can be promoted by early arthritis
treatment, which delays patients fulfilling 1987 ACR criteria, like erosive joint damage.
On the other hand, another important limitation is that they are rarely apparent in the very
early stages of disease. Consequently, the 1987 ACR criteria allows the classification of
established rheumatoid arthritis, but fail to identify individuals with very early arthritis who
subsequently develop rheumatoid arthritis (false negatives, type II error, low sensitivity), or
they classify individuals as rheumatoid arthritis patients when they actually suffer from
similar diseases (false positives, type I error, low specificity).
As a result of all these problems, new and somewhat more complex prediction models
such as the van der Helm model have been developed. These criteria help to forecast
outcomes in patients with early undifferentiated arthritis who do not currently meet the 1987
criteria (but will likely do it in the future) [van der Helm-van Mil et al., 2008]. These criteria
included several factors which seemingly increase the likelihood of developing rheumatoid
arthritis. Amongst these factors, RF and ACPA are taken into account. Similarly, evidence
from clinical studies also suggests that prolonged morning stiffness and systemic
inflammation (evaluated by high levels of acute phase proteins like C-reactive protein or
CRP) are two additional factors that elevate the risk of having this disease. As novelty, they
are accompanied by a scoring system and an optimal cut off value.
More recently, and also in line with this trend, a combined group of the ACR and the
European League Against Rheumatism (EULAR) have developed a set of classification rules
in 3 phases (2010 ACR/EULAR classification criteria) [Aletaha et al., 2010]. These new rules
are intended to classify established disease, but also to identify a subset of patients at high
risk of persistent/chronic and/or erosive disease/damage (i.e., RA patients) amongst those
with undifferentiated inflammatory synovitis.
As Table 2 shows, the 2010 ACR/EULAR classification criteria assess: a) joint
involvement; b) levels of autoantibodies; c) acute phase response intensity; d) and symptoms
duration. This work focused on identifying factors that better discriminate the evolution of the
disease in patients with undifferentiated inflammatory synovitis in early stages. Thus, the new
classification system redefines the diagnosis of the disease, looking at early characteristics
that are associated with persistent disease and/or erosion, rather than define their features in
the latest stage. With these new criteria, the attention is focused on the importance of early
diagnosis to establish an effective therapy to prevent or minimize the occurrence of adverse
effects that currently presents RA [Aletaha et al., 2010].
 Rheumatoid Arthritis 19

Table 2. Classification Criteria of Rheumatoid Arthritis*

Criteria Comment References

1987 ACR Criteria 1. Morning stiffness (>1h)
Four of these seven
2. Arthritis in three or more joint areas
criteria must be
3. Arthritis in hand joints (≥1 swollen
present. Criteria 1–4
joints) [Arnett et
must have been
4. Symmetrical arthritis al., 1988]
present for at least 6
5. Rheumatoid nodules
weeks
6. Serum rheumatoid factor
7. Radiographic changes (erosions)
2010 1. Joint involvement (0–5)
ACR/EULAR • One medium-to-large joint (0)
classification • Two to ten medium-to-large joints (1)
Points are shown in
criteria • One to three small joints (large joints not
parentheses.
counted) (2)
Cutpoint for
• Four to ten small joints (large joints not
rheumatoid arthritis
counted) (3)
6 points or more.
• More than ten joints (at least one small
Patients can also be
joint) (5)
classified as having
2. Serology (0–3)
rheumatoid [Aletaha et
• Negative RF and negative ACPA (0)
arthritis if they al., 2010]
• Low positive RF or low positive ACPA
have: (a) typical
(2)
erosions; (b) long-
• High positive RF or high positive ACPA
standing disease
(3)
previously
3. Acute-phase reactants (0–1)
satisfying the
• Normal CRP and normal ESR (0)
classification
• Abnormal CRP or abnormal ESR (1)
criteria
4. Duration of symptoms (0–1)
• Less than 6 weeks (0)
• 6 weeks or more (1)
*Adapted from Scott DL et al., 2010.

3.3. Disease Monitoring

Rheumatoid arthritis is a multifaceted disorder with multiple medical outcomes reflecting

the disease activity (synovitis, acute phase response), disability, discomfort (pain, fatigue, and
stress), organ/tissue damage, and eventually death [Fransen et al., 2009]. Monitoring of each
one of those outcomes should be performed regularly in order to be useful for observational
analysis, trial studies and daily clinical practice. For example, clinical assessments should be
undertaken every few months in early active RA, and annually in established stable disease
[van Hulst et al., 2009]. For that aim, physician-assessed subjective measures are not
sufficient, and quantitative and objective monitoring of disease are required for a tight control
regimen, better medical decisions, and improved patient outcomes [Grigor et al., 2004; van
der Kooij et al., 2008; Mottonen et al., 1999], as revealed by trials as the Tight Control for
Rheumatoid Arthritis (TICORA) [Grigor et al., 2004] or the Computer Assisted Management
for Early Rheumatoid Arthritis (CAMERA) [Verstappen SM et al., 2007]. Limitations and
drawbacks of tight control are: reluctance of clinicians and patients to adhere to such an
intensive treatment strategies and frequent follow-up, unpleasant medication, and patient´s
perspective of cost-effectiveness differs from those of clinicians [Scott DL et al., 2010].
20 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

Progression of joint damage is a well-established outcome for trials in inflammatory joint

diseases. Physicians perform radiographs once a year at most, and one of the aims of the
treatment is actually to preserve joint structure. However, this is not optimal, and it is
necessary to develop alternative quantitative tools to evaluate the disease activity. Biomarkers
and imaging techniques may help to obtain precise measurements, which is important when
disease manifestations are reduced to subclinical levels because of modern therapies. For
example, ESR and CRP levels correlate rather well with radiographs (reviewed in [Scott et
al., 2010]), while bone edema made visible by imaging techniques may be regarded as a
precursor of bone erosion [Farrant et al., 2007]. Nevertheless, these measures describe only
part of the picture; e.g., ESR and CRP appear to correlate disease activity, but not so nicely
with additional disease outcomes, like functional disability and mortality (reviewed in [Scott
et al., 2010]).
Biologic therapies, coupled with more aggressive therapeutic strategies, have resulted in
major clinical progress. As these therapies are not completely effective yet, and not all
patients respond equally well to the same treatment, the pursued objective is still to make the
patient feel better, by controlling the symptoms (inflammation, pain) and joint structure/organ
damage (disability/comorbility). This aim have brought new developments in outcome
measures in order to detect signs of improvement (or worsening) when there are low levels of
disease activity. The complexity of RA makes difficult to find single representatives of all the
different disease outcomes, where laboratory tests (ESR, CRP) are just one out of a number of
core assessments to take into consideration, including joint counts, global assessment (doctor
and patient), pain score, or disability. Thus, in order to be useful and increase statistical
power, different outcome measures are combined in single, comprehensive, and easily
derived composite scores. These pooled indexes need cautious interpretation [Wolfe F et al.,
2005], and fall in two categories: response or state measures.
Frequently used response measures are the European League Against Rheumatism
(EULAR) response criteria and the American College of Rheumatology (ACR; formerly the
American Rheumatism Association) improvement criteria. To classify a patient as good,
moderate or non-responder, the EULAR criteria use the absolute level of disease activity at
the endpoint (DAS or DAS28; see below), as well as the magnitude of improvement in DAS
indexes. Regarding the ACR improvement criteria, they are widely accepted for use in
clinical trials because they were created to assess changes in the signs and symptoms of RA
between the drug and placebo groups. In clear contrast, their use in daily practice is more
limited [Felson et al., 1995], since the goal is to reach low disease activity or even remission,
and the ACR improvement criteria do not determine the actual degree of disease activity
because the patient´s disease baseline is not taken into consideration [Furst et al., 2007]. The
ACR criteria only define a patient as improved if it is recorded at least 20% improvement
(ACR20%) in tender and swollen joint counts as well as three out of five core-set variables:
acute phase reactant, pain, patient´s global assessment of disease activity, doctor´s global
assessment of disease activity and physical disability/HAQ. ACR50% and 70% criteria have
also been created. Nowadays, despite the most efficient outcome measure for clinical trials
are measures of change as the ACR criteria, state measures (e.g., DAS28) are gradually taken
their place [Fransen et al., 2009].
Within the assessment of the state, the Disease Activity Score (DAS) and its modified
and simpler version DAS28 are continuous measures intended to evaluate the disease activity
 Rheumatoid Arthritis 21

at a given time point. The DAS28, for example, is a frequent measure used in therapeutic
trials, but also a guide for treatment decisions and description of disease activity.
DAS28 combines different measures in a single comprehensive score, which includes
assessment of level of tenderness and swelling of 28 joints (e.g., hands, arms, and knees),
acute phase response markers (C-reactive protein/CRP or erythrocyte sedimentation
rate/ESR), and a global assessment rating of disease activity made by the patient (Visual
Analog Scale/VAS disease activity). Some clinicians use this index to monitor the level of
underlying rheumatoid inflammation (disease activity).
DAS28 ranges from 0 to 10, but a meaningful cut-off point can be used if
dichotomizations are preferred. Thus, a score higher than 5.1 means a high disease activity, a
value below 3.2 indicates low disease activity, and remission is achieved when the score is
lower than 2.6 [Van Gestel et al., 1996, 1998].
In contrast, others find the DAS28 index still impractical for everyday use. The
explanation is that rheumatologists generally do not perform a formal joint count at every
visit, calculation of DAS28 entails application of a complex mathematical formula, and
complete results can not be obtained immediately because they involve the evaluation of an
acute phase reactant. In addition, DAS28 is not always an accurate and sensitive indicator of
treatment effect in RA (reviewed in [Scott et al., 2010]).
Bearing that in mind, new assessment tools have been created to evaluate the response to
therapy. In them, the use of patient-filled questionnaires (the patient´s opinion about morning
stiffness, fatigue, joint pain, depression, loss of autonomy, etc) is becoming increasingly
important. Patient-based measures are especially important because they show how the
individuals perceive their disease. Two good examples are the Simplified Disease Activity
Index (SDAI) and the Clinical Disease Activity Index (CDAI). Still, scoring in SDAI and
CDAI involves 28-joint counts and even determination of CRP levels (SDAI). Another
example is the RA Disease Activity Index (RADAI). To calculate this score patient must fill
in a self-report questionnaire of symptoms and makes a self-assessed joint count [Fransen et
al., 2009].
Faster and simple assessments, where physician joint count has been removed too, are
Routine Assessment of Patient Index Data (RAPID) 3 and Patient Activity Scale (PAS). They
are made of three patient-reported measures: pain, patient global assessment of disease
activity, and the Health Assessment Questionnaire (HAQ). RAPID has also given rise to two
slightly more complicated derivatives; RAPID 4, which includes patient-reported joint count,
and RAPID5, where physician makes also an estimate of global status. Nevertheless, many
rheumatologists are still hesitant in omitting physician-derived sources of information as the
joint count [Fransen et al., 2009].
Finally, to assess disease outcomes as discomfort and disability there are several
questionnaires; the most common is the disability index of the HAQ. Mortality/life
expectancy and joint damage progression can be used as disease outcomes in the long term
context (>1 year). Joint damage progression can be rated, for example, with a system such as
the Sharp-vanderHeijde score applied to X-rays images of the hands and feet, while improved
trends of survival can be an important outcome for clinical trials or to measure the quality of
rheumatology care unit. Quality of life (e.g., emotional wellbeing, functioning) is another
outcome whose measure in RA can be made, for example, with the Short Form (SF)-36
questionnaire on general health (reviewed in [Scott et al., 2010]).
22 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

4. The Identification of Biomarkers for

Early Disease Diagnosis and Prediction of
Drug Responses
As commented before, the diagnosis of RA relies mainly on clinical manifestations. The
problem is that many other conditions resemble those. Therefore, by the time the diagnosis
arrives, it is too late and irreversible damage has occurred in the joint. Many times, even
blood test and X-ray show normal results for months after the onset of the joint paint. After
the diagnosis of RA, it is as important to follow up the progress of the disease in order to treat
it appropriately.
Nowadays, there is no single test to identify this disease clearly. That is why recently the
search for new biomarkers that can make a good diagnosis and prognosis of the disease has
boosted. Key to this new era of biomarkers discovery has been the development of high-
throughput techniques, like proteomics or GWAS (Genomic Wide Association Studies),
which allow the analysis of complex samples from different origins: synovial fluid, plasma
blood, cells secretome, cellular lysates, etc. The discovery of new biomarkers will improve
the early detection of RA and the monitoring of treatment response, and it will help to find
new therapies to treat the disease.
However this landslide of promising new biomarkers has not been rewarded with a new
set of biomarkers that allow an accurate diagnosis or prognosis. As pointed out in several
reports [Smolen et al., 2008; van Baarsen et al., 2009; Tektonidou and Ward, 2010; Tesch et
al., 2010], many translational studies for potential biomarkers fail to include design features
required for a valid clinical application, thus giving origin to a great number of false-positive
and false-negative association between molecules and pathologies. Assessing the quality of
the control group is a key point; patients should be matched by age and sex because
expression of immune-related genes, like immunoglobulins and interferon, has a specific
association with these two features [Eady et al., 2005; Whitney et al., 2003]. Sometimes
“healthy volunteers” for control groups might not take into consideration possible medication
related to minor medical conditions. This is also a point many times forgotten when assessing
the “patient group”, since medication alters significantly biomarkers expression [Kehlen et.
al, 2002; Bennett et al., 2003]. It is also noteworthy the absence of more informative
longitudinal studies, where biomarkers change as disease activity varies [Tektonidou and
Ward, 2010]. Regarding the use of High-throughput technologies, there is a lack of SOPs
(Standard Operation Procedures), from sample handling to analysis, that could allow data to
be compared amongst different laboratories; this is a major limitation in the discovery of new
biomarkers [van Baarsen et al., 2009; De Bock et al., 2010]. False negatives are probably
common due to failure on considering these points, but as they are more likely not to be
reported remains as an immeasurable problem [Tektonidou and Ward, 2010].

4.1. miRNA

MicroRNAs (miRNA) is a promising new class of biomarkers. They are widely studied
in cancer [Nana-Sinkam and Croce, 2011], and their use in other diseases, such as
autoinmmune diseases, has just began to be unveiled [Dai and Ahmed, 2011; Duroux-Richard
 Rheumatoid Arthritis 23

et al., 2011]. The origin, function and mechanism have been widely studied, although we are
far away from knowing everything about them [Ambros, 2004; Bartel, 2004; Tijsterman and
Plasterk, 2004]. Briefly, microRNAs are short RNA molecules that regulate messenger RNA
(mRNA) post-transcriptionally, resulting in repression and gene silencing. miRNA in animals
can target many different sites on the same mRNA or many different mRNAs. The mature
miRNA binds to a protein complex called RISC (RNA-induced silencing complex) or miRNP
(microRNA ribonucleoprotein complex), which contains an endoribonuclease called Dicer
that cleaves double-stranded RNA, forming what sometimes is referred as “miRISC”. Within
this miRISC complex, Dicer cleaves the miRNA generating a short single stranded RNA
molecule (siRNA); the RISC complex, housing a siRNA, recognises complementary mRNA
molecules and degradates them. In this way, the target protein translation decreases, thus
resulting in the gene silencing.
The role of miRNAs in RA has gained a lot of attention in recent years. It is clear that
miRNAs are important regulators in the disease, particularly since they participate in the
regulation of the immune function [Dai and Ahmed, 2011]. A recent article has shown the
importance of miR-155 in a murine experimental model [Blüml et al., 2011]. The miR-155
miRNA, and also the miR-146a miRNA, are usually found deregulated in RA samples
[Nakasa et al., 2008; Pauley et al., 2008; Stanczyk et al., 2008; Murata et al., 2010]. These
two miRNAs are implicated in the regulation of the inflammatory response [Taganov et al.,
2006], so it is not surprising to find them involved in the pathogenesis of RA. Other miRNAs
studied are also regulators of the immune function: miR-16, miR-132, miR-223 [Duroux-
Richard et al., 2011].
miRNAs can be detected in body fluids including serum, plasma, urine, saliva, tears, etc,
thus providing us with a readily accessible biomarker [Gilad et al., 2008]. The detection of
miRNAs in serum was quite unexpected, since RNA molecules are known to be highly
unstable. However, they can avoid RNAase activity as they circulate in the blood within
exosomes or lipoproteins [Hunter et al., 2008; Vickers et al., 2011]. Although blood is an
accessible way of measuring biomarkers, very few studies have approached this strategy for
miRNA detection [Gilad et al., 2008; Vickers et al., 2011].
In 2010, Murata et al. were the first to identify 5 possible miRNA as biomarkers for RA;
they found that there is a distinct pattern in plasma from synovial fluid, although the miRNAs
were originated in the former. miR-132 was a good marker that differentiates healthy controls
from RA and OA in plasma, and it could have diagnosis value as a marker between RA and
OA in synovial fluid; however, miR-132 does not correlate with the DAS28, thus reducing its
value as diagnosis biomarker.
Other miRNAs studied (miR-16, miR-146a, miR-155, miR-223) presented higher levels
in RA synovial fluid than OA, thus they might provide with a new set of biomarkers to
distinguish these two diseases; in this case, this fluid is not so readily available, so their use
would be limited too [Murata et al., 2010]. It is noteworthy that miR-16 has been found to be
elevated also in PBMCs from RA patients [Pauley et al., 2008], as well as plasma [Murata et
al., 2010], and there is a correlation with DAS28, so it may indicate that this is a good
biomarker of disease activity. Further studies would be necessary in order to clarify the
usability of miRNAs as biomarkers of RA.
24 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

4.2. Genetic Markers in RA

Multiple factors seem to be behind the development of RA. The environment has got a
big impact on the disease. Thus, geography, climate, and lifestyle have got a preeminent role
on every autoimmune disease [Youinou et al., 2010], but this is not enough. The population
prevalence is around the 1%, but some families show a higher susceptibility to suffer RA, a
fact that is supported by the increased prevalence of RA in monozygotic and same-sex
dizygotic twins (prevalence of RA is 12-30% and 5-10%, respectively). There are also some
differences between ethnical groups. Native Americans show a prevalence of >2%, while
eastern Asia and African populations have got the lowest (<0.3%) [MacGregor et al., 2000;
Alamanos and Drosos, 2005]. The most part of the studies have focused on the identification
of SNPs (single nucleotide polymorphisms) associated with RA susceptibility through
genome wide association (GWA) studies, thus allowing us to monitor thousands of genes in a
single experiment [Toonen et al., 2008; Raychaudhuri, 2010]. However, none studies to date
have found any allele or any alleles combination that clearly determine the development of
RA; environment, thus, plays a significant role into it.
The HLA region has been reported many times to be involved in RA. Serological studies
conducted in the 70s and 80s had already pointed out in that direction, but there has been
further confirmation during SNPs search [Alekseyenko et al., 2011; Liu et al., 2011]. Some of
the candidates found are rs660895, rs6910071, rs9275390, rs3129871, and rs9275374. The
area involved, HLA-DR, is known for its high polymorphism, specifically in the common
“shared epitope” (SE). But the contribution of this locus to the pathogenesis remains obscure,
since it does not explain how the MHC is related to the disease. Recent studies further suggest
that those SNPs within the HLA region, combined with the ACPA positive disease, might
comprehend a distinct subgroup with a more severe form of the disease [Cui et al., 2009;
Perricone et al., 2011]. Thus, the coincidence of both markers could be considered a bad
prognosis and requires a closer follow up.
Other SNPs colocalize with the loci of PTPN22 and TRAF1-C5, as well as are placed
near the CD28-CTLA4-ICOS locus [Liu et al., 2011]. PTPN22 is an intracellular tyrosine
phosphatase gene that encodes the protein Lyp, an inhibitor of T cell activation. The strongest
association is found with rs2476601. This polymorphism resides in a large haplotype that
spans to several flanking loci and encodes an amino acid change from R to W at position 620
(620W). It is not known how exactly this variation affects the disease, but it has been
suggested that it encodes a phosphatase with reduced affinity for the target kinases, thus
leading to a ineffective downregulation of T cells [Lee et al., 2005; Wesoly et al., 2007].
Although this polymorphism is clearly associated with RA, it has also been linked to several
other autoimmune diseases, like type 1 diabetes or Crohn’s disease [Criswell et al., 2005;
Burn et al., 2011].
TRAF1-C5 has got the strongest link between SNPs and RA with the polymorphisms
rs376184 and rs10818488 [Kurreeman et al., 2007; Plenge et al., 2007; Zhu et al., 2011]. The
genetic signals are located between the genes of TRAF-1 and C5, and they also include the
protein PHF19 (PHD finger protein 19), so the three of them are affected by those
polymorphisms [Chang et al., 2008; Han et al., 2009]. C5 is part of the complement and
contributes to the destruction of the synovium; it also acts as a potent pro-inflammatory
chemotactic factor [Ballanti et al., 2011]. TRAF1 (TNF receptor associated factor) mediates
the signal transduction from various receptors of the TNFR superfamily. Therefore, TRAF1 is
 Rheumatoid Arthritis 25

involved in many cellular functions, like apoptosis, bone remodelling, and activation or
inhibition of cytokines. TRAF-1 is also linked to CD40 signalling, another molecule with a
strong association with RA [van der Linden et al., 2009].
The OPN (Osteopontin) polymorphism rs9138 has got a positive correlation with RA, at
least in Chinese population, but its increased levels might be derived from the presence of
pro-inflammatory mediators [Xu et al., 2005]. This molecule is responsible for the
enhancement of Th1 responses and the inhibition of Th2 responses [Kurokawa et al., 2011],
with different functions of the intracellular and secreted forms. It is noteworthy to point out
that this polymorphism has been found to be correlated with higher serum levels of OPN in
SLE [D’Alfonso et al., 2005]. Elevated serum levels of this protein in RA could result in the
maintenance of the inflamed synovium, via the continuous activation of the Th1 response,
and it can be a link between the inflammatory response, joint damage and cardiovascular risk
[Bazzichi et al., 2009].
CTL-4 is a member of the immunoglobulin superfamily that can be found in the
membrane of Th cells. Its structure it is similar to the co-stimulatory protein CD28, but
instead of transmitting a stimulatory signal, CTL-4 inhibits T cell activation [Alegre et al.,
1996]. Liu et al. also have found several SNP associated with RA near the CD28-CTLA4-
ICOS locus on chromosome 2q33 [Liu et al., 2011], a region previously reported to be linked
with the disease [Walker et al., 2009].
Other genetic markers include the SNP rs12523624 within the FGF1 (Fibroblast Growth
Factor-1) gene [Alekseyenko et al., 2011], which is also one of the SNPs found altered in
psoriatic arthritis [Butt et al., 2007]. Biswas et al. found many proinflammatory genes
activated, including those of several cytokines, pointing out to the activation of different
signalling pathways such as ATF4 (ER stress pathway) and IL8 for RA, and PLCγ signalling
in OA [Biswas et al., 2011].
Genes are a powerful tool to find new therapeutic targets. For instance,
immunosenescence and premature telomere shortening have been found to be behind the
onset and development of autoimmune diseases [Costenbader et al., 2011]. Therefore, any
drug developed to address this problem might have a therapeutic use in RA. Not many studies
have exploited the potential of genetics to monitor the drug response and therefore the healing
process [Lindberg et al., 2006; Lequerré et al., 2006; Koczan et al., 2008; Gutierrez-Roelens
et al., 2011; Lindberg et al., 2010]. Pharmacogenomics looks a promising pathway, because
biomarkers to predict drug efficacy are definitely required for RA management even more
than those for diagnosis. Indeed, as more and more genetic markers are found, they will be
more useful to assess the specific risk of an individual, particularly in families with a known
history of RA. These variants might also represent drug response markers, so this is only the
beginning.

4.3. Epigenetics

Some studies point out that although there is a common genetic background to
autoimmune diseases this is not enough to explain the lower than 50% of concordance rate in
monozygotic twins [Ballestar, 2010]. There must be complementary mechanisms involved in
the regulation of genes that eventually cause the disease; epigenetic changes may be the key.
Epigenetics studies show how histone modifications and DNA methylation determine
26 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

changes in genomic function without altering the DNA sequence; these modifications can be
inherited and inheritable, and determine the expression pattern of genes. They represent an
adaptative mechanism that allows the cell to respond to environmental changes.
Some studies have highlighted the importance that epigenetics plays in the development
of autoimmune diseases [Ballestar et al., 2006; Lu et al., 2010; Meda et al., 2011; Ballestar,
2011], and how divergences between siblings with the same genetic predisposition arise due
to the “epigenetic drift” [Fraga et al., 2005], so that monozygotic twins have a different
epigenetic fingerprint due to different environmental expositions. SLE can be considered a
classical example of how this genomic regulation affects a disease, because DNA methylation
is known to have a role on the disease [Javierre et al., 2010; Zhao et al., 2010; Jeffries et al.,
2011]. It is not clear, anyway, whether those changes initiate the pathogenesis or, more likely,
are an expression of an ongoing process.
Regarding RA, Maciejewska et al. have recently showed that in the aggressive phenotype
of RA synovial fibroblasts (RASF) the expression of SUMO-1 (a small ubiquitin like
modifier involved in regulating protein stability) and MMP-1 are regulated by histone
acetylation, and it is responsible for the RASF invasiveness [Maciejewska-Rodrigues et al.
2010]. There have also been reports on a decreased level on global DNA methylation
[Karouzakis et al., 2009], including the Line-1 promoter [Neidhart et al., 2000], and the
promoter of TNFRSF25 (Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25, also known
as DR-3, Death Receptor 3), leading to a reduction of its levels in synovial cells [Takami et
al., 2006]. A general increase in histone deacetylase (HDAC) activity is also involved in the
pathology of RA, as it is reflected in the effectiveness of the therapy with HDAC inhibitors
[Grabiec et al., 2008].
Epigenetic changes in DNA are not an immediate biomarker with clinical applications for
RA (or any other autoimmune disease), but they fill the gap between genetics and
environmental factors, so it is easy to foresee their use to monitor the progress of the disease,
particularly in patients that do not respond to the usual treatment or in very aggressive cases
of RA.

4.4. Protein Markers in Diagnosis and Prognosis

Proteins are the executors of biological activities. The alternative splicing of gene
transcripts gives origin to multiple variants, and hence allowing its functional modulation;
new levels of complexity are added by post-translational modifications and protein-to-protein
interaction. Their expression levels and the above mentioned characteristics are strongly
influenced and controlled by environmental changes, including disease. Proteomics is a
technique that allows the study of this dynamic protein network; it can be defined as the
large-scale, systematic study of proteins and it includes the description of their interactions,
localizations and functions.
Proteomics has been widely employed because it gives a comprehensive picture of
protein changes in response to disease onset and progress, as well as drug response.
Autoimmune diseases have not escaped from these techniques; in fact, the inherent difficulty
in finding the origin of this pathogenesis, or the right markers for early diagnosis and
prognosis, have made autoimmune diseases (for example, rheumatoid arthritis) a preferred
object of proteomic studies [Camafeita et al., 2009]. We will now address some of the
 Rheumatoid Arthritis 27

putative proteins that could be use as RA biomarkers, identified, mainly, using these
techniques.

4.4.1. Apoliproteins
The relationship between the serum apolipoprotein levels and RA has been known for a
long time, and further confirmed nowadays with proteomic studies [Zheng et al., 2009; Li et
al., 2010]. Apoliproteins are lipid carriers, mainly known for carrying cholesterol.
Apoliprotein A-I (ApoA) is the major component of the HDL complex (High Density
Lipoprotein, or “good cholesterol”), and ApoB is part of the LDL complex (Low Density
Lipoprotein). In patients with RA, the levels of ApoA-I are significantly reduced [Park et al.,
1999], thus increasing the ratio ApoB / ApoA-I and the cardiovascular risk.
It has been proposed that sustained lower serum levels of ApoA-I might be a sign of
chronic inflammation [Burger and Dayer., 2002], and also that HDL might excerpt and anti-
inflammatory activity [Hyka et al., 2001]. Both functions, together, suggest that ApoA-I has a
protective role over RA. In contrast, levels of ApoA-I are found in higher concentration in the
synovium of RA affected joints [Ananth et al., 1993], where it could downregulate the tissue
inflammation and also the intra-articular fibrin formation [Busso et al., 2001].
The composition of the HDL complex is also important to evaluate the degree of the
disease control under drug treatment. Higher levels of haptoglobin or haemoglobin, as well as
ApoA-I, are associated to the proinflammatory form of HDL, and are also characteristic of an
active disease [Charles-Schoeman et al., 2009].
RA is associated with a general increased cardiovascular risk; patients present an
increased frequency of atherosclerosis, ischaemic stroke and acute myocardial infarction
[Semb et al., 2010]. It has been suggested that, apart from the ApoB / ApoA-I ratio, some RA
susceptibility genes (TRAF1/C5, STAT4 and HLA-DRB1-SE) might be involved in the
regulation of lipid metabolism, increasing the susceptibility of having a cardiovascular event
[Toms et al., 2011]; the same has been mentioned for the levels of anti-Apo-A-I IgG
[Vuilleumier et al., 2010]. However, an increased serum ApoB / ApoA-I ratio is not exclusive
of RA, because it can be found in many other circumstances. Still, it seems a good prognosis
indicator in RA; treatments with infliximab or with etanercept reduce the apoB / apoA-I ratio
[Trocmé et al., 2009; Jamnitski et al., 2010], and hence the cardiovascular risk associated to
this disease.

4.4.2. Serum Amyloid Proteins

Serum amyloid A (SAA) has been found to be elevated in several studies with plasma
and synovial fluids [Mallya et al., 1982; Zheng et al., 2009; Jin et al, 2009]. It comprises a
number of protein isoforms that also form part of the HDL complex; they are expressed
constitutively, but also increase their levels in response to inflammatory stimuli [Uhlar and
Whitehead, 1999]. Secondary amyloid A amyloidosis is also an important complication of
rheumatoid arthritis [Nakamura, 2008].
The acute SAA is also a regulator of the inflammatory response in chronic inflammatory
sites, such as the RA affected joint. It can promote fibroblast proliferation and ROS
production [Hatanaka et al., 2011], so SAA might play an important role in the pannus
development; it is also capable of activating cytoskeletal signalling pathways, leading to the
regulation of cell-matrix interactions and cell migration to the affected synovium [Connolly et
al., 2011]. SAA can be used as marker to monitor drug responses, as reduces its level with
28 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

different treatments, like leflunomide [Targońska-Stępniak et al., 2010] or etanercept

[Nakamura et al., 2010].

4.4.3. Calgranulins
Calgranulings are a group of calcium binding proteins that are biochemically related to
the S100 protein family. Calmodulins are cytosolic complexes that are composed of at least
two calgranulin chains: calgranulin A (S100A8 or Migration inhibition factor-related protein-
8, MRP8), and calgranulin B (S100A9 or Migration inhibition factor-related protein-14,
MRP14); this dimmer is also known as calprotectin. These two proteins, along with
calgranulin C (S100A12), have been found to be elevated in serum, plasma, synovial fluid
and saliva of RA patients [Madland et al., 2002; de Seny et al., 2005; Trocmé et al., 2009;
Zheng et al., 2009; Giusti et al., 2010]. Moreover, they correlate with levels of anti-CCP and
other RA risk markers [Hammer et al., 2008; Chen et al., 2009].
Calgranulins A and B can also function as inflammatory cytokines, promoting leukocyte
migration and adhesion [Ryckman et al., 2003], whereas calgranulin C is expressed by
infiltrating monocytes, functioning as a monocyte chemoattractant and activating mast cells to
sequester them in inflammatory lesions [Yang et al., 2001; Yang et al., 2007]. However,
although many studies have highlighted their role on RA [Madland et al., 2002; Hammer et
al., 2007] none of them are specific of RA, since S100 proteins are also elevated in other
inflammatory or autoinmmune diseases such as Sjogren’s Syndrome, JIA or SLE [Brun et al.,
1994; Frosch et al., 2003; Kane et al., 2003; Foell et al., 2010]. In contrast, they might be a
good differentiation marker for OA [Sinz et al., 2002; Athan Baillet et al., 2010].

4.4.4. Other Proteins

LRG (leucine-rich alpha-2-glycoprotein) is an acute phase response protein shown to be
involved in protein-protein interactions, signal transduction and cell adhesion [O’Donell et
al., 2002]. It has been suggested that its function is related with counteracting lymphotoxicity,
since it bounds to the extra-cellular cytochrome c released from apoptotic cells [Codina et al.,
2010], and as a modulator of neutrophil activation [Ai et al., 2008]. LRG was identified in
sera from RA patients along with other acute phase response proteins in two independent
reports [Salgado et al., 2010; Serada et al., 2010]. It represents a promising biomarker since it
correlates with disease activity and, particularly, because it can be detected in a subpopulation
where C-reactive protein levels were normal [Serada et al., 2010].
MnSOD (manganese superoxide dismutase) has been found elevated in synovial tissues
in two different studies [Bo et al., 2009; Chang et al., 2009], so it could be a useful marker to
predict the outcome of a therapy. MnSOD is an antioxidant enzyme that catalyzes the
superoxide transformation into oxygen and hydrogen peroxide, thus reducing the levels of
Reactive Oxygen Species (ROS). ROS are known to be mediators of inflammation and
collaborate in the extracellular matrix degradation [Mazzetti et al., 2001] and the oxidative
stress associated with HDL, which seems to be behind the severity of coronary calcification
[Rho et al., 2010]. PRDX4 is another antioxidant protein (protein peroxiredoxin 4) found
elevated in synovial tissue [Chang et al., 2009]. Its role is to reduce ROS levels in the
endoplasmic reticulum, and it has been suggested that its function might be also to
downregulate growth factor signals [Palande et al., 2011]. Both enzymes could be either new
therapeutically targets or biomarkers of drug treatment response [Vanarsa and Mohan, 2010].
 Rheumatoid Arthritis 29

Platelet factor 4 (PF4, CXCL4) is also a promising marker to follow up treatment

success. Trocmé et al. found that elevated plasma levels of PF4 correspond negatively with
the response to infliximab therapy [Trocmé et al., 2009], although this finding needs to be
corroborated in a larger study and results correlated with the DAS28 assessment.
TNFR2 (TNF Receptor 2) is also a relevant new biomarker to be considered. It is only
found in the membrane of immune cells or in a soluble form in various tissues; the soluble
protein might compete for the TNF-α binding, thus reducing its circulating levels. In a large-
scale long-term follow up study, Karlson et al. found that blood TNFR2 can be found
elevated up to 12 years before the onset of the disease, thus reinforcing the hypothesis of 3
phases in the disease: genetic susceptibility, preclinical autoimmunity with immune
activation, followed by clinical symptoms [Karlson et al., 2009]. This potential biomarker
might give us clues on how and why the disease is developed, as it will allow the
identification of RA patients before the actual onset of the disease and the joint damage.
ADA activity levels (adenosine deaminase) are found increased in platelets of RA
patients, thus reducing the availability of the ADP in serum, a potent anti-inflammatory
molecule with an important protective role in atherosclerosis [Becker et al., 2010]; it might be
considered as a risk factor for cardiovascular events.

4.5. The Use of New Biomarkers: Future Considerations

As we have mentioned above, genetic background is an important factor for developing

RA, but it is not all. Thus, any genetic marker should be considered as an associated risk. The
combination of genetic markers and protein profiling (TNFR2) seems a promising way to
monitor the onset of the disease in some subpopulations with a greater risk associated, even
before the clinical manifestations arise (e.g., a family history of RA). Regarding the
diagnosis, it seems everyday more clear that there is not a unique protein that distinguishes
the disease, probably because many autoimmune diseases share a common autoreactive
cellular pathway, especially joint damaging diseases; it is more likely that any of these
diseases is characterized with a “protein profile” rather than a specific marker. For prognosis,
two types of biomarkers should be considered: those that tell us the state and the degree of the
disease (active, in remission; like PF4 or S100 proteins), and those that help us to prevent
RA-associated problems, like cardiovascular risk (ApoA, SAA, calgranulins, MnSOD,
ADA); both of them should be tested for monitoring the patient’s response to medication.
Again, a panel of biomarkers must be assessed in order to have a wide view on what’s going
on.

Concluding Remarks
Rheumatoid arthritis is a heterogeneous disease, and we do not have enough information
on the immunological base that determines the trigger of the disease; it is probably long
before the onset of the clinical manifestation. By the time the diagnosis is done, there is too
much damaged to be reversed naturally; available treatments at the moment are only able to
30 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

stop the disease progression. New drugs and combinations can reduce the impact RA has got
on patient’s everyday life and reduce the disease outbreaks.
Diagnosis and prognosis biomarkers, particularly those that monitor the drug response,
have beneficiated from the development of new high-throughput techniques. But we are still
far from having a validated “protein profile” of the disease ready to use in clinical
applications. Many developments have been made, but a great coordinated research effort is
still required to obtain a better understanding of RA pathogenesis and how to overcome it.

References
Abraham, DJ; Varga, J. Scleroderma: from cell and mollecular mechanisms to disease
models. Trends in Immunology. 2005. 26(11), 587-595.
Ai, J; Druhan, LJ; Hunter, MG; Loveland, MJ; Avalos, BR. LRG-accelerated differentiation
defines unique G-CSFR signaling pathways downstream of PU.1 and C/EBPepsilon that
modulate neutrophil activation. J. Leukoc. Biol. 2008. May;83(5), 1277-1285.
Alamanos, Y; Drosos, AA. Epidemiology of adult rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev.
2005. Mar;4(3),130-136.
Alegre, ML; Noel, PJ; Eisfelder, BJ; Chuang, E; Clark, MR; Reiner, SL; Thompson, CB.
Regulation of surface and intracellular expression of CTLA4 on mouse T cells. J.
Immunol. 1996. Dec;157(11), 4762-4770.
Alekseyenko, AV; Lytkin, NI; Ai, J; Ding, B; Padyukov, L; Aliferis, CF; Statnikov, A.
Causal Graph-Based Analysis of Genome-Wide Association Data in Rheumatoid
Arthritis. Biol Direct. 2011. May;6(1), 25.
Aletaha, D; Breedveld, FC; Smolen, J. The need for new classification criteria for rheumatoid
arthritis. Arthritis Rheum. 2005. 52, 3333-3336.
Aletaha, D; Neogi, T; Silman, AJ; Funovits, J; Felson, DT; Bingham, CO; Birnbaum, NS;
Burmester, GR; Bykerk, VP; Cohen, MD; Combe, B; Costenbader, KH; Dougados, M;
Emery, P; Ferraccioli, G; Hazes, JMW; Hobbs, K; Huizinga, TWJ; Kavanaugh, A; Kay,
J; Kvien, TK; Laing, T; Mease, P; Menard, HA; Moreland, LW; Naden, RL; Pincus, T;
Smolen, JS; Stanislawska-Biernat, E; Symmons, D; Tak, PP; Upchurch, KS; Vencovsky,
J; Wolfe, F; Hawker, G. 2010 Rheumatoid Arthritis Classification Criteria. Arthritis
Rheum. 2010. 62(9), 2569–2581.
Ambros, V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004. Sep;431(7006), 350-355.
Ananth, L; Prete, PE; Kashyap, ML. Apolipoproteins A-I and B and cholesterol in synovial
fluid of patients with rheumatoid arthritis. Metab. Clin. Exp. 1993. Jul;42(7), 803-806.
Annunziato, F; Cosmi, L; Santarlasci, V; Maggi, L; Liotta, F. Phenotypic and functional
features of human Th17 cells. J. Exp. Med. 2007. 204, 1849–56.
Arnett, FC; Edworthy, SM; Bloch, DA; McShane, DJ; Fries, JF; Cooper, NS; Healey, LA;
Kaplan, SR; Liang, MH;Luthra, HS; Medsger, TA; Mitchell, DM; Neustadt, DH; Pinals,
RS; Schaller, JG; Sharp, JT; Wilder, RL; Hunder, GG. The American Rheumatism
Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis
Rheum. 1988. 31, 315–24.
 Rheumatoid Arthritis 31

Attur, MG; Dave, M; Akamatsu, M; Katoh, M; Amin, AR. Osteoarthritis or osteoarthrosis:

the definition of inflammation becomes a semantic issue in the genomic era of molecular
medicine. Osteoarthritis Cartilage. 2002. 10, 1–4.
Ayral, X; Pickering, EH; Woodworth, TG; Mackillop, N; Dougados, M. Synovitis: a potential
predictive factor of structural progression of medial tibiofemoral knee osteoarthritis
results of a 1 year longitudinal arthroscopic study in 422 patients. Osteoarthritis
Cartilage. 2005. 13, 361–367.
Baillet, A; Trocmé, C; Berthier, S; Arlotto, M; Grange, L; Chenau, J; Quétant, S; Sève, M;
Berger, F; Juvin, R; Morel, F; Gaudin, P. Synovial fluid proteomic fingerprint: S100A8,
S100A9 and S100A12 proteins discriminate rheumatoid arthritis from other
inflammatory joint diseases. Rheumatology. 2010. Apr;49(4), 671-682.
Ballanti, E; Perricone, C; di Muzio, G; Kroegler, B; Chimenti, MS; Graceffa, D; Perricone. R.
Role of the complement system in rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis:
Relationship with anti-TNF inhibitors. Autoimmun. Rev. 2011. Apr 27
[doi:10.1016/[Link].2011.04.012].
Ballestar, E; Esteller, M; Richardson, BC. The epigenetic face of systemic lupus
erythematosus. J. Immunol. 2006. Jun;176(12), 7143-7147.
Ballestar, E. Epigenetic alterations in autoimmune rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol.
2011. May;7(5), 263-271.
Ballestar, E. Epigenetics lessons from twins: prospects for autoimmune disease. Clin. Rev.
Allergy. Immunol. 2010. Aug;39(1), 30-41.
Bartel, DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004.
Jan;116(2), 281-297.
Bayley, JP; Bakker, AM; Kaijzel, EL; Huizinga, TW; Verweij, CL. Association of
polymorphisms of the tumour necrosis factor receptors I and II and rheumatoid arthritis.
Rheumatology. 2003. 42(8) 969-971.
Bazzichi, L; Ghiadoni, L; Rossi, A; Bernardini, M; Lanza, M; De Feo, F; Giacomelli, C;
Mencaroni, I; Raimo, K; Rossi, M; Mazzone, AM; Taddei, S; Bombardieri, S.
Osteopontin is associated with increased arterial stiffness in rheumatoid arthritis. Mol.
Med. 2009. Dec;15(11-12), 402-406.
Becker, LV; Rosa, CS; Souza, V do CG; Bagatini, MD; Casali, EA; Leal, CAM; da Silva,
JCN; Moretto, MB; Pinheiro, F de V; Morsch, VM; Schetinger, MRC; Leal, DBR.
Activities of enzymes that hydrolyze adenine nucleotides in platelets from patients with
rheumatoid arthritis. Clin. Biochem. 2010. Sep;43(13-14), 1096-1100.
Bennett, L; Palucka, AK; Arce, E; Cantrell, V; Borvak, J; Banchereau, J; Pascual, V.
Interferon and granulopoiesis signatures in systemic lupus erythematosus blood. J. Exp.
Med. 2003. Mar;197(6), 711-723.
Biswas, S; Manikandan, J; Pushparaj, PN. Decoding the differential biomarkers of
Rheumatoid arthritis and Osteoarthritis: A functional genomics paradigm to design
disease specific therapeutics. Bioinformation. 2011. 6(4), 153-157.
Blüml, S; Bonelli, M; Niederreiter, B; Puchner, A; Mayr, G; Hayer, S; Koenders, MI; van den
Berg, WB; Smolen, J; Redlich, K. Essential role of miRNA-155 in the pathogenesis of
autoimmune arthritis in mice. Arthritis Rheum. 2011. May;63(5), 1281-1288.
Bo, GP; Zhou, LN; He, WF; Luo GX; Jia, XF; Gan, CJ; Chen, GX; Fang, YF; Larsen, PM;
Wu, J. Analyses of differential proteome of human synovial fibroblasts obtained from
arthritis. Clin. Rheumatol. 2009. Feb;28(2), 191-199.
32 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

Bohndorf, K; Schalm, J. Diagnostic radiography in rheumatoid arthritis: benefits and

limitations. Baillieres Clin. Rheumatol. 1996.10, 399–407.
Boilard E, Nigrovic PA, Larabee K, Watts GFM, Coblyn JS, Weinblatt ME, Massarotti EM,
Remold-O'Donnell E, Farndale RW, Ware J, Lee DM. Platelets Amplify Inflammation in
Arthritis via Collagen-Dependent Microparticle Production. Science, 2010. 327(5965),
580–583.
Bongatz, T, Sutton, AJ, Sweeting, MJ; Buchan, I; Mattesin, EL; Montori, V. Anti-TNF
antibody therapy in rheumatoid arthritis and the risk of serious infections and
malignancies: systematic review and meta-analysis of rare harmful effects in randomized
controlled trials. JAMA. 2006. 295, 2275–85.
Bowes, J; Barton, A. Recent advances in the genetics of rheumatoid arthritis. Rheumatology.
2008. 47, 399–402.
Breedveld, FC; Weisman, MH; Kavanaugh, AF; Cohen, SB; Pavelka, K; van Vollenhoven,
R; Sharp, J; Perez, JL; Spencer-Green, GT. The PREMIER Study. A multicenter,
randomized double-blind clinical trial of combination therapy with adalimumab plus
methotrexate versus methotrexate alone or adalumimab alone in patients with early,
aggressive rheumatoid arthritis who had not received methotrexate treatment. Arthritis
Rheum. 2006. 54, 26–37.
Brun, JG; Jonsson, R; Haga, HJ. Measurement of plasma calprotectin as an indicator of
arthritis and disease activity in patients with inflammatory rheumatic diseases. J.
Rheumatol. 1994. Apr;21(4), 733-738.
Buckley, CD; Pilling, D; Lord, JM; Akbar, AN; Scheel-Toellner, D; Salmon, M. Fibroblasts
regulate the switch from acute resolving to chronic persistent inflammation. Trends
Immunol. 2001. 22, 199–204.
Bukhari, MA; Wiles, NJ; Lunt, M; Harrison, BJ; Scott, DG; Symmons, DP; Silman, AJ.
Influence of disease-modifying therapy on radiographic outcome in inflammatory
polyarthritis at five years: results from a large observational inception study. Arthritis
Rheum. 2003. 48, 46–53.
Burger, D; Dayer, JM. High-density lipoprotein-associated apolipoprotein A-I: the missing
link between infection and chronic inflammation? Autoimmun. Rev. 2002. Feb;1(1-2),
111-117.
Burn, GL; Svensson, L; Sanchez-Blanco, C; Saini, M; Cope, AP. Why is PTPN22 a good
candidate susceptibility gene for autoimmune disease? FEBS Lett. 2011. 20 Apr
[doi:10.1016/[Link].2011.04.032].
Busso, N; Dudler, J; Salvi, R; Péclat, V; Lenain, V; Marcovina, S; Darioli, R; Nicod, P; So,
AK; Mooser, V. Plasma apolipoprotein(a) co-deposits with fibrin in inflammatory
arthritic joints. Am. J. Pathol. 2001. Oct;159(4),1445-1453.
Butt, C; Lim, S; Greenwood, C; Rahman, P. VEGF, FGF1, FGF2 and EGF gene
polymorphisms and psoriatic arthritis. BMC Musculoskelet. Disord. 2007. 8,1.
Camafeita, E; Lamas, JR; Calvo, E; López, JA; Fernández-Gutiérrez, B. Proteomics: New
insights into rheumatic diseases. PROTEOMICS – Clinical Applications. 2009. Feb;3(2),
226-241.
Chang, M; Rowland, CM; Garcia, VE; Schrodi, SJ; Catanese, JJ; van der Helm-van Mil,
AHM; Ardlie, KG; Amos, CI; Criswell, LA; Kastner, DL; Gregersen, PK; Kurreeman,
FAS; Toes, REM; Huizinga, TWJ; Seldin, MF; Begovich, AB. A large-scale rheumatoid
 Rheumatoid Arthritis 33

arthritis genetic study identifies association at chromosome 9q33.2. PLoS Genet. 2008.
Jun;4(6):e1000107.
Chang, X; Cui, Y; Zong, M; Zhao, Y; Yan, X; Chen, Y; Han, J. Identification of proteins with
increased expression in rheumatoid arthritis synovial tissues. J. Rheumatol. 2009.
May;36(5), 872-880.
Charles-Schoeman, C; Watanabe, J; Lee, YY; Furst, DE; Amjadi, S; Elashoff, D; Park, G;
McMahon, M; Paulus, HE; Fogelman, AM; Reddy, ST. Abnormal function of high-
density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in
rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2009. Oct;60(10), 2870-2879.
Chen, YS; Yan, W; Geczy, CL; Brown, MA; Thomas, R. Serum levels of soluble receptor for
advanced glycation end products and of S100 proteins are associated with inflammatory,
autoantibody, and classical risk markers of joint and vascular damage in rheumatoid
arthritis. Arthritis Res. Ther. 2009. 11(2), R39-R39.
Choy, EHS; Smith, C; Dore, CJ; Scott, DL. A meta-analysis of the efficacy and toxicity of
combining disease-modifying antirheumatic drugs in rheumatoid arthritis based on
patient withdrawal. Rheumatology. 2005. 44, 1414–21.
Codina, R; Vanasse, A; Kelekar, A; Vezys, V; Jemmerson, R. Cytochrome c-induced
lymphocyte death from the outside in: inhibition by serum leucine-rich alpha-2-
glycoprotein-1. Apoptosis. 2010. Feb;15(2), 139-152.
Combe, B; Landewe, R; Lukas, C; Bolosiu, HD; Breedveld, F; Dougados, M; Emery, P;
Ferraccioli, G; Hazes, JM; Klareskog, L; Machold, K; Martin-Mola, E; Nielsen, H;
Silman, A; Smolen, J; Yazici, H. EULAR recommendations for the management of early
arthritis: Report of a task force of the European Standing Committee for International
Clinical Studies Including Therapeutics (ESCISIT). Ann. Rheum. Dis. 2007. 66, 34-45.
Connolly, M; Veale, DJ; Fearon, U. Acute serum amyloid A regulates cytoskeletal
rearrangement, cell matrix interactions and promotes cell migration in rheumatoid
arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2011. Jul;70(7), 1296-1303.
Costenbader, KH; Prescott, J; Zee, RY; De Vivo, I. Immunosenescence and rheumatoid
arthritis: Does telomere shortening predict impending disease? Autoimmun. Rev. 2011.
Jul;10(9), 569-573.
Criswell, LA; Pfeiffer, KA; Lum, RF; Gonzales, B; Novitzke, J; Kern, M; Moser, KL;
Begovich, AB; Carlton, VEH; Li, W; Lee, AT; Ortmann, W; Behrens, TW; Gregersen,
PK. Analysis of families in the multiple autoimmune disease genetics consortium
(MADGC) collection: the PTPN22 620W allele associates with multiple autoimmune
phenotypes. Am. J. Hum. Genet. 2005. Apr;76(4), 561-571.
Cui, J; Taylor, KE; Destefano, AL; Criswell, LA; Izmailova, ES; Parker, A; Roubenoff, R;
Plenge, RM; Weinblatt, ME; Shadick, NA; Karlson, EW. Genome-wide association study
of determinants of anti-cyclic citrullinated peptide antibody titer in adults with
rheumatoid arthritis. Mol. Med. 2009. Jun;15(5-6), 136-143.
D’Alfonso, S; Barizzone, N; Giordano, M; Chiocchetti, A; Magnani, C; Castelli, L;
Indelicato, M; Giacopelli, F; Marchini, M; Scorza, R; Danieli, MG; Cappelli, M;
Migliaresi, S; Bigliardo, B; Sabbadini, MG; Baldissera, E; Galeazzi, M; Sebastiani, GD;
Minisola, G; Ravazzolo, R; Dianzani, U; Momigliano-Richiardi, P. Two single-
nucleotide polymorphisms in the 5’ and 3’ ends of the osteopontin gene contribute to
susceptibility to systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2005. Feb;52(2), 539-
547.
34 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

Dai, R; Ahmed, SA. MicroRNA, a new paradigm for understanding immunoregulation,

inflammation, and autoimmune diseases. Transl. Res. 2011. Apr;157(4), 163-179.
Dale, J; Porter, D. Optimising the strategy of care in early rheumatoid arthritis. Best Practice
and Research Clinical Rheumatology. 2010. 24, 443–455.
Dayer, JM. The pivotal role of interleukin-1 in the clinical manifestations of rheumatoid
arthritis. Rheumatology. 2003. 42 (Suppl. 2), ii3–ii10.
De Bock, M; de Seny, D; Meuwis, MA; Chapelle, JP; Louis, E; Malaise, M; Merville, M;
Fillet, M. Challenges for biomarker discovery in body fluids using SELDI-TOF-MS. J.
Biomed. Biotechnol. 2010. 2010:906082.
de Seny, D; Fillet, M; Meuwis, MA; Geurts, P; Lutteri, L; Ribbens, C; Bours, V; Wehenkel.
L; Piette, J; Malaise, M; Merville, MP. Discovery of new rheumatoid arthritis biomarkers
using the surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
ProteinChip approach. Arthritis Rheum. 2005. Dec;52(12), 3801-3812.
Dixon, WG; Symmons, DPM; Lunt, M; Watson, KD; Hyrich, KL; British Society for
Rheumatology Biologics Register Control Centre Consortium; Silman, AJ; British
Society for Rheumatology Biologics Register. Serious infection following anti-tumour
necrosis factor alpha therapy in patients with rheumatoid arthritis. Lessons from
interpreting data from observational studies. Arthritis Rheum. 2007. 56, 2896–904.
Donahue, KE; Gartlehner, G; Jonas, DE; Lux, LJ; Thieda, P; Jonas, BL; Hansen, RA;
Morgan, LC; Lohr, KN. Systematic effectiveness and harms of disease-modifying
medications for rheumatoid arthritis. Ann. Intern. Med. 2008. 148, 124–34.
Duroux-Richard, I; Jorgensen, C; Apparailly, F. miRNAs and rheumatoid arthritis -
promising novel biomarkers. Swiss. Med. Wkly. 2011. 141:w13175.
Eady, JJ; Wortley, GM; Wormstone, YM; Hughes, JC; Astley, SB; Foxall, RJ; Doleman, JF;
Elliott, RM. Variation in gene expression profiles of peripheral blood mononuclear cells
from healthy volunteers. Physiol. Genomics. 2005. Aug;22(3), 402-411.
Emery, P; Breedveld, F; Hall, S; Durez, P; Chang, DJ; Robertson, D; Singh, A; Pedersen,
RD; Koenig, AS; Freundlich B. Comparison of methotrexate monotherapy with a
combination of methotrexare and etanercept in active, early, moderate to severe
rheumatoid arthritis (COMET): a randomised, double-blind, parallel treatment trial.
Lancet. 2008. 372, 375–82.
Esensten, JH; Wofsy, D; Bluestone, JA. Regulatory T cells as therapeutic targets in
rheumatoid arthritis. Nature Reviews Rheumatology. 2009. 5, 560-565.
Farrant, JM; Grainger, AJ; O’Connor, PJ. Advanced imaging in rheumatoid arthritis. Part 2:
erosions. Skeletal Radiol. 2007. 36, 381-389.
Feldmann, M; Maini, RN. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we
learned? Annu. Rev. Immunol. 2001. 19, 163-196.
Felson, DT; Anderson, JJ; Boers, M; Bombardier, C; Furst, D; Goldsmith, C; Katz, LM;
Lightfoot, R; Paulus, H; Strand, V; Tugwell, P; Weinblatt, M; Williams, HJ; Wolfe, F;
Kieszak, S. American College of Rheumatology. Preliminary definition of improvement
in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1995. Jun;38(6), 727-35.
Felson, DT; Neogi, T. Osteoarthritis: is it a disease of cartilage or of bone? Arthritis Rheum.
2004. 50, 341–344.
Finckh, A; Llang, MH; van Herckenrode, CM; Pablo, P. Long-term impact of early treatment
on radiographic progression in rheumatoid arthritis: a meta-analysis. Arthritis Rheum.
2006. 55, 864–72.
 Rheumatoid Arthritis 35

Firestein, GS. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Nature. 2003. 423, 356-361.
Firestein, GS. Inhibiting inflammation in rheumatoid arthritis. N. Engl. J. Med. 2006. 354,
80–82.
Foell, D; Wulffraat, N; Wedderburn, LR; Wittkowski, H; Frosch, M; Gerss, J; Stanevicha, V;
Mihaylova, D; Ferriani, V; Tsakalidou, FK; Foeldvari, I; Cuttica, R; Gonzalez, B;
Ravelli, A; Khubchandani, R; Oliveira, S; Armbrust, W; Garay, S; Vojinovic, J;
Norambuena, X; Gamir, ML; García-Consuegra, J; Lepore, L; Susic, G; Corona, F;
Dolezalova, P; Pistorio, A; Martini, A; Ruperto, N; Roth, J. Methotrexate withdrawal at 6
vs 12 months in juvenile idiopathic arthritis in remission: a randomized clinical trial.
JAMA. 2010. Apr;303(13), 1266-1273.
Foo, Y; Liew, FY; McInnes, IB. A fork in the pathway to inflammation and arthritis. Nature
Medicine. 2005. 11, 601–602.
Fraga, MF; Ballestar, E; Paz, MF; Ropero, S; Setien, F; Ballestar, ML; Heine-Suñer, D;
Cigudosa, JC; Urioste, M; Benitez, J; Boix-Chornet, M; Sanchez-Aguilera, A; Ling, C;
Carlsson, E; Poulsen, P; Vaag, A; Stephan, Z; Spector, TD; Wu, YZ; Plass, C; Esteller,
M. Epigenetic differences arise during the lifetime of monozygotic twins. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 2005. Jul;102(30), 10604-10609.
Fransen, J; van Riel, PL. Outcome measures in inflammatory rheumatic diseases. Arthritis
Research and Therapy. 2009. 11:244 (doi:10.1186/ar2745).
Frosch, M; Vogl, T; Seeliger, S; Wulffraat, N; Kuis, W; Viemann, D; Foell, D; Sorg, C;
Sunderkötter, C; Roth, J. Expression of myeloid-related proteins 8 and 14 in systemic-
onset juvenile rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2003. Sep;48(9), 2622-2626.
Furst, DE; Keystone, EC; Braun, J; Breedveld, FC; Burmester, GR; De Benedetti, F; Dörner,
T; Emery, P; Fleischmann, R; Gibofsky, A; Kalden, JR; Kavanaugh, A; Kirkham, B;
Mease, P; Sieper, J; Singer, NG; Smolen, JS; Van Riel, PL; Weisman, MH; Winthrop, K.
Updated consensus statement on biological agents for the treatment of rheumatic
diseases, 2007. Ann. Rheum. Dis. 2007. Nov;66(Suppl 3):iii, 2-22.
Geborek, P; Bladström, A; Turesson, C; Gulfe, A; Petersson, IF; Saxne, T; Olsson,
H;Jacobsson, LT. Tumour necrosis factor blockers do not increase overall tumour risk in
patients with rheumatoid arthritis, but may be associated with an increased risk of
lymphomas. Ann. Rheum. Dis. 2005. 64, 699–703.
Gilad, S; Meiri, E; Yogev, Y; Benjamin, S; Lebanony, D; Yerushalmi, N; Benjamin, H;
Kushnir, M; Cholakh, H; Melamed, N; Bentwich, Z; Hod M; Goren, Y; Chajut, A. Serum
microRNAs are promising novel biomarkers. PLoS ONE. 2008. 3(9):e3148.
Giusti, L; Baldini, C; Ciregia, F; Giannaccini, G; Giacomelli, C; De Feo, F; Delle Sedie, A;
Riente, L; Lucacchini, A; Bazzichi, L; Bombardieri, S. Is GRP78/BiP a potential salivary
biomarker in patients with rheumatoid arthritis? Proteomics Clin. Appl. 2010. Mar;4(3),
315-324.
Gómez-Reino, JJ; Carmona, L; Valverde, VR; Mola, EM; Montero, MD; BIOBADASER
Group. Treatment of rheumatoid arthritis with tumour necrosis factor inhibitors may
predispose to significant increases in tuberculosis risk: a multicenter active-surveillance
report. Arthritis Rheum. 2003. 48, 2122–7.
Grabiec, AM; Tak, PP; Reedquist, KA. Targeting histone deacetylase activity in rheumatoid
arthritis and asthma as prototypes of inflammatory disease: should we keep our HATs
on? Arthritis Res. Ther. 2008. 10(5), 226.
36 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

Gregersen, P. Gaining insight into PTPN22 and autoimmunity. Nat. Genet. 2005. 37, 1300–
1302
Grigor, C; Capell, H; Stirling, A; McMahon, AD; Lock, P; Vallance, R; Kincaid, W; Porter,
D. Effect of a treatment strategy of tight control for rheumatoid arthritis (the TICORA
study): a single-blind randomised controlled trial. Lancet. 2004. Jul;364 (9430), 263-9.
Gutierrez-Roelens, I; Galant, C; Theate, I; Lories, RJ; Durez, P; Nzeusseu-Toukap, A; Van
den Eynde, B; Houssiau, FA; Lauwerys, BR. Rituximab treatment induces the expression
of genes involved in healing processes in the rheumatoid arthritis synovium. Arthritis
Rheum. 2011. May;63(5), 1246-1254.
Hammer, HB; Haavardsholm, EA; Kvien, TK. Calprotectin (a major leucocyte protein) is
associated with the levels of anti-CCP and rheumatoid factor in a longitudinal study of
patients with very early rheumatoid arthritis. Scand. J. Rheumatol. 2008. Jun;37(3), 179-
182.
Han, T-U; Bang, S-Y; Kang, C; Bae, SC. TRAF1 polymorphisms associated with rheumatoid
arthritis susceptibility in Asians and in Caucasians. Arthritis Rheum. 2009. Sep;60(9),
2577-2584.
Hatanaka, E; Dermargos, A; Armelin, HA; Curi, R; Campa, A. Serum amyloid A induces
reactive oxygen species (ROS) production and proliferation of fibroblast. Clin. Exp.
Immunol. 2011. Mar;163(3), 362-367.
Haywood, L; McWilliams, DF; Pearson, CI; Gill, SE; Ganesan, A; Wilson, D. Inflammation
and angiogenesis in osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2003. 48, 2173–2177.
Hunter, MP; Ismail, N; Zhang, X; Aguda, BD; Lee, EJ; Yu, L; Xiao, T; Schafer, J; Lee,
MLT; Schmittgen, TD; Nana-Sinkam, SP; Jarjoura, D; Marsh, CB. Detection of
microRNA expression in human peripheral blood microvesicles. PLoS ONE. 2008. 3(11):
e3694.
Hyka N; Dayer JM; Modoux C; Kohno T; Edwards CK 3rd; Roux-Lombard P; Burger D.
Apolipoprotein A-I inhibits the production of interleukin-1beta and tumor necrosis factor-
alpha by blocking contact-mediated activation of monocytes by T lymphocytes. Blood.
2001. Apr;97(8), 2381-2389.
Imboden, JB. The immunopathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Annu. Rev. Pathol. Mech.
Dis. 2009. 4, 417-434.
Isaacs JD. The changing face of rheumatoid arthritis: sustained remission for all? Nature
Reviews Immunology. 2010. 10, 605-611.
Jamnitski, A; Visman, IM; Peters, MJL; Dijkmans, BAC; Voskuyl, AE; Nurmohamed, MT.
Beneficial effect of 1-year etanercept treatment on the lipid profile in responding patients
with rheumatoid arthritis, the ETRA study. Ann. Rheum. Dis. 2010. Nov;69(11), 1929-
1933.
Javierre, BM; Fernandez, AF; Richter, J; Al-Shahrour, F; Martin-Subero, JI; Rodriguez-
Ubreva, J; Berdasco, M; Fraga, MF; O’Hanlon, TP; Rider, LG; Jacinto, FV; Lopez-
Longo, FJ; Dopazo, J; Forn, M; Peinado, MA; Carreño, L; Sawalha, AH; Harley, JB;
Siebert, R; Esteller, M; Miller, FW; Ballestar, E. Changes in the pattern of DNA
methylation associate with twin discordance in systemic lupus erythematosus. Genome
Res. 2010. Feb;20(2), 170-179.
Jeffries, M; Dozmorov, M; Tang, Y; Merrill, JT; Wren, JD; Sawalha, AH. Genome-wide
DNA methylation patterns in CD4+ T cells from patients with systemic lupus
erythematosus. Epigenetics. 2011. May;6(5), 593-601.
 Rheumatoid Arthritis 37

Jin, EH; Shim, SC; Kim, HG; Chae, SC; Chung, HT. Polymorphisms of COTL1 gene
identified by proteomic approach and their association with autoimmune disorders. Exp.
Mol. Med, 2009. May;41(5), 354-361.
Kane, D; Roth, J; Frosch, M; Vogl, T; Bresnihan, B; FitzGerald, O. Increased perivascular
synovial membrane expression of myeloid-related proteins in psoriatic arthritis. Arthritis
Rheum. 2003. Jun;48(6), 1676-1685.
Karlson, EW; Chibnik, LB; Tworoger, SS; Lee, I-M; Buring, JE; Shadick, NA; Manson, JE;
Costenbader, KH. Biomarkers of inflammation and development of rheumatoid arthritis
in women from two prospective cohort studies. Arthritis Rheum. 2009. Mar;60(3), 641-
652.
Karouzakis, E; Gay, RE; Michel, BA; Gay, S; Neidhart, M. DNA hypomethylation in
rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis Rheum. 2009. Dec;60(12), 3613-3622.
Kehlen, A; Thiele, K; Riemann, D; Langner, J. Expression, modulation and signalling of IL-
17 receptor in fibroblast-like synoviocytes of patients with rheumatoid arthritis. Clin.
Exp. Immunol. 2002. Mar;127(3), 539-546.
Kiely, PD; Brown, AK; Edwards, CJ; O’Reilly, DT; Ostör, AJ; Quinn, M; Taggart, A;
Taylor, PC; Wakefield, RJ; Conaghan, PG. Contemporary treatment principles for early
rheumatoid arthritis: a consensus statement. Rheumatology. 2009. 48, 765-772.
Koczan, D; Drynda, S; Hecker, M; Drynda, A; Guthke, R; Kekow, J; Thiesen, HJ. Molecular
discrimination of responders and nonresponders to anti-TNF alpha therapy in rheumatoid
arthritis by etanercept. Arthritis Res. Ther. 2008. 10(3): R50.
Konno, S; Kurokawa, M; Uede, T; Nishimura, M; Huang, SK. Role of osteopontin, a
multifunctional protein, in allergy and asthma. Clin. Exp Allergy. 2011 May [doi:
10.1111/j.1365-2222.2011.03775.x.].
Kurreeman, FAS; Padyukov, L; Marques, RB; Schrodi, SJ; Seddighzadeh, M; Stoeken-
Rijsbergen, G; van der Helm-van Mil, AHM; Allaart, CF; Verduyn, W; Houwing-
Duistermaat, J; Alfredsson, L; Begovich, AB; Klareskog, L; Huizinga, TWJ; Toes, REM.
A candidate gene approach identifies the TRAF1/C5 region as a risk factor for
rheumatoid arthritis. PLoS Med. 2007. Sep;4(9): e278.
Kwoh, K; Anderson, LG; Greene, JM; Johnson, DA; O’Dell, JR; Robbins, ML; Roberts, WN;
Simms, RW; Yood, RA. Guidelines for the Management of Rheumatoid Arthritis 2002
Update. Arthritis Rheum. 2002. 46(2) 328–346.
Lee, AT; Li, W; Liew A; Bombardier, C; Weisman, M; Massarotti, EM; Kent J; Wolfe, F;
Begovich, AB; Gregersen, PK. The PTPN22 R620W polymorphism associates with RF
positive rheumatoid arthritis in a dose-dependent manner but not with HLA-SE status.
Genes Immun. [Link];6(2),129-133.
Lee, DM; Kiener, HP; Agarwa, SK; Noss, EH; Watts, GFM; Chisaka, O; Takeichi, M;
Brenner, MB. Cadherin-11 in Synovial Lining Formation and Pathology in Arthritis.
Science. 2007. 315, 5814, 1006-1010.
Lee, DM; Weinblatt, ME. Rheumatoid Arthritis. The Lancet. 2001. 358 (9285) 903–911.
Lee, H; Lee, A; Criswell, L; Seldin, M; Amos, C. Several regions in the major
histocompatibility complex confer risk for anti–CCP antibody positive rheumatoid
arthritis, independent of the DRB1 locus. Mol. Med. 2008. 14, 293–300.
Lequerré, T; Gauthier-Jauneau, AC; Bansard, C; Derambure, C; Hiron, M; Vittecoq, O;
Daveau, M; Mejjad, O; Daragon, A; Tron, F; Le Loët, X; Salier, JP. Gene profiling in
38 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

white blood cells predicts infliximab responsiveness in rheumatoid arthritis. Arthritis Res.
Ther. 2006. 8(4):R105.
Li, TW; Zheng, BR; Huang, ZX; Lin, Q; Zhao, LK; Liao, ZT; Zhao, JJ; Lin, ZM; Gu, JR
Screening disease-associated proteins from sera of patients with rheumatoid arthritis: a
comparative proteomic study. Chin. Med. J. 2010. Mar;123(5), 537-543.
Liepe, J; Skapenko, A; Lipsky, P; Schulze-Koops, H. Regulatory T cells in rheumatoid
arthritis. Arthritis Res. Ther. 2005. 7, 93–99.
Lindberg, J; af Klint, E; Catrina, AI; Nilsson, P; Klareskog, L; Ulfgren, AK; Lundeberg, J.
Effect of infliximab on mRNA expression profiles in synovial tissue of rheumatoid
arthritis patients. Arthritis Res. Ther. 2006. 8(6): R179.
Lindberg, J; Wijbrandts, CA; van Baarsen, LG; Nader, G; Klareskog, L; Catrina, A;
Thurlings, R; Vervoordeldonk, M; Lundeberg, J; Tak, PP. The gene expression profile in
the synovium as a predictor of the clinical response to infliximab treatment in rheumatoid
arthritis. PLoS ONE. 2010. 5(6): e11310.
Liu, C; Ackerman, HH; Carulli, JP. A genome-wide screen of gene-gene interactions for
rheumatoid arthritis susceptibility. Hum. Genet. 2011. May;129(5), 473-485.
Loeser, RF. Molecular Mechanisms of Cartilage Destruction: Mechanics, Inflammatory
Mediators, and Aging Collide. Arthritis Rheum. 2006. 54(5) 1357–1360.
Lu, Q; Renaudineau, Y; Cha, S; Ilei, G; Brooks, WH; Selmi, C; Tzioufas, A; Pers, JO;
Bombardieri, S; Gershwin, ME; Gay, S; Youinou, P. Epigenetics in autoimmune
disorders: highlights of the 10th Sjögren’s syndrome symposium. Autoimmun Rev. 2010.
Jul;9(9), 627-630.
MacGregor, AJ; Snieder, H; Rigby, AS; Koskenvuo, M; Kaprio, J; Aho, K; Silman, AJ.
Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data
from twins. Arthritis Rheum. 2000. Jan;43(1), 30-37.
Maciejewska-Rodrigues, H; Karouzakis, E; Strietholt, S; Hemmatazad, H; Neidhart, M;
Ospelt, C; Gay, RE; Michel, BA; Pap, T; Gay, S; Jüngel, A. Epigenetics and rheumatoid
arthritis: the role of SENP1 in the regulation of MMP-1 expression. J. Autoimmun. 2010.
Aug;35(1), 15-22.
Madland, TM; Hordvik, M; Haga, H-J; Jonsson, R; Brun, JG. Leukocyte protein calprotectin
and outcome in rheumatoid arthritis. A longitudinal study. Scand. J. Rheumatol. 2002.
31(6), 351-354.
Mallya, RK; Vergani, D; Tee, DE; Bevis, L; de Beer, FC; Berry, H; Hamilton, ED; Mace,
BE; Pepys, MB. Correlation in rheumatoid arthritis of concentrations of plasma C3d,
serum rheumatoid factor, immune complexes and C-reactive protein with each other and
with clinical features of disease activity. Clin. Exp. Immunol. 1982. Jun;48(3), 747-753.
Mazzetti, I; Grigolo, B; Pulsatelli, L; Dolzani, P; Silvestri, T; Roseti, L; Meliconi, R;
Facchini, A. Differential roles of nitric oxide and oxygen radicals in chondrocytes
affected by osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Clin. Sci. 2001. Dec;101(6), 593-599.
Meda, F; Folci, M; Baccarelli, A; Selmi, C. The epigenetics of autoimmunity. Cell. Mol.
Immunol. 2011. May;8(3), 226-236.
Meulenbelt, I; Min, JL; van Duijn, CM; Kloppenburg, M; Breedveld, FC; Slagboom, PE.
Strong linkage on 2q33.3 to familial early-onset generalized osteoarthritis and a
consideration of two positional candidate genes. Europ. J. Hum. Genet. 2006. 14, 1280-
1287.
 Rheumatoid Arthritis 39

Möttönen, T; Hannonen, P; Leirisalo-Repo, M; Nissilä, M; Kautiainen, H; Korpela, M;

Laasonen, L; Julkunen, H; Luukkainen, R; Vuori, K; Paimela, L; Blåfield, H; Hakala, M;
Ilva, K; Yli-Kerttula, U; Puolakka, K; Järvinen, P; Hakola, M; Piirainen, H; Ahonen, J;
Pälvimäki, I; Forsberg, S; Koota, K; Friman, C. Comparison of combination therapy with
single-drug therapy in early rheumatoid arthritis: a randomised trial. FIN-RACo trial
group. Lancet. 1999. May;353(9164), 1568-73.
Murata, K; Yoshitomi, H; Tanida, S; Ishikawa, M; Nishitani, K; Ito, H; Nakamura, T. Plasma
and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and
osteoarthritis. Arthritis Res. Ther. 2010.12(3): R86.
Nakamura, T; Higashi, S-ichi; Tomoda, K; Tsukano, M; Shono, M. Etanercept can induce
resolution of renal deterioration in patients with amyloid A amyloidosis secondary to
rheumatoid arthritis. Clin. Rheumatol. 2010. Dec;29(12), [Link], T.
Clinical strategies for amyloid A amyloidosis secondary to rheumatoid arthritis. Mod.
Rheumatol. 2008. 18(2), 109-118.
Nakasa, T; Miyaki, S; Okubo, A; Hashimoto, M; Nishida, K; Ochi, M; Asahara, H.
Expression of microRNA-146 in rheumatoid arthritis synovial tissue. Arthritis Rheum.
2008. May;58(5), 1284-1292.
Nana-Sinkam, SP; Croce, CM. MicroRNAs as therapeutic targets in cancer. Transl. Res.
2011. Apr;157(4), 216-225.
Neidhart, M; Rethage, J; Kuchen, S; Künzler, P; Crowl, RM; Billingham, ME; Gay, RE; Gay,
S. Retrotransposable L1 elements expressed in rheumatoid arthritis synovial tissue:
association with genomic DNA hypomethylation and influence on gene expression.
Arthritis Rheum. 2000. Dec;43(12), 2634-2647.
Nissim, A; Winyard, PG; Corrigall, V; Fatah, R; Perret, D; Panayi, G; Yuti Chernajovsky, Y.
Generation of neoantigenic epitopes after posttranslational modification of type II
collagen by factors present within the inflamed joint. Arthritis Rheumatism. 2005. 52, 12,
3829–3838.
Nistala, K; Adams, S; Cambrook, H. Th17 plasticity in human autoimmune arthritis is driven
by the inflammatory environment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. 107, 14751–14756.
O’Donnell, LC; Druhan, LJ; Avalos, BR. Molecular characterization and expression analysis
of leucine-rich alpha2-glycoprotein, a novel marker of granulocytic differentiation. J.
Leukoc. Biol. 2002 Sep;72(3), 478-485.
Palande, KK; Beekman, R; van der Meeren, LE; Beverloo, HB; Valk, PJM; Touw, IP. The
antioxidant protein peroxiredoxin 4 is epigenetically down regulated in acute
promyelocytic leukemia. PLoS ONE. 2011. 6(1): e16340.
Park, YB; Lee, SK; Lee WK; Suh, CH; Lee, CW; Lee CH; Song, CH; Lee, J. Lipid profiles in
untreated patients with rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. 1999. Aug;26(8), 1701-1704.
Pauley, KM; Satoh, M; Chan, AL; Bubb, MR; Reeves, WH; Chan, EK. Upregulated miR-
146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients.
Arthritis Res. Ther. 2008. 10(4): R101.
Pedersen M, Jacobsen S, Klarlund M, Pedersen BV, Wiik A, Wohlfahrt J, Frisch M:
Environmental risk factors diff er between rheumatoid arthritis with and without auto-
antibodies against cyclic citrullinated peptides. Arthritis Res. Ther 2006, 8:R133.
Pelletier, JP, Martel-Pelletier, J, Abramson, SB. Osteoarthritis; an inflammatory disease:
potential implication for the selection of new therapeutic targets. Arthritis Rheum. 2001.
44; 1237–1247.
40 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

Perricone, C; Ceccarelli, F; Valesini, G. An overview on the genetic of rheumatoid arthritis:

A never-ending story. Autoimmun. Rev. 2011. Apr [doi:10.1016/[Link].2011.04.021].
Plenge, RM; Seielstad, M; Padyukov, L; Lee, AT; Remmers, EF; Ding, B; Liew, A; Khalili,
H; Chandrasekaran, A; Davies, LRL; Li, W; Tan, AKS; Bonnard, C; Ong, RTH;
Thalamuthu, A; Pettersson S; Liu, C; Tian, C; Chen, WV; Carulli, JP; Beckman, EM;
Altshuler, D; Alfredsson, L; Criswell, LA; Amos, CI; Seldin, MF; Kastner, DL;
Klareskog, L; Gregersen, PK. TRAF1-C5 as a risk locus for rheumatoid arthritis--a
genomewide study. N. Engl. J. Med. 2007. Sep;357(12), 1199-1209.
Prior, P; Symmons, DP; Scott, DL; Brown, R; Hawkins CF. Cause of death in rheumatoid
arthritis. Br. J. Rheumatol. 1984. 23, 92–9.
Pruijn GJ, Wiik A, van Venrooij WJ. The use of citrullinated peptides and proteins for the
diagnosis of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2010;12(1):203.
Quinn, MA; Conaghan, PG; O'Connor, PJ; Karim, Z; Greenstein, A; Brown, A; Brown, C;
Fraser, A; Jarret, S; Emery, P. Very early treatment with infliximab in addition to
methotrexate in early, poor prognosis rheumatoid arthritis reduces magnetic resonance
imaging evidence of synovitis and damage, with sustained benefit after infliximab
withdrawal. Results from a twelve-month randomized, double-blind, placebo controlled
trial. Arthritis. Rheum. 2005. 52, 27–35.
Ravindran, V; Rachapalli, S; Choy, EH. Safety of medium- to long-term glucocorticoid
therapy in rheumatoid arthritis: a meta-analysis. Rheumatology. 2009. 48, 807–11.
Raychaudhuri, S. Recent advances in the genetics of rheumatoid arthritis. Curr. Opin.
Rheumatol. 2010. Mar;22(2), 109-118.
Rho, YH; Chung, CP; Oeser, A; Solus, JF; Gebretsadik, T; Shintani, A; Raggi, P; Milne, GL;
Stein, CM. Interaction between oxidative stress and high-density lipoprotein cholesterol
is associated with severity of coronary artery calcification in rheumatoid arthritis.
Arthritis Care Res. 2010. Oct;62(10), 1473-1480.
Rigby, W; Ferraccioli, G; Greenwald, M; Zazueta-Montiel, B; Fleischmann, R; Wassenberg,
S; Ogale, S; Armstrong, G; Jahreis, A; Burke, L; Mela, C; Chen, A. Rituximab improved
physical function and quality of life in patients with early rheumatoid arthritis; results
from a randomized active comparator placebo-controlled trial of rituximab in
combination with methotrexate compared to methotrexate alone. Ann. Rheum. Dis. 2009.
68(Suppl. 3), 581.
Ringold, S; Chon, Y; Singer, NG. Associations between the American College of
Rheumatology pediatric response measures and the continuous measures of disease
activity used in adult rheumatoid arthritis: a secondary analysis of clinical trial data from
children with polyarticular-course juvenile idiopathic arthritis. Arthritis Rheum. 2009.
60(12), 3776-3783.
Romagnani, P; Lasagni, L; Annunziato, F; Serio, M; Romagnani, S. CXC chemokines: the
regulatory link between inflammation and angiogenesis. Trends Immunol. 2004. 25(4),
201-209.
Rommel, C; Camps, M; Ji, H. PI3Kd and PI3Kg: partners in crime in inflammation in
rheumatoid arthritis and beyond? Nature Reviews Immunology. 2007. 7, 191-201.
Ryckman, C; Vandal, K; Rouleau, P; Talbot, M; Tessier, PA. Proinflammatory activities of
S100: proteins S100A8, S100A9, and S100A8/A9 induce neutrophil chemotaxis and
adhesion. J. Immunol. 2003. Mar;170(6), 3233-3242.
 Rheumatoid Arthritis 41

Saag, KG; Teng, GG; Patkar, NM; Anuntiyo, J; Finney, C; Curtis, JR; Paulus, HE; Mudano,
A; Pisu, M; Elkins-Melton, M; Outman, R; Allison, JJ; Suarez Almazor, M; Bridges SL
Jr; Chatham, WW; Hochberg, M; MacLean, C; Mikuls, T; Moreland, LW; O’Dell, J;
Turkiewicz, AM; Furst, DE. American College of Rheumatology: American College of
Rheumatology 2008 Recommendations for the use of nonbiologic and biologic disease-
modifying antirheumatic drugs in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2008. 59, 762-
784.
Salgado, FJ; Vázquez, S; Iglesias, A; Pérez-Díaz, A; Mera-Varela, A; Arias, P; Nogueira, M.
Application of thiophilic chromatography to deplete serum immunoglobulins in sample
preparation for bidimensional electrophoresis. Anal. Chim. Acta. 2010. 658, 18-31.
Sato, K; Suematsu, A; Okamoto, K; Yamaguchi, A; Morissita, Y. Th17 functions as an
osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction. J.
Exp. Med. 2006. 203, 2673–2682.
Scott, DL; Wolfe, F; Huizinga, TW. Rheumatoid arthritis. Lancet. 2010. 376, 1094-1108.
Semb, AG; Kvien, TK; Aastveit, AH; Jungner, I; Pedersen, TR; Walldius, G; Holme, I.
Lipids, myocardial infarction and ischaemic stroke in patients with rheumatoid arthritis in
the Apolipoprotein-related Mortality RISk (AMORIS) Study. Ann. Rheum. Dis. 2010.
Nov;69(11), 1996-2001.
Sheehy, C; Murphy, E; Duffy, T; Barry, M. Remission induction with etanercept and
methotrexate in very early rheumatoid arthritis with sustained remission after etanercept
withdrawal. Arthritis Rheum. 2008. 58(Suppl.),S918.
Shichita, T; Sugiyama, Y; Ooboshi, H; Sugimori, H; Nakagawa, R; Takada, I; Iwaki, T;
Okada, Y; Lida, M; Cua, DJ; Wakura, Y; Yoshimura A. Pivotal role of cerebral
interleukin-17–producing gammadelta T cells in the delayed phase of ischemic brain
injury. Nature Medicine. 2009. 15, 946-950.
Sinz, A; Bantscheff, M; Mikkat, S; Ringel, B; Drynda, S; Kekow, J; Thiesen, HJ; Glocker,
MO. Mass spectrometric proteome analyses of synovial fluids and plasmas from patients
suffering from rheumatoid arthritis and comparison to reactive arthritis or osteoarthritis.
Electrophoresis. 2002. Sep;23(19), 3445-3456.
Smolen, JS; Aletaha, D; Grisar, J; Redlich, K; Steiner, G; Wagner, O. The need for
prognosticators in rheumatoid arthritis. Biological and clinical markers: where are we
now? Arthritis Res. Ther. 2008. 10(3), 208.
St Clair, EW; van der Heijde, DM; Smolen, JS; Maini, RN; Bathon, JM; Emery, P; Keystone,
E; Schiff, M; Kalden, JR; Wang, B; Dewoody, K; Weiss, R; Baker, D; Active-Controlled
Study of Patients Receiving Infliximab for the Treatment of Rheumatoid Arthritis of
Early Onset Study Group. Combination of infliximab and methotrexate therapy for early
rheumatoid arthritis: a randomized, controlled trial. Arthritis Rheum. 2004. 50, 3432–43.
Stanczyk, J; Pedrioli, DML; Brentano, F; Sanchez-Pernaute, O; Kolling, C; Gay, RE; Detmar,
M; Gay, S; Kyburz, D. Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and
synovial tissue in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2008. Apr;58(4), 1001-1009.
Stefansson, SE; Jonsson, H; Ingvarsson, T; Manolescu, I; Jonsson, HH; Olafsdottir, G;
Palsdottir, E; Stefansdottir, G; Sveinbjornsdottir, G; Frigge, ML; Kong, A; Gulcher, JR;
Stefansson, K. Genomewide scan for hand osteoarthritis: a novel mutation in matrilin-3.
Am. J. Hum. Genet. 2003. 72, 1448-1459.
Steinman, L. A brief history of TH17, the first major revision in the Th1/Th2 hypothesis of T
cell–mediated tissue damage. Nature Medicine. 2007. 13, 139–145
42 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

Taganov, KD; Boldin, MP; Chang, KJ; Baltimore, D. NF-kappaB-dependent induction of

microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signalling proteins of innate immune
responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006. Aug;103(33), 12481-12486.
Takami, N; Osawa, K; Miura, Y; Komai, K; Taniguchi, M; Shiraishi, M; Sato, K; Iguchi, T;
Shiozawa, K; Hashiramoto, A; Shiozawa, S. Hypermethylated promoter region of DR3,
the death receptor 3 gene, in rheumatoid arthritis synovial cells. Arthritis Rheum. 2006.
Mar;54(3), 779-787.
Targońska-Stępniak, B; Dryglewska, M; Majdan, M. Influence of long-term leflunomide
treatment on serum amyloid concentration in rheumatoid arthritis patients. Pharmacol.
Rep. 2010. 62(4), 719-725.
Tektonidou, MG; Ward, MM. Validity of clinical associations of biomarkers in translational
research studies: the case of systemic autoimmune diseases. Arthritis Res. Ther. 2010.
12(5): R179.
Tesch, G; Amur, S; Schousboe, JT; Siegel, JN; Lesko, LJ; Bai, JPF. Successes achieved and
challenges ahead in translating biomarkers into clinical applications. AAPS J. 2010.
Sep;12(3), 243-253.
Tijsterman, M; Plasterk, RHA. Dicers at RISC; the mechanism of RNAi. Cell. 2004.
Apr;117(1), 1-3.
Toms, TE; Panoulas, VF; Smith, JP; Douglas, KMJ; Metsios, GS; Stavropoulos-Kalinoglou,
A; Kitas, GD. Rheumatoid arthritis susceptibility genes associate with lipid levels in
patients with rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2011. Jun;70(6), 1025-1032.
Toonen, EJM; Barrera, P; Radstake, TRDJ; van Riel, PLCM; Scheffer, H; Franke, B; Coenen,
MJH. Gene expression profiling in rheumatoid arthritis: current concepts and future
directions. Ann. Rheum. Dis. 2008. Dec;67(12), 1663-1669.
Trocmé, C; Marotte, H; Baillet, A; Pallot-Prades, B; Garin, J; Grange, L; Miossec, P; Tebib,
J; Berger, F; Nissen, MJ; Juvin, R; Morel, F; Gaudin, P. Apolipoprotein A-I and platelet
factor 4 are biomarkers for infliximab response in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis.
2009. Aug;68(8), 1328-1333.
Turesson, C; O'Fallon, WM; Crowson, CS; Gabriel, SE; Matteson, EL. Extra-articular disease
manifestations in rheumatoid arthritis: incidence trends and risk factors over 46 years.
Ann. Rheum. Dis. 2003. 62(8), 722-727.
Uhlar, CM; Whitehead, AS. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant.
Eur. J. Biochem. 1999. Oct;265(2), 501-523.
Van Amelsfort, J; Jacobs, K; Bijlsma, J; Lafeber, F; Taams, L. CD4+ CD25+ regulatory T
cells in rheumatoid arthritis: differences in the presence, phenotype, and function
between peripheral blood and synovial fluid. Arthritis Rheum. 2004. 50, 2775–2785.
van Baarsen, LGM; Bos, CL; van der Pouw Kraan, TCTM; Verweij, CL. Transcription
profiling of rheumatic diseases. Arthritis Res. Ther. 2009. 11(1), 207.
van der Bijl, AE; Goekoop-Ruiterman, YP; de Vries-Bouwstra, JK; Ten Wolde, S; Han, KH;
van Krugten, MV; Allaart, CF; Breedveld, FC; Dijkmans, BA. Infliximab and
methotrexate as induction therapy in patients with early rheumatoid arthritis. Arthritis
Rheum. 2007. 56, 2129–34.
van der Heide, A; Jacobs, JW; Bijlsma, JW; Heurkens, AH; van Booma-Frankfort, C; van der
Veen, MJ; Haanen, HC; Hofman, DM; van Albada-Kuipers, GA; ter Borg, EJ; Brus, HL;
Dinant, HJ; Kruize, AA; Schenk, Y. The effectiveness of early treatment with “second-
 Rheumatoid Arthritis 43

line” antirheumatic drugs: a randomized, controlled trial. Ann. Intern. Med. 1996. 124,
699–707.
Van der Helm-van Mil AH, Verpoort KN, Breedveld FC, Toes REM, Huizinga TWJ:
Antibodies to citrullinated proteins and diff erences in clinical progression of rheumatoid
arthritis. Arthritis Res. Ther 2005, 7:R949-R958.
van der Helm-van Mil, AH; Detert, J; le Cessie, S; Filer, A; Bastian, H; Burmester, GR;
Huizinga, TW; Raza, K. Validation of a prediction rule for disease outcome in patients
with recent-onset undifferentiated arthritis: moving toward individualized treatment
decision-making. Arthritis Rheum. 2008. 58, 2241–47.
van der Kooij, SM; Goekoop-Ruiterman, YP; de Vries-Bouwstra, JK; Peeters, AJ; van
Krugten, MV; Breedveld, FC; Dijkmans, BA; Allaart, CF. Probability of continued low
disease activity in patients with recent onset rheumatoid arthritis treated according to the
disease activity score. Ann. Rheum. Dis. 2008 Feb;67(2), 266-9.
van der Linden, MPM; Feitsma, AL; le Cessie, S; Kern, M; Olsson, LM; Raychaudhuri, S;
Begovich, AB; Chang, M; Catanese, JJ; Kurreeman, FAS; van Nies, J; van der Heijde,
DM; Gregersen, PK; Huizinga, TWJ; Toes, REM; van der Helm-Van Mil, AHM.
Association of a single-nucleotide polymorphism in CD40 with the rate of joint
destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2009. Aug;60(8), 2242-2247.
van der Linden MP, van der WD, Ioan-Facsinay A, Levarht EW, Stoeken-Rijsbergen G,
Huizinga TW, Toes RE, van der Helm-van Mil AH: Value of antimodified citrullinated
vimentin and third-generation anti-cyclic citrullinated peptide compared with second-
generation anti-cyclic citrullinated peptide and rheumatoid factor in predicting disease
outcome in undifferentiated arthritis and rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2009,
60:2232-2241.
van der Linden MP, Batstra MR, Bakker-Jonges LE; Foundation for Quality Medical
Laboratory Diagnostics, Detert J, Bastian H, Scherer HU, Toes RE, Burmester GR,
Mjaavatten MD, Kvien TK, Huizinga TW, van der Helm-van Mil AH. Toward a data-
driven evaluation of the 2010 American College of Rheumatology/European League
Against Rheumatism criteria for rheumatoid arthritis: is it sensible to look at levels of
rheumatoid factor? Arthritis Rheum. 2011 May;63(5):1190-9. doi: 10.1002/art.30200.
van Dongen, H; van Aken, J; Lard, LR; Visser, K; Ronday, HK; Hulsmans, HM; Speyer, I;
Westedt, ML; Peeters, AJ; Allaart, CF; Toes, RE; Breedveld, FC; Huizinga, TW Efficacy
of methotrexate treatment in patients with probable rheumatoid arthritis: a double-blind,
randomized, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum. 2007. 56, 1424–32.
van Gestel, AM; Haagsma, CJ; Van Riel, PLCM. Validation of rheumatoid arthritis
improvement criteria that include simplified joint counts. Arthritis Rheum. 1998. 41,
1845-1850.
van Gestel, AM; Prevoo, ML; van ‘t Hof, MA; van Rijswijk, MH; van de Putte, LB; van Riel,
PL: Development and validation of the European League Against Rheumatism response
criteria for rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1996. 39,34-40.
van Hulst, LT; Fransen, J; den Broeder, AA; Grol, R; van Riel, PL; Hulscher, ME.
Development of quality indicators for monitoring of the disease course in rheumatoid
arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2009. 68. 1805–10.
Vanarsa, K; Mohan, C. Proteomics in rheumatology: the dawn of a new era. F1000 Med. Rep.
2010. 2: 87.
44 Roberto Pontarolo, Astrid Wiens, Cassyano Januário Correr et al.

Verstappen, SM; Jacobs, JW; van der Veen, MJ; Heurkens, AH; Schenk, Y; ter Borg, EJ;
Blaauw, AA; Bijlsma, JW. Utrecht Rheumatoid Arthritis Cohort study group: Intensive
treatment with methotrexate in early rheumatoid arthritis: aiming for remission.
Computer Assisted Management in Early Rheumatoid Arthritis (CAMERA, an open-
label strategy trial). Ann. Rheum. Dis. 2007. 66, 1443-1449.
Vickers, KC; Palmisano, BT; Shoucri, BM; Shamburek, RD; Remaley, AT. MicroRNAs are
transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat.
Cell Biol. 2011. Apr;13(4), 423-433.
Voskuyl, AE. The heart and cardiovascular manifestations in rheumatoid arthritis.
Rheumatology. 2006. 45, 4–7.
Vuilleumier, N; Bas, S; Pagano, S; Montecucco, F; Guerne, P-A; Finckh, A; Lovis, C; Mach,
F; Hochstrasser, D; Roux-Lombard, P; Gabay, C. Anti-apolipoprotein A-1 IgG predicts
major cardiovascular events in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2010.
Sep;62(9), 2640-2650.
Walker, EJ; Hirschfield, GM; Xu, C; Lu, Y; Liu, X; Lu, Y; Coltescu, C; Wang, K; Newman,
WG; Bykerk, V; Keystone, EC; Mosher, D; Amos, CI; Heathcote, EJ; Siminovitch, KA.
CTLA4/ICOS gene variants and haplotypes are associated with rheumatoid arthritis and
primary biliary cirrhosis in the Canadian population. Arthritis Rheum. 2009. Apr;60(4),
931-937.
Wallis, RS; Broder, MS; Wong, JY; Hanson, ME; Beenhouwer, DO. Granulomatous
infectious diseases associated with tumour necrosis factor antagonists. Clin. Infect. Dis.
2004. 38, 1261–5.
Wesoly, J; Hu, X; Thabet, MM; Chang, M; Uh, H; Allaart, CF; Toes, REM; Houwing-
Duistermaat, JJ; Begovich, AB; Huizinga, TWJ. The 620W allele is the PTPN22 genetic
variant conferring susceptibility to RA in a Dutch population. Rheumatology. 2007.
Apr;46(4), 617-621.
Westhovens, R; Kremer, JM; Moreland, LW; Emery, P; Russell, AS; Li, T; Aranda, R;
Becker, JC; Qi, K; Dougados, M. Clinical efficacy and safety of abatacept in
methotrexate-naı¨ve patients with early rheumatoid arthritis and poor prognostic factors.
Ann. Rheum. Dis. 2009. [doi:10.1136/ard.2008.101121].
Whitney, AR; Diehn, M; Popper, SJ; Alizadeh, AA; Boldrick, JC; Relman, DA; Brown, PO.
Individuality and variation in gene expression patterns in human blood. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2003. Feb;100(4), 1896-1901.
Wolfe, F; Michaud, K; Pincus, T; Furst, D; Keystone, E. The disease activity score is not
suitable as the sole criterion for initiation and evaluation of anti-tumor necrosis factor
therapy in the clinic: discordance between assessment measures and limitations in
questionnaire use for regulatory purposes. Arthritis Rheum. 2005. 52, 3873–79.
Wolfe, F; Mitchell, DM; Sibley, JT; Fries, JF; Bloch, DA; Williams, CA; Spitz, PW; Haga,
M; Kleinheksel, SM; Cathey, MA. The mortality of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum.
1994. 37, 481–94.
Wu, X; Shih, F; Atkinson, J. Systemic humoral autoimmunity but joint-specific
inflammation: The syndrome of rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 2007. 56,
2823-2828.
Xu, G; Sun, W; He, D; Wang, L; Zheng, W; Nie, H; Ni, L; Zhang, D; Li, N; Zhang, J.
Overexpression of osteopontin in rheumatoid synovial mononuclear cells is associated
 Rheumatoid Arthritis 45

with joint inflammation, not with genetic polymorphism. J. Rheumatol. 2005. Mar;32(3),
410-416.
Yang, Z; Tao, T; Raftery, MJ; Youssef, P; Di Girolamo, N; Geczy, CL. Proinflammatory
properties of the human S100 protein S100A12. J. Leukoc. Biol. 2001. Jun;69(6), 986-
994.
Yang, Z; Yan, WX; Cai, H; Tedla, N; Armishaw, C; Di Girolamo, N; Wang, HW;
Hampartzoumian, T; Simpson, JL; Gibson, PG; Hunt, J; Hart, P; Hughes, JM; Perry, MA;
Alewood, PF; Geczy, CL. S100A12 provokes mast cell activation: a potential
amplification pathway in asthma and innate immunity. J. Allergy Clin. Immunol. 2007.
Jan;119(1), 106-114.
Yazici, Y. Treatment of rheumatoid arthritis: we are getting there. Lancet. 2009. 374, 178-
180.
Youinou, P; Pers, JO; Gershwin, ME; Shoenfeld, Y. Geo-epidemiology and autoimmunity. J.
Autoimmun. 2010. May;34(3), J163-167.
Zanin-Zhorov, A; Ding, Y; Kumari, S. Protein kinase C-theta mediates negative feedback on
regulatory T cell function. Science. 2010. 328, 372–376.
Zhao, M; Sun, Y; Gao, F; Wu, X; Tang, J; Yin, H; Luo, Y; Richardson, B; Lu, Q. Epigenetics
and SLE: RFX1 downregulation causes CD11a and CD70 overexpression by altering
epigenetic modifications in lupus CD4+ T cells. J. Autoimmun. 2010. Aug;35(1), 58-69.
Zheng, X; Wu, SL; Hincapie, M; Hancock, WS. Study of the human plasma proteome of
rheumatoid arthritis. J. Chromatogr. A. 2009. Apr;1216(16), 3538-3545.
Zhu, J; Zhang, D; Wu, F; He, F; Liu ,X; Wu, L; Zhou, B; Liu, J; Lu, F; Liu, J; Luo, R; Long
W; Yang, M; Ma, S; Wu, X; Shi, Y; Wu, T; Lin, Y; Yang, J; Yuan, G; Yang, Z. Single
nucleotide polymorphisms at the TRAF1/C5 locus are associated with rheumatoid
arthritis in a Han Chinese population. BMC Med. Genet. 2011. 12, 53.
 Combination of T-gel chromatography and immunoaffinity as a new protocol to Department of Biochemistry and
remove immunoglobulins and albumin from serum samples: the case of Molecular Biology
Faculty of Biology
rheumatoid arthritis. University of Santiago de Compostela

Sara Vázquez*, Alba Iglesias*, Francisco J. Salgado*, Amparo Pérez-Díaz*, Pilar Arias*, Antonio Mera¥, and Montserrat 3rd SEProt and 2nd LAHUPO Meeting
Nogueira*§. From bench to bedside
(10-13 February, 2009, Pamplona, Spain
Quantitative analysis of proteins in serum is essential to find disease biomarkers, and 2-DE is still a unrivalled tool to measure quantitative differences. However, the high dynamic range of proteins in serum (up to 12 orders, which exceeds the
dynamic range of 2-DE), the fact that only 1% of total serum protein may contain potential biomarkers, and the reproducibility issue, are all still important aspects to solve. Removal of high-abundance proteins is a common practice, but also one of
the biggest challenges. Most of the depletion methods used have a low loading capacity, are costly or need equipment not always available at a lab. Thereby, the present work describes a new approach, where depletion of most of immunoglobulin
(Ig) isotypes as well as albumin (HSA) from 1 ml serum samples is achieved by using the combination of two methodologies: a thiophilic chromatography, not previously used in 2-DE, and a HSA-specific immunoaffinity resin, respectively. Samples
were analysed by 2-DE to evaluate the effectiveness of the depletion method and a pattern of serum proteins, most of them identified by MS, detected. Reproducibility was also assayed, and a preliminary study with rheumatoid arthritis (RA) patients
carried out to test the performance of the new protocol. RA is a chronic autoimmune disease characterized by inflammation at the synovial joint and infiltration of leukocytes. RA treatments are nowadays more effective, but should be started as early
as possible; i.e., new RA biomarkers are necessary. We have analyzed Igs/HSA-depleted sera obtained from 3 healthy individuals and 3 recently diagnosed and untreated RA patients (18 gels), finding significative changes in many negative or
positive acute-phase proteins previously described as altered in RA (e.g., transferrin or ApoA1). However, SAP, a1-microglobulin or VSP28 have also come up during this preliminary study as proteins upregulated during RA.

*Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Biology, CIBUS, University of Santiago de Compostela. Santiago de Compostela (A Coruña). Spain. ¥Reumatology Service. Clinic Universitary Hospital of Santiago (CHUS). Santiago
de Compostela (A Coruña).

§ Dra. Montserrat Nogueira E-mail: [Link]@[Link]

Table legend: Table 1. Mass spectrometric analysis of some of the protein spots detected by 2-DE
INTRODUCTION
Detection in the sample (score) Max.

A.- Protocol workflow MW and pI have been obtained from PDQuest analysis.
* indicates that MW and pI data come from the HUPO Proteome
Spot
number
Protein
Data
Base
Accesion
number
Igs/HSA
depleted
samples
Immunoglobu
linome
Albuminome
Matched
peptides
Sequence
Coverage
(%)
Mw
(kDa)
pI
Identification of all the proteins in biofluids is difficult to accomplish because of the thousands of compounds, the high dinamic
1 Acid Orosomucoid H.P.P.M n.d. + (n.d.) - - n.d. n.d. 44.0 4.21
Plasma 2-DE Map (H.P.P.M). 2 Albumin NCBI, CAA00298 + (179) + (129) + (73-305) 10-22 56.5 67.50- 5.59-5.88 range of concentrations and the presence of multiple postranslational and genetic variants. However, these studies are very
** MW and pI correspond to the theoretical values from MASCOT. (Serum albumin) MSDB 1AO6A 104.12
important in Clinical Proteomics to identify the specific “signature” of a disease (diagnosis), its evolution (prognosis) or to test the
# Full lenght protein MW. 3 ALB protein NCBI Q86YG0_Human - - + (141-248) 13-22 91.0 49 # ** 6.0 # **
(Growth-inhibiting activity of a drug. Analysis of biological fluids require extensive depletion of abundant proteins. Therefore, only ~1-20% of the initial
Downregulated 4
protein 20)
Albumin, isoform NCBI gi/119626066 + (118) - - 9 88.2 24.17 5.72 total serum protein mass will be recovered for the final analysis, which represents a common setback because commercial
1. Blood extraction Upregulated 5
CRA_c
Alpha-1-antitrypsin NCBI 1QLPA + (84-140) - - 7-20 97 55.04- 5.17-4.50 depleting methods work with small initial sample volumes (up to 180 ml). Consequently, fractionated biofluids have to be
MSDB AAH34554 117.14
ITHU
accumulated and only a handful of samples/donors with a low number of replicates can be analyzed. In addition, a scarce sample
AAH15642
CAA00206
implies that proteins in 2-DE gels must be detected with high sensitive means, like silver staining (very low reproducibility) or
BD Vacutainer® SSTTM II Advance 6 Alpha-1-antitrypsin MSDB 1QLPA + (105) - - 11 42.3 54.67 5.16
fluorescent dyes (costly); MS identification becomes then difficult because of the low protein content in spots. To overcome these
B.- 2-DE Immunoglobulinome 7
& Vitamin D BP
Alpha-1-
antichymotrypsin
MSDB
VYHUD
2ACHA
+ (79)
+ (155) - -
7
16
41.5
84.1 66.94 4.49 problems we have developed a fractioning protocol that, starting with 1 ml sample volumes, is able to eliminate 80% of serum
3 pI 10NL (1 mg, 17 cm) 8 Alpha-1- Beta
glycoprotein
MSDB OMHU1B + (127) - - 10 60.8 82.73 5.28 protein. The protocol has been used to carry out a preliminary comparative study between the serum proteome of rheumatoid
3 pI 10 NL 9 Alpha-2-HS MSDB WOHU + (99) - - 10 72.1 56.81-53.85 4.63-4.70 arthritis (RA) patients and healthy donors.
glycoprotein
2. Sample preparation: Kda
kDa 10 Alpha-fetoprotein MSDB E973181 - - + (84-217) 9-23 87.8 68 # ** 5.7 # **
11 11 Alpha- MSDB MAHU - + (156) - 21 79.4 186-190 * 5.3-5.6 *
centrifugations, 36 35
-97.4
macroglobulin RESULTS
protease cocktail 26
- 97.4 12 Alpha-1-
microglobulin
MSDB HCHU + (77) - - 7 44.3 31.43-31.66 5.34-5.22

 13 Antithrombin NCBI 2ANTI2 + (107-160) - - 10-14 63.1 57.90-61.98 5.36-5.49

addition and storage at - -66.2 MSDB 1AZXI Serum samples from healthy caucasian individuals (n=3) and early diagnosed and untreated RA patients (n=3) were obtained,
20 - 66.2 14 Apolipoprotein A-I NCBI,M gi/90108664 + (127-257) + (116) + (237) 8-23 86.7 24.07 5.43
80ºC (1 ml aliquots) 33 2 stored and handled following the MIAPE guidelines. As the high concentration of immunoglobulins (Ig) and albumin (HSA) hinders
30 SDB CAA00975
1 ml of serum -s --45.0
45.0 15 Apolipoprotein A-IV MSDB AAA51748 + (161) - + (230) 16-21 61.5 43.03 5.29
the identification of other proteins these species were firstly eliminated from sera before 2-DE. For Ig (up to 20% of total serum
31 16 Apolipoprotein J H.P.P.M n.d. - - - n.d. n.d. 37.82 4.93
22 proteins) 1 ml samples were run through thiophilic matrices (T-gels), which selectively bind IgA, IgG (including IgG1-IgG4) and IgM
17 Apolipoprotein E MSDB AAB59518 + (106-158) - - 10-19 48.9 34.29-35.84 5.46-5.58
3. T-gel chromatography 50 (Figure A). Elution of non retained (NRF) or retained (RF) fractions was monitorized at 280 nm. The amount of protein within RF
21 --31.0
31.0 18 Apolipoprotein H
(Beta-2-
MSDB 1QUBA + (114) - - 9 91.3 55.80-62.19 5.56-6.75 (Immunoglobulinome) accounted for the 19-22% of all the recovered protein after T-gel chromatography. Immunoglobulinome was
glycoprotein) analyzed by 2-DE (Figure B), and shows that immunoglobulins were eliminated with a high specificity. In addition, other proteins,
- 19 C2 Complement MSDB Q5JP69_Human + (78) - - 14 19 95.31- 5.88-6.50

T-Gel™ Adsorbent immobilized ligand 14 32

101.70 like complement factors C3, C4b, Cr1 and B, a2-macroglobulin, transferrin, ceruloplasmin, albumin, prealbumin/trasthyretin, a1-
--21.5
21.5 20 C3 Complement MSDB C3HU - + (93) - 14 79.4 70 * 6.9 * antitrypsin, ApoA-I, zinc-a-2-glycoprotein, retinol binding protein, plasminogen, kininogen and the CD5 molecule-like Sp-alpha
37 21 C4b Complement MSDB Q5ST68_Human - + (95) - 9 89.8 31 * 6.5 *
Elution pattern of NRF and RF 22 CD5L MSDB AAD01446 - + (157) - 11 75.3 40 ** 5.3 ** (CD5L, AIM; scavenger receptor cysteine rich family) have been detected together with immunoglobulins; these proteins are either
23 Cerulopasmin NCBI Q1L857_Human + (168) - - 27 28 116.20 5.43

4
--14.4
14.4 24 Ceruloplasmin & NCBI Q1L857_Human + (73-141) - - 17-28 17-26 107.30 5.31 retained by the T-gel column or interact with immunoglobulins (case of complement factors), being removed.
Inter- alpha-trypsin JX0368
A280 nm

inhibitor
2 25 Complement Factor MSDB BBHU + (77-97) - - 8-11 88.7 62.60-62.63 6.34-6.75
B (Isoform 2) Ig-depleted samples were pooled, desalted/concentrated and quantified. HSA was removed using a commercial
0 26 Cr1 Complement MSDB C1HURB - + (96) - 12 67.6 80 ** 5.9 **
0 2 4 6 8 10 12 NRF 27 Haptoglobin chain H.P.P.M n.d. - - - n.d. n.d. 12.32-17.10 5.03-6.07 immunoaffinity protocol from 10 mg samples and flow-through (NRF) or retained fractions (RF) collected (Figure A). The amount of
(non-retained
C.- 2-DE Albuminome
alpha
NRF
fractions)
28 Haptoglobin MSDB Q6NSB4_Human + (81-116) - - 8-11 88.3 35.63-43.74 4.80-641 protein present within RF (albuminome) represented about 55% of all the recovered protein. 2-DE analysis of albuminome (Figure
chain beta AAA52687
4
C) proved that the anti-HSA affinity resin was very specific, since apart from albumin and a shorter splicing variant called ALB
A280 nm

29 Hemopexin MSDB CAA26382 + (106-163) - - 12-18 90.9 18.30-78.62 4.56-6.43

NCBI
2
H.P.P.M protein (Growth-inhibiting protein 20), only human alpha-fetoprotein (a protein coded by a different gene within the albumin family),
0 33 pI pI 10NL
10NL (1 mg, 17 cm) 30 Immunoglobulin A MSDB Q96KX8_Human - + (84) - 8 73.3 54 ** 4.5-5.6 **
a1-antitrypsin and both apoA-I and apoA-IV apolipoproteins were detected. According to these data, it is tempting to speculate with
heavy chain
0 2 4 6 8 10 12 31 Immunoglobilin G MSDB CAC20454 - + (92) - 6 81.5 50-51 * 6.8-8.8 *
RF
RF (retained fractions) kDa
Kda heavy chain the existence of albumin-antitrypsin-apoliprotein-AI/AIV complexes in serum
water 32 Immunoglobulin G MSDB BAC01750 - + (111) - 9 83.6 29 ₤ 6.7 ₤
ACN Immunoglobulinome 2 33
light chain
Kininogen MSDB/ KGHUH1/P01042 - + (114) - 10 58.5 72 # 6.3 #
-97.4 After Ig/HSA removal the amount of protein (4-5 mg) was enough to run at least 3 times the same sample. This was very
10 Uniprot
34 Leucine rich-alpha- MSDB NBHUA2 + (79-88) - - 6 92.3 44.70-48.21 4.46-4.72
-66.2 2-glycoprotein important to test the analytical reproducibility and perform the differential expression study between sera from three recently
10 35
36
Plasminogen
Proapolipoprotein
MSDB
NCBI
Q5TEH4_Human
gi/178775
-
+ (183)
+ (186)
-
-
-
21
17
79.1
73.2
112-116 *
24.53
6.4-6.5 *
5.51
diagnosed and untreated RA patients and sera from a group of three age-matched normal donors. An Ettan DALT Six
Protein desalting 3 -45.0 37
A-I
Retinol binding NCBI gi/55663330 + (102) + (65) - 6 93.7 21.85 5.45
Electrophoresis System with 11 cm IPG-strips pH 4-7NL for the first dimension and 12% SDS-PAGE gels. IPG-strips, containing
& concentration
38
protein
Serum amyloid P
MSDB
NCBI
VAHU
gi/576259 + (87) - - 6 44.7 27.40 5.52
either RA or healthy depleted sera, were run side by side in every wide format 2-DE gel (20 x 20 cm; 12 samples per run). A typical
(SAP) colloidal Coomassie stained gel, where most of spots have been identified by MS (Table I), is shown in Figure D. Gel scanning
39 Tetranectin NCBI gi/267108 + (91) - - 7 43.2 21.27 5.48
40 Transthyretin MSDB AAA61181 + (213-251) - - 11-12 88.7 13.80-35.40 5.44-5.55 was followed by PDQuestTM software analysis, where background was filtered out and a matchset, consisting of 9 gels and two
NCBI
2 H.P.P.M classes (healthy donors and patients), was created. After detecting and editing all the spots, matching was performed manually and
14 -31.0 41 Transferrin H.P.P.M TFHUP - + (146) - 20 82.3 81.98 6.62
MSDB the intra-sample and inter-sample variability values calculated with the Scatter Plot tool. This analysis yielded good intra-sample
4. HSA-depletion 42 Unknown protein n.d. n.d. n.d. - n.d. n.d. 116.17 5.78
43 Unknown protein n.d. n.d. n.d. - n.d. n.d. 116.80 5.84 (0.946±0.006) and inter-sample (0.923±0.008) coefficients of correlation, with a value of 0.970 between healthy and patients
10 44 Unknown protein n.d. n.d. n.d. - n.d. n.d. 48.97 6.58
15
45 Unknown protein n.d. n.d. n.d. - n.d. n.d. 47.84 6.47 classes (Figure E). Finally, data were submitted to Wilcoxon Rank Sum test (non parametric) for paired observations to test the
46 Unknown protein n.d. n.d. n.d. - n.d. n.d. 33.85 5.49
2
-21.5 47 Unknown protein n.d. n.d. n.d. - n.d. n.d. 33.00 5.65 null hypothesis of unchanged protein concentration between RA and healthy donors. Results are presented in Table I and Figures
2 48 Vacuolar sorting MSDB Q548N1_Human + (72) - - 6 57.5 36.85 5.42
Add 10 mg
Spin Spin protein 28 F-L. As it can be seen in Figure F (matchset report) and Figures G-L, 20 spots were significantly (p0.05) downregulated in RA,
3
of protein 49 Vitamin D binding
protein
MSDB VYHUD + (182) - - 17 40.6 48.72-55.59 5.33-5.47
corresponding to hemopexin, a2-HS-glycoprotein, tetranectin, retinol binding protein, antithrombin III, a1-antitrypsin, transthyretin,
-14.4 50 Zinc-alpha-2-
glycoprotein (ZAG)
MSDB 1ZAGD - + (116) - 11 82.8 40.42 * 4.8-6 *
albumin, and several unidentified species (spots #42-47). On the other hand, levels of 7 spots (leucine rich a2 glycoprotein,
haptoglobin b chain) were significantly (p0.05) upregulated in RA patients.
RF (retained fractions)
NRF (non-retained fractions) Albuminome DISCUSSION
Elution pattern of NRF and RF
D.- 2-DE Ig/HSA depleted sera E.- Reproducibility F.- Matchset
2
(healthy vs patients) (quantitative and significative (p  0.05) differences) Many of these proteins have been described previously. Thus, hemopexin, a2HS-glycoprotein, tetranectin, a1-antitrypsin,
4 pI
pI 7NL (0.5 mg, 11 cm)
A280 nm

1 42 43 transthyretin, retinol binding protein and albumin have been described as negative acute phase response proteins in RA (Doherty
23 et al., 1998; Sato et al., 2007; Kamper et al., 1997; Kamper et al., 1998; Denko et al., 1979; Honkanen et al., 1989), while
0 24 19 Kda
kDa 5
5 2
0 2 4
haptoglobin has been presented as a positive acute phase protein in patients suffering from RA (Doherty et al., 1998). Besides, the
NRF 8
29 --97.4
97.4
41 Scatterplot 5 above described proteins are included in a more complex pattern where proteins like apoA1, Gc-globulin/vitamin D binding protein,
a2-macroglobulin, a1B-glycoprotein, apoA4, apoE or C1s are downmodulated and fibrinogen, a1-antichymotrypsin, ceruloplasmin,
2
2 X-axis= healthy 13
A280 nm

7 13 --66.2
66.2
1 25 Y-axis= RA patients 9
9 5 18 44
serum amyloid A or C3 proactivator are upregulated. This acute phase response is dependent on the increased production by
0 Coor coeff= 0.969
0 2 4 6 49 29 45 APCs (macrophages, dendritic cells) of proinflammatory cytokines such as IL-1, IL-6, TNFa or IL-12 (Cordero et al., 2001), and
15 Slope= 1.009, Intercept= -0.0098
RF 34
28 --45.0
45.0 help the body to opsonize and phagocytate certain macromolecules coming from the damaged tissue (e.g., CRP or complement
water Spot count= 266 34
ACN
1
28
factors), inhibit proteolitic enzymes (e.g., a1-antitrypsin and a1-antichymotrypsin), capture free hemoglobin molecules (e.g.,
28
48 40 2-fold haptoglobin or hemopexin), fibrinolysis regulation (e.g. tetranectin) or provide with all the aminoacids necessary for protein
synthesis (e.g., albumin and transthyretin) amongst others still unknown (e.g., a2HS-glycoprotein).
16 28
5 40
2-DE analysis 17 46
40 47
Protein desalting & concentration (Ig/HSA depleted serum) 12
38 --31.0
31.0 Leucine rich a2 glycoprotein (LRG) is an acute phase serum glycoprotein with an unknown function produced by liver cells
14 4 and neutrophils. Increased LRG levels have been seen with bacterial (toxic shock syndrome) and viral (HIV) infections as well as
36
37 some kind of cancers, but normal levels were found in patients with inflammatory arthritis (Weivoda et al., 2008). Our data, instead,
37
39 39
show that LRG is significantly upregulated in RA patients, but the exact biological function is unknown so far. On the other hand,
antithrombin III (ATIII) is a single chain glycoprotein synthesized by liver and the main inhibitor of thrombin and blood coagulation
--21.5
21.5 29 factors like Xa, IXa, XIa or XIIa. ATIII deficiency results in an increased risk of venous thromboembolism. In this sense, it has been
40 described higher rates of coagulation activity and venous and/or arterial thrombosis in RA patients. Therefore, reduced levels of
both ATIII and tetranectin (which enhances plasminogen activation and clot destruction) may give rise to an imbalance between
--14.4
14.4
procoagulatory and anticoagulatory activities. Contrary to our data, Seriolo et al. (1999) found ATIII in the normal range, while
27
Zorina et al. (2008) and Jones et al. detected increased levels in RA patients; the reason for such a discrepancy could be that ATIII
levels are augmented by anabolic steroids, progesterone and oral anticoagulants. Finally, retinol binding protein decreased levels
correlate with lower levels of vitamin A in RA patients (Paredes et al., 2002), which may also explain the high risk of cardiovascular
disease in patients.

Vsp28 (#48; SSP 4107); upregulated (n.s) Finally, quantitative, but not significative, differences have been found for several proteins in this analysis: e.g., transferrin,
G.- Transthyretin, chain A (#40; SSP 4008); downregulated, p 0.05
#46 (SSP 5021) and #47 (SSP 6009) downmodulated, p 0.05
H.- Leucine a2 glycoprotein (#34); upregulated, p 0.05
I.- ATIII (#13; SSP 4505, 4508, and 5401); downmodulated, p 0.05
ApoA1, vacuolar sorting protein 28 (VSP 28), serum amyloid P component (SAP) or a1microglobulin. However, a broader study in
progress with more patients yields significative differences in these proteins because of the augmented sensitivity (data not
shown). VSP28 is a class E VSP protein which appear to be important for normal endocytic sorting. VSP28 can be found
intracellularly as part of a 350 kDa complex named ESCRT-1 (endosomal sorting protein required for transport-1), but also
extracellularly in exosomes. SAP is a opsonising protein produced in response to IL-6 by liver with an important function in the
elimination of apoptotic material, while a1-microglobulin is an immunomodulatory protein whose exact biological functions are
under study. The potential importance of all these proteins as biomarkers is clear, but further clinical proteomic analysis and studies
are required in order to know whether quantification of these proteins has a diagnostic or prognostic value for RA.

CONCLUSIONS
J.- Haptoglobin chain B (#28); upregulated, p 0.05 K.- Tetranectin (#4009); downregulated, p 0.05
and retinol binding protein (#4010); downregulated, p 0.05
L.- #44 (SSP 8317) and # 45 (SSP 8318); both downmodulated, p 0.05
1. This work describes an efficient approach to remove albumin and most of
immunoglobulin isotypes with a low sample manipulation. The protocol arises from
the combination of two high capacity affinity methods (thiophilic chromatography
and anti-HSA spin-columns) and appears to be useful for serum analysis in Clinical
Proteomics.

2. Hemopexin, a2-HS-glycoprotein, tetranectin, retinol binding protein, antithrombin III,

a1-antitrypsin, transthyretin, albumin, and several unidentified proteins have been
found significantly downregulated in recently diagnosed and untreated RA patients,
while leucine rich a2 glycoprotein and haptoglobin b chain have been found
significantly upregulated.
Acknowledgements:
We are grateful to the Medical Service at the University of Santiago and the Reumatology Service at the Clinic Universitary Hospital of Santiago (CHUS) for helping us with this
study. This work was supported by grant PGIDIT04BTF200014PR, from Xunta de Galicia. Amparo Díaz was a recipient of a grant from Xunta de Galicia.
 P11-17
El complicado arte de decodificar los cambios
en el proteoma sérico de pacientes con artritis
reumatoide
Francisco Javier Salgado Castro1, Sara Vázquez Rodríguez1, Antonio Mera
Varela2, Pilar Arias Crespo1, Montserrat Nogueira Álvarez1
(1)
1Centro de Investigaciones Biológicas (CIBUS). Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, ES
2Servicio de Reumatología. Complejo Hospitalario Clínico Universitario de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, ES

ABSTRACT
(2)
La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria autoinmune que afecta simétricamente a las articulaciones y en cuyo desarrollo influyen factores medioambientales y
personales (sexo, edad, perfil genético). Cursa con inflamación sinovial y daño en cartílago/hueso, pero presenta además repercusiones sistémicas, como las cardiovasculares. Los
estudios de asociación han destacado un posible papel de ciertos genes (e.j., HLA, PTPN22 o CTLA-4). Sin embargo, su impacto en el fenotipo es difícil de inferir debido a
fenómenos epigenéticos, el papel de microRNAs, el procesamiento alternativo del mRNA, las modificaciones postraduccionales o las interacciones entre proteínas. Los estudios
proteómicos permiten abordar toda esta complejidad producida en respuesta a enfermedades como la RA y perseverar así en la búsqueda de nuevos biomarcadores séricos que
permitan un diagnóstico más temprano y simple de enfermedad, actualmente basado en complejos criterios (2010 ACR/EULAR) de aceptable sensibilidad (79-84%) pero baja
especificidad (59-64%). En el presente estudio hemos analizado mediante 2-DE muestras de suero procedentes de 8 individuos control y 8 pacientes con RA recién diagnosticados
(o no tratados) cuya complejidad fue reducida mediante cromatografía tiofílica/inmunodepleción o librerías peptídicas. El análisis uni- y multivariante puso de relieve cambios en los
niveles de ciertas proteínas (albúmina, apoA1, apoA4 apoH, antitrombina III, transtirretina, factores de complemento, hemopexina, glicoproteína α2 rica en leucina, y haptoglobina) y
aportó indicios que apuntan hacia una mayor frecuencia de los alelos APOE*4 (que favorecería la citrulinización de la apolipoproteína) y HP*1 en RA que podrían funcionar como
determinantes importantes de riesgo cardiovascular en RA.

Clustering A)
Reducidas las variables a un conjunto más manejable que explicaba la mayor parte de la variabilidad de
nuestros datos el siguiente paso fue analizar cómo los donantes de este estudio se agrupaban en función de
dichas nuevas variables o componentes principales.

Realizamos un primer análisis de agrupamiento jerárquico basado en el valor de cada donante para cada
una de las 7 primeras componentes principales. En este proceso tanto los donantes sanos (S) como los
Sanos Pacientes RA pacientes (SAR) fueron organizados en una estructura en forma de árbol en la que predominaban dos
clusters: uno formado mayormente por individuos del grupo control (4 sanos y 2 enfermos) y otro formado
4 7NL 4 7NL principalmente por el grupo de pacientes (6 enfermos y 4 sujetos control) (Figura A). No obstante, los
valores de sensibilidad (75%), especificidad (50%), eficiencia diagnóstica (62.5%) y valor predictivo positivo
(60%), estaban lejos de lo óptimo del óptimo (>80%).
-97 kDa

BD Vacutainer® SST TM II Advance

8 donantes sanos -66.2 kDa Como la variabilidad explicada decrecía bastante a partir del tercer componente principal, realizamos un
nuevo estudio de agrupamiento jerárquico considerando sólo las tres primeras componentes (66.7% de
8 donantes con RA. -45 kDa variabilidad explicada) (Figura B). Dos clusters se pudieron distinguir; el primero de ellos englobaba
principalmente a los individuos sanos (7 individuos control y 3 pacientes), mientras que el segundo se
correspondía mayormente con pacientes (5 donantes con RA y 1 individuo control). Los valores de
especificidad (87.5%), eficacia diagnóstica (75%) y valor predictivo positivo (83.3%) fueron bastante
S: sanos
ApoE
razonables, salvo en el caso de la sensibilidad (62.5%). Esta reducida sensibilidad diagnóstica podría

B)
-31 kDa relacionarse con el hecho de que algunos de estos pacientes se encuentran en etapas iniciales de la SAR: pacientes con RA
enfermedad.

La proteína codificada por APOE (Apo E) es una proteína rica en arginina que se puede encontrar
1 ml de suero ( 70-80 mg proteína) -21.5 kDa en quilomicrones, VLDL, LDL y HDL. Apo E podría tener un papel en RA, aunque los trabajos con
modelos murinos arrojan resultados contradictorios. Además, el gen APOE es polimórfico, con tres
alelos codominantes principales con las siguientes frecuencias en la población española (Tabla):
-14.4 kDa ApoE2 (Cys112, Cys158; 3.3-7.05%), ApoE3 (Cys112, Arg158; 84.25-92.8%) y ApoE4 (Arg112,
Arg158; 3.9-8.7%). APOE4 es el alelo de menor frecuencia, pero dicha frecuencia podría estar
aumentada en los pacientes con RA (Tabla). La proteína apoE4 se une fundamentalmente a
lipoproteínas grandes de bajo peso molecular (VLDL, LDL), mientras que apoE2 y apoE3 prefieren
lipoproteínas más pequeñas de alta densidad (HDL). Además, apoE4 es más sensible a la
desestabilización de la estructura proteica en respuesta al estrés químico o termal, se relaciona con
mayores respuestas inflamatorias, y este hecho podría jugar un papel en amiloidosis, osteoporosis y
Cromatografía tiofílica (T-Gel™) en el desarrollo de complicaciones cardiovasculares. La mayor riqueza en arginina de apoE4 y su
Eliminación de IgG, IgM e IgA estructura más inestable podría hacerla más sensible a la citrulinización (a la generación de
autoanticuerpos), pudiendo ser el origen de la presencia de spots adicionales en los geles
bidimensionales en los pacientes con RA.

Fracción no retenida I Diferencias funcionales Diferencias Enfermedades

estructurales asociadas

Alelo Frecuencia Variación Afinidad por Lipoproteína Estabilidad

§
alélica (%) aminoacídica receptor LDL a la que está conformacional
asociada

Eliminación de albúmina (HSA) APOE*2 3.3% (n=330) Cys112 Cys158 Baja HDL Alta Hiperlipoproteinemia
de tipo III
6.3% (n= 627)

7.05% (n=242)

18.75% (n=8) S
Fracción no 2-DE (0.5 mg; triplicado) PDQuest ™7.3.1 MS: MALDI-TOF
retenida II 1ª: IPG-strips 4-7NL (Protean IEF CellTM) MS2 : MALDI-TOF/TOF 18.75%(n=8) RA
2ª: 12% SDS-PAGE. Ettan Dalt SixTM APOE*3 92.8% (n=330) Cys112 Arg158 Alta HDL Media Desconocida S10 (E3/E3) S11 (E3/E3) S14 (E3/E3)
Tinción: Coomassie G-250 (Blue Silver)
85% (n=627)

84.25% (n= 242)

S15 (E2/E3) S16 (E2/E3) S17 (E2/E3)
81.25% (n=8) S

68.75%(n=8) RA

Análisis estadístico univariante: LRG1 y ATIII

APOE*4 3.9% (n=330) Arg112 Arg158 Alta VLDL, LDL Baja Alzheimer de inicio
tardío, S18 (E3/E3) S19 (E3/E3)
8.5% (n=627)
TTR
Ateroesclerosis

bisiálico
8.7% (n= 242)
monosiálico

Se identificaron 30 spots con distribución Cobertura de secuencia 0% (n=8) S

normal. Se aplicó un contraste de
diferencias de medias (T-test), 1 msswsrqrpk spggiqphvs rtlfllllla asawgvtlsp kdcqvfrsdh gssiscqppa
12.5% (n=8) RA SAR0
(E3/E3)
SAR1
(E3/E3)
E2 E3 E4
ore

encontrando en RA reducciones 61 eipgylpadt vhlaveffnl thlpanllqg asklqelhls sngleslspe flrpvpqlrv

121 ldltrnaltg lppglfqasa tldtlvlken qlevlevswl hglkalghld lsgnrlrklp
§
Los datos de frecuencias alélicas son los proporcionados por Corella et al. 2000 en una población valenciana de 330 individuos
significativas (p ≤ 0.05) de 8 proteínas
se sc

181 pgllanftll rtldlgenql etlppdllrg plqlerlhle gnklqvlgkd lllpqpdlry sanos, Cervantes et al. 2011 en una población española de n= 627 o n=242 individuos sanos, y los procedentes de nuestro estudio
241 lflngnklar vaagafqglr qldmldlsnn slasvpeglw aslgqpnwdm rdgfdisgnp con 8 donantes sanos y 8 pacientes con artritis reumatoide. S= sanos, RA= enfermos de artritis reumatoide.
(albúmina, apoA1, apoA4, apoH, ATIII y 301 wicdqnlsdl yrwlqaqkdk mfsqndtrca gpeavkgqtl lavaksq
m/z secuencia pé
péptidos
LRG1

transtirretina) y aumentos de la cadena β

Mow

SAR6
SAR4 SAR5
de la haptoglobina. (E3/E3) (E2/E3)
(¿E3/E4?)
968.4616 [Link].L
989.5285 [Link].Q
Se realizó con todos los spots un 1152.5900
1712.8930
[Link].L
[Link].S
contraste de igualdad de distribuciones
basado en rangos (U de Mann-W hitney),
Sano RA Sano RA 1818.0360
2037.0852
2485.1331
[Link].Y
[Link].G
[Link].W SAR9
+(79-88)
2959.7098 [Link].V SAR7 SAR8
encontrando 41 spots con diferencias (E2/E3) (¿E3/E4?) (E2/E3)

significativas. Se detectó elevación en RA

de haptoglobina y LRG1, así como
reducciones de albúmina, A1AT, apoA1,
apoA4, apoH, ATIII, complemento C2,
hemopexina y transtirretina. LRG1 ATIII
1 hgspvdicta kprdipmnpm ciyrspekka tedegseqki peatnrrvwe lskansrfat
61 tfyqhladsk ndndniflsp lsistafamt klgacndtlq qlmevfkfdt isektsdqih
El estado procoagulatorio en RA 121 fffaklncrl yrkanksskl vsanrlfgdk sltfnetyqd iselvygakl qpldfkenae
181 qsraainkwv snktegritd vipseainel tvlvlvntiy fkglwkskfs pentrkelfy
encajaría con la reducción de ATIII, que 241 kadgescsas mmyqegkfry rrvaegtqvl elpfkgddit mvlilpkpek slakvekelt
ATIII

301 pevlqewlde leemmlvvhm prfriedgfs lkeqlqdmgl vdlfspeksk lpgivaegrd

provocaría un desequilibrio en la 361 dlyvsdafhk aflevneegs eaaastavvi agrslnpnrv tfkanrpflv firevplnti 1211.5800 [Link].E
formación/degradación de fibrina que 421 ifmgrvanpc vk 1232.6650 [Link].E

Librerías peptídicas
1340.6253 [Link].L
llevaría a su acumulación en 1389.7471 [Link].V
1405.7297 [Link].V + Oxidation (M)
articulaciones y placas ateromatosas. 1441.6395 [Link].S + 2 Oxidation (M)
1528.7152 [Link].N
1674.8612 [Link].A
El aumento de LRG1 en RA podría servir 1848.8849 [Link].S

para eliminar al citocromo c de la Gráficas de densidad +(107-160)

1864.8820
2202.1171
2291.1509
[Link].S + Oxidation (M)
[Link].A
[Link].S Pool S: 8 sanos Pool Sanos Pool Pacientes RA
circulación (señal de peligro) y como
Pool SAR: 8 enfermos
2315.0969 [Link].L + Oxidation (M)
3080.5160 [Link].S 5 8L 5 8L
factor de supervivencia para linfocitos o de 3096.5196 [Link].S + Oxidation (M)

activación para neutrófilos 0.1 mg;

mg; 3 ré
réplicas té
técnicas -97 kDa
1ª: IPG-
IPG-strips 5-8L (Protean
(Protean IEF -66.2 kDa
Cell TM)
2ª: 12% SDS-
SDS-PAGE. Ettan Dalt SixTM -45 kDa
Ettan Dalt Six
Tinció
Tinción: SYPRO Ruby

Análisis estadístico multivariante Aná

Análisis: Ludesi
Identificació
Identificación, MALDI-
TOF/TOF
TOF/TOF
MALDI-TOF y MALDI-
MALDI-
-31 kDa

El rango dinámico de concentración proteica en los sueros fue reducido utilizando una colección combinatoria de hexapéptidos (ProteMinerTM)
PC1 (Tamaño) especialmente formulada para análisis mediante 2-DE. Debido al elevado coste de esta tecnología, se decidió preparar dos pooles de muestras de un
volumen de 1 ml cada uno. El primero de ellos se generó a partir de los sueros de 8 donantes sanos, mientras que el segundo se preparó juntando los
sueros de los 8 pacientes con RA. Las proteínas eluidas de las columnas se separaron en geles bidimensionales. Debido a la pequeña cantidad de
Respuesta de fase aguda/inflamación proteína cargada en cada tira de IEF (0.1 mg), los geles fueron teñidos con SYPRO Ruby (Figura superior). El análisis diferencial fue realizado
utilizando el software LUDESI (Anova ≤ 0.05, fold ±2). Los resultados obtenidos (Figura inferior) confirman la reducción de anti-trombina III en suero de
pacientes con RA, pero entran en conflicto con la reducción observada previamente de apoA-I o apoA-IV, posiblemente porque se está favoreciendo la
interacción entre los hexapéptidos de las librerías y las apolipoproteínas.

PCA ID: #32, apoA-I Compilación de las proteínas encontradas modificadas en pacientes RA
Anova: 0.0452 dentro de las fracciones retenidas por la cromatografía tiofílica
Fold: 3.10
(inmunoglobulinoma) o en sueros tratados mediante inmuno-sustracción o
Sanos Pacientes RA librerías peptídicas
TM
Frecuencia (%)/valor absoluto (n)(1) Proteína Inmunoglobulinoma Suero sin Ig/HSA ProteoMiner
Componente % varianza acumulada explicada
ID: #72, apoA-IV Albúmina n.d. Reducida n.d.
PC1 30.28 (A) (B) (C) (D) (E) (F) Media
(2)
(G) Media
(3) Anova: 0.0108
Fold: 2.70 Antitrombina III n.d. Reducida Reducida
Nuestros

Nuestros
datos

datos

PC2 45.20 Apolipoproteína A-I n.d. Reducida Aumentada

PC3 55.47 Apolipoproteína A-IV n.d. Reducida Aumentada

Hp2-2 37.5/3 39.5/19 29/30 43.75/7 38.2/121 32.2/242 35.9/79 36.6%/501 25/2 17/4 21%/6 ID: #343, apoJ
PC4 63.19 Anova: 0.0340 Apolipoproteína J n.d. n.d. Aumentada
Hp2-1 37.5/3 37.5/18 45/46 37.5/6 47.6/151 51.2/385 48.2/106 43.5%/715 50/4 65/15 58%/19 Fold: 2.02
Ceruloplasmina n.d. Aumentada n.d.
PC5 69.56
Hp1-1 25/2 23/11 26/26 18.75/3 14.2/45 16.6/125 15.9/35 19.9%/247 25/2 17/4 21%/6
Complemento C2 n..d Reducido n.d.
PC6 74.66
20000,0 (1)
Frecuencia (%)/valor absoluto (n) Complemento C4a n.d. n.d. Aumentado
18000,0
PC7 78.93
16000,0
14000,0
12000,0
Hp2 56.3/9 58.3/56 51.5/106 62.5/20 62/393 57.8/869 60/264 58.3%/1717 50/8 50/23 50%/31 PC2 (Forma): ID: #289, C4a
Anova: 0.0034
Glicoproteína α2 rica
en leucina
n.d. Aumentada n.d.

10000,0 Fold: 2.18

8000,0
6000,0
Hp1 43.7/7

Ratios
(4)
41.7/40 48.5/98 37.5/12 38/241 42.2/635 40/176 41.7%/1209 50/8 50/23 50%/31
Fenotipo Haptoglobina n.d. Aumentada n.d.

4000,0 Hemopexina n.d. Reducida n.d.

2000,0
0,0

Hp2-2
enfermos

sanos
Hp2/Hp1 1.3 1.4 1.1 1.7 1.6 1.4 1.5 1.4 1 1 1 haptoglobinas ID: #92, ATIII
IgG, cadena pesada Aumentada n.d. Reducida

Hp2-1 Anova: 0.0192 Precursor amiloide n.d. Aumentada n.d.

Hp1-1
Fold: 2.64 sérico
(1) (A) Rodríguez et al. 2006. 2-DE. Población española. n= 48 individuos sanos; Quero et al., 2011. 2-DE. Población española. n=
Se ha aplicado una técnica de reducción de la dimensión de los datos (análisis de componentes 48 individuos sanos; (B) Álvarez-Blasco et al., 2009. PCR. Población española. n=102 individuos sanos; (C) Pavón et al., 2006. Proteína de unión a n.d. Reducida n.d.
principales o PCA) para generar un menor número de variables: los componentes. Como se 2-DE. Población española. n= 16 individuos sanos; (D) Datos de Moral et al., 1983. Purificación de haptoglobina y retinol
electroforesis en geles de poliacrilamida-urea. Población española (Barcelona). n=317 individuos sanos; (E) de Pacorbo &
aprecia en la Tabla, se necesitan un número elevado de componentes (PC1-PC7) para explicar García-Orad, 1987. Electroforesis en geles de almidón. n=752 individuos sanos procedentes de 9 poblaciones españolas; (F)
ID: #344, IgG, Proteína de unión a n.d. Reducida Aumentada
el 80% de la variabilidad. Datos de la población belga procedentes del estudio de Louagie et al., 1996. Electroforesis en geles de almidón de muestras
de suero suplementadas con hemoglobina. n= 220 individuos sanos; (G) Baeten et al., 2004. Población Belga. Electroforesis cadena pesada vitamina D
A pesar de que la interpretación del análisis PCA implica subjetividad, se puede decir que PC1 en geles de almidón. n= 23 pacientes RA Anova: 0.0153
Quininógeno Aumentado n.d. n.d.
se refiere al nivel de inflamación, ya que los spots con pesos negativos se corresponden con (2) La distribución de frecuencias fenotípicas en la población de individuos sanos está en consonancia con la esperada según el
2
Fold: 4.03
equilibrio de Hardy-Weinberg. ÷ (1 g.l.) = 0.262
proteínas de fase aguda positiva y viceversa. (3) La distribución de frecuencias fenotípicas en enfermos parece estar en consonancia con la esperada según el equilibrio de Tetranectina n.d. Reducida n.d.
2
Hardy-Weinberg . χ (1 g.l.) = 1.58
En cambio, el segundo componente podemos definirlo como el fenotipo de los individuos en cuanto a las haptoglobinas, ya que (4) En un polimorfismo equilibrado la ratio Hp2/Hp1 debería de permanecer constante, pero en este momento la especie Transtirretina n.d. Reducida n.d.
tanto las variables/proteínas con mayores coeficientes positivos (Haptoglobina, cadena α, Hp2) como las variables/proteínas con humana se encuentra en un estado de polimorfismo transitorio (Langlois & Delanghe, 1996). Ratio Hp2/Hp1 sanos: 1.4.
α1 anti-quimotripsina n.d. Aumentada n.d.
Ratio Hp2/Hp1 enfermos: 1
mayor peso negativo (Haptoglobina, cadena β y Haptoglobina cadena α, Hp1s/f) dentro de PC2 son cadenas de las haptoglobinas.
Haptoglobina actúa como una molécula antioxidativa y un antagonista natural de la inflamación y la activación del sistema inmune. α1 anti-tripsina Reducida Reducida n.d.
Sus niveles aumentan en muchas enfermedades (ej., RA), aunque también se ven influenciados por el fenotipo de los individuos
α2 HS glicoproteína n.d. Reducida n.d.
(ver histograma). Las frecuencias alélicas obtenidas en nuestros 8 controles sanos (Hp1 0.437 y Hp2 0.563) encajan con los datos
de la población gallega (Carracedo et al., 1987) (Hp1 0.426 y Hp2 0.573) y otras regiones españolas (Hp1, 0.37-0.44; Hp2, 0.56-
0.63; Tabla) y europeas (Moral et al., 1983). Nuestros datos en pacientes con RA apuntan incluso hacia una mayor frecuencia del
alelo Hp1 y del fenotipo Hp 2-1 (Tabla), si bien el tamaño muestral no permite confirmar si dichas diferencias son significativas.
Algunos datos en la población belga (Baeten et al. en 2004) parecen reforzar esa idea.
 Entidad financiadora:

Ministerio de Educación y Ciencia (BFU2006-09717/BMC).

Xunta de Galicia (INCITE08PXIB200062PR).