GUÍA N° 4: TOMA DE MUESTRAS, PROCESAMIENTO Y MÉTODOS DE SIEMBRA PARA

AISLAMIENTO BACTERIANO

FACULTAD CURSO AMBIENTE

INMUNOLOGÍA,
FACULTAD DE CIENCIAS DE LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA E
LA SALUD MULTIFUNCIONAL 2
INFECCIÓN

ELABORADO POR JOHANNA IVONNE REYES CASTILLO APROBADO POR DENISSE CHAMPIN
VERSIÓN 001 FECHA DE APROBACIÓN 26/2 / 20

1. LOGRO GENERAL DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE

Al final de la unidad el estudiante diferencia las características de las bacterias que explican su
transmisión y generación de enfermedad

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO

Al finalizar la unidad el estudiante ejecuta las diferentes técnicas de cultivo y aislamiento bacteriano, así
como observar el desarrollo de las bacterias a partir de un cultivo mixto.

3. MATERIALES Y EQUIPOS

 Tubo con cultivo mixto de Staphylococcus aureus y Escherichia coli en caldo nutritivo.
 Placas con agar nutritivo.
 Placas con agar Mac Conkey.
 Placas con agar manitol salado.
 Tubos con caldo nutritivo.
 Tubos con agar nutritivo.
 Asa bacteriológica en aro y en punta.

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 4. PAUTAS DE SEGURIDAD

Normas a seguir en el laboratorio

1. El uso de la bata de laboratorio es indispensable, tanto para asistir a la práctica y durante las sesiones; siempre
debe estar bien abotonada y deberá quitársela antes de abandonar el laboratorio.
2. Se prohíbe ingerir o beber, y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
3. Se prohíbe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto.
4. Mantenga la mesa libre de todo lo que no sea esencial. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no
relacionados con la práctica de laboratorio, colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la
zona especificada por el profesor.
5. Se deberá lavar bien las manos con agua y jabón, antes y después de cada práctica. Luego asegure de frotarse
las manos con alcohol.
6. Llevar registro de sus análisis indicando: Tipo de muestra, procedencia, fecha, tipo de siembra o método,
cultivos empleados y resultados obtenidos.
7. Identificar las muestras antes de comenzar el análisis, no desechar hasta obtener el resultado (contramuestra).
8. El material a examinar debe tocarse exclusivamente con instrumentos estériles.
9. Cuando tenga el asa bacteriológica cargada con algún cultivo de microorganismos no se desplace de un área a
otra ya que puede crear aerosoles, trabaje solo en su puesto y siempre flamee el asa antes y después de usarla.
10. En caso de regarse un cultivo sobre la mesa o el piso o cualquier accidente como cortadura, quemaduras, caída
del material infectado en la conjuntiva ocular, ruptura de una lámina montada al microscopio de aviso
inmediato al profesor o monitor. Tome todas las precauciones posibles para evitar estos accidentes.
11. Descarte todo el material usado en recipientes destinados para tal fin por ningún motivo en los desagües o
lavatorios.
12. Tenga cuidado con las preparaciones teñidas ya que puede salpicar colorantes a mesones y pisos.
13. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos.
14. Antes y después de cada sesión práctica, los alumnos deberán limpiar y desinfectar la superficie de las mesas
de trabajo con el desinfectante que se le proporcionara para este fin; y asimismo, dejar ordenada la mesa de
trabajo antes de retirarse.

Sugerencias para el trabajo en el laboratorio

1. Es muy importante la asistencia a la práctica a la hora indicada, ya que las explicaciones se darán en los
primeros minutos. Cada sesión de laboratorio deberá iniciarse con una corta explicación. No empiece a trabajar
hasta que haya recibido todas las instrucciones.
2. Venir leyendo la guía de laboratorio y antes de comenzar la práctica. Esto le ayudará a entender mejor y a
realizar un ordenado y eficiente trabajo de laboratorio. La buena técnica de laboratorio depende
primordialmente de que se sepa lo que se va a hacer.
3. Anote todos los resultados y las explicaciones pertinentes.
4. Los instrumentos de laboratorio son muy delicados. Tenga mucho cuidado al manejarlos. Cualquier pequeño
descuido puede ocasionar una pérdida irreparable.
5. El material entregado para la práctica debe ser devuelto antes de abandonar el laboratorio.
6. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos como de sus
cuadernos o prendas de vestir.
7. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos
contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les
indicará el profesor.
8. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas,
autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier Irregularidad en el funcionamiento.
9. En caso de producirse una quemadura por fuego u otro motivo, el alumno deberá notificarlo de inmediato al
profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la
calma y de inmediato informar al profesor, debiendo inmediatamente: Colocar toallas de papel sobre el material
derramado para evitar su dispersión y poner abundante solución desinfectante sobre las toallas y dejar transcurrir al
menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la eliminación de materiales
contaminados.

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 5. FUNDAMENTO

 La población microbiana ambiental es grande y diversa. También existe una gran variedad de
especies de microorganismos que habitan normalmente las distintas partes de nuestro cuerpo,
como, por ejemplo: la cavidad oral, tracto intestinal y la piel, donde se encuentran en grandes
cantidades. De igual manera el medio que nos rodea, aire, suelo, agua y alimentos tienen una
diversidad de microorganismos.
 El estudio adecuado de las bacterias que existen en estos hábitats requiere de procedimientos que
nos permitan identificar específicamente a cada una de ellas; Para lograr lo anterior es necesario
utilizar técnicas que ayuden a separar esta compleja población, mixta en sus distintas especies.
 Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células bacterianas
(inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al querer aislar una especie en
particular a partir de una muestra con mezcla de microorganismos deben emplearse técnicas de
aislamiento lo que permiten obtenerlas en forma pura.
 Esto implica la utilización de medios tanto simples como especiales, mayormente sólidos de acuerdo
a la naturaleza del microorganismo. Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones
sucesivas.

6. PROCEDIMIENTO (DESARROLLO DE LA PRÁCTICA)

EXPERIENCIA 1.

Manejo del asa bacteriológica

 El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que se deben tener
en la toma de la muestra, tales como: esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar la destrucción de
las bacterias.
 Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido (ya que este sitio se encuentra una mayor
concentración de microorganismos) y observar que el asa al retirar el tubo esté cubierta por una
película líquida.

Método de siembra por agotamiento

 Tomar un lápiz graso y marcar por detrás de la placa que contiene el agar, las líneas, como está
indicado en la figura 1, quedarán tres sectores, el sector número 1 es más pequeño que los otros dos
y servirá para descargar el asa.
 Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido (como se indicó previamente).
Cerrar el tubo y colocar en una gradilla.

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  Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar trazando una
serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector 1. (Esto mismo se puede hacer
colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano, hacer un movimiento rápido
para levantar el fondo que contiene el medio de cultivo, como indicará el profesor).
 Esterilizar el asa en el mechero. Girar la placa 90 grados hasta que el sector 1 quede a la izquierda
y el sector 2 hacia arriba. Sin volver a tocar el inóculo, trazar un zigzag un poco más abierto en el
sector 2, invadiendo el sector 1 en las primeras líneas de zigzag, pero no en las últimas.
 Girar nuevamente la placa 90 grados, ahora el sector 2 estará a la izquierda y el sector 3 hacia la
derecha. Hacer un nuevo zigzag en el sector 3, invadiendo el sector 2. Este paso puede repetirse,
sembrando un cuarto sector.
 Incubar las cajas a 37° C durante 24 horas. Las placas ya sembradas deberán colocarse con la tapa
hacia abajo.

Método de siembra en caldo de cultivo

 Coger el asa de siembra en aro, esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos
segundos. Abrir una placa con cultivo bacteriano y coger una colonia bien aislada, con ayuda del
asa de siembra.
 Luego destapar un tubo con caldo de cultivo, cogiendo la torunda con el dedo meñique de la
mano con que se está cogiendo el asa de siembra.
 Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la colonia del
asa de siembra.
 Tapar el tubo con la torunda, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el caldo.
Llevar a incubar a 37° C por 12 horas.
 Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo.

RESULTADOS:
Esquematiza las observaciones realizadas indicando las principales características de cada uno de los
métodos de siembra y aislamiento estudiados durante la sesión práctica.

Experiencia No. 1

Caldo nutritivo

Sin sembrar Escherichia coli Staphylococcus aureus

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 Observaciones:

Experiencia No. 2

Agar nutritivo

Sin sembrar (blanco) Escherichia coli Staphylococcus aureus

Observaciones:

Experiencia No. 3

Agar Mac Conkey

Sin sembrar Escherichia coli

Observaciones

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Cuestionario

1. ¿Qué métodos de siembra se utilizan en el laboratorio de microbiología y en qué consisten?

La siembra se puede realizar en medios líquidos, sólidos o semisólidos utilizando asas, hilos o hisopos o 8.
pipetas estériles. Los bucles o hilos deben esterilizarse con llama (hasta que todo el hilo esté al rojo
vivo) y enfriarse antes y después de sembrar.
2. ¿Qué es un aislamiento bacteriano y para qué sirve?
Es una colección de cultivos bacterianos puros extraídos por técnicas de laboratorio de un ambiente a
otro para inducir el crecimiento en medios nutritivos artificiales con el fin de llevar a cabo su
identificación.
3. ¿Cuál es la importancia de los métodos de siembra para un aislamiento bacteriano?
Estos métodos son importantes porque permiten cultivarlos bajo condiciones experimentales y
manejar un solo tipo de [Link] que, es necesario considerar que en el área de trabajo,
existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir
que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. También es importante considerar las
condiciones ambientales como el ph, la luminosidad, concentración de sales, temperatura, incubación
y otros. La aplicación de estos procedimientos ha facilitado de este modo, el estudio, caracterización,
aplicación y control de los mismos.
4. ¿Cuáles son los nutrientes que aporta el medio de cultivo a los microorganismos?
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman las sustancias químicas que necesitan para
crecer, del medio donde habitan. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para dos
objetivos:
-Energéticos: Los microorganismos requieren energía del exterior.
-Biosintéticos: formar sustancias que constituyen la célula (Ej.: proteínas)
Los nutrientes pueden clasificarse en:
-Universales: Son aquellos nutrientes que todos, o bien la mayoría de los microorganismos, requieren
para su crecimiento. Los más importantes son: agua, dióxido de carbono (CO2), fosfatos, sales
minerales.
-Particulares: Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo de
las capacidades biocinéticas del microorganismo que se considere. Concretamente consideraremos los
elementos N y S (que requieren todos los seres vivos).
-Factores de crecimiento: Son moléculas orgánicas específicas que algunas bacterias necesitan, en muy
pequeña cantidad, para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica, ni sirven como fuente de
energía. Suelen ser coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden
fabricar por sí mismas, al carecer de parte (o toda) de una ruta biocinética. Consideraremos como
ejemplos, oligoelementos, vitaminas y minerales. 
5. ¿Para qué casos se utiliza un medio líquido o un medio sólido o semisólido o de que depende su uso?
Los medios de cultivo :
Líquidos: Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua.
Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.
Sólidos: Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes
solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y
mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
Semisólidos: Contienen el agente solidificante en menor concentración que los sólidos, como
el  Agar de Hugh-Leiffson.
6. ¿Cuál es la importancia de un cultivo puro?
Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Por importantes porque
mantienen los organismos viables, permiten hacer subcultivos para someterlos a diferentes análisis e
intercambiarlos con otros laboratorios
7. ¿Qué es el agar y porque la importancia de su uso?
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Su uso es
importante porque se  utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El
componente predominante en el agar bacteriológico es un polisacárido al que acompañan algunas
impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de agar al 1-2 % en agua licua hacia los
100°C y se gelifica alrededor de los 40°C, dependiendo de su grado de pureza. Con la excepción de
algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente por las bacterias. Página 6 de 6
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¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias?
El agar nutritivo es un medio de cultivo comúnmente utilizado para todo tipo de bacterias. Es muy útil
porque permanece sólido incluso a temperaturas relativamente altas. Además, el crecimiento bacteriano en
este agar tiene lugar en la superficie, lo que facilita la distinción de colonias pequeñas.

Experiencia No. 4

Agar manitol salado

Sin sembrar Staphylococcus aureus

Observaciones:

7. ENTREGABLES

8. FUENTES DE INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA

 Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
 Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by
Frances Pouch Downes and Keith Ito, 200.
 Practical Handbook of Microbiology. CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College,
New York, New York, USA.
 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore,
USA.
 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated
(APHA), American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater. Ed. (1991).

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