Prácticas de Enzimología

PRÁCTICA 1

CALCULO DE VELOCIDAD INICIAL A PARTIR DE

CURVAS DE PROGRESO

Resumen
Los términos Vmax (velocidad máxima) y Km (constante de Michaelis) son dos
parámetros cinéticos característicos de cada enzima, que pueden determinarse
experimentalmente.
La velocidad máxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad de reacción se hace
independiente de la concentración de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad
alcanza un valor máximo. Este valor depende de la cantidad de enzima que
tengamos.
La constante de Michaelis (Km) nos indica la concentración de sustrato a la cuál la
velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Este parámetro es
independiente de la concentración de enzima, y es característico de cada enzima
según el sustrato utilizado (si tiene varios). La Km también indica la afinidad que
posee la enzima por el sustrato, siendo esta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto
menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad
de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese
sustrato

Objetivos
 Calcular velocidades iniciales
 Representar curvas de saturación

Marco teórico:
El curso de las reacciones enzimáticas

Después de mezclar una enzima con su sustrato en solución y luego de medir (por algún
medio conveniente) la cantidad de sustrato remanente y/o la cantidad de producto
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liberado durante el tiempo, se puede observar curvas de progreso similares a las que se
muestra en la Fig. 1.1.

Notar que la curva de depleción del sustrato es la imagen especular de la curva de

aparición del producto. En los primeros momentos la pérdida del sustrato y la aparición
del producto cambian rápidamente con el tiempo, pero conforme aumenta el tiempo
estas velocidades disminuyen, llegando a cero cuando todo el sustrato ha sido
convertido en producto pro la enzima. Tales cursos respecto al tiempo están bien
modelados por la cinética de primer orden:

donde [S] es la concentración de sustrato remanente en el tiempo t, [So] es la

concentración de sustrato de partida, y k es la constante de velocidad de seudo-primer
orden para la reacción. La velocidad v de tal reacción está dada por:

Observemos con más cuidado el perfil de aparición del producto para una reacción
catalizada enzimáticamente (Fig. 1.2). Si restringimos nuestra atención a la porción muy
inicial de esta gráfica (área sombreada), observamos que el incremento en la formación
del producto (y también la depleción del sustrato) es aproximadamente lineal respecto al
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tiempo. Para este periodo de tiempo limitado, la velocidad inicial vo puede ser
aproximada como la pendiente (cambio en y sobre el cambio en x) de la gráfica lineal
de [S] o [P] en función del tiempo:

Experimentalmente, se puede encontrar que el curso de la aparición del producto y la

depleción del sustrato quedan bien modeladas por una función lineal hasta cuando un
10% de la concentración inicial del sustrato haya sido convertido en producto. Al variar
las condiciones de la solución, podemos alterar la longitud del tiempo en el que una
reacción catalizada por una enzima puede exhibir cinética lineal. Aquí, asumimos que la
velocidad de reacción se mide durante esta fase inicial de la reacción, lo cual indica que
desde aquí v = vo, la velocidad inicial.

Problemas
PROBLEMA 1

Un substrato S se transforma en producto por acción de una enzima, y la velocidad de

su desaparición se mide cada 30 segundos durante 3 minutos. Se preparó una serie de 6
tubos de ensayo que contenían 1.5 g de enzima (P.M. = 30,000) a los cuales se les
agregó el mismo volumen de solución de substrato, pero de distinta concentración. Los
resultados se dan en la siguiente tabla. ¿Cuáles son las velocidades iniciales para cada
tubo con distinta concentración de substrato?
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PROBLEMA 2 La fosfatasa alcalina de leche cataliza la siguiente reacción:

Con el fin de calcular el Km de la enzima para el fenil fosfato disódico (FFDS), se hizo
un estudio cinético utilizando un extracto con una concentración óptima de la enzima.

La velocidad de reacción se midió según la cantidad de fenol liberado, utilizando el

reactivo de Folin. Se prepararon cuatro series de tubos de ensayo con concentraciones
crecientes de FFDS tamponado a pH 10.

En cada tubo se añadió 0.2 ml de la solución enzimática y se incubaron a 37°C durante

tiempos de: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 y 5.0 minutos.

Transcurrido el tiempo de incubación se detuvo la reacción añadiendo 2 ml de reactivo

de Folin. Se agregó a cada tubo 1 ml de solución de Na2CO3 al 20% y, después de 15
minutos, se midió la absorbancia a 680 nm.

Paralelamente, se prepararon blancos (controles) para cada concentración de substrato y

tiempo de incubación, sustituyendo el extracto enzimático por 0.2 ml de tampón.

Los valores de absorbancia obtenidos para cada tubo blanco se restaron del valor de la
absorbancia de su respectivo tubo problema.

A partir de los datos experimentales obtenidos, representar la curva de saturación de la

enzima y calcular el Km.
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Resultados
Problema 1
tiempo Substrato transformado (uMol)
  0
S 1
S 2
S 3
S 4
S 5
S 6
S
0.5 0 0.49 0.56 0.71 1.1 1.36 1.45
1 0.1 0.95 1.13 1.42 2.14 2.64 2.94
1.5 0.2 1.46 1.73 2.36 3.28    
2 0.3 1.93 2.31 2.88      
2.5 0.4 2.41 2.9 3.6      
3 0.5 2.9 3.5        
concentración 0 2.32 3 4.55 12.6 38.5 200
inicial 6
moles/ml

Curvas de progreso
4
f(x) = 1.49
0.724x x−++0.04
1.09
1.28 0.00666666666666638
0.0800000000000001
0.0220000000000002
3.5
f(x) = 0.588285714285714 x − 0.0373333333333332
3
f(x) = 0.482857142857143 x
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0.5 1 1.5 2 2.5 3

s1 Linear (s1) s2
Linear (s2) s3 Linear (s3)
s4 Linear (s4) s5
Linear (s5) s6 Linear (s6)

Vo=m
1
S 0.48
2
S 0.59
3
S 0.72
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4
S 1.09
5
S 1.28
6
S 1.49

Problema 2

Curvas de progreso
0.6
f(x) = 0.070875 x + 0.2814375
0.5
f(x) = 0.060875 x + 0.1964375
0.4
f(x) = 0.046625 x + 0.1473125
0.3

0.2 f(x) = 0.033625 x + 0.0788125

0.1

0
0 1 2 3 4 5 6

S1 Linear (S1) S2
Linear (S2) S3 Linear (S3)
S4 Linear (S4)

Vo
S1 0.034
S2 0.047
S3 0.061
S4 0.071

Se aplica la inversa de la concentración y la velocidad inicial

1/Vo 1/[S]
29.41176471 4
21.27659574 2.22222222
16.39344262 1
14.08450704 0.4
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35

30
f(x) = 4.2632661955886 x + 12.1676869451258
25

20

15

10

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Vmax 1/Vmax=12.168 0.0821 mM/s

Km 1/km=-2.854121 0.3504 mM

Vmax= 0.0821 mM/s

Km= 0.3504 mM

Conclusiones
Estudiar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de una enzima no es
sencillo, si pensamos que lógicamente la concentración del sustrato disminuye según
avanza la reacción.
La velocidad de una reacción catalizada (V) nos indica la cantidad de sustrato
consumido, o producto formado, por unidad de tiempo
Para una concentración baja de sustrato, la velocidad de la reacción es directamente
proporcional a la concentración del sustrato (relación lineal), la cinética es de primer
orden.
Para una concentración alta de sustrato, la velocidad de la reacción se hace
prácticamente constante e independiente de la concentración de sustrato, la cinética se
considera de orden cero
Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser lineal,
y a esta zona se la denomina de cinética mixta

Cuestionario
1. ¿Cuál es la reacción que cataliza la fosfatasa alcalina de la leche?
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La fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima presente de forma natural en todas las
leches crudas. Cataliza la desfosforilación de muchos tipos de proteínas y
nucleótidos.
2. Indique la importancia de las fosfatasas que componen la leche.
La fosfatasa alcalina es una enzima presente en la leche cruda y progresivamente
inactivada por calentamiento a temperaturas superiores a 60°C. Las temperaturas
normales de pasterización baja y alta de la leche la inactivan. Por ello debe estar
ausente en una leche correctamente pasterizada. La ausencia de esta enzima
termolábil a la salida de la leche del pasterizador permite asegurar que la
pasterización ha sido efectuada a una temperatura suficientemente alta para
asegurar la destrucción de los gérmenes patógenos, normalmente destruidos por
la pasterización
3. ¿Qué importancia tienen las determinaciones cinéticas en la industria de
alimentos y en bioquímica, de 2 ejemplos?
Es muy importante el estudio de la cinética de crecimiento de los
microorganismos, ya que permite a la industria alimentaria conocer mejor el
desarrollo microbiano de los productos alimentarios y poder desarrollar métodos
de rendimiento y prevención en los procesos como:
Pasteurización de la leche y control de microorganismo en productos
alimenticios

Bibliografía

CSA seguridad alimentaria . (2021). ¿Qué es la cinética microbiana? Obtenido de

[Link]
%20importante%20el%20estudio,y%20prevenci%C3%B3n%20en%20los
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[Link]
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Martinez, A., & Rosenberger, M. (2013). MODELADO NUMÉRICO DE
PASTEURIZACIÓN ARTESANAL DE LECHE Y JUGOS NATURALES.
Obtenido de
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[Link]
[Link]?sequence=1&isAllowed=y
Universidad de Murcia. (2019). Determinación del grado de calentamiento de la leche.
Obtenido de [Link]
cursos/higiene-inspeccion-y-control-alimentario/practicas/determinacion-del-
grado#:~:text=La%20fosfatasa%20alcalina%20es%20una,en%20una%20leche
%20correctamente%20pasterizada.