Esquemas practicas

Practica 2 pureza y cuantificación ADN

[Link] de resultados

Preguntas sobre el trabajo a partir de una muestra patrón

1. ¿Qué valores de absorbancia has obtenido al analizar el esperma de salmón?

A230 A260 A280 A320

Muestra diluida 0.093 0.138 0.082 0.017

2. ¿Podrías considerar que tu muestra es pura? Realiza los cálculos correspondientes.

Para determinar si una muestra es pura, se utiliza la relación de absorbancia A260/A280. Para una muestra de ADN puro, se espera
que esta relación esté en el rango de 1.8 a 2.0.

En este caso, la relación de absorbancia A260/A280 sería:

A260/A280 = 0.138/0.082 = 1.68

Este valor indica que la muestra no es pura, ya que la relación de absorbancia A260/A280 está por debajo del rango esperado para una
muestra de ADN puro.

Sin embargo, es importante tener en cuenta que esta muestra es de esperma de salmón y no de ADN purificado, por lo que es posible
que otros componentes de la muestra, como proteínas o lípidos, estén afectando la relación de absorbancia A260/A280. Por lo tanto,
se deben realizar pruebas adicionales para determinar la pureza de la muestra.

3. ¿Qué dilución has tenido que hacer de tu muestra para leer la absorbancia en el espectrofotómetro?

4. ¿Qué concentración de DNA genómico tiene tu muestra?

[Link] de hacer la lectura de absorbancia, ha tenido que hacer el blanco. ¿Con qué lo ha hecho? ¿Por qué?

Es común que antes de realizar la lectura de absorbancia en espectrofotometría, se realice una lectura de blanco para establecer el
fondo o nivel de ruido de la lectura.

El blanco se realiza con el mismo disolvente que se utiliza para diluir la muestra, en este caso probablemente agua destilada. La razón
por la cual se utiliza agua destilada como blanco es para establecer un punto de referencia para la lectura de absorbancia de la muestra.
El agua destilada no debería contener ninguna molécula que absorba luz en el rango de longitud de onda utilizado para la lectura, por
lo que cualquier lectura de absorbancia obtenida del blanco se debe únicamente al ruido de fondo del espectrofotómetro y no a la
presencia de moléculas en la solución.

Por lo tanto, al restar la lectura de absorbancia del blanco a la lectura de absorbancia de la muestra, se corrige cualquier variación en
la lectura debida al ruido de fondo y se obtiene una medida más precisa de la absorbancia de la muestra.

Preguntas sobre el trabajo a partir de tu muestra

6. ¿Qué valores de absorbancia has obtenido al analizar tu muestra?

 A230 A260 A280 A320

Mostra diluïda 0.083 0.272 0.045 0.002

7. ¿Cuál es la dilución de la muestra de ADN en la cubeta de cuarzo respecto a la muestra de partida?

- Mostra diluïda: 1950 microlitros de agua destilada con 50 microlitros de ADN

8.¿Es pura tu muestra de ADN purificado? ¿Por qué?

Para determinar si la muestra de ADN purificado es pura, se utiliza la relación de absorbancia A260/A280 y A260/A230. Se espera
que esta relación esté en el rango de 1.7 a 2.0 y 1.5 a 2.2 para una muestra de ADN puro. En este caso, la relación de absorbancia
A260/A280 y A260/A230 sería:

A260/A280 = 0.270/0.043 = 6.27

A260/230 = 0.270/0.081=3.33

Este valor indica que la muestra no es pura, ya que la relación de absorbancia A260/A280 está por encima del rango esperado para
una muestra de ADN puro. Es posible que otros componentes de la muestra, como ARN, estén afectando la relación de absorbancia
A260/A280 se puede eliminar con ARNasas.

9. ¿Qué concentración de ADN genómico hay en la cubeta?

Para calcular la concentración de ADN genómico en la cubeta, se puede utilizar la ley de Lambert-Beer:

C = A / (ε x l)

donde C es la concentración en µg/mL, A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción molar en unidades de L/(mol x cm), y l es
la longitud de la trayectoria de la luz en cm (en este caso, la longitud de la cubeta de cuarzo, que suele ser de 1 cm).

El coeficiente de extinción molar para el ADN a una longitud de onda de 260 nm es de aproximadamente 50 µg/(mL x cm). Por lo
tanto, la concentración de ADN en la cubeta sería:

C = 0.272 / (50 x 0.1) = 0.544 µg/mL

10.¿Qué concentración de ADN genómico hay en la muestra original sabiendo que hay 3ml 0.75 ml?

Para calcular la concentración de ADN genómico en la muestra original de 3 mL, se necesita conocer el volumen final de la muestra
en la cubeta y la cantidad de diluciones realizadas. Si no se dispone de esta información, no es posible calcular la concentración de
ADN en la muestra original.

Preguntes extra

[Link] la puresa de les següents mostres. A les mostres que creguis que hi ha contaminació, explica quins són els possibles
contaminants i quines solucions prendries per eliminar-los:

MOSTRA 1: DNA MOSTRA 2: DNA MOSTRA 3: RNA

A230 = 0,182 A230 = 0,235 A230 = 0,229
A260 = 0,352 A260 = 0,436 A260 = 0,312
A280 = 0,265 A280 = 0,248 A280 = 0,166
A320 = 0,025 A320 = 0,020 A320 = 0,029
[Link] un tubo eppendorf disponemos de 50µl de una solución de DNA genómico humano. Para calcular su concentración se diluyen
5µl de la solución con 195µl de tampón y se miden las absorbancias de la dilución a 260nm, 280nm y 320nm.

Los valores obtenidos son:

MUESTRA

A260 = 0,469

A280 = 0,265

A320 = 0,019

Calcule:

●La pureza del DNA

●La concentración de la solución original en ng/µl

●La cantidad total de DNA en µg en la solución original.

[Link] ha purificado un DNA genómico de ratón obteniendo 100µl de solución. Para calcular su concentración se diluyen 2µl de esta
solución con 398µl de tampón TE. Se miden las absorbancias de la dilución a 230nm, 260nm, 280nm y 320nm. Los valores obtenidos
son:

A230 = 0,229

A260 = 0,312

A280 = 0,166

A320 = 0,029

Calcule:

●La pureza del DNA, indique los posibles contaminantes y qué soluciones tomaría para eliminarlo.

●La concentración de la solución original en ng/µl

●La cantidad total de DNA purificado en µg en la solución original.

Preguntas opcionales (para seguir practicando)

14. Analiza la pureza de las siguientes muestras. En las muestras que creas que existe contaminación, explica cuáles son los posibles
contaminantes y qué soluciones tomarías para eliminarlos:

MUESTRA 1: DNA MUESTRA 2: DNA MUESTRA 3: RNA

A230 = 0,182 A230 = 0,235 A230 = 0,229

A260 = 0,352 A260 = 0,436 A260 = 0,312

A280 = 0,265 A280 = 0,248 A280 = 0,166

A320 = 0,025 A320 = 0,020 A320 = 0,029

15. En un tubo eppendorf disponemos de 50µl de una solución de DNA genómico humano. Para calcular su concentración se diluyen
5µl de la solución con 195µl de tampón y se miden las absorbancias de la dilución a 260nm, 280nm y 320nm.

Los valores obtenidos son:

MUESTRA

A260 = 0,469

A280 = 0,265

A320 = 0,019

Calcule:

a. La pureza del DNA

b. La concentración de la solución original en ng/µl

c. La cantidad total de DNA en µg en la solución original.

PRÀCTICA Nº3: DISSENY DE PRIMERS

1. Objetivos

⮚Utilizar programas de bioinformática para obtener información sobre el inserto que clonará o sobre los cebadores necesarios para
llevar a cabo una PCR.

⮚Caracterización de programas informáticos utilizados en técnicas de secuenciación.

[Link] teórico

La BIOINFORMÁTICA es una parte de la informática que utiliza herramientas computacionales para gestionar y analizar datos
biológicos y médicos.
 La gestión de datos comporta: adquisición, organización, almacenamiento, análisis, comparación, visualización....

La bioinformática aplicada a la biología molecular tiene las siguientes aplicaciones:

●Localizar y comparar secuencias

●Diseño de primeros y sondas

●Obtener información sobre los fragmentos que se quieren insertar para clonar, etc.

La evolución de la bioinformática se ha debido a la evolución de las técnicas de biología molecular.

Bases de datos que se han desarrollado en el campo de la bioinformática:

⮚Bases de datos de proteínas

⮚Bases de datos genómicos para almacenar la información obtenida de la secuenciación completa de muchos organismos, incluyendo
el genoma humano.

⮚Aplicaciones por análisis y comparación de secuencias.

⮚Software para creación de mapas genómicos y cromosómicos.

⮚Diseño de primeros y sondas.

⮚Herramientas para creación de árboles filogenéticos.

⮚Aplicaciones para la interpretación de microarrays y análisis de expresión génica.

⮚Modelos de predicción de la estructura 3D de proteínas.

El último avance en bioinformática ha sido la investigación simulada por ordenador.

Nosotros nos centraremos en 3 tipos de aplicaciones bioinformáticas para estudios en biología molecular: BASES DE DATOS DE
SECUENCIAS, ANÁLISIS DE SECUENCIAS Y DISEÑO DE PRIMEROS.

Algunas bases de datos son:

●PubMed

●GenBank

●Swissprot

●PDB (Protein Data Bank)

●ENSEMBRE

●NCBI

1. Procedimento experimental

Queremos realizar una PCR de los genes DMD de humanos. Algunas alteraciones en el gen DMD provocan Distrofia Muscular de
Duchenne.

En esta práctica, se pretende diseñar los primeros que permitirán la amplificación por PCR de regiones concretas de cada uno de los
dos genes.

a. Busque el gen DMD en la base de datos de PubMed.

b. En el buscador de PubMed seleccione la opción de “Gene” e introduzca el nombre del gen que está buscando.

c. Seleccione el gen de humano (Homo sapiens), que tiene el código de referencia ID: 1756.

d. Llegue a una página que centraliza mucha información sobre este gen. En nuestro caso, utilizamos la información contenida en
Ensembl, un navegador genómico realizado por genetistas, biólogos moleculares y otros investigadores que estudian los genomas de
la especie humana y de otros vertebrados y organismos modelo.

e. Una vez en Ensembl, puede consultar mucha información sobre este gen: descripción, otros sólo, localización, fenotipos, etc.
Concretamente, si entra en el apartado de fenotipos, encontrará las patologías que se asocian al gen concreto que está analizando. En
el caso del gen DMD, encontrará la Distrofia Muscular de Duchenne.
 f. Dentro de cada patología seleccione la opción Show, para ver todas las variantes asociadas a cada patología.

g. Para el caso del gen DMD, no es necesario que se quede con ninguna de estas variantes, ya que, directamente, buscará el exón 13
para encontrar las regiones flanqueantes que le permitan diseñar los primeros para la PCR.

h. En las opciones de la parte izquierda de la pantalla de Ensembl, seleccione Sequence.

2. Hoja de resultados

1. Haga una copia de las siguientes pantallas:

● Pantalla del PubMed donde aparece información del gen.

● Pantalla del Ensembl donde aparece información del gen.

● Pantalla de Ensembl donde se vea la tabla con diferentes fenotipos y enfermedades asociadas a variantes del gen.

● Pantalla de Ensembl donde se vea la secuencia del gen que copiará en el Primer3Plus.

1. Haga una copia de la secuencia de su interés con las correspondientes regiones flanqueantes. Recuerde señalar la región de interés
entre corchetes [ ].

2. ¿Cuáles son los primeros forward y reverse que ha obtenido en cada caso?

3. ¿Cuáles son las características de cada pareja de primeros?

4. Finalmente busque el gen de la enfermedad genética que ha escogido cada equipo y diseñe los primeros que le permitirían realizar
una PCR con el fin de dar un diagnóstico.

1. Formulari

En aquest cas, el formulari l’omplireu a partir de les preguntes que hi ha a continuació.

Aquí teniu el link al formulari: [Link]

Realice el diseño de primeros para amplificar unas regiones concretas para las secuencias dadas.

Con el fin de diseñar ladrillos los mismos primeros, haremos que cumplan estas dos condiciones:

- Tienen una longitud de 18 bp.

- Se unen JUSTO a los nucleótidos que flanquean la región roja.

COMPTE! Aquestes dues condicions només s’apliquen per aquest exercici. Ja sabeu que en el disseny de primers ÉS POSSIBLE:

- Dissenyar primers amb una longitud de 16 bp a 35 bp.

- Fer que els primers hibdridin en regions no tan properes a la regió d’interès (és a dir, amb uns quants nucleòtids de separació).

A) Diseña MANUALMENTE los primeros que te permitirían amplificar la región señalada en rojo.

5’ATGAGCTATGCTAGCTGGATATTTTCCCGATGGATAGGATACGATCCCTAGGCTAGCTAGC3’

3’TACTCGATACGATCGACCTATAAAAGGGCTACCTATCCTATGCTAGGGATCCGATCGATCG5’

Resultat primer F:

Resultat primer R:

B) Diseña MANUALMENTE los primeros que te permitirían amplificar la región señalada en rojo. Sigue las indicaciones de
18 bp y primeros flanqueantes en la región roja.
Resultat primer F:

Resultat primer R:

C) Diseña MANUALMENTE los primeros que te permitirían amplificar la región señalada en rojo. En este caso, como puedes
comprobar, sólo se te da una de las dos cadenas, pero, sin embargo, tú sabes cómo deducir la otra, ¿no? :)

5’GCCATCGATCGGATAATCGATTCGACAGTGACAGCCTAGCTAGTCGGTAGCTGTGACGA3’

Resultat primer F:

Resultat primer R:

Practica 4 – faker PCR

1) Aunque queramos master mix por 8 tubos, hacemos los cálculos pensando que prepararemos 9

2) calcula la cantidad de volumen de cada componente que es necesaria para preparar un único tubo. En segundo lugar, calcula el
volumen que debe pipetear para hacer la master mix para todos los tubos.

Componentes de la PCR:

Concentració final Volum inicial al Càlculs de la

Components de la PCR (amb les corresponents
al tub de PCR de tub de PCR de MASTER MIX per a
concentracions stock)
50 µl 50 µl 9 tubs
Buffer (5x) 1x
MgCl2 (25 mM) 2,5 mM
Primer F (50 µM) 1,5 µM
Primer R (50 µM) 1,5 µM
Taq polymerase
0,025 U/µL
(10 U/µL)
dNTP Mix
0,4 mM
(0,01M)
H2O RNAse Free --
NOO! Mai es posa
DNA genòmic pur (la Ci és la mateixa per cada parella
2 ng/µl 2 µl DNA a la MASTER
després d’haver fet l’apartat de “Preparació de mostres”)
MIX
VOLUM TOTAL -- 50 µl

Preparación de la master mix

¡ATENCIÓN! Trabaje manteniendo los reactivos y la máster mix en hielo.

a. Tome 1 tubo eppendorf de 1,5 ml estéril. Rotula el tubo escribiendo MM (de máster mix).

b. Tome, también, 8 microtubos eppendorf de PCR estériles. Rotule cada tubo con la muestra que pondrán.

c. Pipetee en el tubo de la MM los volúmenes de cada reactivo que ha calculado en la tabla anterior.

d. Una vez hecha la MM, debe dispensarse a los 8 tubos de PCR. Concretamente, pondrá un total de 48 µl en cada tubo (ya que los 2
µl restantes hasta llegar a los 50 µl son de ADN --o de agua en el caso del control negativo--).

[Link], añada 2 µl de ADN genómico puro a los tubos de PCR correspondientes.(50ng/ul)

[Link] la preparación del control positivo, añada 2 µl de una muestra de ADN genómico puro que le darán las mentorxes.
[Link] la preparación del control negativo, añada 2 µl de agua de PCR estéril al tubo eppendorf correspondiente que ya contiene la
MM.g. Para la preparación del control negativo, añada 2 μl de agua de PCR estéril al tubo eppendorf correspondiente que ya contiene
la MM

¡ATENCIÓN! Añada la Taq polimerasa en último lugar para preservarla en contacto directo con el hielo durante más rato.

PROCEDIMIENTO

1. Prepare un microtubo que contenga:

• Cantidad de reactivos (μμμμL)

• Mezcla master mix
• Solución que contiene ADN genómico 20
• Mezcla de imprimación

2. Agregue los cebadores al final, justo antes de colocarlos en el termociclador.

3. Programe el termociclador de la siguiente manera

94°C 2'

94°C 1'

60°C 1'

72°C 2'

72°C 10'

4. Al final del proceso, retire el microtubo del termociclador y guárdelo a -20°C para su posterior análisis electroforético.

Practica 5 - PCR

[Link] teórico

La PCR es una técnica in vitro de amplificación de DNA que nos permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto
de todo el DNA, partiendo de una cantidad mínima de DNA molde.

Actualmente se pueden amplificar fragmentos de 35Kb y se han desarrollado diversas variantes de PCR:

●PCR múltiple: amplificar varios fragmentos en una única reacción.

●PCR-RT: Amplificar fragmentos de RNA.

●PCR cuantitativa, PCR real-time.

VENTAJAS:

⮚TÉCNICA DE AMPLIFICACIÓN: Técnica mucho más rápida que técnicas de clonación con vectores mediante DNA recombinante.
Es un proceso automático y la clonación es manual.

⮚TÉCNICA DE DETECCIÓN: La PCR utiliza cantidades mucho más pequeñas de muestra que las técnicas de hibridación. Además,
con la PCR real-time podemos cuantificar secuencias concretas.

Las aplicaciones de la técnica de la PCR son innumerables en campos como biología, medicina e incluso paleontología. Ejemplos:

⮚Diagnóstico y pronóstico de enfermedades de origen genético.

⮚Medicina forense (asesinato, delitos sexuales)

⮚Pruebas de paternidad

⮚Estudios filogenéticos
 ⮚Estudios paleontológicos

Concrecions sobre la PCR que duem a terme:

- Gen GAPDH:
- F: GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG
- R: 5ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA3
- Per trobar les seqüències a l’Ensembl:
- F: 5 GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG 3
- R: 5 TTGGCTACAGCAACAGGGTGGT 3
- L’amplicó queda de: 235bp

GTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCAC 4020

4021 TCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATT 4080

4081 TCCTGGTATGTGGCTGGGGCCAGAGACTGGCTCTTAAAAAGTGCAGGGTCTGGCGCCCTC 4140

4141 TGGTGGCTGGCTCAGAAAAAGGGCCCTGACAACTCTTTTCATCTTCTAGGTATGACAACG 4200

4201 AATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGT

- Mida de l’amplicó 122bp

- Mida Allele Ladder:
- The allele ladder contains 8 bands of 1,500, 1,000, 700, 500, 400, 300, 200, and 100 bp in length

[Link] EXPERIMENTAL

Preparación de las muestras

VÍA FÁCIL

Pide a las mentoras o mentores un tubo eppendorf del congelador que contiene una muestra de DNA a concentración 50 ng/µl. Realiza
la práctica a partir de esta muestra.

VÍA DESAFIANTE :)

Se trabaja con la muestra de ADN que se ha extraído de los leucocitos provenientes de una muestra de sangre venosa conservada con
EDTA. Este ADN, en las prácticas anteriores, ya se ha extraído, se ha purificado y se ha analizado su calidad (tanto la concentración
como la pureza).

-Anota en la libreta la concentración a la que tienes la muestra de ADN purificada.

-Ejemplo ADN purificado: 125 ng/µl

-Queremos que cada tubo de PCR disponga de una concentración de 2 a 6 ng/µl de DNA genómico puro. Concretamente, trabajaremos
con la concentración de 2 ng/µl.

-Queremos que todas las parejas añada 2 µl de DNA genómico al tubo de PCR, de modo que
tendrá que diluir (o concentrar) sus muestras de ADN puro para que, cuando cojamos 2 µl y los ponemos en el tubo de PCR, el ADN
esté a una concentración de 2 ng/µl en el tubo de PCR, por tanto la concentración del tubo de ADN será de 50 ng/µl.

-Tenga en cuenta que los tubos de PCR queremos que tengan un volumen final de 50 µl.

-Es necesario que averigüe, pues, a qué concentración inicial debe hacer llegar sus muestras de ADN puro. Rellenar la siguiente tabla
puede ayudarle a saber cuál es su incógnita (es decir, de qué ítem no tiene información):

- Calcule la concentración inicial de ADN que deseamos antes de la PCR:

La teva mostra Exemple

Concentració inicial que tenim 125 ng/µl
Volum inicial 2 µl

Concentració inicial que desitgem abans de la PCR ¿? ng/µl

Volum final 50 µl

Concentració final 2 ng/µl

Exemple:
Vi · Ci = Vf · Cf
2 µl · X ng/µl = 50 µl · 2 ng/µl
X = 50 · 2 / 2 = 50 ng/µl

Els vostres tubs d’ADN:

- Finalmente, ¿cómo hará que sus muestras iniciales (o las rojas de ejemplo) estén en la concentración que acaba de calcular?

Com faríeu que les mostres arribessin a la concentració inicial del vostre interès?
Concentració inicial mostra
Feu els càlculs corresponents en cada cas.
ADN exemple: 125 ng/µl Tinc un tub amb 50 µl a 125 ng/µl.
El vull a 50 ng/µl.
Per tant, he de diluir.
Vi = 50 µl
Ci = 125 ng/µl
Vf = incògnita
Cf = 50 ng/µl

Per tant, el Vf = 125 µl → Si el DNA ja està en 50 µl i el vull portar fins a 125 µl, només em
queda afegir-li 75 µl d’aigua destil·lada.

Els vostres tubs d’ADN:

Gracias a que TODAS las muestras de ADN genómico puro estén en la misma concentración, deberá añadir el mismo volumen inicial
en todos los tubos de PCR (de modo que podrá utilizar una única master mix para todas las muestras con las que trabaja).

¡ATENCIÓN! Mantenga la muestra en hielo hasta el momento de colocarla en los tubos de PCR.
 Cálculos para la master mix

Cada pareja analiza un total de 4 tubos:

-TUB 1: muestra de ADN genómico puro 1.

-TUB 2: muestra de ADN genómico puro 2.

-TUB 3: control positivo (con ADN facilitado por los mentorxs).

-TUB 4: control negativo.

Aunque queramos master mix para 5 tubos, hacemos los cálculos pensando que prepararemos 6, ya que mejor preparar un poco más
y que sobrio que quedarnos sin él. ¡Eso sí, con cuidado, que la Taq polimerasa es cara de narices!

En primer lugar, pues, calcula cuál es la cantidad de volumen de cada componente que es necesaria para preparar un único tubo. En
segundo lugar, calcula el volumen que debe pipetear para hacer la master mix para los 6 tubos.

Casa comercial
Concentració Volum inicial al Càlculs de la
Components de la PCR (amb les corresponents proveïdora de cada
final al tub de tub de PCR de 50 MASTER MIX per a
concentracions stock) producte i número de
PCR de 50 µl µl 6 tubs
referència
Buffer (10x)
Ja el comprem preparat,
Format per:
tot i que es podria 1x 5 25
160mM (NH4)2SO4, 670mM Tris-HCl, 0,1%
preparar al Lab.
Tween-20, pH8,8
MgCl2 (50 mM) Sigma 2 mM 2 10
Primer F (50 µM) Invitrogen 1 µM 1 5
Primer R (50 µM) Invitrogen 1 µM 1 5
Taq polymerase BIOLINE (BIO-21040)
0,025 U/µl 0.25 1.25
(5 U/µL) Manual
dNTP Mix BIOLINE (BIO-39044)
0,2 mM 1 5
(10 mM) Manual
H2O RNAse Free Sigma W4502 -- 37.75 188.75
NOO! Mai es posa
DNA genòmic pur (la Ci és la mateixa per cada parella després d’haver fet
2 ng/µl 2 µl DNA a la MASTER
l’apartat de “Preparació de mostres”)
MIX
VOLUM TOTAL -- 50 µl

Preparación de la master mix

¡ATENCIÓN! Trabaje manteniendo los reactivos y la máster mix en hielo.

a. Tome 1 tubo eppendorf de 1,5 ml estéril. Rotule el tubo escribiendo MM (de máster mix).

[Link], también, 4 microtubos eppendorf de PCR estériles. Rotule cada tubo con la muestra que pondrá.

c. Pipetee en el tubo de la MM los volúmenes de cada reactivo que ha calculado en la tabla anterior.

¡ATENCIÓN! Sea estricto con el cambio de punta para evitar contaminaciones cruzadas entre tubos.

¡ATENCIÓN! Añada la Taq polimerasa en último lugar para preservarla en contacto directo con el hielo durante más rato.

d. Una vez hecha la MM, debe dispensarse a los 4 tubos de PCR. Concretamente, pondrá un total de 48 µl en cada tubo (ya que los 2
µl restantes hasta llegar a los 50 µl son de ADN --o de agua en el caso del control negativo--).

[Link], añada 2 µl de ADN genómico puro a los tubos de PCR correspondientes.

[Link] la preparación del control positivo, añada 2 µl de una muestra de ADN genómico puro que le darán las mentorxes.

[Link] la preparación del control negativo, añada 2 µl de agua de PCR estéril al tubo eppendorf correspondiente que ya contiene la
MM.

PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOR

[Link] vez tiene los 4 tubos preparados con todos los componentes, programe el termociclador.
¡ATENCIÓN! Añada los tubos al termociclador DESPUÉS de programarlo, ya que así estarán más rato en el hielo y así garantice que
no empiece la reacción antes de tiempo.

[Link] programa del termociclador es el siguiente:

Fase Subfase Temp Duració Nº de cicles

Desnaturalització Desnaturalització inicial 94 ºC 2 min x1
Cicle de temperatura Desnaturalització 94 ºC 30 s x35
Hibridació o anellament 52 ºC 30 s
Extensió 72 ºC 1 min
Extensió final Extensió final 72 ºC 10 min x1
Manteniment Manteniment 4 ºC Indeterminat x1

[Link] los tubos en el termociclador.

[Link] vez finalizado el proceso conserva los productos amplificados a 4 ºC.

 [Link] de ejercicios

[Link] la información que tiene en la tabla de una PCR de un laboratorio calcula la cantidad necesaria de cada componente para realizar
la PCR de 10 muestras.

µM final µL µL x 10 tubs Reacció

H2O RNAse Free (Sigma W4502)

Buffer 10x (160mM (NH4)2SO4, 670mM Tris-HCl, 0,1% Tween-
1x
20, pH8,8)
Mg* (50mM) 2mM
dNTP Mix (2,5mM each, BIOLINE) 0,2mM each
DMSO (Sigma 108K01864) 1% 25µL
Primer 1 (Invitrogen) (50µM) 1µM
Primer 2 (Invitrogen) (50µM) 1µM
Primer 3 (Invitrogen) (50µM) 1µM
Primer 4 (Invitrogen) (50µM) 1µM
Taq polymerase* 5U/µL 0,025 U/µL
SAMPLE 1

[Link] preparar la MÁSTER MIX para un tubo con el DNA molde de uno de los pacientes. Calcule el volumen necesario de cada
reactivo para preparar un tubo con un volumen final de 50µl. Por eso dispone de los siguientes reactivos:

• Tampón de PCR (stock:10x; final:1x)

• MgCl2 (stock:25mM; final:1,5mM)
• Primeros FQ-F y FQ-R (stock:10µM cada uno; final:0,2µMcada uno)
• dNTPS mezcla (stock:10mM; final:200µM)
• Taq DNA polimerasa (stock:5U/µl; final:1U/µl)
• DNA molde del individuo (stock:25ng/µl; final:1ng/µl)
• Agua destilada

[Link] reproducir las condiciones de una PCR que ha leído en una publicación científica.

• Volumen final de la máster mix por la PCR: 25µl.

• Concentración final de MgCl2: 1,5mM.
• Concentración final de dNTPS: 200µM de cada uno.
• Concentración final de cada primero (F y R): 400nM
• Taq DNA polimerasa: 1U

Para preparar esto disponemos de un Kit de PCR que contiene los siguientes reactivos:

• Tampón de reacción 10x.

• Concentración inicial de MgCl2: 25mM.
• Concentración inicial de dNTPS: 10mM total.
• Concentración inicial de cada primero (F y R): 10pmol/µl cada primero
• Taq DNA polimerasa: 2U

Calcule las cantidades de cada componente para preparar la mezcla de reacción, teniendo en cuenta que debe añadir un 1µl de DNA
molde.

PRÁCTICA Nº6: ELECTROFORESIS DEL PRODUCTO AMPLIFICADO

[Link]

⮚Seleccionar el marcador de peso molecular y el tipo de detección en función de la técnica de electroforesis a realizar.
⮚Cargar en el hielo el marcador, las muestras y controles.

⮚Programar las condiciones de electroforesis de acuerdo al protocolo de la técnica.

⮚Determinar el tamaño de los fragmentos amplificados.

[Link]

●Tubos con productos de PCR

●Puntas de micropipeta estériles con filtro

●Micropipetas P10 y P100

●Cubilla y fuente de electroforesis ●Soporte hielo y peines

●Timmer

●Guantes

●Papel de filtro

●Rotulador de vidrio

●Papel absorbente

●Contenedor para residuos

●biológicos

[Link]

●TAE 1x (preparado en la electroforesis del EH principiante)

●Kit PCR:

oMarcador peso molecular (Allele ladder o similar)

oLoading buffer (Orange dye 5x o similar)

oSYBR SAFE DNA

●Etanol 70%

●Gel

[Link] de seguridad a considerar

[Link] teórico

El fundamento de la electroforesis consiste en la capacidad de migración que tienen las partículas con carga si se somete a un campo
eléctrico externo. El campo eléctrico se aplica a una disolución mediante electrodos de carga opuesta. Bajo la acción del campo
eléctrico, los iones se mueven por la disolución hacia el electrodo de carga opuesta a la suya. Así, las partículas con carga positiva
(cationes) se dirigen hacia el electrodo cargado negativamente (cátodo) mientras que las partículas con carga negativa (aniones)
migrarán hacia el electrodo cargado positivamente (ánodo).

Desde su inicio, la electroforesis ha ido evolucionando y hoy en día se pueden encontrar muchos tipos, electroforesis sobre bandas de
acetato, con geles de agarosa, en columnas; de una dirección, bidireccionales, etc.

Pero en todas ellas el objetivo es el mismo conseguir la separación de las moléculas presentes en una mezcla, ya sean proteínas,
fragmentos de ADN u otro tipo de sustancias.

Las muestras que colocamos en el gel de electroforesis deben previamente mezclarlas con un tampón de carga. Concretamente
utilizaremos Orange G Loading dye, que es una sustancia que contiene:

-Glicerol: lo que hace que las muestras de ADN queden depositadas en el fondo del pozo.

-Una fragmento muy pequeño de ADN que, sin ayuda de ningún otro reactivo, lo podemos visualizar a simple vista mirando el hielo.
Este fragmento, al ser el que tiene un tamaño más pequeño, es el que correrá más, por lo que indica por dónde está avanzando la
electroforesis.

Una vez hecha la electroforesis deberemos visualizar el resultado. En los laboratorios existen normalmente transiluminadores con los
que se puede observar la radiación UV que emite el bromuro de etidio u otros componentes similares como el SYBR Safe.
[Link] experimental

Procedimiento de preparación de 1L de TAE 1X

A partir del TAE 10X, preparamos el TAE 1X diluyéndolo 10 veces. Es necesario preparar unos 1000ml.

Esto se puede hacer con un matraz aforado o también con una probeta. La precisión de la probeta no es tan grande, pero para estos
procedimientos se acepta.

Preparación del gel de agarosa

[Link] visualizar el ADN del hielo, utilizamos SYBR SAFE DNA. Es imprescindible que añada la cantidad correspondiente de SYBR
SAFE al gel de agarosa en el momento en que éste todavía está en estado líquido.

i.¿Cuál es la cantidad correspondiente? En la caja del SYBR SAFE dice que éste está 10.000x, por tanto, a partir de esto puede deducir
qué volumen pipeteará.

[Link] 50 ml de gel de agarosa al 3% en tampón TAE 1x. Siga el mismo procedimiento que en la electroforesis del espacio de
habilidades principiante.

RESUMEN DE LA PREPARACION DEL GEL DE AGAROSA

La preparación del gel es como sigue:

1) Se pesa la cantidad adecuada de agarosa en polvo (3 g) y se añade al volumen adecuado de tampón (1000 ml) TBE 1x.

2) Se calienta hasta ebullición el tiempo necesario para que se forme una solución transparente, y se deja enfriar durante unos
minutos.

3) Se añade 5 μl de SYBR SAFE a 10.000x y se vierte la solución de agarosa, aun caliente y liquida, en un recipiente adecuado que
contenga el denominado peine.

4) Se deja transcurrir un tiempo hasta que la solución se hace un gel por enfriamiento, Se retirará el peine del gel creando así unos
pocillos donde se cargarán las muestras en una solución de carga más densa que el TBE y que además contiene un colorante, azul de
bromofenol, que nos marcará el frente de la carrera.
Como prepararlo

Es necesario preparar un gel de agarosa al 3% utilizando un molde que tiene un volumen de 50ml, y con 8-10 pozos.

9. Preparar el molde para realizar el gel.

a. Sellar los lados con cinta adhesiva (¡dos capas!). En caso de tener soporte no es

necesario.

b. Certificar que no se derrama poniendo agua corriente

c. Colocar el peine adecuado para hacer 8-10 pozos, en el lugar adecuado.

d. Poner el molde sobre una superficie plana.

10. Pesar la cantidad de agarosa necesaria para preparar 50ml de agarosa al 3%. Es necesario hacer cálculo previamente.

11. Poner la agarosa en un Erlenmeyer de 100ml.

12. Añadir 50ml de TAE 1X (preparado en el paso anterior).

13. Disolver la agarosa por calor:

e. Calentar el Erlenmeyer en el microondas durante unos 30 segundos. El líquido debe llegar a ebullición

pero no es necesario mantenerlo mucho rato.

f. Con guantes ignífugos, sacar el recipiente del microondas y, agitándolo en círculos,

comprobar que la agarosa se ha disuelto completamente (que no hay partículas en

suspensión).

g. Si no es el caso, volver a poner el Erlenmeyer en el microondas y repetir hasta que la agarosa se disuelva completamente.

14. Dejar enfriar la agarosa a temperatura ambiente mientras se mueve por agitación en círculos, hasta que esté a unos 65 grados (No
es necesario termómetro, se valora que se pueda coger el vidrio de Erlenmeyer con las manos sin quemarse).

15. Colocar el peine de electroforesis correspondiente al soporte donde debe solidificar el gel.

16. Verter la agarosa en el molde.

17. Con una punta de pipeta, quitar las posibles burbujas que se hayan hecho en la superficie.

18. Dejar enfriar el gel sobre una superficie plana hasta que haya polimerizado completamente.

Si es necesario acelerar el proceso, es posible ponerlo en el frigorífico, pero hay que tener cuidado.

19. Una vez ha polimerizado, retirar el peine y la cinta adhesiva con cuidado.

20. Si el gel no debe utilizarse inmediatamente se puede guardar en la nevera unos días sumergido en tampón de electroforesis.
Preparación de las muestras

[Link] los tubos del termociclador (que contienen los productos de la PCR).

[Link] tubos tienen un volumen de ______ µl.

[Link] un spin de los tubos. Spin: poner los tubos microtubos de PCR dentro de eppendorf de 1,5ml y centrifugarlos 1segundo a
máximo de rpm.

[Link] necesario que añada a cada tubo una cantidad determinada de Orange G Loading Dye (5x).

[Link] tenemos a 5x y lo queremos dentro del tubo del producto de la PCR a 1x.

[Link] vez que añada el Orange Loading Dye a un tubo, mezcle bien con la micropipeta.

[Link] un spin de los tubos

[Link] de preparar las muestras, es necesario preparar el marcador [probablemente esto sólo lo hará la primera pareja]:

[Link] el tubo de Allele Ladder.

ii.Añada directamente 50 µl de Orange G Loading Dye.

[Link]í, habrá creado el Orange G Allele Ladder.

Para correr el gel

[Link] el gel de agarosa en la cubeta de electroforesis.

[Link] la cubeta de electroforesis con TAE 1x hasta que cubra todo el gel.

[Link] 20µl de sus muestras en cada pozo.

[Link] cada hilera de pozos debe rellenar un pozo con el marcador (es decir, el Orange G Allele Ladder).

[Link] la cubeta a la fuente de electroforesis.

[Link] la fuente para correr a 100V durante 30 minutos aproximadamente.

[Link] de resultados

[Link] en la libreta en qué orden ha puesto las muestras en el gel:

los estándares de peso

molecular

[Link] de la electroforesis

Aquí un resultado de electroforesis:

Se necesita un sistema de documentación de geles, en el cual se coloca el gel una vez terminada la electroforesis y por luz UV se
tomará una imagen que podemos visualizar.

En la imagen podemos ver varios pozos marcados con C-, C+, Gen A, Marcador y Gen B. Es importante indicar cuales son las muestras
colocadas en los pozos del gel ya que es importante para su posterior estudio.

Marcador es el fragmento de ADN con un peso molecular conocido, en este caso es del Gen A.

Gen A es una muestra que estamos amplificando para ese gen.

Gen B este gen no es del mismo tamaño que el Gen A sino más pequeño por lo que se encuentra a un nivel más abajo del Gen

C- o control negativo es una muestra que no lleva el gen de interés que estamos estudiando en este caso Gen A,

C+ o control positivo es una muestra que sabemos que lleva ese gen de estudio.
Carril M: Patrón de peso molecular

Carriles 1 al 7: muestras de pacientes con restos de reactivos

Carril 8: Control positivo

Carril 9: Control negativo (mezcla de reacción sin ADN)

Gel 1: Quina mostra s’ha carregat a cada carril?

• Carril 1: Patró de pes molecular

• Carril 2: Control positiu

• Carrils 3 al 7: Bandes d'ADN sense restes de reactius, amb pes molecular de 574 pb aproximadament

• Carril 8: Control negatiu (barreja de reacció sense ADN)

Por medio del control positivo y negativo

Control POSITIVO:

Puerta ADN molde control.

Se espera que sí haya amplificación, sí que en el control positivo hubo amplificación.

Si no se observa amplificación en el control positivo, significa que algún reactivo no funciona correctamente o que la muestra contiene
inhibidores de la PCR. Esto invalida todos los resultados de la PCR.

Control NEGATIVO o BLANCO:

Lleva agua de PCR en lugar de ADN.

*Se espera que no exista amplificación, que es el caso, en el control negativo no hubo amplificación.

*Si se observa amplificación en el control negativo, esto indica que ha habido contaminación de algún reactivo o pipeta que se haya
utilizado en la técnica, lo que invalida los resultados.

* Patró de pes molecular : El marcador sirve para determinar, por comparación, el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o
proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.

Deberemos tener en cuenta a la hora de escoger un marcador u otro la longitud del fragmento amplificado, entonces este marcador
debe tener dentro de su rango de pares de bases la longitud de ese fragmento. Un ejemplo sería tomar un marcador que tenga un rango
de 200 bp hasta 2000bp, y que nuestro fragmento escogido tenga 1000bp, ya que si tomamos un marcador que tenga su rango por
encima de las 1000bp, no saldría ninguna banda.

●Tiempo de electroforesis:

Como referencia, para la separación de fragmentos de ADN en un gel de agarosa al 1,5% utilizando una corriente constante de 100-
150 V, el tiempo de electroforesis suele ser de alrededor de 30-60 minutos. Sin embargo, si los fragmentos de ADN son muy grandes,
puede ser necesario aumentar el tiempo de electroforesis para permitir que los fragmentos migren lo suficiente para separarse.

[Link] los resultados. En caso de que haya habido algún problema haz una hipótesis sobre lo que puede haber pasado.

[Link]ón

Haz un escrito con las conclusiones obtenidas de la práctica. Esto es una de las cosas que más valoraremos a la hora de realizar la
corrección de las prácticas. Es importante considerar los siguientes aspectos:

-Cualquier anomalía que se haya producido en la elaboración de la práctica.

-Cualquier modificación o error del protocolo.

-Valores concretos de pesadas (balanza), volúmenes, tiempo, diluciones, etc.

-Cualquier resultado que te llame la atención para que consideres anómalo. Elabora una hipótesis de lo que ha podido ocurrir.

-Dotar de criterio lo que haga (en el proceso, en los cálculos o en los resultados).

[Link]
 [Link]

PRÁCTICA 7: INVESTIGACIÓN POR EL CUIDADO DEL CÁNCER COLORECTAL (OPCIONAL)

PRÁCTICA 8. INICIO DE UN CULTIVO Y PASE DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN

1. Objetivos

-Hacer el inicio de un cultivo a partir de una disgregación celular.

-Hacer un subcultivo, o pase, de un cultivo celular en suspensión.

2. Materiales

-Placa de Petri estéril

-Flascón Roux estéril

-Tub Falcon estéril

-Micropipetas y puntas estériles

-Pipums y pipetas estériles

3. Reactivos

-Medio de cultivo DMEM o agua de peptona

-suplementado al 10% con FBS (Fetal Bovine Serum)

4. Fundamento teórico

Inicio del cultivo celular

Para iniciar un cultivo celular es necesario partir de una suspensión celular que se puede haber obtenido por cualquiera de estas tres opciones:

[Link]ón celular (cuando las células se obtienen a partir de un tejido y, por tanto, es necesario disgregarlas, es decir, separarlas y hacer
que estén en suspensión).

[Link]ón celular (cuando partimos de células ya suspendidas en un líquido y sólo es necesario aislar y seleccionar las que son de nuestro
interés).

[Link]ón (cuando partimos de un vial de células que previamente hemos congelado o que hemos comprado de una empresa
proveedora de células y nos llega al laboratorio congelado).

En cualquiera de estos tres casos, se debe sembrar un número determinado de células en el recipiente que sea que escojamos.

Pase de células en suspensión

El subcultivo, o pase, es un procedimiento que se lleva a cabo con el fin de garantizar que el cultivo sigue creciendo. Al realizar un
subcultivo, se permite que las células que forman parte del cultivo se sigan dividiendo, originando otras nuevas.

En el caso de los cultivos en suspensión, llega un momento (también, después de 6-7 días del cultivo inicial) que el cultivo llega a un número
crítico de células en relación con el volumen de medio y los nutrientes que quedan en él. En ese momento se produce el fenómeno de
inhibición por densidad y las células dejan de crecer. Para hacer que las células reinicien su crecimiento, es necesario realizar un subcultivo.

El cultivo que proviene directamente de la muestra de origen (tejido o suspensión celular) recibe el nombre de cultivo primario, mientras
que el cultivo que se obtiene después de realizar un subcultivo o pase recibe el nombre de cultivo secundario. Si a partir de un cultivo
secundario se hace otro subcultivo, el nuevo cultivo obtenido se continuará diciendo cultivo secundario (NUNCA terciario o cuaternario).
Es fundamental rotular en el recipiente del cultivo los números de pase por lo que vamos. Por ejemplo, se puede rotular: "Cultivo 2ri HeLa
/ 5º pase / 01-07-20".
¿Cómo se realizan los cálculos de los pases en cultivos en suspensión?

Para responder a esta pregunta, debe tener a mano el recuento de células viables que ve hacer en una práctica anterior. P10 Recuento y
viabilidad.(se hará posteriormente).

Un ejemplo:

Extraigo los leucocitos de una muestra de sangre periférica. Hago el análisis de la viabilidad utilizando el azul tripán y obtengo una densidad
de células viables (es decir, vivas) de 20.000 células/µl.

Si quiero hacer la siembra en una placa de pétreo de 10 cm de diámetro, será necesario que siembra 2,2 · 106 células en 10 ml de medio.

Esto hace que la densidad inicial de células en la placa de Petri deba ser de:

10 ml de medio = 10000 µl de medio

2,2 · 106 células / 10000 µl de medio = 220 células/µl

Por tanto, si yo parto de una concentración inicial de 20.000 células/µl y quiero una concentración final de 220 células/µl, qué volumen
debo coger de la muestra para pasar a la placa de Petri (que tendrá un volumen final de 10 ml)?

Ci · Vino = Cf · Vf → Vino = Cf · Vf / Ci

Vino = 220 cielos/µl · 10 ml / 20.000 cielos/µl = 220 · 10 / 20.000 = 0,11 ml = 110 µl

Inicio de un cultivo en suspensión

[Link] la disgregación celular inicial del incubador. Verá que se encuentra en un recipiente en el que ya se ha hecho el recuento y la
viabilidad y los valores obtenidos están anotados con rotulador. Concretamente, la suspensión inicial tiene una densidad celular de 5,6 · 105
células/ml.

[Link] sembrar 1,4 105 células/ml en un frasco roux que contenga un volumen final de 50 ml.

[Link] el volumen que debe tomar de la suspensión inicial.

[Link] el volumen que haya determinado de la suspensión inicial a un tubo eppendorf o Falcón y lavarlo con medio de cultivo
atemperado a 37 °C.

5. Centrifuge 5 minutos a 1000 rpm y decante el sobrenadante.

6.Añada los ml correspondientes de medio.

[Link] las células con medio al recipiente escogido para hacer el cultivo.

[Link] el recipiente de cultivo en un incubador a 37 °C con un 5% de CO₂ y 95% de humedad.

Pase de un cultivo en suspensión

[Link] las 24h (como mínimo) desde que ve hacer el inicio del cultivo, recupere el cultivo inicial primario y realice su primer pase.

[Link] el cultivo primario en suspensión en un tubo halcón estéril.

[Link] el tubo halcón a 700-800 rpm durante 5 minutos.

[Link] el sobrenadante y quedarse únicamente con el pellet, ya que es donde están las células.

13. Lave con PBS 1x y repita la centrigufación para quedarse únicamente con las células.

14.Añada 10 ml de medio de cultivo (agua de peptona o medio RPMI-1640, en función de las células sembradas).

[Link]á un subcultivo 1/4 respecto al cultivo inicial. [Cuando haga este punto avise a unx mentorx para verificar que tiene bien los
cálculos].

[Link] el frasco roux donde hará la nueva siembra. Antes de añadir nada, rótulo para mantener la trazabilidad.

17.Añada al frasco el volumen que haya calculado del cultivo inicial que tiene en el tubo halcón.

18.A continuación, añada el volumen de medio (agua de peptona o RPMI-1640) necesario hasta llegar a los 50 ml de volumen final.

19. Lleve el nuevo cultivo al incubador a 37 °C con un 5% de CO₂ y 95% de humedad. ¡Eh! Recuerda que nuestro incubador carece de
regulador de CO₂.
Hoja de resultados

[Link] los cálculos de los subcultivos que ha hecho al procedimiento experimental.

[Link] los siguientes cálculos y explica la diferencia entre unos y otros:

5.

Exercici 1 Tinc 8 ml de cultiu cel·lular i vull fer un pase 1/20. El volum final del nou cultiu vull que sigui de 10 ml.
Quin volum de cultiu cel·lular inicial he de pipetejar? Com acabo de preparar el nou cultiu?

Exercici 2 Tinc 15 ml d’una dissolució 3 mM. Vull diluir aquesta dissolució, de manera que vull preparar 10 ml d’una nova
dissolució que estigui a una concentració 1/20 respecte la inicial.
Quin volum de dissolució inicial he de ppipetejar? Com acabo de preparar la nova dissolució?

Quines són les diferències entre els càlculs que heu fet a l’exercici 1 i els de l’exercici 2?

[Link]ón de la práctica

Haz un escrito con las conclusiones obtenidas de la práctica. Esto es una de las cosas que más valoraremos a la hora de realizar la
corrección de las prácticas. Es importante considerar los siguientes aspectos:

-Cualquier anomalía que se haya producido en la elaboración de la práctica.

-Cualquier modificación o error del protocolo.

-Valores concretos de pesadas (balanza), volúmenes, tiempo, diluciones, etc.

-Cualquier resultado que te llame la atención para que consideres anómalo. Elabora una hipótesis de lo que ha podido ocurrir.

Dotar de criterio lo que haga (en el proceso, en los cálculos o en los resultados).

PRÁCTICA 9. SUBCULTIVO O PASE DE CÉLULAS EN MONOCAPA [SIMULACIÓN]

[Link]

-Hacer un subcultivo, o pase, de un cultivo celular en monocapa.

[Link]

-Placa de Petri estéril

-Flascón Roux estéril

-Tub Falcon estéril

-Micropipetas y puntas estériles

-Pipums y pipetas estériles

[Link]

-Medio de cultivo DMEM suplementado al 10% con FBS (Fetal Bovine Serum)

-Tripsina 0,05% + EDTA 0,016%

[Link] teórico

El subcultivo, o pase, es un procedimiento que se lleva a cabo con el fin de garantizar que el cultivo sigue creciendo. Al realizar un
subcultivo, se permite que las células que forman parte del cultivo se sigan dividiendo, originando otras nuevas.

Se acostumbra a realizar cada 6-7 días de cultivo, aunque depende mucho de la velocidad de crecimiento del tipo celular con el que
trabajamos. El momento idóneo para realizar un pase es al final de la fase exponencial.

En el caso de los cultivos en monocapa, después de cierto tiempo en cultivo (6-7 días) entran en confluencia, lo que significa que las
células ocupan la totalidad de la superficie del recipiente que las contiene. Esto provoca lo que se llama “inhibición por contacto”, es
decir, el paro del crecimiento de las células. Para que las células renauden su crecimiento, es necesario realizar un subcultivo de parte
de las células del cultivo inicial a un nuevo recipiente.

¿Cómo se realizan los cálculos de los pases en cultivos de crecimiento en monocapa?

Lo que es imprescindible es que haga el cálculo teniendo en cuenta el volumen inicial de células que tiene y que desea dividir en
nuevos recipientes.

Un ejemplo:

Tengo 10 ml de cultivo celular y quiero dar un pase 1/4. El volumen final del nuevo cultivo quiero que sea de 15 ml. Los cálculos,
pues, son los siguientes:

10 ml · 1/4 = 2,5 ml

Para realizar el pase, cogeré 2,5 ml de cultivo inicial y los pondré en el nuevo recipiente. A continuación, añada medio de cultivo hasta
llegar a los 15 ml de volumen total.

[Link] experimental

Pase de un cultivo en monocapa

[Link] el cultivo inicial del incubador.

[Link] todo el medio de cultivo (o bien por decantación o bien con el uso de una pipeta estéril).

[Link] con PBS 1x.

[Link] la monocapa con 1 ml de tripsina+EDTA durante 1 minuto a 37 ºC hasta que vea que las células se desunen del recipiente.

e.Añada 4 ml de medio DMEM+FBS.

[Link] varias veces el medio de cultivo por toda la placa con fuerza suficiente para acabar despegando y separando las células. Al
final es necesario obtener una suspensión celular sin agregados.

[Link]á tres subcultivos: [Cuando haga este punto avise a unx mentorx para ver que tiene bien los cálculos].
i.1/10 del cultivo inicial

ii.1/20 del cultivo inicial

iii.1/100 de los cultivos inicial

[Link] las tres nuevas placas de pétreo donde hará la nueva siembra. Antes de añadir nada, rótulas para mantener la trazabilidad.

i.Añada a cada placa el volumen de cultivo inicial que haya calculado en cada caso.

j.A continuación, añada el volumen de medio DMEM+FBS necesario hasta llegar a un volumen final será de 15ml.

Lleve los nuevos cultivos al incubador a 37 °C con un 5% de CO₂ y 95% de humedad. ¡Eh! Recuerda que estamos en una simulación
y nuestro incubador no tiene CO₂.

[Link] de resultados

[Link] los cálculos de los subcultivos que ha hecho al procedimiento experimental.

[Link] de ejercicios

Tengo 4 ml de cultivo celular y quiero dar un pase 1/8. El volumen final del nuevo cultivo quiero que sea de 12 ml. ¿Cómo
preparo el nuevo cultivo?

Para calcular el nuevo volumen y la cantidad de medio de cultivo necesaria, se puede utilizar la siguiente fórmula:

Volumen final = Volumen inicial x (1/2)^n

Donde "n" es el número de veces que se ha diluido el cultivo celular. En este caso, se desea hacer un pase 1/8, lo que significa que se
diluirá el cultivo 8 veces en total.

Por lo tanto, el nuevo volumen del cultivo será:

12 ml = 4 ml x (1/2)^8

Para preparar el nuevo cultivo, se puede seguir los siguientes pasos:

Obtener 12 ml de medio de cultivo fresco.

Diluir el cultivo celular original 1:2 o 0.5 ml de cultivo original y 0.5 ml de medio fresco. Este es el primer paso de dilución.

Tomar 0.5 ml del cultivo diluido en el paso 2 y añadirlo a 4.5 ml de medio fresco. Este es el segundo paso de dilución.

Repetir el paso 3 dos veces más, es decir, tomar 0.5 ml de la solución del paso anterior y añadirlo a 4.5 ml de medio fresco. Esto
resultará en un total de 4 diluciones.

Finalmente, tomar 0.5 ml de la solución del paso anterior y añadirlo a 11.5 ml de medio fresco. Esto dará como resultado el nuevo
cultivo de 12 ml con una dilución total de 1/8.

Es importante asegurarse de realizar las diluciones de forma estéril para evitar la contaminación del cultivo celular.

Tengo 8 ml de cultivo celular y quiero hacer un pase 1/10. El volumen final del nuevo cultivo quiero que sea de 15 ml. ¿Cómo
preparo el nuevo cultivo?

Para preparar un nuevo cultivo celular con un pase de dilución de 1/10, se pueden seguir los siguientes pasos:

Obtener 15 ml de medio de cultivo fresco.

Tomar 0.8 ml del cultivo celular original y añadirlo a 7.2 ml de medio de cultivo fresco. Este es el primer paso de la dilución y da
como resultado una dilución de 1/10.

Tomar 0.8 ml de la solución diluida del paso 2 y añadirlo a 7.2 ml de medio de cultivo fresco. Este es el segundo paso de dilución y
da como resultado una dilución total de 1/100.

Tomar 0.8 ml de la solución diluida del paso 3 y añadirlo a 7.2 ml de medio de cultivo fresco. Este es el tercer paso de dilución y da
como resultado una dilución total de 1/1000.
Tomar 0.8 ml de la solución diluida del paso 4 y añadirlo a 14.2 ml de medio de cultivo fresco. Este es el cuarto y último paso de
dilución y da como resultado una dilución total de 1/10,000.

Comprobar que la concentración del nuevo cultivo es la adecuada y que no hay signos de contaminación.

Es importante asegurarse de realizar las diluciones de forma estéril para evitar la contaminación del cultivo celular.

Para hacer los cálculos, utilizaremos la fórmula: C1 x V1 = C2 x V2

donde C1 es la concentración inicial del cultivo celular, V1 es el volumen inicial del cultivo celular, C2 es la concentración final del
cultivo celular deseada y V2 es el volumen final del nuevo cultivo celular.

Dado que tenemos 8 ml de cultivo celular y queremos hacer un pase 1/10 para obtener un nuevo cultivo de 15 ml, podemos calcular
la concentración final del cultivo celular de la siguiente manera:

Primero, calculemos el factor de dilución necesario para hacer un pase 1/10. El factor de dilución es el inverso de la fracción de
dilución, por lo que en este caso es 1/10, lo que equivale a un factor de dilución de 10.

A continuación, multipliquemos el volumen inicial del cultivo celular por el factor de dilución para obtener el volumen final del nuevo
cultivo celular:

Volumen final = Volumen inicial x Factor de dilución

Volumen final = 8 ml x 10

Volumen final = 80 ml

Ahora podemos utilizar la fórmula de dilución para calcular la concentración final del cultivo celular:

C1 x V1 = C2 x V2

Despejando C2:

C2 = (C1 x V1) / V2

C2 = (concentración inicial del cultivo x volumen inicial del cultivo) / volumen final del nuevo cultivo

C2 = (C1 x V1) / V2

C2 = (1 x 8 ml) / 80 ml

C2 = 0.1

Por lo tanto, la concentración final deseada del cultivo celular es de 0.1 células/ml.

Tengo 2 ml de cultivo celular y quiero dar un pase 1/5. El volumen final del nuevo cultivo quiero que sea de 8 ml. ¿Cómo
preparo el nuevo cultivo?

Para preparar el nuevo cultivo celular con un pase 1/5 y un volumen final de 8 ml, puedes seguir estos pasos:

Añade 2 ml del cultivo celular inicial en un tubo de ensayo estéril.

Añade 6 ml de medio fresco estéril al mismo tubo de ensayo.

Mezcla bien el contenido del tubo de ensayo para obtener una dilución homogénea.

Transfiere 2 ml de la solución anterior a un segundo tubo de ensayo estéril. Este segundo tubo contendrá 2 ml del cultivo celular
diluido en 6 ml de medio fresco.

Añade 6 ml de medio fresco estéril al segundo tubo de ensayo.

Mezcla bien el contenido del segundo tubo de ensayo para obtener una dilución homogénea.

El nuevo cultivo celular resultante tendrá una concentración 1/5 (es decir, una dilución 1:5) y un volumen total de 8 ml.

De esta forma, se ha tomado 2 ml del cultivo inicial y se ha añadido un volumen igual de medio fresco para obtener una dilución 1/2.
A continuación, se ha tomado 2 ml de esta solución diluida y se ha añadido un volumen igual de medio fresco para obtener una dilución
1/5.

Para calcular la dilución necesaria para realizar un pase 1/5 con un volumen final de 8 ml, podemos utilizar la fórmula: C1 x
V1 = C2 x V2

donde C1 es la concentración inicial del cultivo celular, V1 es el volumen inicial del cultivo celular, C2 es la concentración final del
cultivo celular deseada y V2 es el volumen final del nuevo cultivo celular.
Dado que tenemos 2 ml de cultivo celular y queremos hacer un pase 1/5 para obtener un nuevo cultivo de 8 ml, podemos calcular la
concentración final del cultivo celular de la siguiente manera:

Primero, calculemos el factor de dilución necesario para hacer un pase 1/5. El factor de dilución es el inverso de la fracción de dilución,
por lo que en este caso es 1/5, lo que equivale a un factor de dilución de 5.

A continuación, multipliquemos el volumen inicial del cultivo celular por el factor de dilución para obtener el volumen final del nuevo
cultivo celular:

Volumen final = Volumen inicial x Factor de dilución

Volumen final = 2 ml x 5

Volumen final = 10 ml

Sin embargo, necesitamos un volumen final de 8 ml, por lo que debemos ajustar el volumen final en la fórmula de la siguiente manera:

Volumen inicial x Factor de dilución = Concentración final x Volumen final

2 ml x 5 = Concentración final x 8 ml

Concentración final = 1.25 células/ml

Por lo tanto, la concentración final deseada del cultivo celular es de 1.25 células/ml.

Valoració de la pràctica

PRÁCTICA 10. RECUENTO Y VIABILIDAD CELULAR

[Link] teórico

RECUENTO y VIABILIDAD

Habitualmente es necesario determinar la densidad celular de una suspensión y su viabilidad celular.

Actualmente existen dos métodos para determinar la densidad celular:

oEl Cell Coulter, un contador electrónico de células.

oCámaras de recuento celular de las que existen mucho tipo pero la más utilizada es la cámara de Neubauer.

Una cámara de recuento celular es un dispositivo en el que se coloca la muestra de la suspensión celular que se va a medir. El
dispositivo presenta unas señales que determinan un volumen conocido. Al contar bajo el microscopio el número de partículas que
encontramos en este volumen, puede determinarse la densidad de partículas en la suspensión de origen. Las cámaras de Neubauer
pueden disponer de una o dos retículas de recuento como la que se detalla a continuación.

Dado que la profundidad de la cámara es de 0,1mm, cada una de estas unidades (es decir, de los recuadros) tiene un volumen fijo y
conocido.

La retícula de conteo está formada por 9 cuadras de 1 mm de lado. Multiplicando la medida de ambos lados (1 mm x 1 mm) obtenemos
que la superficie de cada cuadrado es de 1 mm2. Los cuadrados de 1 mm2 localizados en cada esquina están subdivididos 16 cuadrados.
Dado que la profundidad de la cámara es de 0,1 mm, cada uno de los cuadrados tiene un volumen de 0,1 mm x 1 mm2 = 0,1 mm3.
Las unidades de volumen pueden expresarse tanto en mm3 como en μl, por lo que es necesario encontrar la equivalencia entre ambas
unidades.
 Mesura del quadrat:
- Alçada: 1 mm
- Base: 1 mm
- Profunditat: 0,1 mm

Volum del quadrat:

1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm3

Equivalència d’unitats:
0,1 mm3 = 0,1 μl

Esto nos permitirá calcular la densidad de células (células por ml) de la suspensión celular.
Para un recuento correcto, se deben contar las células que tocan o están situadas sobre los lados
superior e izquierdo del cuadrado, y no tener en cuenta las células que tocan o están situadas
sobre los lados inferior y derecho del cuadrado. El límite del cuadrado lo marca la línea central
del grupo de tres líneas que delimitan el cuadrado.

Para la determinación de la viabilidad celular existen varios métodos. El más utilizado es el

método del azul de Tripà (Trypan Blue). El azul de tripán es un coloide que se introduce en el
interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así, las células que aparecen en la
imagen claramente de color azul se consideran no viables. Existen otros métodos de tinción
como el yoduro de propidio que requiere visualización en el microscopio de fluorescencia.

1. Procediment experimental

PROCEDIMIENTO RECUENTO Y VIABILIDAD

Recuento total de leucocitos por el método de Türk

a. Tome la muestra de sangre con EDTA y realice una dilución 1:200 de la muestra en líquido de Türk.
[Link] 1ml de la muestra resultante.
[Link] durante 10 minutos a 10.000g.
[Link] el pellet en 100µl de PBS 1x.
[Link] la cámara de Neubauer.
[Link] 10 µl cerca de un extremo de la cámara para que se llene por capilaridad.
[Link] en la pletina del microscopio y enfocar la cuadrícula a 10x y observe el rayado de la cámara de Neubauer y las células.
[Link]és con la cuadrícula a 40x cuenta los cuatro cuadrados de los extremos teniendo en cuenta que no se deben contar las células
que tocan los extremos indicados en la figura en rojo.

[Link] los cálculos correspondientes para saber la densidad celular de la muestra de sangre inicial.

Viabilidad celular

[Link] el volumen de suspensión celular de la que ha tomado una muestra para realizar el recuento celular (debería tener unos 90
µl de suspensión celular en el eppendorf).

[Link] 90 µl de Tripan Blue al 0,4% y homogeneice la mezcla (mezclando varias veces con la micropipeta de 5 a 8 veces).

[Link] 10 µl de la mezcla a cada lado de la cámara de Neubauer.

[Link] reposar la suspensión celular en la cámara unos minutos.

[Link] la cámara de Neubauer en el microscopio y localice la retícula grabada.

[Link] a cada cuadrante el número de células vivas y muertas y anótelo.

[Link] la viabilidad celular de su muestra.

[Link] el material y limpie la zona de trabajo con etanol 70ºC.

3. Exercicis relacionats amb la pràctica

[Link]és de realizar el procedimiento de viabilidad celular con el método del azul tripán, obtenga las siguientes imágenes,
correspondientes a los cuadrados 4x4 de la cámara de Neubauer. Haz el estudio de la viabilidad celular de la suspensión que
observas en las imágenes. Ten en cuenta las diluciones que se han realizado observando el protocolo del recuento y viabilidad
celular.
un ejemplo de cómo realizar el estudio de viabilidad celular después de utilizar el método de azul tripán:
Supongamos que hemos realizado una dilución de 1:10 de nuestra suspensión celular y hemos cargado la cámara de Neubauer con
una alícuota de 10 µl de la suspensión diluida. Después de observar al microscopio, contamos el número total de células en 4 cuadrados
de la cámara de Neubauer y obtenemos los siguientes resultados:

Cuadrado Número de células

1 30

2 32

3 34

4 36

Para calcular el número total de células, sumamos el número de células de los 4 cuadrados:
30 + 32 + 34 + 36 = 132
Por lo tanto, el número total de células en 10 µl de la suspensión diluida es de 132.
A continuación, contamos el número de células teñidas de azul y el número de células no teñidas en los mismos 4 cuadrados:
 Cuadrado Número de células Número de células teñidas Número de células no teñidas

1 30 4 26

2 32 3 29

3 34 2 32

4 36 6 30

Para calcular el porcentaje de viabilidad, sumamos el número de células no teñidas en los 4 cuadrados y lo dividimos por el número
total de células, y luego multiplicamos por 100%:
Número total de células no teñidas = 26 + 29 + 32 + 30 = 117
% de viabilidad = (117 / 132) x 100% = 88,6%
Por lo tanto, el porcentaje de viabilidad de la suspensión celular es de aproximadamente 88,6%. Esto significa que alrededor del 88,6%
de las células están vivas y el 11,4% restante están muertas o dañadas.

[Link] en un laboratorio donde se realizan cultivos celulares. Hoy te toca realizar el mantenimiento de una línea celular.
Tripsinizas las células, resuspenso en 5ml de medio y los resultados que obtienes en los diversos cuadrantes visualizados en la
cámara de Neubauer son: 30 células, 25 células, 35 células y 27 células. TENGAS EN CUENTA: El recuento es posible
realizarlo gracias al método del azul tripán explicado al procedimiento.
Calcula:
▪Número de células totales
▪Densidad celular
▪Cuántos mililitros debes tomar de la suspensión celular obtenida para preparar un nuevo frasco con una dilución
1/100.

Resolución de los cálculos:

Para calcular el número total de células, sumamos el número de células de los 4 cuadrados:
30 + 25 + 35 + 27 = 117 células
Para calcular la densidad celular, dividimos el número total de células por el volumen de la suspensión:
117 células / 5 ml = 23,4 células/ml
Para preparar un nuevo frasco con una dilución 1/100, debemos tomar una alícuota de la suspensión original y diluirla 100
veces. Si llamamos x al volumen de la alícuota que debemos tomar, entonces:
x ml (alícuota) / 100 = Volumen final de la nueva suspensión (en ml)

Despejando x:
x = (100 x Volumen final de la nueva suspensión) / 100
x = Volumen final de la nueva suspensión
Por lo tanto, si queremos preparar una nueva suspensión con un volumen final de 10 ml, debemos tomar una alícuota de:x
= 10 ml

[Link] quiere realizar un pase (pasar las células) de un cultivo en monocapa que está a punto de entrar en confluencia. Una vez
tripsinizadas y lavadas las células, se resuspenden en 5 ml de medio de cultivo. Para realizar el recuento de células viables se mezclan
20 μl de la suspensión celular con 20 μl de azul de tripán, y con la mezcla se realiza el recuento en la cámara de Neubauer. El recuento
de células azules y blancas en los cuatro cuadrantes de los lados de la cámara de Neubauer es el siguiente:
1-76 blancas y 16 azules
2-68 blancas y 20 azules
3-72 blancas y 16 azules
4-64 blancas y 12 azules

●¿Cuál es la densidad celular total de los 5 ml de suspensión celular? ¿Y la densidad celular viable?
●¿Qué viabilidad tienen las células? (porcentaje de viables respecto a totales)
●Las células deben subcultivarse en frascos de 25 cm2 y se quieren sembrar 7 · 105 células en cada frasco en un volumen final de
medio de cultivo de 5 ml por frasco. ¿Cuántos frascos se necesitan? ¿Qué cantidad de medio de cultivo y qué cantidad de suspensión
celular debe ponerse en cada uno?

[Link] congelar células de una línea celular que crece en suspensión. Partimos de una suspensión celular lavada y
resuspesa en 5 ml de medio de cultivo. Para realizar el recuento de viables se hace una dilución previa 1:10 de la suspensión
con PBS. Luego se mezclan 20 µl de la dilución celular con 20 µl de azul de tripán y esta mezcla se hace el recuento en la
cámara de Neubauer. El recuento de células azules y blancas en los cuatro cuadrantes de los lados de la cámara de Neubauer
es el siguiente:
5-48 blancas y 10 azules
6-41 blancas y 9 azules
7-44 blancas y 12 azules
8-47 blancas y 11 azules
●¿Cuál es la densidad celular total de los 5 ml de suspensión celular? ¿Y la densidad celular viable?
●¿Qué viabilidad tienen las células? (porcentaje de viables respecto a totales)

Para calcular la densidad celular total, primero debemos determinar el número total de células presentes en los 5 ml de suspensión
celular. Para ello, realizamos el recuento de células azules y blancas en cada cuadrante de la cámara de Neubauer y luego aplicamos
la fórmula:

Número total de células = (Número total de cuadrantes contados x Número de células contadas) / Volumen de la cámara x Factor de
dilución

El factor de dilución se calcula en función de la dilución de la suspensión celular utilizada en el recuento. En este caso, se mezclan 20
μl de la suspensión celular con 20 μl de azul de tripán, por lo que el factor de dilución es 2. Así, tenemos:

Número total de células = (16+20+16+12) x 10⁴ / 0.1 x 2

Número total de células = 60 x 10⁴
Número total de células = 6 x 10⁵

Para calcular la densidad celular total, dividimos el número total de células por el volumen de suspensión celular utilizado:

Densidad celular total = Número total de células / Volumen de suspensión celular

Densidad celular total = 6 x 10⁵ / 5 ml
Densidad celular total = 1.2 x 10⁵ células/ml

Para calcular la densidad celular viable, primero debemos determinar el número de células viables presentes en los 5 ml de suspensión
celular. Para ello, contamos el número de células azules y blancas presentes en cada cuadrante y aplicamos la fórmula:

Número de células viables = (Número total de cuadrantes contados x Número de células viables contadas) / Volumen de la cámara x
Factor de dilución

En este caso, las células azules están muertas, por lo que sólo contamos las células blancas como células viables. Así, tenemos:

Número de células viables = (76+68+72+64) x 10⁴ / 0.1 x 2

Número de células viables = 280 x 10⁴
Número de células viables = 2.8 x 10⁶

Para calcular la densidad celular viable, dividimos el número de células viables por el volumen de suspensión celular utilizado:

Densidad celular viable = Número de células viables / Volumen de suspensión celular

Densidad celular viable = 2.8 x 10⁶ / 5 ml
Densidad celular viable = 5.6 x 10⁵ células/ml

Para determinar la viabilidad celular, dividimos el número de células viables por el número total de células y multiplicamos por 100:

Viabilidad celular = (Número de células viables / Número total de células) x 100

Viabilidad celular = (2.8 x 10⁶ / 6 x 10⁵) x 100
Viabilidad celular = 466.7 %

Este resultado no es posible, ya que indica una viabilidad superior al 100%. Probablemente se ha cometido un error en el recuento o
en el cálculo. Una viabilidad realista estaría en el rango del 80-90%.

● Queremos congelar las células en criotubos a una densidad de 10^6 células viables/ml, poniendo 1,5 ml de suspensión celular
en cada criotub. Explica qué pasos seguiríasdes de la suspensió de cèl·lules en medi de cultiu fins a col·locar els criotubs en
nitrogen líquid. Quin volum de solució de congelació necessitem? Quants criotubs necessitem?
Para sembrar 7·10^5 células en un frasco de 25 cm², necesitamos conocer la densidad celular de la suspensión celular y el volumen
de suspensión que debemos agregar al frasco.

En primer lugar, calculemos la densidad celular total:

Densidad celular total = (número de células contadas en los 4 cuadrantes / 4) x dilución
Donde la dilución es 1:2 (20 μl de suspensión celular + 20 μl de azul de tripán).
Densidad celular total = ((76+68+72+64)/4) x 2 = 580 células/μl
En segundo lugar, calculemos la cantidad de suspensión celular que necesitamos para sembrar 7·10^5 células:
Volumen de suspensión celular = número de células que queremos sembrar / densidad celular total
Volumen de suspensión celular = (7·10^5 células) / (580 células/μl) = 1207 μl

Como queremos agregar 5 ml de medio de cultivo a cada frasco, podemos calcular el volumen total de líquido que necesitamos para
sembrar las células en los frascos:

Volumen total = volumen de suspensión celular + volumen de medio de cultivo

Volumen total = 1207 μl + 5 ml = 5.12 ml

Por lo tanto, necesitamos agregar 1207 μl de suspensión celular a 4.88 ml de medio de cultivo para sembrar 7·10^5 células en un
frasco de 25 cm².

Para calcular el número de frascos necesarios, podemos dividir el volumen total de la suspensión celular y del medio de cultivo entre
5 ml (el volumen final deseado en cada frasco):

Número de frascos = volumen total / 5 ml

Número de frascos = 5.12 ml / 5 ml ≈ 1 frasco
Por lo tanto, necesitamos sembrar las células en un solo frasco de 25 cm².

PRÁCTICA 11. INTERPRETACIÓN DE CARIOTIPOS

[Link]

-Reconocer los cromosomas humanos.

-Elaborar el cariotipo a partir de una imagen.

-Determinar la fórmula cromosómica y anomalías cromosómicas asociadas al cariotipo.

[Link]

-Ordenador

-Programa Adobe Flash Player instalado.

[Link] de seguridad a considerar

❖Cuidado con la cantidad de horas delante de la pantalla. Puede colocar filtros de luz azul en su ordenador o móvil para reducir la
cantidad que reciben sus ojos.

[Link] teórico

El cariotipo humano

En el cariotipo humano, al ordenar los cromosomas, se forman 7 grupos, no sólo según el tamaño de cada uno, sino teniendo en cuenta
la posición del centrómero (metacéntricos, submetacéntricos y acrocéntricos) y la presencia de constricciones secundarias.

Los grupos que forman el cariotipo humano son:

-GRUPO A: Cromosomas 1, 2, 3

-GRUPO B: 4, 5

-GRUPO C: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12

-GRUPO D: 13, 14, 15

-GRUPO E: 16, 17, 18

-GRUPO F: 19, 20

-GRUPO G: 21, 22

-CROMOSOMAS SEXUALES
Las anomalías cromosómicas van asociadas a enfermedades

Las variaciones en el complemento normal de cromosomas se han asociado a numerosas enfermedades prenatales. Esto puede incluir
alteraciones numéricas, en las que el número de cromosomas es inferior o superior al estado no patológico, y alteraciones estructurales
como deleciones, duplicaciones y translocaciones. Aproximadamente el 0,5% de todos los nacidos vivos se asocia con algún tipo de
anomalía cromosómica (Tabla 1).

Los fenotipos provocados por las anomalías cromosómicas son muy variables, pero en casi todos los casos se asocian con retraso en
el desarrollo y retraso mental, alteraciones faciales y determinadas malformaciones congénitas.
El desorden más común de estos desórdenes genéticos es el Síndrome de Down, que se encuentra en el 0,125% de los nacimientos
vivos, que es debido a una duplicación del cromosoma 21, lo que resulta en una trisomía del cromosoma 21 ( Figura 3). Existen otras
trisomías menos abundantes del cromosoma 13 (Síndrome de Patau) y del cromosoma 18 (Síndrome de Edwads).

Delecciones parciales o totales de cromosomas se han ligado a estos trastornos. Por ejemplo, una deleción parcial en el brazo corto o
"p" del cromosoma 5 es responsable del Síndrome de Cri-du-Chat (nombre que sale del hecho de que los niños afectados dan un grito
parecido a los gatos) (Figura 4).
Las delecciones o duplicaciones en los cromosomas sexuales son mejor
toleradas. La monosomía del cromosoma X conduce al Síndrome de Turner.
También han sido descritos en personas cariotipos XXX, XXY y XYY.

Otros cariotipos anormales pueden producir individuos sanos, por ejemplo,

las translocaciones balanceadas en las que regiones recíprocas de distintos
cromosomas son intercambiadas (Figura 5).

¿En qué consiste la práctica?

Esta práctica es una simulación de cómo realizar cariotipos en seres humanos con las imágenes digitales de cromosomas de estudios
reales de genética humana.

Arreglará los cromosomas de un cariotipo completo e interpretará tus resultados como si estuviera trabajando en un programa de
análisis genético en un hospital o una clínica. Imagine que haga estos análisis para personas reales y que sus conclusiones afectarán a
sus vidas.

El ejercicio está diseñado como introducción a las investigaciones genéticas a los seres humanos. Realizar cariotipos es una de las
muchas técnicas que nos permiten investigar miles de enfermedades genéticas. El análisis involucra la comparación de cromosomas
por su longitud, la ubicación de los centrómeros (lugar donde las dos cromátidas están unidas) y la ubicación y tamaño de las bandas-
G.

1. Procedimento experimental

Importante: para realizar esta actividad debe poder utilizar el programa ADOBE FLASH.
Ejercicio 1.
a. Empareje los cromosomas del siguiente link:[Link]
b. Feu una captura de pantalla del cariotip complet, ja que la necessitareu per al full de resultats
Exercici 2.
a. Entreu en aquest link: [Link]
b. Resoleu el primer cariotip, que és normal.
 c. Quan premeu el botó de “Go to next page” us apareixeran 5 casos, dels quals, com a mínim, cal que en feu 2 cadascú. Els
casos poden ser alguna de les següents patologies:

d. Seleccióna un cas, construeix-ne el cariotip, identifica l’anomalia cromosòmica present i associa-la a una patologia de la
llista.
e. Feu una captura de pantalla de cada cas.

2. Full de resultats

Responeu les següents preguntes a la llibreta de laboratori:

Exercici 1.

a. Enganxeu la captura de pantalla i comenteu-la.

b. Quina és la fórmula cromosómica del cariotip obtingut? Hi ha alguna anomalia?

Exercici 2.

c. Enganxeu la captura de pantalla de totes les persones que hàgiu analitzat i comenteu-la.

d. Quina és la fórmula cromosómica de cadascun dels cariotips obtinguts? Hi ha alguna anomalia?

e. Quin diagnòstic donaríeu als pacient en cada cas?

3. Valoració de la pràctica

PRÁCTICA 12. TINCIÓN DE CROMOSOMAS EN CÉLULAS PREFIJADAS (PRÁCTICA OPCIONAL)

PRÁCTICA 13. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS EN MITOSIS (PRÁCTICA OPCIONAL)

METACOGNICIÓN FINAL DEL EH PRO DE CITOGENÉTICA