NETosis: mecanismos moleculares, papel en fisiología y
patología
NV Vorobjeva 1 y BV Chernyak 2
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Abstracto
NETosis es un programa para la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET),
que consisten en cromatina modificada decorada con proteínas bactericidas de gránulos y
citoplasma. Varios patógenos, anticuerpos y complejos inmunes, citoquinas, microcristales
y otros estímulos fisiológicos pueden causar NETosis. La inducción de NETosis depende
de las especies reactivas de oxígeno (ROS), cuya fuente principal es la NADPH oxidasa. La
activación de la NADPH oxidasa depende del aumento de la concentración de Ca 2+en el
citoplasma y en algunos casos en la generación de ROS en las mitocondrias. La NETosis
incluye la liberación de los componentes de los gránulos en el citosol, la modificación de
las histonas que conducen a la descondensación de la cromatina, la destrucción de la
envoltura nuclear y la formación de poros en la membrana plasmática. En esta revisión, se
discuten los mecanismos básicos de la NETosis, así como su papel en la patogénesis de
algunas enfermedades, incluida la COVID-19.
Palabras clave: neutrófilos, trampas extracelulares de neutrófilos, NETosis, NADPH
oxidasa, especies reactivas de oxígeno, poro mitocondrial, COVID-19
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INTRODUCCIÓ N
Los neutrófilos son la población más grande de leucocitos mieloides, que normalmente
comprenden del 50 al 70% de todos los glóbulos blancos. Los neutrófilos se diferencian en
la médula ósea de las células madre hematopoyéticas y, después de la maduración
completa, ingresan al torrente sanguíneo. Los neutrófilos circulan en el torrente sanguíneo
durante no más de 72 h, luego regresan a la médula ósea para ser fagocitados por los
macrófagos residentes o sufren apoptosis en los tejidos periféricos, donde también son
fagocitados. Cuando el organismo huésped se infecta, los neutrófilos migran
inmediatamente desde el torrente sanguíneo al sitio de la infección proporcionando una
"primera línea" de defensa contra los patógenos.
Al ser fagocitos "profesionales", los neutrófilos contienen una gran cantidad de "armas"
antimicrobianas en sus gránulos que les permiten destruir patógenos en el proceso de
fagocitosis. Las enzimas bactericidas también pueden liberarse de las células durante la
desgranulación. La activación de la NADPH oxidasa conduce a la generación masiva de
especies reactivas de oxígeno (ROS), que están involucradas en la destrucción de patógenos
tanto dentro de los fagosomas como fuera de las células. Finalmente, existe otro mecanismo
antimicrobiano que representa la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET),
que consisten en cromatina modificada “decorada” con proteínas bactericidas de gránulos y
citoplasma. Este fenómeno fue descrito por primera vez en el trabajo de Takei y
colaboradores [ 1] y posteriormente caracterizado en detalle en el laboratorio de Arturo
Zychlinsky [ 2 ]. Dado que inicialmente se demostró que la formación de NET se acompaña
de muerte celular, este proceso se denominó NETosis [ 3 ].
La formación de NET puede ser activada por diversos patógenos, como bacterias, hongos,
protozoos, virus, así como componentes de la pared celular bacteriana: lipopolisacáridos
(LPS). La NETosis puede ser inducida por anticuerpos y complejos inmunitarios, citocinas
y quimiocinas (IL-8, TNF), microcristales y otros estímulos fisiológicos [ 4 - 8 ]. Para
inducir NETosis en experimentos in vitro , los ésteres de forbol (en particular, forbol-12-
miristato-13-acetato, PMA), que imitan la acción de la proteína quinasa C activadora de
diacilglicerol, así como el calcio (ionomicina, A23187) y A menudo se utilizan ionóforos
de potasio (nigericina).
Actualmente, se han descrito dos formas fundamentalmente diferentes de NETosis:
NETosis clásica o suicida, que conduce a la muerte celular, y NETosis vital, en la que la
célula conserva no solo la viabilidad, sino también muchas de sus funciones efectoras (ver
más abajo).
La NETosis clásica es una forma especial de muerte celular programada (PCD), que se
caracteriza por la liberación de componentes granulares en el citosol, así como por la
descondensación de la cromatina asociada con la modificación de las histonas. Al mismo
tiempo, muchas características características de otras formas de DCP (apoptosis,
necroptosis, piroptosis, autofagia, necrosis secundaria) también son inherentes a la
NETosis. Durante la NETosis, al igual que en la apoptosis, ocurren cambios coordinados en
el núcleo y en el citoplasma, aunque la naturaleza de los cambios es diferente, y la
NETosis, a diferencia de la apoptosis, no requiere la activación de caspasas. A diferencia de
la apoptosis, la NETosis (como las otras formas de PCD) se acompaña de una alteración de
las propiedades aislantes de la membrana plasmática, y los mecanismos de
permeabilización son similares para la NETosis, la piroptosis y la necroptosis.9 ], que
también controla la inducción de autofagia, pero no se requiere el ensamblaje de
autofagosomas para NETosis [ 10 ]. Las vías que conducen a la NETosis y la necroptosis
pueden estar estrechamente entrelazadas [ 11 - 13 ]. Durante mucho tiempo se creyó que las
mitocondrias no desempeñan un papel importante en el funcionamiento de los neutrófilos,
ya que su contenido en estas células es bajo, el suministro de energía se sustenta en la
glucólisis y la NADPH oxidasa es la principal fuente de ROS. Posteriormente, sin embargo,
resultó que las mitocondrias están involucradas en la transmisión de señales que determinan
las principales respuestas de los neutrófilos a los patógenos [ 14] .]. Se encontró que las
ROS mitocondriales están involucradas en la activación de la NADPH oxidasa y en la
inducción de NETosis causada por diversos estímulos [ 15 , 16 ].
La formación de NET también se ha demostrado en otros tipos de células inmunitarias:
eosinófilos y mastocitos [ 17 ], basófilos [ 18 ], monocitos [ 19 ] y macrófagos
[ 20 ]. Curiosamente, la cromatina descondensada no solo la utilizan los animales para
protegerse de los patógenos, sino también los eucariotas unicelulares [ 21 ], así como las
plantas [ 22 ]. Por lo tanto, se puede suponer que el uso de la cromatina para proteger al
huésped contra patógenos surgió bastante temprano en el curso de la evolución de los
eucariotas.
En los últimos años se han acumulado datos sobre el papel de la NETosis en un amplio
abanico de patologías asociadas a procesos inflamatorios. Esto condujo a un aumento en las
publicaciones sobre NETosis. En la base de datos PubMed se pueden encontrar casi 3000
publicaciones sobre este tema, de las cuales aproximadamente un tercio aparece en 2018-
2020. Tales estudios intensivos dieron como resultado avances significativos en la
comprensión de la naturaleza de la NETosis, pero al mismo tiempo han llevado a la
acumulación de datos que se contradicen entre sí. En esta revisión, intentamos considerar
los conceptos básicos de los mecanismos de NETosis, que determinan su lugar entre otras
formas de DCP. Además, discutimos brevemente el papel de NETosis en la patogénesis de
ciertas enfermedades.
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MECANISMOS DE FORMACIÓ N DE REDES
Participación de las ROS producidas por NADPH oxidasa y mitocondrias en la
inducción de NETosis. Como se demostró en los primeros estudios clásicos de A.
Zychlinsky y colaboradores [ 23 ], la NETosis causada por Staphilococcus aureus o PMA
dependía de las ROS producidas por la NADPH oxidasa. Curiosamente, la adición de ROS
exógenas a los neutrófilos de pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD), para
los cuales la ausencia de NADPH oxidasa era típica, promovió la formación de NET
[23 ] . El principal mecanismo de activación de la NADPH oxidasa está asociado con la
fosforilación de sus subunidades por la proteína quinasa C (PKC), que conduce al
ensamblaje de la enzima activa en la membrana [24] .]. Otras quinasas c-Raf, MEK, Akt y
ERK, junto con PKC, contribuyeron a la activación de la NADPH oxidasa durante la
NETosis causada por Helicobacter pylori [ 25 ]. La NETosis inducida por el
parásito Entamoeba histolytica también dependía de la activación de la cascada de la cinasa
c-Raf-MEK-ERK, pero la PKC no estaba involucrada [ 26 ]. Curiosamente, la cascada de
señalización de c-Raf-MEK-ERK, así como la PKC, estimulan la expresión de Mcl-1, la
principal proteína antiapoptótica de los neutrófilos [ 25 ]. Aparentemente, la inducción de
NETosis se puede asociar con la supresión de la apoptosis, lo que aumenta el efecto
antimicrobiano general.
Los principales mecanismos de activación de la NADPH oxidasa durante la NETosis
probablemente no sean muy diferentes de los que proporcionan un estallido oxidativo de
neutrófilos en respuesta a patógenos y otros estímulos. Encontramos en el curso de la
investigación de la activación de la NADPH oxidasa por el péptido quimioatrayente N -
formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), que causó el estallido oxidativo y la
desgranulación pero no la NETosis, que las mitocondrias jugaron un papel importante en
estos procesos. El antioxidante SkQ1 dirigido a las mitocondrias en concentraciones
submicromolares impidió la activación de la NADPH oxidasa inducida por fMLP pero no
por PMA [ 15] .]. Las ROS mitocondriales (mtROS) estimularon la NADPH oxidasa con la
participación de la PKC, pero se desconocía el objetivo principal de su acción. Este puede
ser el propio PKC, que tiene dos grupos de azufre-zinc sensibles a redox en el dominio de
unión a diacilglicerol. Además, algunos miembros de la familia de quinasas Src (en
particular, Lyn quinasa), que estimulan la PKC a través de la fosforilación de sus residuos
de tirosina, son activados por ROS [27 ] . Otro mecanismo sensible a redox de la activación
de la NADPH oxidasa en los neutrófilos se basa en la asociación dependiente de ROS de la
proteína disulfuro isomerasa con la subunidad p47phox, que conduce a su translocación a la
membrana con el posterior ensamblaje de la NADPH oxidasa [28 ] .
La activación de NADPH oxidasa por mtROS fue demostrada por primera vez por Dikalov
y colaboradores [ 29 ] en células endoteliales. Demostraron que el antioxidante
MitoTEMPO dirigido a las mitocondrias y la expresión de la superóxido dismutasa
mitocondrial SOD2 prevenían la activación de la NADPH oxidasa causada por la hormona
angiotensina II, que estimulaba la hipertensión. Estudios posteriores demostraron que
mtROS en el endotelio estimulaba solo una de las cuatro isoformas de NADPH oxidasa:
NOX2 [ 30 ], y esta isoforma era típica de los neutrófilos. En los neutrófilos, se describió la
activación de la NADPH oxidasa por el mixotiazol, un inhibidor del complejo III de la
cadena respiratoria, que estimuló la producción de mtROS [ 31 ]. En nuestro estudio [ 15],
un aumento en mtROS y la activación de NADPH oxidasa fue causado por una señal del
receptor fMLP acoplado a proteína G, que inició la liberación de Ca 2+ del retículo
intracelular, así como la activación independiente de Ca 2+ de PI3K. Ambas vías de
señalización son aparentemente importantes para la activación mediada por receptores de la
NADPH oxidasa en los neutrófilos [ 27 ].
La generación de mtROS dependiente de Ca 2+ podría servir como fuente predominante de
ROS en el caso de inducción de NETosis por ionóforos de Ca 2+ (A23187 o ionomicina)
[ 32 ] y algunos otros estímulos [ 33 , 34 ]. Estas observaciones promueven el concepto de
dos mecanismos diferentes de NETosis, uno de los cuales es independiente de la NADPH
oxidasa (consulte la revisión [ 5 ]). Sin embargo, mtROS puede contribuir al inicio de la
NETosis debido a la estimulación de la NADPH oxidasa. Por ejemplo, como se mostró en
nuestro trabajo reciente [ 16], la NETosis inducida por A23187 fue inhibida tanto por el
antioxidante SkQ1 dirigido a las mitocondrias como por los inhibidores específicos de la
NADPH oxidasa. Al mismo tiempo, también demostramos que en neutrófilos aislados de la
sangre de pacientes con CGD ligada al cromosoma X, la formación de NET en respuesta a
A23187 dependía de la generación mejorada de mtROS sin la participación de NADPH
oxidasa [16 ] . Sugerimos que en los neutrófilos deficientes en NADPH oxidasa, los
mtROS se forman con mayor intensidad debido a la acumulación excesiva de Ca 2+ [ 35 ] y
esto es suficiente para desencadenar NETosis. La entrada descontrolada de Ca 2+ en el
citoplasma de los neutrófilos CGD aparentemente se debe a la falta de función
electrogénica de la NADPH oxidasa y la despolarización de la membrana tras la
activación.36 ].
Nuestros estudios demostraron que la generación de mtROS causada tanto por fMLP como
por A23187 dependía de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial
no selectivo (mPTP) [ 16 ]. Este fenómeno pasó desapercibido durante mucho tiempo,
probablemente debido al hecho de que el inhibidor de mPTP más conocido, la ciclosporina
A (CsA), también era un inhibidor de la fosfatasa calcineurina citoplasmática implicada en
la transmisión de numerosas señales dependientes de Ca 2+ [ 37]. En nuestro estudio,
utilizamos los inhibidores de mPTP sangliferina A y ácido bongkrekic, que no afectaron a
la calcineurina. Curiosamente, fMLP no causó una disminución significativa en el potencial
de la membrana mitocondrial y la hinchazón mitocondrial característica de la apertura
prolongada de mPTP. Asumimos que este aumento a corto plazo en el Ca 2+ citoplasmático
causado por fMLP indujo la apertura de poros reversibles temporales. Este modo de
apertura de mPTP se ha descrito tanto en mitocondrias aisladas [ 37 ] como en modelos
celulares [ 38 ]. La función de señalización de la apertura de mPTP y la producción
asociada de mtROS se han descrito previamente en las células endoteliales [ 30 ] y en los
neutrófilos tratados con mixotiazol [ 31 ].
La NETosis causada por A23187 también dependía de la apertura de mPTP [ 16 ]. En este
caso, la microscopía electrónica reveló una inflamación significativa de las mitocondrias,
que se acompañó de descondensación de la cromatina y destrucción de la envoltura nuclear
(Figura 1).
Figura 1.
Microscopía electrónica de neutrófilos en las primeras etapas de NETosis. a, b) neutrófilos
humanos intactos; cyd) neutrófilos estimulados con A23187 2 µM durante 30 min. La
descondensación de la cromatina, característica de la NETosis, y la hinchazón de las
mitocondrias se observaron simultáneamente, lo que indica la apertura del poro
mitocondrial no selectivo, mPTP. Barras de escala: 2 µm (a, c) y 500 nm (b, d) [ 16 ].
Se puede suponer que el aumento significativo de Ca 2+ citoplasmático inducido por
A23187 provocó una apertura prolongada del poro. La apertura dependiente de Ca 2+ del
mPTP estimuló la formación de mtROS, mientras que los inhibidores de mPTP impidieron
su acumulación [ 16 ]. La causa directa de la formación excesiva de mtROS probablemente
estuvo relacionada con la liberación de los principales componentes de la defensa
antioxidante, como NADPH [ 38 ] y glutatión reducido [ 16 ] de las mitocondrias. Junto
con el Ca 2+ , el estrés oxidativo es un inductor eficaz de la apertura del mPTP [ 37]. Es
posible que las ROS formadas por la NADPH oxidasa penetren en la célula, estimulando
así la apertura del mPTP y creando un bucle de amplificación que conduce a la NETosis
(Figura 2).
Figura 2.
Esquema que ilustra los mecanismos de NETosis inducidos por varios estímulos. La
NETosis causada por el ionóforo de calcio A23187 comienza con la movilización de
Ca desde el retículo endoplásmico (ER), lo que conduce a la activación de los canales
2+
CRAC ubicados en la membrana citoplasmática y la entrada de Ca extracelular al
2+
citoplasma. Además, A23187 cataliza la transferencia de Ca a través de la membrana
2+
plasmática hacia el citoplasma. La acumulación posterior de Ca en la matriz mitocondrial
2+
conduce a la activación de poros mitocondriales no selectivos (mPTP) y la formación de
especies de oxígeno reactivo mitocondrial (mtROS). Junto con Ca sobrecarga, el estrés
2+
oxidativo también es un inductor del mPTP. Los mtROS liberados de las mitocondrias al
citosol activan la NADPH oxidasa aparentemente con la participación de la proteína
quinasa C (PKC). La PKC se puede activar con el éster de forbol (PMA), que induce
NADPH oxidasa y NETosis independientemente de mtROS y mPTP. La NADPH oxidasa
también puede ser activada por un quimioatrayente N -formilmetionil-leucil-fenilalanina
(fMLP), que al unirse a un receptor específico activa la fosfolipasa C (PLC) para estimular
la formación de diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3) a partir de la
fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato. La activación de la NADPH oxidasa en este caso depende
de mtROS y de la apertura de mPTP. Por razones que no se comprenden completamente,
fMLP no induce NETosis [ 16]. (La versión en color de la figura está disponible en la
versión en línea del artículo y se puede acceder a ella en:
[Link]
La apertura del poro mitocondrial se ha considerado durante mucho tiempo como uno de
los pasos en el programa de apoptosis [ 39 ]. Inicialmente, se supuso que la apertura de
mPTP producía hinchazón de la matriz, ruptura de la membrana mitocondrial externa y
salida de proteínas proapoptóticas (en particular, citocromo c ) del espacio intermembrana
hacia el citoplasma. Posteriormente, esta hipótesis se modificó teniendo en cuenta los datos
sobre la liberación de citocromo c a través de los poros de la proteína en la membrana. Se
asumió que la apertura del mPTP promueve el cambio en la morfología de la membrana
interna y la liberación de citocromo c desde el espacio interior de las crestas [ 40]. Los
detalles de este mecanismo siguen sin estar claros, pero no hay duda de que los inhibidores
de poros específicos previenen la apoptosis en varios modelos. La apertura de mPTP
también está involucrada en la inducción de muerte necrótica. En particular, la apertura de
mPTP contribuye a la necrosis inducida por isquemia/reperfusión del corazón, y su función
crítica ha sido confirmada por el efecto protector de los inhibidores de poros [ 41 ]. Estos
datos nos permiten ubicar la NETosis inducida por ionóforos de calcio en la familia de
mecanismos de PCD dependientes de mPTP. La activación de la NADPH oxidasa
dependiente de mtROS durante la NETosis, que a menudo se denomina "NADPH oxidasa
independiente", indica que parece más exacto llamarla "NETosis dependiente de la
mitocondria".
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MECANISMOS DE NETosis
Un evento importante en la NETosis es la liberación de algunas proteínas de los gránulos al
citosol. Los gránulos azurófilos contienen el complejo proteico "azurosoma", que incluye
ocho tipos de proteínas, tres de ellas son serina proteasas altamente homólogas: elastasa
neutrofílica (NE), catepsina G y azurocidina, y también mieloperoxidasa (MPO), una
enzima que produce el anión hipoclorito. utilizando cloro y peróxido de hidrógeno como
sustratos. Se demostró que las ROS causan la disociación de los azurosomas, lo que
condujo a la liberación de serina proteasas y MPO de los gránulos al citosol [ 42 ]. Las
serina proteasas (principalmente, NE) descomponen los elementos del citoesqueleto que
contribuyen a la realización de NETosis [ 43]. Posteriormente migran al núcleo, donde
rompen la lámina y las histonas contribuyendo a la descondensación de la cromatina y
destrucción de la envoltura nuclear. MPO juega un papel importante en la disociación del
azurosoma y la liberación de las proteasas de los gránulos [ 42 , 44 ]. Curiosamente, no se
requiere actividad enzimática de MPO en esta etapa. Es probable que esta proteína que
contiene hemo sirva como receptor de peróxido de hidrógeno intracelular. Sin embargo, la
actividad de la MPO es necesaria para la NETosis, ya que el anión hipoclorito estimula la
actividad de la elastasa de los neutrófilos [ 42] .]. Vale la pena señalar que la liberación de
proteínas de los gránulos dependiente de ROS durante la NETosis es en muchos aspectos
similar a la permeabilización de los lisosomas dependiente de ROS y la liberación de
catepsinas de ellos, que es típica de muchas variantes de necrosis [45 ] .
Además, la peptidil-arginina desaminasa 4 (PAD4) se transfiere del citoplasma al núcleo
para catalizar la citrulinación de las histonas, lo que conduce a la descondensación de la
cromatina. La inhibición de PAD4 impidió la descondensación de la cromatina y la
NETosis causada por ionóforos de Ca 2+ o Shigella flexneri , y los neutrófilos aislados de
los ratones knockout para PAD4 no formaron NET en respuesta a PMA [ 46 ]. Las peptidil-
arginina desaminasas son proteínas de unión a Ca 2+ y su actividad es estimulada por Ca 2+ . Por otro lado,
PAD4 se activa y provoca la citrulinación de histonas en respuesta a la adición de peróxido
de hidrógeno [ 46] .]. Además, la citrulinación de histonas y la NETosis relacionadas con
LPS dependen de la integridad de los microtúbulos [ 47 ]. Aparentemente, la combinación
de todos estos factores es necesaria para la activación de PAD4. Junto con la citrulinación,
las histonas también pueden sufrir acetilación durante la NETosis, pero su papel en este
proceso aún no se conoce bien [ 5 ]. La descondensación de la cromatina, así como el daño
proteolítico de la lámina nuclear conduce a la destrucción de la envoltura nuclear y la
liberación de cromatina en el citoplasma. Recientemente, se ha demostrado que la NETosis
puede ocurrir debido a la activación de quinasas dependientes de ciclina (CDK), que
facilitan la entrada en el ciclo celular [ 48] .]. Es posible que partes del aparato de mitosis,
como la fosforilación de láminas y la separación de centrosomas, se utilicen para destruir la
envoltura nuclear durante la NETosis.
En la etapa final de la NETosis, se forman poros en la membrana plasmática y la cromatina
se libera al medio ambiente con la formación de NET. Las proteínas liberadas de los
gránulos se unen fuertemente a la cromatina descondensada debido a la interacción
electrostática. Los poros que permiten el paso de este complejo gigante están formados por
la proteína gasdermina D (GSDMD), que también forma poros en la membrana del
macrófago durante la piroptosis. A diferencia de la piroptosis, donde GSDMD se activa a
través de la escisión por caspasa-1 y -4/5 (caspasa-11, en ratones), durante NETosis es
escindida y activada principalmente por elastasa de neutrófilos [49 , 50 ] . La activación de
GSDMD probablemente conduce a la formación de poros no solo en el plasmalema, sino
también en la membrana nuclear [ 51] .]. La activación dependiente de caspasa de GSDMD
en neutrófilos también puede ocurrir como resultado de la activación no canónica del
inflamasoma [ 51 ], pero el papel de este mecanismo en NETosis requiere más
investigaciones. Gasdermin E, relacionado con GSDMD, es activado por caspasa-3 que
conduce a la permeabilización de las mitocondrias y la promoción de la apoptosis, así como
la necrosis secundaria [ 52 , 53 ]. Otra proteína formadora de poros MLKL (no relacionada
con las gasderminas) es activada por las quinasas RIP durante la necroptosis. La activación
de MLKL en los neutrófilos también puede conducir a la liberación de NET [ 11 - 13 ].
Modulación fisiológica de la NETosis. En condiciones fisiológicas, la proporción de
concentraciones de CO 2 / HCO 3 , el pH y el contenido de O 2 pueden modular la
NETosis. En condiciones moderadamente alcalinas y con una proporción reducida de
CO 2 /HCO 3 – , aumentó el nivel de NETosis causado por PMA, ionóforo de Ca 2+ , microcristales
de ácido úrico o LPS [
54 ]. Un aumento del pH en el citoplasma de los neutrófilos provocó un
aumento en la concentración de Ca 2+ y una mayor producción de ROS tanto por la NADPH
oxidasa como por las mitocondrias [ 55] .]. Una disminución del pH en el medio provoca la
inhibición de la NETosis, posiblemente debido a la inhibición de la glucólisis
[ 56 ]. Además, a un pH bajo, la probabilidad de apertura de mPTP se reduce
considerablemente [ 37 ], lo que podría reducir la producción de mtROS [ 16 ]. Se supone
que la dependencia del pH de la NETosis conduce al hecho de que se activa al máximo en
la periferia de la lesión inflamatoria protegiendo el tejido de los patógenos, mientras que en
el centro de la lesión, que se caracteriza por un pH bajo, la NETosis se debilita y no mejorar
el daño tisular [ 54]. La información sobre el efecto de la hipoxia en la NETosis es
controvertida. Por un lado, la eliminación de Hif-1α (el principal factor de transcripción que
regula la adaptación a la hipoxia) suprimió la NETosis, mientras que la estabilización
farmacológica de Hif-1α la estimuló [ 57 ]. Por otro lado, la NETosis inducida por PMA
(pero no por S. aureus ) disminuyó con la hipoxia, y este efecto no dependió de Hif-1α
[ 58 ]. Además de la composición del medio, la NETosis depende de su osmolaridad, por lo
tanto, el medio hipertónico suprimió la producción de ROS y NETosis. El nivel de ROS en
este caso fue crítico, ya que la adición de peróxido de hidrógeno restauró la NETosis [ 59 ].
Las citocinas y los mediadores inflamatorios juegan un papel importante en la activación de
la NETosis, mientras que al mismo tiempo algunas sustancias antiinflamatorias pueden
provocar el efecto contrario. Por lo tanto, la prostaglandina E2, que desempeña un papel
importante en la resolución de la inflamación, inhibe la NETosis debido al aumento del
contenido intracelular de AMP cíclico [ 60 , 61 ]. La proteína C activada (una serina
proteinasa con efectos antitrombóticos y antiinflamatorios) también puede inhibir la
NETosis al unirse a un receptor específico (EPCR) o al interactuar con el receptor 3
activado por proteasa (PAR3) y las integrinas CD11b/CD18 (Mac- 1). Curiosamente, la
misma proteína C activada puede escindir histonas que forman parte de las redes [ 62] .]. Se
ha demostrado que la NETosis es suprimida por la importante citocina antiinflamatoria IL-
10 [ 63 ]. Se han encontrado péptidos que suprimen eficazmente la formación de NET en la
sangre del cordón umbilical. El péptido más común se denomina “factor inhibidor de NET
neonatales” (nNIF). Este péptido inhibió selectivamente la NETosis sin afectar la
fagocitosis y otras funciones de los neutrófilos. Su administración intravenosa protegió a
los ratones de la inflamación sistémica causada por LPS y de la sepsis microbiana [ 64 ].
Los microorganismos patógenos tienen una amplia gama de herramientas que interfieren
con la acción microbicida de los NET [ 65 ]. Muchos microorganismos producen enzimas
líticas (principalmente, endonucleasas) que destruyen los NET. Las bacterias,
como Pseudomonas aeruginosa , Mycobacterium tuberculosis , así como hongos del
género Aspergillus , producen envolturas extracelulares protectoras y enmascaradoras. En
el caso de P. aeruginosa , el recubrimiento con ácidos siálicos induce la producción de IL-
10, que suprime la NETosis. El mismo mecanismo parece ser utilizado por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH-1). Los viriones del VIH-1 estimulan la producción de IL-
10 por parte de las células dendríticas, lo que protege al virus de la acción lítica de las
enzimas NET [ 63] .]. El virus de la hepatitis B (VHB) inhibe la NETosis al suprimir la
producción de ROS en los neutrófilos utilizando la proteína de la cubierta HBE y la
proteína central HBC [ 66 ].
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LIBERACIÓ N NETA VITAL
Junto con la NETosis suicida descrita anteriormente, también existen mecanismos de
liberación de ADN, cuando los neutrófilos conservan su viabilidad y sus funciones
efectoras naturales (para una revisión, consulte [ 6 ]). Se utilizó el término “NETosis vital”
para describir estos procesos. Sin embargo, el Comité de Nomenclatura de Muerte Celular
en 2018 [ 67 ] no recomendó usar el término NETosis para procesos no asociados con la
muerte celular. La liberación vital de cromatina se describió por primera vez en un sistema
en el que había neutrófilos junto con plaquetas activadas por LPS a través de TLR4
[ 68] .]. La NETosis, en este caso, ocurrió mucho más rápido que cuando fue inducida por
PMA, y no se estudió el papel de la NADPH oxidasa y las ROS. Desafortunadamente, este
interesante modelo, que tiene un significado fisiológico obvio, no se ha investigado más. Se
observó una liberación vital similar de cromatina in vivo cuando la piel estaba infectada con
bacterias grampositivas [ 69 ]. La inducción de NETosis en este caso requirió la
opsonización de las bacterias, la interacción con TLR2 y la activación del sistema del
complemento. Curiosamente, después de la NETosis, los neutrófilos libres de energía
nuclear eran capaces de quimiotaxis y fagocitosis de bacterias.
Se observó una liberación masiva y muy rápida de ADN mitocondrial (ADNmt) sin pérdida
de viabilidad en eosinófilos y neutrófilos cebados con citoquinas proinflamatorias
IL-5/IFN-γ o GM-CSF, respectivamente, y estimulados con LPS [ 70 , 71 ] . En ambos
tipos de granulocitos, este proceso fue dependiente de la actividad de la NADPH
oxidasa. Un fenómeno similar se observó en el caso de los basófilos [ 18 ]. Recientemente,
se descubrió la liberación vital de mtDNA en los linfocitos B y T, así como en las células
asesinas naturales (células NK) en respuesta a los oligodesoxinucleótidos [ 72] .]. A
diferencia de los granulocitos, la liberación de mtDNA de los linfocitos no dependía de la
NADPH oxidasa. La cuestión del papel funcional del mtDNA extracelular permanece
abierta. El bajo contenido de mitocondrias en los neutrófilos y, especialmente, en los
eosinófilos hace que la formación de NET funcionales sea extremadamente improbable. En
el caso de los linfocitos, el ADNmt extracelular no contenía enzimas líticas y lo más
probable es que cumpliera una función de señalización. En particular, el mtDNA estimuló
la expresión y secreción de los interferones tipo I por parte de las células mononucleares de
sangre periférica [ 72 ]. Cabe señalar que el ADNmt extracelular (normalmente, oxidado)
se encuentra en la sangre en una amplia gama de patologías, incluido el lupus eritematoso
sistémico, una enfermedad autoinmune en cuya patogenia la NETosis juega un papel
importante [33] .].
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EL PAPEL DE LA NETosis EN LA DEFENSA Y LA PATOLOGÍA
DEL HUÉ SPED
En los primeros estudios sobre NETosis, se sugirió el papel protector fisiológico de este
fenómeno. En particular, se encontraron estructuras similares a las NET en el contenido del
apéndice [ 2 ]. Posteriormente, se encontraron NET en numerosos órganos y tejidos [ 6 ],
sin embargo, la cuestión de su efecto protector sigue abierta. La NETosis se observa en
focos de infecciones y, aparentemente, frena la propagación de patógenos. Por lo tanto, se
ha demostrado que los NET en las infecciones cutáneas estafilocócicas inhiben la
penetración de los patógenos en el torrente sanguíneo [ 69 ]. Los ratones que no son
capaces de NETosis debido a la inactivación del gen PAD4 sufrieron de manera más
significativa la fascitis necrótica causada por el grupo A Streptococcus
pyogenes [ 46] .]. Sin duda, la formación excesiva de TNE asociada tanto al aumento de
NETosis como a defectos en los mecanismos para su eliminación puede dar lugar a
patologías inflamatorias y autoinmunes, así como a la oclusión vascular o de conductos.
NETosis en la superficie del epitelio. Los microorganismos atacan constantemente las
barreras epiteliales induciendo la formación de NET en la superficie de los ojos, la mucosa
oral y la piel. Por lo tanto, la formación de NET y su degradación deben estar estrictamente
reguladas para evitar la inflamación en estos tejidos. Se han descrito varias enfermedades
en las que los NET desempeñan un papel tanto antimicrobiano como patogénico.
En la superficie de la córnea del ojo, la NETosis participa en la protección contra
infecciones bacterianas y fúngicas. En pacientes con NETosis severa, la queratitis fúngica
progresó mucho más fácilmente [ 73 ], mientras que la queratitis causada por aislamientos
clínicos de P. aeruginosa fue exacerbada por NETosis en el modelo de ratón [ 74 ]. En el
caso de la inflamación estéril de la córnea durante el síndrome del ojo seco, también se
observó acumulación de NET [ 75 ]. Una de las razones de la NETosis podría ser el
aumento de la osmolaridad del líquido lagrimal que lava la córnea en pacientes con
síndrome de ojo seco [ 76 ]. Síndrome del ojo seco, que a menudo ocurre como una
manifestación de la reacción de "injerto contra huésped" después del trasplante de médula
ósea [ 77] y el síndrome autoinmune de Sjogren [ 78 ] también se caracterizan por la
acumulación de NET en el líquido lagrimal. Curiosamente, se demostró que el antioxidante
SkQ1 dirigido a las mitocondrias (un componente activo de las gotas para los ojos
"Visomitin") es altamente efectivo en el tratamiento del síndrome del ojo seco de diversas
etiologías [ 79 ] . Se puede suponer que este efecto de SkQ1 está relacionado en parte con
la supresión de NETosis descrita en nuestro estudio [ 16 ].
El papel de la NETosis en la trombosis. NETosis juega un papel importante en la
patogenia de la trombosis de diversos orígenes [ 80 , 81 ]. Por ejemplo, en el modelo de
estenosis de la vena cava inferior, la probabilidad de trombosis se redujo significativamente
en los ratones knockout para PAD4 [ 82 ]. El papel de los NET en la trombosis implica la
interacción con el endotelio y las plaquetas, así como la captura de pequeños coágulos de
sangre. La NETosis aparentemente subyace a la trombosis asociada con reacciones de
inmunidad innata excesivas ("inmunotrombosis") [ 83]. La inmunotrombosis,
presumiblemente, es una reacción protectora del cuerpo contra los patógenos, facilitando su
captura en un coágulo de fibrina. Además, los trombos de los vasos sanguíneos pequeños
pueden crear compartimentos, donde los patógenos pueden destruirse de manera
efectiva. Sin embargo, las consecuencias de tal reacción pueden ser trágicas. Un reciente
estudio clínico a gran escala reveló una correlación entre el nivel de NETosis y la gravedad
del accidente cerebrovascular isquémico y el infarto de miocardio [ 84 ]. La NETosis puede
ser activada por microcristales de colesterol y participar en la patogenia de la
aterosclerosis. Las histonas en los NET provocan la activación de macrófagos dependiente
de TLR4 y la liberación de citocinas que activan las células T colaboradoras (Th17)
[ 85 , 86]. El proceso inflamatorio en las placas ateroscleróticas puede ser una de las causas
de la trombosis [ 87 ]. Las enfermedades oncológicas podrían ser otra causa de trombosis, y
se cree que la NETosis está involucrada en este caso [ 87 ]. Por otro lado, la infección viral
terapéutica de tumores induce la coagulación intratumoral dependiente de neutrófilos y la
muerte de las células cancerosas. Sin embargo, queda por dilucidar si este proceso es
realmente causado por NETosis [ 88 ]. La trombosis, que es característica de varias
infecciones virales, podría estar asociada con una NETosis excesiva y parece estar
involucrada en la patogenia de la COVID-19 (ver más abajo).
En los conductos pancreáticos, la NETosis puede ser causada por microcristales de
carbonato de calcio, lo que provoca el bloqueo del conducto pancreático y la pancreatitis
[ 89 ]. Dichos cristales causan NETosis en los conductos biliares y en la vesícula biliar, lo
que puede conducir a la formación de cálculos biliares [ 90 ].
El papel de la NETosis en el desarrollo de enfermedades pulmonares. En el tracto
respiratorio, la NETosis contribuye a la protección contra la infección aumentando la
viscosidad de la mucosidad y destruyendo los patógenos. Sin embargo, muchos de los
patógenos (en particular, Streptococcus pneumoniae , Haemophilus influenzae ) producen
endonucleasas que descomponen los NET y protegen a las bacterias (ver revisión [ 91]). Al
mismo tiempo, la NETosis contribuye al desarrollo de complicaciones de las enfermedades
infecciosas de los pulmones, incluido el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA),
la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), así como el asma bronquial, etc. El
ensayo clínico reciente (realizado antes hasta el inicio de la pandemia de COVID-19)
mostró una correlación entre el contenido de NET y la gravedad de la neumonía adquirida
en la comunidad [ 92 ]. La lesión pulmonar aguda (ALI) y el SDRA de diversas etiologías
se acompañan de NETosis excesiva (ver revisión [ 93]). Los NET en estas patologías
pueden estar involucrados en el daño del epitelio alveolar y el endotelio. La EPOC, que
generalmente se asocia con el tabaquismo y la contaminación del aire, y el asma
"neutrofílica" grave también se caracterizan por la acumulación de NET en el esputo y el
lavado de las vías respiratorias [ 94 ] . La infección por rinovirus en pacientes con asma
aumentó significativamente el contenido de NET [ 95 ]. En el asma, la formación de
trampas que contienen cromatina también puede ocurrir debido a la muerte de los
eosinófilos, que es similar a la NETosis [ 96 ].
La infección respiratoria aguda grave COVID-19 (enfermedad por coronavirus-19), que
estalló en diciembre de 2019 en la ciudad china de Wuhan y posteriormente se convirtió en
una pandemia, ha afectado hasta ahora a más de 15 millones de personas de 250 países. La
enfermedad fue causada por un nuevo coronavirus llamado SARS-CoV-2 (síndrome
respiratorio agudo severo coronavirus2) y estuvo acompañada de neumonía viral que a
menudo progresaba a SDRA y falla multiorgánica. Los niveles elevados de neutrófilos en la
sangre indican la gravedad de la enfermedad y un mal pronóstico [ 97 ]. El examen de los
pacientes infectados con SARS-CoV-2 reveló un aumento en el nivel de marcadores de
NETosis (ADN libre de células, complejos MPO-ADN e histona H3 citrulinada) y el
marcador de muerte celular: lactato deshidrogenasa [ 98]. La concentración de ADN libre
de células se correlacionó con el contenido de neutrófilos, proteína C reactiva (marcador de
la fase aguda de la inflamación) y el dímero D (marcador de trombosis). Suero de los
pacientes con NETosis inducida por COVID-19 en la sangre de donantes sanos en el
sistema in vitro . Una de las manifestaciones de la COVID-19 es el síndrome de Kawasaki,
vasculitis que se presenta en niños, que se acompaña de NETosis excesiva [ 99 ]. La
NETosis en COVID-19 puede ser causada por células epiteliales y endoteliales afectadas
por el virus, por plaquetas activadas y por citoquinas inflamatorias. Al mismo tiempo, la
NETosis excesiva está involucrada en el desarrollo de la "tormenta de citoquinas" y la
trombosis, que son los principales indicadores del curso severo de COVID-19 [ 100 ].
NETosis y enfermedades autoinmunes. Muchos componentes de NET, en particular, el
ADN de doble cadena, las proteínas granulares y las histonas, pueden estimular la
producción de anticuerpos y el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Por primera vez,
se estudió en detalle la participación de NETosis en la patogénesis de enfermedades
autoinmunes para el lupus eritematoso sistémico (ver revisión [ 101 ]). Una forma especial
de granulocitos llamados “granulocitos de baja densidad” aparece en la sangre durante esta
enfermedad. Estas células producen más citocinas inflamatorias (incluidos los interferones
de tipo I) y están más involucradas en NETotsis que los neutrófilos normales. Sus NET
contienen más autoantígenos y ADN mitocondrial oxidado [ 33], lo que los convierte en
inmunoestimulantes más potentes. Una de las peculiaridades de los granulocitos de baja
densidad es el aumento de la producción de ROS mitocondriales. Recientemente, se
demostró que el antioxidante MitoQ dirigido a las mitocondrias (similar en estructura a
SkQ1) suprimió la acumulación de NET y las manifestaciones patológicas en el modelo de
ratón con lupus eritematoso sistémico [ 102 ] .
En la artritis reumatoide (AR), el desarrollo de la patología se correlacionó con la
acumulación de marcadores de NETosis, como complejos de ADN-MPO y anticuerpos
contra histonas citrulinadas [ 103 , 104 ]. Además, se descubrió que los NET engullidos por
fibroblastos estimulaban la formación de anticuerpos contra histonas citrulinadas en el
modelo de AR [ 105 ]. Observaciones similares indican la participación de NETosis en
enfermedades autoinmunes, como la vasculitis asociada con "anticuerpos antineutrófilos"
(AAV), síndrome antifosfolípido, esclerosis múltiple y psoriasis (ver revisión
[ 106]). Curiosamente, en algunas enfermedades, la NETosis puede desempeñar un papel
antiinflamatorio. Por ejemplo, durante los ataques de gota, la NETosis inducida por
cristales de ácido úrico se acompaña de la liberación de enzimas líticas que descomponen
las citocinas proinflamatorias en los focos de inflamación. Se cree que la NETosis en la
gota previene el desarrollo de la enfermedad crónica [ 107 ].
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TERAPIA DE NETosis
Las evidencias de la implicación de la NETosis en diversas patologías han llevado a un
estudio y ensayo intensivos de varios enfoques terapéuticos. Un enfoque incluye el uso de
medicamentos que previenen la NETosis. Comprende una terapia anticitoquinas dirigida a
prevenir la acumulación de neutrófilos en los focos y su activación, así como la aplicación
de inhibidores de los componentes implicados en el programa NETosis: NE, PAD4 y
GSDMD. Otro enfoque se basa en la destrucción de las NET o en la atenuación de sus
efectos dañinos. La terapia con anticitoquinas dirigida contra IL-1β se usa ampliamente en
varias enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Uno de sus objetivos puede ser la
NETosis excesiva. La anakinra recombinanteLa proteína, un antagonista del receptor de
IL-1β, se encuentra actualmente en ensayos clínicos como una preparación potencial para
tratar COVID-19
([Link] los
inhibidores de NETosis, los ensayos de los inhibidores de NE son los que más han
progresado. El primero de estos, sivelestat , fue aprobado para el tratamiento del SDRA en
Japón y Corea del Sur, pero el metanálisis de los datos clínicos no confirmó su eficacia
[ 108 ]. La nueva generación de inhibidores de NE se encuentra actualmente solo en la
primera etapa de ensayos clínicos. Los inhibidores de GSDMD y PAD4 se encuentran en la
etapa preclínica de prueba. De gran interés es el uso de fármacos existentes para la
inhibición de NETosis. Entonces, disulfiram, que se utiliza para tratar el alcoholismo,
inhibe la activación de GSDMD y protege a los ratones en el modelo letal de sepsis
inducida por LPS [ 109 ]. Cabe señalar que GSDMD también es un componente crítico del
programa de piroptosis y los autores del estudio atribuyen su efecto a la prevención de la
piroptosis de macrófagos. Los experimentos in vitro han demostrado que los inhibidores de
microtúbulos pueden prevenir la NETosis [ 47 ]. Este grupo de medicamentos incluye la
colchicina , y los ensayos clínicos que prueban la eficacia de la colchicina contra el
COVID-19 están actualmente en curso
([Link]
).
Entre los fármacos destinados a destruir los TNE, la DNasa I y los anticuerpos antihistona
son los más estudiados. La ADNasa I recombinante se ha utilizado con éxito en casi todos
los modelos de patologías asociadas con NETosis. En particular, la introducción de DNase
I facilita significativamente el curso de ARDS [ 93 ] y EPOC [ 94 ] en modelos
animales. En pacientes con fibrosis quística, la inhalación de ADNasa mejoró la función
pulmonar y la elastasa de neutrófilos facilitó la disolución del esputo haciéndolo más
accesible para la ADNasa [ 110 ]. Los ensayos clínicos de ADNasa resistente a la actina
(PRX-110) pasan por la segunda fase y dan resultados alentadores
([Link] posible esperar que la
ADNasa no solo licue el esputo, sino que también interrumpa la progresión del SDRA,
como se observó en modelos experimentales con animales.
Nuestros experimentos con el antioxidante SkQ1 dirigido a las mitocondrias han
demostrado su eficacia potencial contra la NETosis [ 16 ]. En el modelo de ratón del
síndrome inflamatorio sistémico, SkQ1 evitó el efecto letal de la citoquina inflamatoria
TNF [ 111 ]. El antioxidante MitoQ, de estructura similar a SkQ1, suprimió la NETosis en
el modelo de ratón con lupus eritematoso sistémico [ 102 ]. Estos resultados sugieren que
pronto se crearán fármacos basados en antioxidantes dirigidos a las mitocondrias para tratar
enfermedades asociadas con la NETosis excesiva y, en particular, para combatir el COVID-
19.
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CONCLUSIÓ N
El programa para la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETosis) se está
estudiando ampliamente, sin embargo, quedan abiertas muchas preguntas sobre sus
mecanismos y su función fisiológica. En primer lugar, esto se refiere a los mecanismos de
señalización del inicio de NETosis. En particular, los procesos que conducen a la
modificación y descondensación de la cromatina siguen sin estar claros. Aún no se han
determinado los objetivos para la acción de mtROS y los detalles de la activación de la
NADPH oxidasa dependiente de mtROS. Se ha sugerido que la NETosis excesiva juega un
papel importante en la patogénesis de muchas enfermedades infecciosas, inflamatorias y
autoinmunes, pero no hay pruebas suficientes para respaldar esto. Un nuevo impulso para
estudiar el papel fisiopatológico de NETosis puede estar relacionado con su papel putativo
en la patogénesis de COVID-19. El desarrollo de nuevos fármacos que previenen la
NETosis,
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Agradecimientos
Los autores agradecen a los colaboradores O. Yu. Pletjushkina, II Galkin, SA Golyshev,
RA Zinovkin y AS Prikhodko (Instituto Belozersky de Biología Fisicoquímica,
Universidad Estatal Lomonosov de Moscú), quienes participaron en los estudios
experimentales sobre NETosis, desgranulación y explosión oxidativa en neutrófilos
humanos. Agradecemos a Vladimir Petrovich Skulachev, quien inició nuestro trabajo en el
campo de la mitocondriología, y felicitamos a nuestro querido maestro por el 85
aniversario.
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abreviaturas
SDRA síndrome de distrés respiratorio agudo
CGD enfermedad granulomatosa cronica
EPOC enfermedad pulmonar obstructiva crónica
GSDMD gasdermina D
LPS lipopolisacárido de la pared bacteriana
MPO mieloperoxidasa
mPTP poro de transición de permeabilidad mitocondrial no selectivo
nordeste elastasa de neutrófilos
redes Trampas extracelulares de neutrófilos
DCP muerte celular programada
PKC proteína quinasa C
AMP forbol-12-miristato-13-acetato
ROS especies de oxígeno reactivas
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