Uso de las enzimas en la producción de alimentos y forrajes
El consumo de azúcar en el mundo aumenta cada vez más. La remolacha
azucarera y la caña de azúcar requieren, sin embargo, las correspondientes
condiciones climáticas y una buena calidad del suelo para su desarrollo, y debe
añadirse la materia prima de inmediato a la cosecha para evitar pérdidas. El
almidón, el producto de almacenamiento natural de las plantas, puede
obtenerse de diferentes plantas (papas, cereales, mandioca, batatas), incluso
en áreas agrícolamente desfavorables, y se almacena perfectamente bien. A
partir del almidón se puede obtener azúcar (glucosa) con facilidad.
El almidón se degrada con el uso de amilasas. El producto final, la glucosa,
presenta sin embargo una deficiencia: tiene tres cuartas partes de la fuerza
edulcorante de la sacarosa. Para alcanzar el mismo efecto como edulcorante
que la sacarosa, se necesita más glucosa.
La fructosa (azúcar de la fruta) tiene alrededor de un 80% de efecto
edulcorante superior al de la sacarosa, y es el doble de dulce que la glucosa.
Ya que la fructosa es un isómero de la glucosa, es decir, tiene la misma
fórmula molecular (C6H12O6) y consta de los mismos atomos, la glucosa debería
convertirse en fructosa “sólo” químicamente y así podría doblarse el efecto
edulcorante.
Jarabe de fructosa
El proceso puramente químico de la isomerización de glucosa a fructosa con
catalizadores técnicos a altos valores de pH fue un fracaso. Se forman
productos colaterales coloreados oscuros y de mal sabor, cuya separación
sería demasiado cara.
En 1957 se descubrió la xilosa isomerasa, que aparte de xilosa a xilulosa
también puede isomerizar glucosa a fructosa. Puesto que la actividad colateral
representa una variante intersante económicamente, al enzima se denomina
hoy principalmente glucosa isomerasa. La glucosa isomerasa es una enzima
intracelular y se origina a partir de microorganismos diferentes, por ejemplo
de Streptomyces.
En 1960 se patentó en Estados Unidos el correspondiente proceso enzimático.
En 1966, unos investigadores japoneses en la ciudad de Chiba describieron un
proceso industrial que utiliza la glucosa isomerasa soluble. En el proceso de
isomerización de la glucosa se obtiene como producto una mezcla de glucosa y
fructosa. Esta mezcla puede usarse en lugar de la sacarosa cristalina como
jarabe, puesto que su capacidad edulcorante es muy grande.
En Estados Unidos, la Clinton Corn Procesing Company empezó en 1967 la
producción de jarabe de glucosa-fructosa mediante una glucosa isomerasa
soluble. Este jarabe contenía inicialmente, sin embargo, sólo un 15% de
fructosa. Además, pronto quedó claro que el proceso de la glucosa isomerasa
sólo puede ser rentable económicamente sólo si se utiliza de nuevo la cara
enzima. Por surte, la glucosa isomerasa es una enzima ideal para la
inmovilización. Es estable a altas temperaturas, y puesto que tanto el sustrato
(glucosa) como el producto (fructosa) son moléculas muy pequeñas, hay pocos
problemas de difusión si la enzima inmovilizada se empaqueta en columnas.
Las moléculas de glucosa y fructosa no llevan carga eléctrica, por lo que la
glucosa isomerasa podría unirse a un derivado de celulosa cargado como
material portador; de lo contrario, el sustrato y el producto “permanecerían
pegados" electrostáticamente al portador.
En 1968 la Clinton Corn Procesing Company llevó a cabo un proceso
discontinuo con una enzima inmovilizada, que liberó un 42% de fructosa. En
1972 consiguió desarrollar un sistema que trabaja continuamente con glucosa
isomerasa inmovilizada.
Esta próspera solución tecnológica por sí sola no bastaba, sin embargo, para el
reconocimiento del procedimiento era decisiva la situación del mercado.
En los años 1960 el precio del azúcar era de 15 a 20 centavos por kilogramo.
El jarabe de fructosa no podía producirse más barato en ningún caso. En ese
momento prevalecían también las desventajas del proceso enzimático. Además
de la fuerza de los prejuicios, era importante un acercamiento a la industria: se
tuvo que desarrollar un sistema complicado de filtros de presión y un aparato
para la separación del metal pesado cobalto, que se utilizó como estabilizador
de la enzima.
Pero en noviembre de 1974 aumentó el precio del azúcar a 1 dólar y 25
centavos el kilogramo. El proceso de la isomerasa se hizo muy atractivo de la
noche a la mañana. Al mismo tiempo, la compañía danesa Novo Industry A/S
inmovilizó un preparado de glucosa isomerasa que era más batato, sin adición
de cobalto y soportando la presión en grandes reactores industriales, por lo que
no era nada raro encontrarlos en columnas de siete metros de altura.
En 1976, solamente en Estados Unidos se produjeron 750 t de glucosa
isomerasa y con ellas 800000 t de jarabe de fructosa al 42%. Puesto que el
precio del azúcar a finales de 1976 cayó de nuevo a 15 centavos por kilogramo,
se estableció y se impulsó el nuevo proceso ya exitoso. El jarabe de fructosa al
42% se produjo a precios menores que la sacarosa. En 1978 se dio otro paso
adelante. Mediante los nuevos procedimientos de separación se obtuvo un
jarabe de fructosa al 55%. Era solamente un 15 a 25% más caro que el jarabe
al 42%. Para bebidas ácidas, como la Coca-Cola (valor de pH de 4.0), fue
necesario un jarabe con al menos un 55% de fructosa para remplazar a la
sacarosa. Con ello tuvo éxito en un mercado importante el aumento masivo del
jarabe de fructosa.
Actualmente, la producción mundial asciende a aproximadamente 100000
toneladas de glucosa isomerasa al año. Se producen nueve a diez millones de
toneladas de jarabe de fructosa. En Estados Unidos se prefiere utilizar jarabe
de fructosa en las bebidas. La glucosa isomerasa hoy se obtiene e inmoviliza
sobre todo a partir de Streptomyces. Para ello se presentan principalmente las
células bacterianas muertas, que aun está completamente intacta. A menudo
se conectan unas con otras en una red mediante glutaraldialdehído y así se
estabiliza.
Enormemente interesante es la fructosa para productores de alimentos: se
capta más rápido que otros azucares y por tanto es ideal para bebidas
deportivas. Aumenta el sabor a fruta y también a chocolate, y enmascara el
gusto amargo de las sustancias sustitutas del azúcar. La fructosa reduce el
punto de congelación en los helados y así los hace más blandos, más
cremosos y agradablemente “sabrosos”. De acuerdo con las pruebas clínicas,
los diabéticos pueden controlar su nivel de glucosa mucho mejor con alimentos
que contienen fructosa que con los que contienen sacarosa o almidón.
La fructosa la usa el hígado en su mayor parte independientemente de la
insulina. La fructosa es, pues, un importante alimento dietético. Debido a su
elevada fuerza edulcorante aporta menos calorías que el azúcar (sacarosa).
El azúcar de la fruta enriquecido se produce en Europa a partir del almidón
mediante la degradación con amilasas y una conversión final con glucosa
isomerasa. Alternativamente, se puede partir de la sacarosa: por hidrólisis
ácida o fragmentación con la enzima invertasa origina azúcar invertido, o sea
fructosa más glucosa. La glucosa menos dulce e indeseada para los diabéticos
se separa por cromatografía.
Los gastos totales de la aplicación de la glucosa isomerasa inmovilizada son un
40% menores que con la enzima soluble.
Proceso de obtención de fructosa a partir de almidón
Alimentos y forrajes con enzimas inmovilizadas
El ejemplo de la glucosa isomerasa ha mostrado que mediante enzimas
inmovilizadas se pueden producir grandes cantidades de productos a bajo
costo. Otra posibilidad para las enzimas inmovilizadas, la producción eficaz de
productos de alta calidad en pequeñas cantidades, la presenta la penicilina
acilasa, que cataliza los cambios adecuados en la molécula de penicilina.
Los aminoácidos como la lisina y la metionina no pueden sintetizarse en los no
rumiantes, por ejemplo humanos, pollos y cerdos, o sólo puede hacerse con
insuficiente velocidad, y deben proporcionarse con la alimentación; por ello se
denominan esenciales (indispensables). La necesidad de aminoácidos
esenciales como adición al forraje y para fines médicos (soluciones de
inyección) aumenta rápidamente. Hoy se empiezan a utilizar los métodos
fermentativos y químicos para la fabricación industrial de L-aminoácidos, en
lugar del aislamiento convencional de hidrolizados de proteína. Los
aminoácidos sintetizados químicamente son, sin embargo, mezclas ópticas
inactivas (racematos) de isómeros D y L. Sólo la forma L óptica (excepción:
metionina) es fisiológicamente activa, y sólo ésta es útil en medicina, para
deportistas y forraje.
Ichiro Chibata y su grupo desarrollaron en Japón un proceso en el cual el
racemato de acetil-D,L-aminoácidos producido químicamente se separa
enzimáticamente en los L-aminoácidos y los acetil-D-aminoácidos no
hidrolizados. Los L-aminoácidos deseados se separaron fácilmente, debido a
su solubilidad reducida, de los D-aminoácidos acetilados. Los D-aminoácidos
no deseados se utilizaron de nuevo para la síntesis química del racemato. Al
principio, este proceso se realizó con aminoacilasa soluble de riñón o
de Aspergillus oryzae, pero no podía recuperarse la enzima.
Para determinados fines (por ejemplo para soluciones de inyección que
contienen aminoácidos) las “impurezas enzimáticas” se tuvieron que separar de
nuevo, con dificultad, para evitar las reacciones inmunitarias de defensa en los
pacientes. Esto condujo a pérdidas del rendimiento y gastos adicionales. La
inmovilización se ofreció como una salida. Se une entonces la enzima de modo
sencillo y barato mediante adsorción (fijación) a un portador (bolas de DEAE-
celulosa). Es muy estable, en 65 días su actividad disminuye sólo a la mitad. La
empresa Tanabe Seiyaku, de Osaka, había utilizado con ello por primera vez
una enzima inmovilizada industrialmente.
El primer proceso industrial (1969, Tanabe Seiyaku, Japón) con enzimas inmovilizadas: conversión química
de acetil-D,L-aminoácido, mediante aminoacilasa, en el fisiológicamente activo L-aminoácido (difícilmente
soluble, cristalizado) y el inactivo acetil-D-aminoácido, que puede transferirse de nuevo térmica o
químicamente a la forma de partida (mezcla de forma D y L). En el correspondiente proceso se utiliza el
material crudo completo.
Desde 1969 se produjeron industrialmente con este procedimiento los
aminoácidos L-fenilalanina, L-valina y L-alanina.
Los gastos totales del proceso inmovilizando la aminoacilasa se encuentran
aproximadamente un 40% por debajo que con la enzima soluble. Puesto que el
proceso está ampliamente automatizado se ahorran los gastos de personal, los
gastos del catalizador son menores y el rendimiento de la producción es
superior. Con ello se muestra claramente la superioridad del uso de la forma
inmovilizada.
Esta superioridad no se pudo lograr con el uso de otras enzimas. Así, desde
hace ya más de 20 años se utiliza la glucoamilasa soluble industrialmente.
Hubo muchos intentos satisfactorios para la inmovilizar glucoamilasa.
Finalmente, sin embargo –a pesar de las ventajas que tiene técnicamente una
enzima inmovilizada- la forma inmovilizada no compitió con la soluble, porque
es fácil obtener glucoamilasa soluble y, por lo tanto, es barata, puede utilizarse
sin problemas técnicos y el proceso se puede optimizar al máximo. Con lactasa
soluble o inmovilizada se produce leche exenta de lactosa, fácilmente digerible.
Otra enzima soluble se utiliza actualmente cada vez más para la elaboración de
forraje: la fitasa. La fitasa fragmenta los grupos fosfato del fitato en los granos
de forraje, y así ayuda a disminuir la costosa adición de fosfato y la eliminación
de fosfato de cerdos y pollos, lo cual resulta mucho mejor para el medio
ambiente.
Diferencias en la alimentación del ganado con y sin fitasa
Materiales y Métodos
Aislamiento de almidón
El plátano de la variedad macho en estado fisiológico maduro fue adquirido en la
central de abasto de Cuautla, Morelos. Se utilizó el método de extracción propuesto
por Flores-Gorosquieta et al. (2004), procedimiento que consiste en molienda de la
pulpa, tamizado, centrifugado y secado, para la obtención del almidón en polvo.
Licuefacción del almidón de plátano
Se siguió el método utilizado por Flores-Gorosquieta (2003), utilizando un reactor
de 20 litros. Se preparó una suspensión de almidón de plátano en agua destilada al
20% (p/v), se ajustó el pH a 7,3 y se gelatinizó a 80°C por 10min. Se disminuyó la
temperatura a 70°C, se adicionó a-amilasa (Starzyme TE, actividad de 8,430µg
maltosa/min) de ENMEX®, México, al 0,06% (v/v) y se dejó reaccionar por 3h, para
posteriormente inactivar la enzima con HCl 0,1N (pH 2,0). A continuación se
centrifugó a 1700rpm a fin de separar el almidón no hidrolizado.
Sacarificación del almidón
Una vez separado el almidón no hidrolizado, se sometió al sobrenadante a una
temperatura de 60°C y el pH fue ajustado a 4,5 con HCl 0,1N o con NaOH 0,1N. Se
adicionó 0,15% (v/v) de amiloglucosidasa (Starzyme TE, actividad de 13,385µg
maltosa/min) de ENMEX®, México y se dejó reaccionar por 6h (Bello-Pérez et al.,
2002). Al jarabe de glucosa obtenido se le determinó la dextrosa equivalente (DE)
empleando el método de Pancoast y Junk (1980). En este paso se realizó una
estandarización del método para la obtención de un jarabe con una DE de 80
utilizando un reactor de 20 litros.
Obtención de jarabe fructosado
Antes de llevar a cabo la isomerización del jarabe de glucosa obtenido de la
sacarificación del almidón de plátano, se procedió a realizar el proceso de
isomerización utilizando glucosa anhidra, con el objeto de verificar la funcionalidad
del reactor. Para ello se trabajó un total de 168h, tiempo durante el cual la
concentración de fructosa fue variable, lo que indicó que existía inestabilidad en el
sistema. Factores como el pH pueden alterar la actividad y la estabilidad de la
enzima (Mishra y Debnath, 2002) y en consecuencia causar variaciones en la
concentración de fructosa durante el proceso continuo. Para comprobar esta
hipótesis se corrió un segundo proceso de isomerización por 48h, monitoreando el
pH en el reservorio del sustrato, el cual cambió de 7,5 a 8,14, indicando que el
regulador de carbonato no estaba funcionando. Se procedió entonces a cambiar el
regulador que contiene el sustrato de la reacción, eligiéndose a partir de la
literatura (Kumakura et al., 1979; Zhou et al., 1992; Ge et al., 1999; Bandlish et
al., 2002) un regulador de fosfatos y se realizó una prueba de isomerización
durante la cual la concentración de fructosa en el efluente se mantuvo constante en
179mg·ml-1 por un total de 28h. Sin embargo, el uso de este regulador provocó que
precipitaran cristales de color blanco en el reactor y después de un tiempo se
obliteró por el exceso de precipitado.
A partir de estos datos se encontró que el control del pH del sustrato es clave para
el proceso de isomerización y que el regulador de fosfato permite controlar el pH en
forma adecuada, pero después de un tiempo oblitera el reactor haciendo imposible
el flujo del sustrato. Se decidió entonces volver a utilizar el regulador de carbonato
monitoreando y controlando el pH del sustrato. Los resultados mostraron que la
concentración de fructosa fue constante (205mg·ml-1) a la salida del reactor por
88h y se obtuvo una conversión del 45,7%. Una vez realizada esta caracterización
del sistema y conociendo las condiciones de trabajo se procedió a realizar la
isomerización del jarabe de glucosa obtenido a partir del almidón de plátano.
La obtención del jarabe fructosado se realizó a 60ºC, en un reactor de columna con
camisa para control de temperatura, con una relación 1:20 (diámetro:altura) y se
usaron 2,0g de enzima glucosa izomerasa (Sweetzyme IT®, Bagsvaerd, Denmark)
con actividad de 160 IGIU/g, donde IGIU son las siglas de immobilized glucose
isomerase units (Bandlish et al., 2002). Para activar la enzima se siguió el
procedimiento descrito por Novozymes (2002). Se pesaron 2,0g de enzima en un
vaso de precipitado de 100ml, se adicionaron 40ml de sustrato de glucosa anhidra
al 45% (p/v) preparado bajo las condiciones de Novozymes; pH 7,5 ajustado con
H2SO4 0,5M y NaOH 1M; 1g·l-1 MgSO47H2O; 0,18g·l-1 Na2S2O5; 0,21g·l-1 Na2CO3), se
dejó reaccionar por 1h agitándose cada 5min, durante los primeros 15min y
después con intervalos de 15min. Posteriormente se vertió la enzima en el reactor.
A continuación se alimentó de forma continua el reactor con el jarabe de glucosa
obtenido a partir del almidón de plátano (también preparado bajo las condiciones
de Novozymes), para lo que se empleó una bomba peristáltica (Master Flex C/L,
modelo 77120-62, Barrington, IL, EEUU) a una velocidad de flujo de 0,8ml/min
(Bandlish et al., 2002) y se mantuvo constante el pH (7,55) con un controlador
digital (Modelo pH 7615, B&C Electronics, Italia). La concentración de fructosa se
determinó por el método de Ting (1956) y fue monitoreada mediante un programa
basado en tomar muestras a diferentes intervalos de tiempos.
Color y estabilidad de color en el jarabe de fructosa
El color y la estabilidad del color se determinaron de acuerdo al método reportado
por Pancoast y Junk (1980). El color de los jarabes usualmente se reporta en
unidades de densidad óptica (UDO) que se calculan con la fórmula