Microbiología General
Seminario Nro. 2
Microscopía
1er Cuatrimestre 2023
Esquema de la Clase
Microscopía, conceptos generales, tipos de
microscopios ópticos, microscopios
electrónicos
Tinciones, tipos de colorantes, tinciones
simples y diferenciales, preparación de
extendidos
Importancia de la Microscopía para observar el mundo microbiano
Repasar “la vision de lo muy pequeño” del capitulo 2 del Brock
¿Cómo funciona un microscopio ?
El funcionamiento del microscopio óptico se basa en un sistema de lentes, que
de forma simplificada se asemeja a una sistema de lupas.
El microscopio óptico más común hoy en día es el microscopio óptico
compuesto. Este microscopio combina al menos dos juegos de lentes,
el objetivo y el ocular. Por detrás de la muestra hay una lámpara cuya luz
atraviesa la muestra y forma una imagen en el objetivo que es ampliada y
proyectada hacia el ocular. El funcionamiento del objetivo podría asimilarse al
funcionamiento de la lente de un proyector de cine y la forma en la que se
proyecta la imagen sobre la pantalla.
¿Y como funciona una lente?
Para entender eso primero veamos que pasa cuando la luz
atraviesa un prisma
Haz de Luz
Ahora pensemos que una lente está compuesta por un
conjunto de prismas
Cuando la luz atraviesa una lente convexa (lupa por ejemplo), es
curvada por el vidrio. Nuestros ojos perciben esa luz curvada como si
viéramos un objeto más grande, aunque el tamaño del objeto no
haya cambiado. Ocular
Objetivo
Si ahora pensáramos en usar una segunda lupa sobre la primera,
tendríamos el esquema básico de un microscopio. Donde la primer
lupa (primer lente) se llama objetivo y la segunda lupa (segundo
lente) se llama Ocular.
Ahora que sabemos el fundamento
básico de un microscopio vamos a
repasar un poco de su historia…
Ya en la antigüedad se sabía que los espejos curvos y las esferas de
cristal llenas de agua aumentaban el tamaño de las imágenes. En
las primeras décadas del siglo XVII se iniciaron experiencias con
lentes (así llamadas por tener forma de lentejas) a fin de lograr el
mayor aumento posible.
Gerd Bining y
Hinrch Bining y
Anton Van Frits
Zacharias Jenssen RoherZernike Roher
Leewenhoek Zernike
Primer microscopio Microscopio simple, pero Microscopio de Contraste de Microscopio efecto Microscopio de
óptico con lentes de mejor calidad fases túnel Fuerza Atómica
1590 1655 1674 1830 1930 1932 1937 1955 1981 1985
Robert Hooke Ernst Ruska y Manfred Von Marvin Minsky
Max Knall Ardenne
Microscopio compuesto
(dos lentes)
Microscopio Microscopio electrónico de Microscopio Confocal
electrónico barrido
Para mas informacion consultar:
Historia del microscopio y su
repercusión en la Microbiología. Rev
Hum Med. 2015, vol.15, n.2 Breve linea de tiempo de la microscopia
Microscopio Óptico
Ocular
Cabezal Revolver
Objetivos
Brazo Ajuste de
la platina
Macrométrico Platina
Micrométrico Condensador
Fuente de
luz
Base Regulador de la fuente de luz
Como vemos en este esquema un microscopio óptico de rutina es algo mas complejo
que los que presentamos al inicio y consta de tres lentes, el ocular el objetivo y el
condensador.
Microscopio óptico de campo claro
Como habíamos mencionado al principio, la luz que pasa o no a través de una
muestra y llega a nuestro ojos es lo que nos permite construir un imagen
microscópica que luego percibimos con nuestro ojo. Por lo tanto para terminar de
comprender como funciona un microscopio óptico compuesto es importante
prestar atención al camino que recorre la luz hasta llegar a nuestro ojo y tener
presente que cuanto mas luz captemos mejor será la imagen que podremos
construir
Para caracterizar cuan buena es una imagen
Se utilizan dos conceptos
Aumento
Resolución
Aumento
Una imagen se puede amplificar infinitamente pero eso no significa que la pueda
observar bien, para poder ver un imagen en forma defina además del aumento
debo tener en cuenta el poder de resolución
Aumento + Poder de Resolucion
Aumento: Cuanto se aplifica una imagen
AUMENTO TOTAL = Aumento del objetivo x Aumento del ocular
1000 = 100X x 10X
Poder de Resolución (R): Cuan buena es la imagen
Distancia mínima entre dos puntos para que estos
sean vistos como dos objetos individuales.
Al tratarse de la distancia mínima, cuanto mas pequeña sea esa
distancia mayor el poder de resolución.
Depende de la cantidad y energía de luz que es capaz de captar
el lente
Mas luz o luz con mas energía Mayor poder de resolución menor R
¿Cómo Mejorar el poder de Resolucion ?
Previamente habíamos mencionada que para construir un imagen es
necesario luz por lo tanto para mejorar el poder de resolución
debemos aumentar la luz que índice sobre la muestra y que luego es
captada por el lente.
El valor de nos permite cuantificar
cuanta luz es capaz de captar un lente.
Cuanto mayor sea el angulo mas luz sera
captada por el lente
Lente objetivo
a b
Muestra
Fuente de Luz
El lente b capta mas luz y por lo tanto tiene mayor
lo que permite imagenes con mayor resolusion
Apertura numérica
Máxima AN (teórica)
AN = n x seno (alfa)
n= índice de refracción
Alfa () es el ángulo de luz que
capta el lente
n = 1 y alfa = 90° entonces
AN = 1
En la práctica AN = 0.95
(ángulo 72 °)
¿Uso del condensador?
Los microscopios ópticos
compuestos tiene un tercer lente
llamado condensador debajo de
la muestra para permitir que
mas luz llegue a la muestra y de
ese modo mejorar el poder de
resolución
Condensador
¿Uso de aceite de inmersión ?
El uso de aceite de inmersión
entre el lente objetivo y la
muestra, evita que los rayos de
luz refracten al pasar del vidrio al
aire ya tiene un índice de
refracción semejante al vidrio
Apertura numérica
Máxima AN (teórica)
En objetivos de inmersión:
n = 1.51
y alfa = 90°
entonces NA = 1.51
En la práctica NA = 1.25
Como calcular el poder de resolución (R) :
Distancia mínima entre dos puntos para que estos
sean vistos como dos objetos individuales
Longitud de onda de la fuente de Luz
R = λ
2 x AN
Apertura numérica
Es un medida de la cantidad de luz que
es capaz de captar el lente
R = 550 nm = 220 nm
2 x 1.25 Dos objetos que estén a mas 220 nm (0.22 m)
De van a observar como dos objetos separados
Como calcular el poder de resolución (R) :
¿Que pasa si hacemos el mismo calculo para un
objetivo 4X?
R = 550 nm = 2750 nm
2 x 0.10
Dos objetos que estén a mas 2750 nm (2.75 m)
De van a observar como dos objetos separados
Tipos de Microscopio Óptico que veremos a
continuación:
Microscopio de Campo Claro
Microscopio de Campo Obscuro
Microscopio de Contraste de fases
Microscopio de Fluorescencia
Campo claro Contraste de fases Campo Oscuro
Microscopía de campo claro vs obscuro
Campo claro Campo Oscuro
Luz
dispersada
Microscopía de contraste de fases
Funciona de forma similar a un microscopio convencional pero incluye
algunos elementos adicionales que le permiten detectar los cambios en las
fases de las ondas
Permite observar microorganismo vivos (sin teñir) y seguir eventos
dinámicos en células vivas (migración, división, etc.)
Campo claro Contraste de fases Campo Oscuro
Microscopía de Interferencia Diferencial (Nomarski)
Aprovecha los efectos de interferencia entre las ondas que
atraviesan la célula, para crear una imagen de la
estructura celular viva, nítida y tridimensional
Célula epitelial de mejilla humana
Campo Claro Nomarski Campo Oscuro
Microscopía de fluorescencia
Microscopía de fluorescencia
Sensibilidad! Mediante
fluorocromos permite detectar
la presencia de moléculas en
baja cantidad (DNA, proteínas)
Microscopía Confocal
Capacidad de obtener la imagen en secciones (planos)
controlando la profundidad del espécimen.
Elimina el background !
Microscopía Confocal
vs
Microscopía de fluorescencia
Fluorescencia
Pierde detalle
por alta señal
de emisión
Confocal Las
secciones plano
por plano
permiten
evidenciar
diferencias en
estructuras
Microscopía electrónica
Microscopio Óptico Microscopio electrónico
Microscopio electrónico de barrido
de transmisión
Microscopio
electrónico de
transmisión
Microscopio
electrónico de
barrido
Microscopio de fuerza atómica
Microscopio de túnel de barrido
(tunneling)
Cuando una punta conductora es colocada muy cerca de la superficie a ser
examinada, una corriente de polarización (diferencia de voltaje) aplicada entre
las dos puede permitir a los electrones pasar al otro lado mediante efecto túnel
a través del vacío entre ellas. La resultante corriente de tunelización es una
función de la posición de la punta
Microbiología General
Seminario Nro. 2
Microscopia
1er Cuatrimestre 2022
Esquema de la Clase
Microscopia, conceptos generales, tipos de
microscopios ópticos, microscopios electrónicos
Tinciones, tipos de colorantes, tinciones simples
y diferenciales, preparación de extendidos
Cultivo Solido Cultivo líquido
[Link] una gota
de agua Ansa
2. Agregar una Ansa
ansada de cultivo
solido
Agregar una
ansada de Preparación
cultivo liquido
de un
Con un ansa Con un ansa extendido
esteril esteril
extender el extender el
preparado preparado
Dejar secar al aire
Tinción simple Morfología Bacteriana
Dejar secar al aire
Para observar la morfologia de
diferentes bacterias de importancia clinica ver el
link: [Link]
Tinción negativa
(procedimiento)
Agregar una ansada
de cultivo liquido
Adicionar unas gotas
de nigrosina
Utilizando otro
portaobjetos
extender la
mezcla
Dejar secar al aire
Tinción de Gram
Tinción desarrollada en por el bacteriólogo
danés Christian Gram en 1844. Sobre la base
de su reacción a la tinción de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, gram
positivas y gram negativas
Christian Gram
Tinción de Gram
(procedimiento)
Gram +
Gram -
Tinción de bacilos acido alcohol resistentes (BAAR)
Tinción de Ziehl - Neelsen
Se basa en que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen
ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90
átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol resistentes o
BAAR.
Franz Ziehl Friedrich Neelsen
El género Mycobacterium, incluido en esta clasificación (BAAR), comprende
especies patógenas para el hombre y animales.
M. tuberculosis M. leprae
Tinción de bacilos acido alcohol resistentes (BAAR)
Tinción de Ziehl - Neelsen
No acido alchol
resistente
acido alchol
resistente
Agregar el colorante Aplicar calor para Decolorar con Agregar el colorante
primario que el colorante Alcohol acido secundario
(Carbol Fuccina) entre en las celulas (Etanhol : HCl) Azul de Metileno
Celulas
epiteliales
acido alchol
resistente
No acido alchol
resistente
Tinción de esporas
Estructura muy resistente y
refractaria a los colorantes
Para ello se aplica calor
Presencia y posición y morfología
Tinción de
Esporas
Técnica Schaeffer-
Fulton
Aplicar verde de Malaquita Remover el exeso de
en calor durante 10 min colorante con agua
Aplicar el colorante Remover el exeso de
secundario (Safranina) e colorante con agua
incubar 5 min
Dejar secar al aire
Tinción de
Esporas
Técnica de
Preparar un tuvo Dorner
con carbol fuccina
Agregar un ansada
de cultivo
Incubar al calor Colocar unas gotas de nigrosina en un
durante 10 min portobjetos y agregar la preparacion
con carbolfuccina
Extender la muestra de la misma
forma que para la tincion negativa
Dejar secar al aire
Tinción de Capsula
Capsula
Estructura lábil
Calor
Aplicar Cristal Violeta e Lavar suavemente con
incubar 5 – 10 min Sulfato de cobre
Tinción de
Dejar secar al aire
Cápsula
Tinción con naranja de acridina
Coloración vital
El naranja de acridina ha sido empleado como colorante
vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo está vivo y roja si está muerto.
1. Extender la muestra
en un portaobjetos Celulas metabolicamente
Celulas
metabolicamente Inactivas
2. Agregar naranja de activas
acridina e incubar 5 min
Fijar
3. Lavar el exeso de
colorante suavente con agua
Este colorante por interaccionar con el ADN es
altamente mutagénico
Tinción de motilidad
Esta tinción sirve para evaluar capacidad de un microorganismo de moverse en
un medio liquido. Es importante al momento de la observación discriminar entre
el movimiento browniano (de un solido en solución) respecto de la motilidad
bacteriana impulsada por uno o mas flagelos.
Cubreobjetos Cultivo liquido
Microorganismo Montaje Húmedo
vivo
Sin coloración o con un colorante diluido
(Cristal violeta 1/50)