Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.

C - 51

TRABAJO PRÁCTICO N° 6: FERTILIZANTES BIOLÓGICOS: DESARROLLO

Y CONTROL DE CALIDAD DE INOCULANTES

Objetivos:
• Conocer los parámetros para la selección de cepas.
• Conocer las metodologías y procedimientos microbiológicos para la
evaluación y control de los inoculantes más utilizados en la actualidad.
• Adquirir habilidades y/o destrezas para la evaluación de la inoculación a
campo.
• Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para
fomentar una eficiente labor grupal.

INTRODUCCIÓN

El uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura

ocasiona graves problemas de contaminación, ya que no todo el fertilizante que
se aplica lo aprovecha la planta, sino que una cantidad importante acaba en
aguas superficiales y subterráneas. En este sentido, una alternativa para
disminuir la utilización de fertilizantes químicos puede ser la utilización de
microorganismos con fijación biológica de nitrógeno (FBN), ya que además de
no poseer riesgo de contaminación ambiental, su efecto está fuertemente
sincronizado con los requerimientos de la planta y generalmente son de menor
costo.

En general, se estima que alrededor del 50 % de un fertilizante

nitrogenado cuando es aplicado a los cultivos es absorbido por las plantas y el
otro 50 % o más es almacenado en el suelo para la nutrición de los cultivos
subsiguientes; pero una gran parte de este es transformado en nitrógeno
atmosférico mediante los procesos de denitrificación y otra gran parte es
lixiviado a capas inferiores donde produce contaminación de las aguas
subterráneas y el manto freático en forma de nitrato (NO3-).

Los procesos naturales de FBN juegan un importante rol en la activación

de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. La
contribución de la FBN al ciclo global del nitrógeno es importante, presentando
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 52

un balance con el proceso de denitrificación. Algunos de los compuestos de

nitrógeno gaseoso originados por denitrificación juntamente con el CO2,
producen el efecto invernadero causante en gran medida del calentamiento
global.

Por lo tanto, el incremento de FBN en el suelo, puede mitigar la

necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente
efecto benéfico al ciclo de nitrógeno, el calentamiento global y el saneamiento
de las aguas subterráneas y superficiales. Este proceso depende básicamente
de la acción de los microorganismos en conjunto con las plantas (interacción
microorganismo-planta).

Fertilizantes biológicos (inoculantes)

La legislación argentina define como fertilizantes biológicos a los

productos que contienen uno o varios microorganismos como principal
componente sobre un determinado soporte sólido, líquido u oleoso. Estos
productos están formulados con microorganismos viables benéficos,
seleccionados para favorecer la nutrición y/o promover el crecimiento de las
plantas. La calidad de un inoculante está definida en principio por la eficiencia
de la cepa presente en el producto, que debe ser escogida en base a un
riguroso proceso de selección de cepas en diferentes condiciones
agroecológicas. En segundo lugar, dependerá de la formulación del inoculante,
la que deberá garantizar el número mínimo de células viables desde su
elaboración y hasta el periodo de vencimiento en condiciones de
almacenamiento determinados y durante el periodo de vida útil o tiempo de
vigencia establecido por los entes de fiscalización. En general, el periodo de
validez de los inoculantes está condicionado principalmente por las
características del soporte y el mismo va desde los 6 hasta los 18 meses.

Si bien, en nuestro país y en el mundo se ha despertado gran interés en

el uso de microorganismos como los Rizobios para fabricar inoculantes, otros
microorganismos como Pseudomonas y Azospirillum, también son utilizados
como inoculantes. Ese interés ha ido acompañado del desarrollo de productos
microbianos de calidad obteniendo resultados favorables en las investigaciones
y ensayos realizados que provocaron que se incremente en los últimos años su
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 53

producción y utilización, en especial como tratamientos a la semilla previos a la

siembra.

Clasificación de los inoculantes

En general, los inoculantes pueden clasificarse según:

- El soporte: puede ser: a) líquido (acuosos con o sin turba en suspensión y

oleosos) o b) sólido (generalmente turba). El soporte constituye la mayor
proporción o volumen del inoculante y su función es la de nutrir y proteger a los
microorganismos frente a factores adversos, durante el periodo que transcurre
desde su elaboración hasta su uso en los sistemas de producción. Los
soportes deben ser capaces de mantener elevadas las concentraciones de
microorganismos viables, sin producir alteraciones en sus propiedades
fisiológicas durante periodos de almacenamiento prolongados. Además, deben
proveer los elementos imprescindibles para la vida de las bacterias (alimento,
oxígeno y humedad), evitar la competencia con otros organismos y no poseer
sustancias tóxicas que alteren a las bacterias.

- La cantidad de cepas con las que estén formulados: Los inoculantes

efectivos pueden integrarse con una sola cepa (inoculantes monocepa), o
pueden contener varias cepas (inoculantes multicepa).

Cualidades de un inoculante efectivo:

- Deberá contener microorganismos seleccionadas por su capacidad para fijar

grandes cantidades de nitrógeno.

- Los microorganismos utilizados deberán ser específicos para el cultivo a

tratar.

- Los microorganismos deben estar adaptados a las condiciones ambientales

del lugar del cultivo.

- Que los microorganismos estén presentes en número adecuado (1 x 10 9

bacterias/g o mL de inoculante a la fecha de fabricación y 1 x 107 bacterias/g o
mL de inoculante a la fecha de vencimiento). Ley Nº 20466/80.

- Presentar un soporte que debe proteger al microorganismo, debe ser fácil de

aplicar y adherirse bien a la semilla.
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 54

- No deben poseer contaminantes, es decir, deben estar libre de otras bacterias

que puedan ser perjudiciales a los microorganismos, al ambiente o a la planta.

- Debe estar envasado para proteger a los microorganismos hasta que sea
usado por el productor. Para ello, el envase debe permitir el intercambio de
gases y la retención de la humedad.

- Que el envase provea instrucciones claras y una lista de las especies con las
cuales nodula efectivamente.

- El nombre y dirección del fabricante deben estar impresos en el paquete.

Recomendaciones al comprar un inoculante:

- Observar que el envase cuenta con la siguiente información: a) nombre del

cultivo para el cual es efectivo (nombre común y científico); b) nombre científico
de las especies de microorganismos que contiene el inoculante; c) número de
microorganismos viables por gramo o mL de soporte al momento del
vencimiento y d) fecha de vencimiento, número de lote, instrucciones de uso y
peso neto del inoculante.

- Observar las características del envase (permeable al oxígeno, cámara de

aire, no presentar daño, etc.)

- Controlar la fecha de vencimiento ya que es un producto perecedero.

- Controlar que no esté formulado (mezclado) con productos químicos

(curasemillas o insecticidas).

- Observar las condiciones de comercialización (cadena de frío).

 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 55

Desarrollo de un inoculante para leguminosas

1º etapa: selección de cepas

Antes de comenzar con la preparación, deben elegirse cepas infectivas,

específicas y efectivas para el cultivo a inocular. Estas pueden provenir de
colecciones de cultivos especializadas o pueden aislarse a partir de plantas
bien noduladas (Fig. 1). En el caso de realizar los aislamientos a partir de
nódulos, se seleccionan los nódulos turgentes y se los desinfecta para eliminar
los contaminantes del suelo. Luego, los nódulos son macerados en agua estéril
(liberando los bacteroides a la solución) y posteriormente se procede a la
siembra por estriado en cajas de Petri con medio Y.E.M. (yeast extract
medium) diferencial para el crecimiento de rizobios, con el objetivo de obtener
colonias aisladas (cepas).

Figura 1. Esquema de aislamiento de rizobios a partir de nódulos de plantas

leguminosas.
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 56

Las cepas seleccionadas deben ser buenas competidoras con respecto

a las cepas nativas o naturalizadas y deben estar seleccionadas para las
condiciones agroecológicas de la zona o región donde se desarrollarán las
plantas o los hospedantes para los cuales se recomienda. Estas cepas deberán
poseer habilidad para sobrevivir y multiplicarse en el suelo, y sobrevivir en la
semilla. La primera etapa de la selección de cepas se realiza en cámaras de
cultivo en el laboratorio (Fig. 2), en las cuales las cepas que se desean
comparar se prueban en macetas. Para ello, se realizan dos tipos de ensayos:

- Ensayos de infectividad: en los cuales se realiza la preselección de las

mejores estirpes, evaluando la nodulación. Esta queda determinada por la
cantidad de nódulos que producen, ubicación, tamaño y calidad al corte (color
rojo) y actividad fijadora de nitrógeno. Dichas observaciones se realizan en
distintos momentos del ciclo del cultivo, generalmente a los 30 y 60 días, y se
relacionan con su crecimiento y aspecto vegetativo. Con este paso se realiza la
preselección de las cepas de mayor capacidad de nodulación, para luego
realizar una evaluación más compleja del sistema simbiótico.

- Ensayos de efectividad: las cepas elegidas se evalúan en un ambiente

óptimo (cámara de cultivo), con el fin de que desarrollen toda su capacidad
potencial de fijación. Las variables que se evalúan en este caso son
nodulación, materia seca, % de nitrógeno, etc., y por diferencia con los testigos
se puede obtener la cantidad aproximada de nitrógeno que fija una cepa.

La etapa final de selección se realiza a campo. Consiste en realizar

ensayos con las cepas más destacadas de las etapas anteriores a las cuales
se somete a las condiciones que se quieren seleccionar. Este tipo de ensayos
debe repetirse por lo menos tres años con el objeto de contemplar las
variaciones climáticas. Para evaluar los resultados se consideran los
parámetros nodulación, peso seco de nódulos, % de nitrógeno, rendimiento en
grano, entre otros.
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 57

Figura 2. Ensayo tipo para selección de cepas de leguminosas.

En el país el IMYZA (INTA-CASTELAR) dispone de una selección de

150 cepas de Bradhyrizobium japonicum (para soja) evaluadas por su
eficiencia para distintas condiciones de suelo, clima y variedad. Este instituto
realiza ensayos en invernáculos, realizando pruebas a campo con las cepas de
mayor eficiencia. De los ensayos allí realizados surgen las recomendaciones
de cepas altamente eficientes para ser empleadas por los fabricantes de
inoculantes nacionales e incluso de otros países.

2º etapa: preparación del cultivo a nivel industrial

En este caso, el primer paso consiste en el desarrollo y crecimiento de la cepa

elegida a pequeña escala (cultivo de iniciación o starter) para posteriormente
inocular el biodigestor (cultivo a nivel industrial).

a) Cultivo de iniciación o pie de cuba: se prepara medio de cultivo Y.E.M.

líquido estéril (cultivo de iniciación). La cantidad de mL de medio de cultivo a
preparar dependerá de la escala a la que se trabaje (por ej: 500 mL de medio
de cultivo Y.E.M. líquido para un biodigestor de 25 mL o 50 mL para un
biodigestor de 2,5 L). Luego, se inocula el medio de cultivo con la cepa elegida
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 58

(conservada en pico de flauta), se coloca el cultivo en un agitador (para

asegurar la aireación del medio) y se incuba a 28-30ºC por 3 o 4 días.

Posteriormente, se controla la viabilidad y pureza del cultivo. Para ello, se

realiza el recuento de microorganismos en medio Y.E.M. sólido y coloraciones
Gram para determinar pureza de la cepa.

b) Siembra en el biodigestor: el cultivo de iniciación o starter previamente

controlado se siembra en el biodigestor representando un 2% del volumen a
inocular (por ej 500 mL se utilizan para inocular un fermentador de 25 litros de
volumen total). El biodigestor es un recipiente destinado a la multiplicación y
desarrollo de cultivos de microorganismos a gran escala. Los biodigestores
pueden ser de vidrio (usados en producciones de escala más pequeña) o
grandes cubas de acero inoxidable con gran capacidad. Dentro de estos
biodigestores encontramos medio de cultivo Asbhy estéril (la diferencia con el
medio Y.E.M., radica en que posee una fuente de carbono menos eficiente
pero más económica para la multiplicación a gran escala de rizobios). El
biodigestor se inocula con el cultivo de iniciación y se pone en funcionamiento
(presenta un mecanismo de aireación que favorece la disolución de oxígeno).
Luego de 3 o 4 días los microorganismos se desarrollan durante la incubación y
se obtiene el producto cuando llegan a una concentración de: 10 9 células de
rizobios por mL. Nuevamente, en esta etapa se controla la viabilidad y pureza
del cultivo (recuento en medio Y.E.M. sólido y coloraciones Gram para
determinar pureza de la cepa) (Fig. 3).
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 59

Figura 3. Producción de inoculantes

Control de calidad de inoculantes

Como todo producto biológico, los inoculantes pueden perder rápidamente su

calidad por variaciones o mutaciones de los cultivos, presentar pérdida de
viabilidad por no poseer el número adecuado de rizobios o por una inadecuada
preservación del producto una vez que este se encuentra en el mercado.

Metodología para el control de calidad de inoculantes de Bradirhizobium

japonicum para cultivo de soja

Si el inoculante es sólido:

- Sanitizar el envase con alcohol 70%.

- Homogeneizar el envase mediante agitación manual (durante 30 segundos).

- En forma aséptica abrir el envase, extraer y pesar 10 gramos de producto en

forma aséptica y colocarlos en 90 mL de solución salina estéril
(suspensión/dilución: 1/10).

- Mezclar con agitador por 15 a 20 minutos.

- En forma aséptica extraer 1 mL de la suspensión/dilución con pipeta estéril

bajo llama de mechero o cámara de flujo laminar.

- Realizar diluciones al décimo con solución salina estéril.

- Sembrar por triplicado y mediante el método de inmersión (sólo se siembran

las últimas tres diluciones: 10-6, 10-7 y 10-8).
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 60

- Verter el medio de cultivo diferencial (Y.E.M. con rojo Congo) previamente

fundido (a una temperatura de aproximadamente 45-50ºC para evitar la muerte
de microorganismos).

- Dejar solidificar e incubar las placas en estufa a 28-30ºC por 7 días.

- Realizar la lectura a los 7 días y verificar a los 10 días.

- Se cuentan las placas que presenten entre 30 y 300 colonias. Las colonias
típicas de Bradirhizobium japonicum son normalmente blancas y circulares si
crecen sobre el agar y de forma lenticular si se encuentran embebidas en el
mismo (Fig. 4).

Figura 4. Siembra de un inocúlate sólido.

 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 61

Si el inoculante es líquido:

- Sanitizar el envase con alcohol 70%.

- Homogeneizar el envase mediante agitación manual (durante 30 segundos).

- En forma aséptica abrir el envase y extraer 1 mL de inoculante líquido con

pipeta estéril bajo llama de mechero o cámara de flujo laminar.

- Realizar diluciones al décimo con solución salina estéril.

- Continuar como indica el protocolo para inoculante sólido (Fig. 5).

Figura 5. Siembra de un inocúlate líquido.

 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 62

Técnicas de inoculación a campo

Inocular consiste en contactar la semilla con el inoculante. Las técnicas más

recomendadas son las que utilizan métodos húmedos ya que permiten mayor
adherencia de las bacterias al tegumento de la semilla.

El inoculante debe diluirse antes de su aplicación para que pueda ser

distribuido de manera homogénea en todas las semillas. El volumen total de
líquido (agua + inoculante + curasemilla) para la dilución depende del tamaño
de las semillas; en función de ello se recomienda:

 semillas grandes: hasta 2,4 litros cada 100 kg de semilla (soja: 900
mL/100 kg, ya que el exceso de humedad provoca ruptura de
tegumentos)
 semillas chicas: hasta 4 litros cada 100 kg de semillas (alfalfa 1000
mL/100 kg)

En la dilución, puede utilizarse agua azucarada al 10%, para disminuir la

mortandad de rizobios durante la desecación de las semillas. La mezcla puede
realizarse en hormigonera, inoculadora o directamente en la tolva de la
sembradora.

Existen distintas técnicas de inoculación:

- Sobre la semilla: se denomina inoculación directa cuando sólo se le

aplica el inoculante y pelleteado cuando además del inoculante, se
aplican otros compuestos con la finalidad de proteger las bacterias y/o
las semillas (por ej. CaCO3). Se recomienda realizar esta operación
inmediatamente antes de la siembra para asegurar la viabilidad de los
microorganismos; además es frecuente la aplicación de curasemillas
durante la misma operación, lo que puede afectar la efectividad del
inoculante.
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 63

- En el surco: el inoculante se “chorrea” en el fondo del surco previo a la

siembra. Generalmente, la siembra e inoculación se realizan en una sola
operación, a tal fin se equipan las máquinas sembradoras con sistemas
que permitan distribuir el inoculante diluido, preferentemente en el fondo
del surco, antes que caiga la semilla.

Recomendaciones generales para inocular a campo

- Realizar la inoculación a la sombra.

- Inocular la cantidad necesaria para un día de siembra.

- Si debe aplicar curasemillas, realice la mezcla de ambos productos

respetando el volumen de agua y sembrar inmediatamente.

- No conservar el inoculante mezclado con el curasemillas durante mucho

tiempo.

- No usar herramientas o recipientes que hayan estado en contacto con

combustibles o pesticidas.

- Si durante la operación se aplica también inoculante, deben respetarse las

normas de manejo seguro de agroquímicos:

• Leer atentamente el marbete del producto antes de su utilización y

proceder según lo indicado en el mismo.
• Utilizar ropa de protección: guantes y overol o ropa cubierta, para evitar
el contacto dermal con el agroquímico.
• Utilizar respirador o barbijo, para proteger boca y nariz.
• Preparar la mezcla al aire libre y lejos de viviendas.
• No ingerir alimentos ni tocar boca o rostro durante la operación.
• No colocar agroquímicos en botellas de bebida, ni utilizar éstas para
realizar la mezcla.
• Realizar el triple lavado de los envases vacíos (no liberar el agua de
lavado a cursos de agua), perforarlos y disponerlos en sitios autorizados.
• Finalizada la operación, se recomienda lavar manos y brazos con
abundante agua y jabón.
 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 64

TRABAJO DE LABORATORIO

Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades:

1. Aislamiento de rizobios y visualización de bacteroides a partir de

nódulos de leguminosas.

Trabajando en condiciones de asepsia, realizar el aislamiento de rizobios a

partir de 2 plantas leguminosas noduladas.

Procedimiento:

- Cortar las raíces de plantas noduladas.

- Lavar las raíces con cuidado y sin romper los nódulos.

- Extraer de 5 a 10 nódulos turgentes

- Desinfectar los nódulos extraídos con agua oxigenada durante 5 minutos.

- Enjuagar los nódulos con agua destilada estéril.

- Macerar los nódulos extraídos en 2 mL de agua destilada estéril.

- Realizar estrías en medio Y.E.M. e incubar durante 7 días a 28- 30°C.

- A partir del macerado realizar una coloración de Gram.

- Visualizar el carácter Gram y la forma de los bacteroides.

2. Control de inoculantes para soja.

- Trabajando en condiciones de asepsia, realizar la siembra de 2 inoculantes

para soja.

- Realizar diluciones al décimo (1/10) en solución salina estéril.

- Sembrar 1 mL de las últimas tres diluciones mediante el método de inmersión

o embebido en cajas de Petri estériles. Verter en cada placa unos 20 mL de
medio Y.E.M. previamente fundido y atemperado a 45- 50 °C.

- Incubar durante 7 días a 28- 30°C.

3. Análisis de calidad de inoculante

- Observar el crecimiento en cajas de Petri.