II.

Técnicas Espectroscópicas
II.4.B Espectroscopía UV-Visible: Luminiscencia
II.4.B.1 Fundamentos de la Luminiscencia
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
II.4.B.4 Aplicaciones
II.4.B.1 Fundamentos de Luminiscencia
 La luminiscencia es la emisión de radiación por parte de una especie que ha
sido excitada utilizando radiación o mediante una reacción química.
 Si la fuente de excitación es una reacción química, el proceso de emisión de
radiación se denomina quimioluminiscencia.
 Si la fuente de excitación es la absorción de radiación, el proceso de emisión de
radiación se denomina fotoluminiscencia. Hay dos tipos de fotoluminiscencia:
fluorescencia y fosforescencia.
 La fluorescencia es un proceso de emisión de radiación en el que no cambia la
multiplicidad de espín de la especie emisora. Sucede a una velocidad mayor que la
fosforescencia debido a que las transiciones que conservan la multiplicidad de
espín están permitidas por las reglas de selección.
 La fosforescencia es un proceso de emisión de radiación que implica un cambio en
la multiplicidad de espín de la especie emisora. Sucede a una velocidad menor que
la fluorescencia ya que las transiciones que implican cambio de multiplicidad de
espín están prohibidas por las reglas de selección.
II.4.B.1 Fundamentos de Luminiscencia
 La medición de la intensidad de luminiscencia permite determinar cuantitativamente
trazas de un conjunto amplio de especies orgánicas e inorgánicas importantes.
 Tiene dos ventajas importantes para el análisis:
 Altísima sensibilidad, con límites de detección que son de uno a tres órdenes de magnitud más
bajos que los métodos de absorción. Muy útil para la determinación de trazas.
 Amplios intervalos de linealidad, significativamente mayores que los de los métodos de
absorción.
 Desventajas:
 No todas las especies son capaces de emitir luminiscencia.
 La luminiscencia depende fuertemente del entorno: disolvente, presencia de otros solutos,
condiciones fisicoquímicas de la muestra (densidad, temperatura).
 La desactivación de la luminiscencia es fácil y frecuente. Necesidad de procurar condiciones
óptimas para evitar la desactivación.
 Los métodos de absorción se emplean con mayor frecuencia porque la cantidad de
especies que absorben en el UV/Vis es mucho mayor que las especies capaces de
emitir luminiscencia tras dicha absorción.
II.4.B.2 Procesos de
desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 El diagrama de Jablonski es una
representación gráfica, esquemática
y sintética de los procesos que
pueden ocurrir en una molécula tras
su excitación.
 Representa, por tanto, los diferentes
caminos que una molécula puede
recorrer en su vuelta al estado
fundamental.
 Una molécula siempre optará por el
camino más rápido posible hacia el
estado fundamental. Tendrán
prevalencia, por tanto, aquellos
procesos que posean más
velocidad.
II.4.B.2 Procesos de
desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 La velocidad de los distintos procesos
depende de muchos factores que se
pueden agrupar en:
 Factores estructurales o
intramoleculares (rigidez o flexibilidad
de la estructura de la molécula,
presencia de determinados sustituyentes,
etc.).
 Factores externos o intermoleculares
(disolvente, otros solutos, temperatura,
densidad, colisiones intermoleculares,
etc.)
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
Diagrama de Jablonski
 Antes de ver el diagrama de Jablonski y los distintos procesos que tienen lugar, debemos recordar un
concepto ya conocido: la multiplicidad de espín.
 Salvo contadas excepciones, el estado fundamental de la mayoría de las moléculas es un estado
singlete (suma de los espines igual a cero).
 Los estados excitados suelen ser tanto singletes como tripletes (suma de los espines igual a uno).
 En la figura se muestra esquemáticamente el estado fundamental singlete (a), el primer estado
excitado singlete (b), y el primer estado excitado triplete (c).
 Nótese que el primer estado excitado triplete es más estable que el primer estado excitado singlete.
Es lo que ocurre en la mayoría de las moléculas.
 Es determinante para la espectroscopía de
fotoluminiscencia la ley que establece que:
 las transiciones que implican un
cambio de multiplicidad de espín
están prohibidas mientras que las
que la conservan están permitidas.
 Las transiciones prohibidas no quiere decir
que no se produzcan, sino que son mucho
menos probables. Dicho de otro modo,
ocurren mucho más lentamente que las
permitidas.
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 Proceso de Absorción: es el proceso más rápido de todos (su velocidad es de 1014
– 1015 s-1). Antes de iluminar la muestra todas las moléculas se encuentran en su
estado electrónico fundamental S0. Al llegar la radiación de excitación
(habitualmente UV) a la muestra, cada fotón que se encuentre con una molécula
será absorbido por ella, empleándose su energía en el tránsito a un nivel
electrónico excitado (S1, S2). Dentro del nivel electrónico excitado la molécula
puede llegar a cualquiera de sus niveles vibracionales.
 Relajación vibracional: la molécula, una vez excitada a un nivel vibracional
cualquiera de un estado electrónico excitado, enseguida empieza a relajarse
vibracionalmente mediante colisiones con otras moléculas excitadas, solutos y
solvente o mediante energía cinética. Es un proceso muy rápido y eficaz, siendo su
velocidad de 1012 s-1. Es el proceso más rápido después de la absorción, por eso
todas las moléculas excitadas llegan al estado vibracional más bajo del primer
estado electrónico excitado antes de caer al estado electrónico fundamental. De
manera que la fluorescencia y los demás procesos de desactivación final se
producen siempre desde el estado vibracional más bajo del estado electrónico
excitado de más baja energía.
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 Proceso de Fluorescencia: una vez que la molécula ha alcanzado el estado vibracional
más bajo del estado electrónico excitado singlete más bajo (S1), lo más rápido es que
ocurra la transición directa a cualquiera de los estados vibracionales del estado
electrónico fundamental (S0). Se emitirán distintos fotones (muy próximos en frecuencia)
uno por cada tránsito a cada nivel vibracional distinto del estado electrónico
fundamental S0. Habitualmente, esas líneas no se resuelven en el espectro electrónico
experimental (están muy próximas entre sí), sino que se observa como una banda. Es la
banda de emisión fluorescente.
 Dado que los saltos desde el nivel vibracional más bajo del estado electrónico excitado
S1 a cualquiera de los niveles vibracionales del estado electrónico fundamental S0 son
menos energéticos que los saltos que se han producido en la absorción-excitación,
aparecerán a longitudes de onda mayores (menos energéticas). Este desplazamiento de
la banda de emisión respecto a la de absorción se conoce como desplazamiento
Stokes. Sólo hay una coincidencia entre ambas bandas, y es la que tiene lugar en el
pico de resonancia (transiciones entre el nivel vibracional más bajo del estado
fundamental y el nivel correspondiente del estado excitado).
 Un pico de resonancia se da cuando se emite un fotón de la misma energía que un
fotón absorbido en el proceso de excitación.
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión

Los picos de la banda

Los picos de la banda de
de fluorescencia
absorción muestran los
muestran los niveles
niveles vibracionales del
vibracionales del
estado electrónico
estado electrónico
excitado.
fundamental.

Superposición de banda
de fluorescencia y de
absorción a la longitud de
onda de resonancia

Desplazamiento de la
banda de fluorescencia
respecto a la banda de
absorción (excitación)
Superposición de banda de emisión
y de absorción a la longitud de
onda de resonancia
Despazamiento
Stokes
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 Conversión interna: son los procesos intramoleculares por los cuales la molécula
excitada cambia de estado electrónico conservando la multiplicidad de espín, y
sin emitir radiación. Es particularmente eficaz y rápido cuando los niveles de
energía electrónicos están lo suficientemente próximos como para que haya
coincidencia o superposición de los niveles de energía vibracional. (Véase la
figura).
 Conviene destacar que es más rápida y probable la conversión interna a través de
niveles vibracionales coincidentes (S2 a S1) que la pérdida de energía por
fluorescencia a partir de un estado excitado superior (S2 a S0).
 Obsérvese en el espectro de excitación-emisión de una solución de quinina, que
aunque la molécula admite dos bandas de excitación (que corresponden a las
transiciones S0 a S2 y S0 a S1), sólo presenta una banda de emisión fluorescente
(que corresponde al tránsito S1-S0). No aparece emisión de S2 a S0. Lo cual
confirma lo dicho en el párrafo anterior.
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 Cruce entre sistemas: es igual que el proceso de conversión interna salvo que
implica un cambio en la multiplicidad de espín. El cruce más común es del estado
singlete al triplete (S1 a T1, y T1 a S0 ).
 Como sucedía en los procesos de conversión interna, la probabilidad de que ocurra
el cruce entre sistema aumenta si los niveles vibracionales de los dos estados se
superponen. (véase la figura).
 Los átomos pesados (como el yodo o el bromo) aumentan la interacción espín-
orbital y facilitan que se produzca el cambio de espín que requiere el cruce entre
sistemas. Este fenómeno es conocido como efecto del átomo pesado.
 La presencia de especies paramagnéticas (es decir especies cuyo estado
fundamental es triplete como por ejemplo el oxígeno molecular) en disolución
ayuda también al cruce entre sistemas.
 El cruce entre sistemas compite con la fluorescencia. Su velocidad oscila entre
104 y 1012 s-1. Para que ocurra la fluorescencia en lugar del cruce es necesario que
la velocidad de la fluorescencia sea mayor.
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 Conversión externa: Es la transferencia de energía de la molécula excitada a
elementos de su entorno. Lo habitual es que estas pérdidas de energía se deban
a la interacción entre la molécula excitada y el solvente u otros solutos (colisiones
intermoleculares).
 En la figura formaría parte de la transición NO radiante del estado S1 al S0 o del
T1 al S0.
 Este proceso se hace evidente al observar el enorme efecto que ejerce el solvente
en la intensidad de fluorescencia. Las condiciones que reducen las colisiones
intermoleculares (baja temperatura y elevada viscosidad) aumentan la
fluorescencia.

 Para poder lograr una alta intensidad fluorescente hay que evitar en la medida
de lo posible los procesos que compiten con la emisión fluorescente: conversión
interna, externa, y cruce entre sistemas. Como son procesos que contribuyen a
devolver la molécula excitada al estado fundamental sin emitir radiación
fluorescente se les llama procesos de desactivación.
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 Otros procesos de desactivación molecular que compiten con la fluorescencia son la
predisociación y la disociación.
 La predisociación ocurre del siguiente modo: la molécula es excitada a un estado
electrónico superior (pongamos como ejemplo el estado S2). En el proceso de
relajación se produce una conversión interna al estado S1, pero de manera que cae
en un estado vibracional excitado del estado S1 tan energético que es capaz de
romper un enlace de la molécula, desactivándola e impidiendo que emita
fluorescencia. La energía se perdería en la rotura del enlace.
 La disociación: en este caso la excitación por absorción de luz conduce
directamente a un estado excitado capaz de romper un enlace molecular,
ocasionando así la desactivación de la molécula de modo similar al caso anterior.
 Debido a estos fenómenos se intenta evitar el empleo de radiación de excitación
de longitud de onda menor de 250 nm, ya que sería lo suficientemente energética
como para desencadenar la desactivación de los estados excitados por disociación
o predisociación.
II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
 Diagrama de Jablonski
 Fosforescencia: Ocurre sólo tras un cruce entre sistemas. La molécula excitada
después del cruce acaba relajándose al nivel vibracional más bajo del estado
triplete excitado (T1). Si se produce la transición directa de dicho estado T1 al
estado fundamental S0, se emite radiación que es conocida como emisión
fosforescente o simplemente fosforescencia.
 La transición T1 a S0 está prohibida y por eso es el proceso más lento de todos los
que se producen tras la excitación. Su velocidad oscila entre 104 y 0.1 s-1.
 Dado que la molécula se puede desactivar por procesos de cruce entre sistemas o
conversión externa (que son mucho más rápidos que la fosforescencia), el único
modo de obtener fosforescencia es a temperaturas bajas, en medios altamente
viscosos o protegiendo de alguna manera el estado triplete de la desactivación.
 Por último, como el estado triplete T1 está a más baja energía que el singlete S1, la
transición T1-S0 emitirá radiación de menor energía que la transición S1-S0, y por
tanto la banda de emisión fosforescente aparecerá a longitudes de onda mayores
que la fluorescente.
Ejemplo de moléculas fluorescentes
 II.4.B.2 Procesos de desactivación y emisión
estados singlete excitados
5 estados de
3
S2 2
1
Relajación energía
0
vibracional (RV) vibracional
Conversión interna (CI) (10-14-10-12 s) Cruce entre
5
3 sistemas (CES)
estado
S1 2
1 RV (10-4-10-12 s) triplete excitado
5
0
3
CI (10-14-10-12 s)

2 T1
fluorescencia
(10-5-10-10 s) RV
(10-14-10-15 s)

1
(10-5-10-7 s)
Conversión

quenching
absorción

externa /

hnabs hnem

hnem
5
3
S0 2
1 RV
0
estado fundamental
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Lo dos factores principales que determinan que una molécula sea o no
luminiscente y su intensidad de emisión son la estructura molecular y el entorno
químico-físico.
 Vamos a tratar de ver como afectan algunas de estas variables.
 Definimos en primer lugar el concepto de rendimiento cuántico (F) de la fluorescencia
como el cociente entre el número de moléculas que producen fluorescencia y el
número total de moléculas que han sido excitadas. moléculas fluorescencia
=
moléculasexcitadas
 El número de moléculas que interviene en cada proceso de emisión o desactivación
depende de la velocidad de dicho proceso (los procesos más rápidos son seguidos por
un número mayor de moléculas). Por tanto, podemos expresar el rendimiento cuántico en
función de las constantes de velocidad de los procesos: k : fluorescencia
f
kces: cruce entre sistemas
kf kci: conversión interna
=
k f + k ces + k ci + k ce + k pd + k d kce: conversión externa
kpd: predisociación
kd: disociación
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Si el rendimiento cuántico es de 1, quiere decir que todas las moléculas excitadas emiten
fluorescencia. Si es de 0, quiere decir que ninguna de las moléculas excitadas emite
fluorescencia. Los rendimientos intermedios, quieren decir que compiten varios procesos
entre sí.
kf
=
k f + k ces + k ci + k ce + k pd + k d
 kf, kci, kpd y kd dependen sobre todo de la estructura de la molécula. En cambio, kces y
kce dependen además (fuertemente) del entorno en el que se encuentra la molécula.
 Para obtener alta intensidad de fluorescencia (más sensibilidad en la medida) debemos
eliminar o reducir la velocidad de los procesos que compiten con la fluorescencia.
 Los procesos de disociación y predisociación se evitan usando longitudes de onda de
excitación mayores de 250 nm (esto excluye las transiciones s-s*). Empleando las
transiciones n-p* y p-p*, evitamos generalmente los procesos relacionados con la
disociación.
 Además, se conoce experimentalmente que la fluorescencia se da sobre todo en las
transiciones p-p*. Por tanto, en general, a la hora de hablar de emisión fluorescente de
moléculas orgánicas estamos tratando principalmente con transiciones de tipo p-p*.
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con la estructura de la molécula
 Sustitución de átomos pesados. La influencia de la sustitución de halógenos es
sorprendente. La fluorescencia disminuye rápidamente con la masa molar del halógeno
(efecto de átomo pesado), el cual aumenta la probabilidad del cruce entre sistemas
(kces) y disminuye el rendimiento cuántico de la fluorescencia. Si se quisiera potenciar
la fosforescencia, el efecto del átomo pesado favorecería el cruce entre sistemas y por
tanto la fosforescencia.

Compuesto Fórmula lem Intensidad

Benceno C6H6 270-310 10
Fluorobenceno C6H5F 270-320 10
Clorobenceno C6H5Cl 275-345 7
Bromobenceno C6H5Br 290-380 5
Yodobenceno C6H5I - 0
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con la estructura de la molécula
 Rigidez estructural. La fluorescencia se ve favorecida en moléculas que poseen
estructuras rígidas.
 Ejemplo. Los rendimientos cuánticos del fluoreno y el bifenilo son de 1.0 y 0.2
respectivamente. Se debe a la mayor rigidez estructural del fluoreno.

 La falta de rigidez de una molécula aumenta la velocidad de procesos de conversión

interna (kci) (procesos en que se disipa energía sin emitir radiación) y por tanto aumenta
la probabilidad de desactivación sin radiación.
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con el entorno químico-físico
 Efecto de la viscosidad. Al aumentar la viscosidad de un medio se reduce la
probabilidad de colisiones intermoleculares (porque se reduce el movimiento de
traslación molecular) y por tanto se reduce la velocidad de desactivación por
conversión externa (kce). Eso hace que aumente el rendimiento cuántico de la
fluorescencia.

 Efecto de la temperatura. Al aumentar la temperatura aumenta la probabilidad de

colisiones intermoleculares y por tanto aumenta la velocidad de desactivación por
conversión externa (kce). Eso hace que disminuye el rendimiento cuántico de la
fluorescencia.

 Efecto de la presencia de átomos pesados o especies paramagnéticas. Si en el medio

en el que se encuentra la molécula están presentes dichas especies, aumenta la
probabilidad del cruce entre sistemas y por tanto aumenta la velocidad de dicho
proceso (kces) y disminuye el rendimiento cuántico de la fluorescencia.
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con el entorno químico-físico
 Efecto de la polaridad del disolvente. La polaridad del disolvente suele estabilizar el
estado excitado desde el que se produce la emisión fluorescente, y desestabilizar el estado
fundamental al que llega la molécula tras emitir fluorescencia, de manera que la transición
entre ellos se hace menos energética, y la longitud de onda se hace mayor (se desplaza hacia
el rojo).
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
Ejemplo de efecto de la polaridad del disolvente
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con el entorno químico-físico
 Procesos de supresión. Una de las posibles vías de desactivación molecular por conversión
externa se denomina supresión o amortiguamiento (quenching). Es la transferencia de
energía de un modo no radiante desde una especie excitada hacia otras moléculas
(compite con la fluorescencia). Conforme crece el proceso de desactivación respecto al de
fluorescencia se va apagando (quenching) la intensidad de fluorescencia
 La sustancia que sustrae la energía de la molécula excitada se llama agente supresor
(quencher, Q).
 Como dicha transferencia implica contacto entre la molécula excitada y el agente
supresor, la viscosidad y la temperatura jugaran un papel en este proceso. La viscosidad
disminuye el quenching y la temperatura lo aumenta.
 Obviamente, la velocidad del quenching dependerá también de modo directo de la
concentración del agente supresor (Q).
 Por tanto, si existe un agente supresor, la conversión externa se deberá principalmente a
dicho agente y la velocidad de conversión externa se puede expresar directamente
como:

k ce = k q Q
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con el entorno químico-físico
 Procesos de supresión.
 Si estamos empleado longitudes de onda de excitación mayores de 250 nm (lo habitual en
fluorescencia), no habrá procesos de desactivación por disociación. Y en ausencia de agentes
supresores no habrá procesos de conversión externa importantes. En estas circunstancias la
expresión del rendimiento cuántico se puede simplificar a:
kf
 0f =
k f + k ces + k ci
 Si hay un agente supresor, el factor de conversión externa se incluiría como k ce = k q Q
kf
f =
k f + k ces + k ci + k q Q

 Si dividimos el rendimiento cuántico sin agente supresor entre el rendimiento con agente
supresor, quedaría:
k f + k ces + k ci + k q Q
kf
 0f k f + kces + kci
= =
 f k + k +k kf + k Q  k f + k ces + k ci
f ces ci q

 0f k f + k ces + k ci kq
== + Q
f k f + k ces + k ci k f + k ces + k ci
 0f
= 1 + K q Q
f
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con el entorno químico-físico
 Procesos de supresión.
 Es la conocida como ecuación de Stern-Volmer:
 0f
= 1 + K q Q
f
 Dado que la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional al rendimiento
cuántico, podemos utilizar directamente intensidad de fluorescencia F en lugar de rendimiento
cuántico y la ecuación continúa siendo cierta:

F0
= 1 + K q Q
F
 Donde F0 y F son las intensidades de fluorescencia en ausencia y en presencia de agente
supresor respectivamente. Al representar dicho cociente frente a la concentración de agente
supresor se obtiene una línea recta donde la ordenada en el origen es 1 y la pendiente es la
constante de Stern-Volmer Kq.
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con el entorno químico-físico
Procesos de supresión. F0
= 1 + K q Q


La fluorescencia del sulfato de quinina es atenuada por altas concentraciones de ión

cloruro. Las siguientes señales de fluorescencia se observaron en función de la
concentración de ión cloruro.
Intensidad de fluorescencia, F [Cl-], M Determine la constante de
180.0 0.00 supresión (o de
87.5 0.005 quenching) del ión cloruro
para sulfato de quinina.
58.0 0.010
43.2 0.015
35.0 0.020
28.5 0.025
24.5 0.030
19.1 0.040
15.7 0.050
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
 Algunos fenómenos relacionados con el entorno químico-físico
 Procesos de supresión.

F F0/F C F0
180.0 1.00 0 = 1 + K q Q
F
87.5 2.06 0.005
58.0 3.10 0.01
43.2 4.17 0.015
35.0 5.14 0.02
28.5 6.32 0.025
24.5 7.35 0.03
19.1 9.42 0.04
15.7 11.46 0.05
II.4.B.3 Variables que afectan a la fluorescencia
II.4.B.4 Aplicaciones
 Esquema de un fluorímetro
 Un fluorímetro consta de los siguientes componentes:
 Fuente de excitación: fuente que proporciona la radiación de excitación que va a ser
absorbida por la muestra
 Monocromador de excitación: de todas las longitudes de onda que proporciona la fuente,
selecciona la banda a la que absorbe el analito. Se le llama longitud de onda de excitación
(lex).
 Cubeta de muestra: debe ser transparente en la región UV/Vis (cuarzo).
 Monocromador de emisión: para que se de una relación lineal entre la intensidad de
fluorescencia y la concentración, debemos escoger el máximo de la banda de emisión. A esa
longitud de onda se le llama longitud de onda de emisión (lem). Además a ese máximo la
sensibilidad es mayor porque la señal es mayor y la relación señal/ruido mejora. Para
seleccionar la longitud de onda que llega al detector se usa un segundo monocromador, cuya
función es seleccionar de entre todo el rango de emisión fluorescente, la longitud de onda del
máximo de emisión.
 Detector: situado a 90º de la dirección del haz de excitación para evitar que la luz de
excitación llegue al detector de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia se emite en
todas direcciones, por eso se puede medir a 90º. El detector suele ser un tubo
fotomultiplicador ya que la intensidad de fluorescencia es baja.
II.4.B.4 Aplicaciones
 Esquema de un fluorímetro

Filtro Monocromador
lex lem
II.4.B.4 Aplicaciones
 Relación fluorescencia-concentración
 La intensidad de fluorescencia (o potencia fluorescente) es directamente proporcional a
la cantidad de luz de excitación absorbida y al rendimiento cuántico de esa
absorción. A su vez La cantidad de luz absorbida será la diferencia entre la intensidad
de entrada y la de salida. Así quedaría: F = K  f ( I 0 - I )

I0

 K” es una constante de proporcionalidad que depende de cada

sistema, y el rendimiento cuántico también es una constante para
cada sistema concreto. Así que las podemos englobar en una
constante K’:
F = K ( I 0 - I )
II.4.B.4 Aplicaciones
 Relación fluorescencia-concentración
 Lo que se busca es poner en relación la intensidad de fluorescencia con la concentración
del analito fluorescente. Sabemos que, en los procesos de absorción de luz, la relación
entre la intensidad que sale y la original viene dada por la Ley de Beer:

I
T= = 10 - A = 10 -bC
I I0
I = I 0 10 -bC
I0
 Si sustituimos este valor de la intensidad de salida tras la absorción
en la ecuación anterior quedaría:
F = K ( I 0 - I )
F = K (I 0 - I 0 10 -bC )
F = K I 0 (1 - 10 -bC )
 No es la relación que buscábamos. Pero se puede desarrollar
un poco más.
II.4.B.4 Aplicaciones
 Relación fluorescencia-concentración
 Resulta que el término exponencial se puede desarrollar matemáticamente en serie y
quedaría:
F = K I 0 (1 - 10
-bC
)
 ( 2.303bC ) (2.303bC )
2 3

F = K I 0 2.303bC - + - 
I  2! 3! 
 Siempre que la absorbancia (A=bC) sea inferior a 0.05
I0 (disoluciones muy diluidas, concentraciones 10-5 a 10-7 M), se
pueden despreciar todos los términos salvo el primero, y el error
que se comete es de sólo 0.13%. Así podemos escribir:
F = K I 0 2.303bC
 Todos los términos que aparecen son constantes para cada
sistema menos la concentración. De manera que podemos
englobar todos los términos en una constante K y quedaría
simplemente: F = KC
II.4.B.4 Aplicaciones
 Relación fluorescencia-concentración
 Esta relación lineal entre la intensidad de fluorescencia y la concentración se pierde por
dos causas (absorción primaria y secundaria) y un mismo motivo (concentración
elevada).
 Si la concentración es tal que produce una absorbancia mayor de 0.05 entonces la
intensidad de fluorescencia cae respecto al comportamiento lineal. A esta absorción se
fluorescencia que hace que caiga su intensidad se le llama absorción primaria.
I
 Por otro lado, a elevadas concentraciones se produce la llamada
autoabsorción o absorción secundaria. La fluorescencia disminuye
porque la radiación emitida atraviesa la disolución y es absorbida I0
por otras moléculas en ella. La absorción secundaria puede ser
causada por el propio analito (si hay superposición de las bandas
de absorción y emisión) o por otros solutos presentes en la
disolución (cuya banda de absorción coincida con la banda de
emisión del analito). La absorbancia secundaria es despreciable
para concentraciones que producen absorbancias menores de 0.05.
II.4.B.4 Aplicaciones
+Zn2+
 Análisis de especies inorgánicas
 Las especies inorgánicas se pueden
determinar por fluorimetría de dos
modos:

 Formación directa de un quelato fluorescente entre

el ión y el agente quelatante, y medición de su
emisión.

F = KC
 Aplicación de ecuación de Stern-Volmer en
procesos de supresión en los que intervienen
aniones inorgánicos (Cl-, I-, etc).

F0
= 1 + K q Q
F
II.4.B.4 Aplicaciones
 Análisis de especies inorgánicas F = KC
Los volúmenes de una solución que contenía1.10 ppm de Zn2+ que se muestran en la tabla
se vaciaron con una pipeta en embudos de decantación que contenían cada uno de ellos
5 ml de una solución de cinc desconocida. Cada una de ellas fue extraída con tres
alícuotas de 5ml de CCl4 que contenía un exceso de 8-hidroxiquinolina. Los extractos se
diluyeron luego a 25 ml y se midió su fluorescencia con un fluorímetro. Los resultados
fueron:

Volumen de Intensidad de
Zn2+ patrón, ml fluorescencia
0.000 6.12 +Zn2+

4.00 11.16
8.00 15.68
12.00 20.64

Calcule la concentración de cinc en la muestra

II.4.B.4 Aplicaciones
 Análisis de especies inorgánicas F = KC
Los volúmenes de una solución que contenía1.10 ppm de Zn2+ que se muestran en la tabla
se vaciaron con una pipeta en embudos de decantación que contenían cada uno de ellos
5 ml de una solución de cinc desconocida. Cada una de ellas fue extraída con tres
alícuotas de 5ml de CCl4 que contenía un exceso de 8-hidroxiquinolina. Los extractos se
diluyeron luego a 25 ml y se midió su fluorescencia con un fluorímetro. Los resultados
fueron: Señal (intensidad relativa)
bC p0 6.188  1.10 ppm
C =
0
=
1.202ml -1  5ml
x
mVx
C x0 = 1.13 ppm

Vp (ml)
II.4.B.4 Aplicaciones
 Análisis de especies inorgánicas
II.4.B.4 Aplicaciones
 Aplicación a especies orgánicas
 La cantidad de aplicaciones de la fluorimetría en química orgánica es impresionante.
 Comprende sustancias muy importantes y muy diversas como: adenina, ácido antranílico,
hidrocarburos aromáticos policíclicos, cisteína, guanina, isoniacida, naftoles, gases que
atacan el sistema nervioso como sarín y tabún, proteínas, ácido salicílico, escatol,
triptófano, ácido úrico y warfarina (coumadina).
 Muchos agentes medicinales: adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaína,
reserpina y dietilamida del ácido lisérgico (LSD).
 La aplicación más importante, sin duda, es en el análisis de productos alimenticios,
farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales.
 La sensibilidad y selectividad del método lo hacen particularmente valioso en estos
campos.
II.4.B.4 Aplicaciones
 Aplicación a especies orgánicas
La forma reducida del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NADH) es una importante
coenzima muy fluorescente. Tiene un máximo de absorción a 340 nm y un máximo de
emisión a 465 nm. Unas soluciones patrón de NADH dieron las siguientes intensidades de
fluorescencia:
C (mmol/L), NADH Intensidad
relativa
0.100 2.24
0.200 4.52
0.300 6.63
0.400 9.01
0.500 10.94
0.600 13.71
0.700 15.49
0.800 17.91

Determine la relación Señal-Concentración, y calcule la concentración de una muestra

problema de NADH que dio una señal de 12.16. (Puede suponer que no hay efecto
matriz)
II.4.B.4 Aplicaciones
 Aplicación a especies orgánicas
La forma reducida del dinucleótido de adenina y nicotinamida (NADH) es una importante
coenzima muy fluorescente. Tiene un máximo de absorción a 340 nm y un máximo de
emisión a 465 nm. Unas soluciones patrón de NADH dieron las siguientes intensidades de
fluorescencia:
Señal (intensidad fluorescente)
I = 22.346  C NADH + 0.0004
I - 0.0004 12.16 - 0.0004
C NADH = =
22.346 22.346
C NADH = 0.544 mmol
L

Concentración NADH (mmol/L)

II.4.B.4 Aplicaciones
 Aplicación a especies orgánicas
La quinina de una tableta antimalaria de 1.664 g se disolvió en suficiente HCl 0.10 M
para obtener 500 ml de solución. Una alícuota de 20 ml se diluyó luego a 100 ml con el
ácido. La intensidad de la fluorescencia para la muestra diluida a 347.5 nm fue de 245
en una escala arbitraria. Una solución patrón de quinina de 100 ppm registró 125
cuando se midió en condiciones idénticas a la de la muestra diluida. Determine los mg de
quinina en la tableta.
Fx = KC x
Fp = KC p
Comparación directa con
Fx KC x C x Fx 245
un patrón en las mismas = =  Cx = Cp = 100 ppm = 196 ppm
Fp KC p C p Fp 125
condiciones que la muestra
problema
C madreVtomado = CdiluidaVdiluida
196 ppm100ml
C madre = = 980 ppm
20ml

mg
980 0.5 L = 490mg
L
II.4.B.4 Aplicaciones
 Aplicación a especies orgánicas
La quinina de una tableta antimalaria de 4.236 g se disolvió en suficiente HCl 0.10 M
para obtener 1 L de solución. Una alícuota de 20 ml se diluyó luego a 100 ml con el
ácido. La intensidad de la fluorescencia para la muestra diluida a 347.5 nm fue de 448
en una escala arbitraria. Una segunda alícuota de 20 ml se mezcló con 10 ml de una
solución patrón de quinina de 50 ppm antes de diluirla a 100 ml. La intensidad de
fluorescencia para esta disolución fue de 525. Determine el porcentaje de quinina en la
tableta.

Adición estándar única S1V p C p0 448  10ml  50 ppm

con dos muestras (a una C =
0
=
x
(S 2 - S1 )Vx (525 - 448)  20ml
se le añade patrón y a la
C x0 = 145.45 ppm
otra no)

mg
145.45 1L = 145.45mg
L

0.14545 g quinina
%=  100 = 3.43%
4.236 g totales
II.4.B.5 Quimioluminiscencia
 La aplicación de la quimioluminiscencia es reciente. Las reacciones químicas que
producen quimiolumniscencia son pocas, lo que limita su aplicación a un número
relativamente pequeño de especies. No obstante, algunas sustancias que reaccionan
manifestando quimiolumniscencia son componentes importantes del medioambiante.
 Debido a la altísima selectividad, sencillez y sensibilidad del método
quimioluminiscente para dichas especies importantes, ha crecido mucho su aplicación.
 La quimioluminiscencia es la emisión de luz que se produce tras una reacción química que
ha dado lugar a un producto excitado que cae al estado fundamental.
 Se podría expresar de modo sencillo como sigue:

A + B → C*+ D
hn
C
II.4.B.5 Quimioluminiscencia
 En la quimioluminiscencia, la intensidad de radiación depende de la velocidad a la que
se forma el producto emisor y del rendimiento cuántico de la quimioluminiscencia
(cuantas moléculas en estado excitado se forman por segundo y qué proporción de ellas
caen al estado fundamental emitiendo luz en lugar de desactivarse por otros
mecanismos). d C 
I QL = QL
A + B → C*+ D dt
Si reorganizamos los términos e
hn 

integramos quedaría:
C
I QL dt = QL d C 

I 
t C

QL dt = QL d C 
0 0

Área = QL C 
II.4.B.5 Quimioluminiscencia
 Los equipos para medir quimiolumniscencia son sencillísimos porque no hacen falta
monocromadores: la única señal luminosa es la que produce el analito. No hay otras
fuentes. Básicamente lo único que se necesita es un recipiente adecuado para producir
la reacción y un fotodetector (tubo fotomultiplicador , ya que son intensidades bajas).
Área = QL C 
 Se preparan varias concentraciones de
reactivo, y se mide como varía la intensidad
con el tiempo para cada concentración. Se
obtiene un gráfico como el de abajo para
cada concentración. Existe una relación lineal
entre el área y la concentración. La linealidad
abarca varios órdenes de magnitud.
 En el caso de las reacciones catalizadas la
relación lineal se puede obtener
directamente con la concentración de
catalizador (manteniendo constante las demás
concentraciones de partida)
 II.4.B.5 Quimioluminiscencia
Los iones hierro(II) catalizan la oxidación del luminol con H2O2. Está
comprobado que la intensidad de quimiolumniscencia resultante aumenta linealmente con
la concentración de Fe(II) en un rango amplio de concentraciones diluidas.

A una alícuota de 2 ml de una disolución problema de Fe(II) se le adicionó 1 ml

exacto de agua, seguido de 2 ml de una disolución diluida de H2O2 y 1 ml de una
disolución alcalina de luminol. La señal quimioluminiscente de la mezcla se integró
durante un periodo de 10 segundos y se encontró que el área era de 14.3.

A una segunda alícuota de 2 ml de la muestra se le añadió 1 ml de una

solución de Fe(II) 3.58 10-5 M seguido del mismo volumen de H2O2 y luminol. La
intensidad integrada (área) fue de 33.3.

Calcule la concentración de Fe(II) en la muestra.

II.4.B.5 Quimioluminiscencia
Método de adición estándar única con dos muestras (a una se le añade patrón y
a la otra no)

S1V p C p0 14.3  1ml  3.58  10 -5 M

C =
0
=
x
(S 2 - S1 )Vx (33.3 - 14.3)  2ml
C x0 = 1.35  10 -5 M