Prefacio

Norma Boliviana NB 32002

Ensayos microbiológicos
– Preparación de
muestras para el análisis
microbiológico de
alimentos
Primera revisión

ICS 07.100.30 Microbiología de los alimentos

Julio 2002

Instituto Boliviano de Normalización y Calidad

Prefacio
La revisión de la Norma Boliviana NB 32002-02 "Ensayos microbiológicos – Preparación
de muestras para el análisis microbiológico de alimentos" (Primera revisión) (que anula
y reemplaza a la NB 654-95 "Ensayos microbiológicos – Preparación de muestras para
el análisis microbiológico de alimentos”, ha sido encomendada al Comité Técnico
Normalizador: N 3.2 "Microbiologia".

Las instituciones y representantes que participaron fueron los siguientes:

REPRESENTANTES INSTITUCIONES

Angélica Espada INLASA – MICROBIOLOGIA

Daisy Montiveros INLASA – MICROBIOLOGIA
Rosario C. De Conchari INDUSTRIAS VENADO
Jacqueline Cuiza Ramos TUSEQUIS LTDA.
Katerine Rodriguez UNSLP
Eulogio Mejía EISPDM
Virginia Rojas Mercado FACULTAD DE INGENIERIA – UMSA
Gisela Mollinedo Vargas PIL ANDINA LA PAZ
Raquel Calderón Morales SELADIS
Eida Cordeiro LABORATORIO MUNICIPAL LA PAZ
Nieves Ramos INAL LTDA.
Lizet Echeverria PROFESIONAL INDEPENDIENTE
Martha Caero LIDIVECO – COCHABAMBA
Natalia Garzo 3M – SANTA CRUZ
Reynaldo Flores CODEX - IBNORCA

Fecha de aprobación por el Comité Técnico de Normalización 2002-06-20

Fecha de aprobación por el Consejo Rector de Normalización 2002-06-27

Fecha de aprobación por la Junta Directiva del IBNORCA 2002-07-12

IBNORCA NORMA BOLIVIANA NB 32002

Ensayos microbiológicos - Preparación de muestras para el análisis microbiológico de

alimentos

1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma establece los procedimientos a seguir para la preparación de la porción de

ensayo, previo al análisis microbiológico.

2 REFERENCIA

NB 32001 Técnicas de muestreo de alimentos para el análisis microbiológico

3 DEFINICIÓN DE MUESTRA

Véase NB 32001.

4 INSTRUMENTAL Y MATERIAL

- Autoclave
- Incubadoras
- Baño María con termostato
- Campana de flujo laminar
- Balanza con resolución de 0,1 g
- Medidor de pH
- Licuadora con frascos y vasos resistentes a la temperatura del autoclave
- Equipo Stomacher
- Agitador Vortex
- Instrumental para preparar la muestra, como: bisturí, cuchillos, espátulas, tenedores,
pinzas, tijeras, cucharas, abridores, etc
- Erlenmeyer o frascos
- Cajas petri
- Tubos de ensayo con tapa de rosca
- Pipetas

5 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

NOTA

Al momento de dispensar los diluyentes colocar un excedente para compensar la pérdida por autoclavado.

5.1 Diluyentes

5.1.1 Solución de peptona al 0,1 %

Composición

Peptona 1,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

1
 NB 32002

Preparación

Disolver la peptona en agua, ajustar el pH de forma que después de la esterilización sea de

7,0 ± 0,1 a 40 C, se distribuye a 225 ml ó 450 ml en Erlenmeyer o frascos de dilución y se
esteriliza a 121 C durante 15 min.

5.1.2 Agua peptonada tamponada

Composición

Peptona 10,00 g

Cloruro de sodio (NaCl) 5,00 g

Fosfato disódico (Na2HPO4) 3,5 g

Fosfato dipotásico (K2HP04) 1,5 g

Agua destilada 1 000, 00 ml

Preparación

Ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Autoclavar a 121 °C por 15 min.
Mantener refrigerado, se distribuye a 225 ó 450 ml en Erlenmeyer o frascos de dilución.

5.1.3 Solución reguladora de fosfatos

[Link] Solución madre

Composición

Dihidrogenofosfato de potasio (KH 2PO4) 34,00 g

Agua destilada 500,00 ml

Preparación

Se ajusta el pH a 7,2 con un litro de solución 1 N de hidróxido de sodio y se almacena

(solución base) ; se añade 1,25 ml de solución base a un litro de agua destilada y se esteriliza
a 121 °C durante 15 min.

[Link] Solución diluida de trabajo

Preparación

A un matraz de 1 000 ml que contenga aproximadamente 800 ml de agua destilada, transferir

1,25 ml de la solución madre, mezclar y completar el volumen a un litro con agua destilada.
Transferir la solución a frascos de dilución en cantidades de 225 ml ó 450 ml, se esteriliza a
121 C durante 15 min.
 NB 32002

5.1.4 Solución diluida Ringer 1:4

Composición

Cloruro de sodio (NaCl) 9,00 g

Cloruro de potasio (KCl) 0,42 g

Cloruro de calcio anhidro (CaCl2) 0,24 g

Carbonato ácido de sodio (NaHCO3) 0,20 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Preparación

Disolver los componentes en agua y llevar a un volumen de 1 000 ml. Antes de su utilización,
añadir un volumen de la solución a tres (3) volúmenes de agua. La solución diluida repartir en
frascos en cantidades de 225 ml ó 450 ml. Esterilizar 15 min a 121C ± 1 C.

5.1.5 Solución de citrato de sodio al 2 %

Composición

Citrato de sodio (Na3C6H 5O 7.2H2O) 20,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Preparación

Disolver el citrato en el agua destilada esterilizada, no calentar para disolver, esterilizar por
filtración. Mantener en refrigeración.

5.1.6 Solución de fosfato ácido de potasio al 2 %

Composición

Fosfato dipotásico (K 2HPO4) 20,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Preparación

Disolver el fosfato en agua en un matraz y repartir en frascos de dilución en cantidades de 225

ml ó 450 ml. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 C ± 1 C.

5.1.7 Solución fisiológica

Composición

Cloruro de sodio (NaCl) 8,50 g

Agua destilada 1 000,00 ml

 NB 32002

Preparación

Disolver el cloruro de sodio en agua llevándolo a ebullición, dejar enfriar a temperatura

ambiente; ajustar el pH de manera que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,1 a 20 C.
Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 C ± 1 C.

5.2 Desinfectantes.

5.2.1 Alcohol al 70 %

5.2.2 Solución de alcohol iodado

[Link] Solución A

Yoduro de potasio (KI) 2,50 g

Yodo metálico (I2) 6,00 g

Agua destilada (c.s.p.) 100,00 ml

Diluir el yoduro de potasio en agua y luego el yodo metálico.

[Link] Solución B

Alcohol de 96 729 ml

Agua destilada 271 ml

[Link] Preparación final

Solución A 20 ml

Solución B 980 ml

6 CONSIDERACIONES GENERALES

El material y equipo a utilizarse debe estar convenientemente preparado, identificado y listo

para su uso.

Al recibir la muestra en el laboratorio, debe examinarse rápidamente el informe del muestreo a

fin de establecer la naturaleza, origen y la forma de muestreo.

Al llegar la muestra al laboratorio debe procederse a su debida identificación y/o codificación.

Se tomarán en cuenta las condiciones en las que se recibió la muestra tales como,
temperatura, aspecto y cierre hermético del envase.

Comenzar el análisis lo más pronto posible; las muestras recibidas deben ser conservadas
adecuadamente hasta el momento del análisis (refrigerada, congelada o a temperatura
ambiente, según el caso lo requiera).

Todos los aparatos y utensilios a utilizar para la preparación de la porción de ensayo, deben
estar limpios y esterilizados, empleando los métodos más adecuados para cada caso.
 NB 32002

El sitio donde se realizará la preparación de la muestra, debe reunir las condiciones de

asepsia indispensables.

Cuando se abra el recipiente con la muestra debe evitarse cualquier tipo de contaminación
externa.

Cuando el producto esté envuelto en cartón, papel celofán, papel aluminio o cualquier otro
material de empaque similar, este debe limpiarse externamente con un algodón humedecido
con agente desinfectante (alcohol al 70 %), para eliminar la contaminación superficial y el
polvo. Debe darse una atención especial al área de abertura.

Los envases de productos alimenticios como: latas, jarras, botellas y otros recipientes
cerrados se deben lavar, secar y esterilizar debidamente, sobre todo el área de abertura,
mediante agentes adecuados como el alcohol al 70 %, el cual debe ser eliminado a la llama
(flameado), se debe evitar el daño al envase, eliminando los riesgos de incendio o explosión.

Cuando se proceda a hacer el análisis, debe tomarse nota de las características

organolépticas de la muestra: color, olor, consistencia, textura, etc.

Las muestras recibidas que no se adecuen con los requisitos estipulados en la NB 32001,
deben ser rechazadas.

7 PROCEDIMIENTO

7.1 Carnes y productos cárnicos

Para homogeneizar el alimento si se utiliza licuadora o Stomacher ver anexo A. De este modo
se obtiene la dilución 10-1 .

7.2 Leche y productos lácteos

7.2.1 Leche fluida

Con el fin de asegurar un reparto uniforme de microorganismos, mezclar cuidadosamente la

muestra, invirtiendo el recipiente varias veces. Igualmente es posible agitar la muestra
mecánicamente, si se obtiene el mismo resultado. El tiempo transcurrido desde la mezcla
hasta la toma para ensayo no debe ser superior a 3 min. Tomar 25 ml ó 50 ml de muestra y
homogeneizar con 225 ml ó 450 ml respectivamente del diluyente más conveniente (5.1.1,
5.1.2, 5.1.3 y 5.1.4).

7.2.2 Leche en polvo y productos deshidratados de leche incluyendo alimentos para

niños

La leche en polvo es un producto que absorbe fácilmente humedad y olores extraños; por
tanto, es necesario que todos los utensilios y recipientes, además de limpios y estériles, estén
secos.

La extracción de la muestra debe realizarse en un ambiente seco y exento de polvo y olores,

lo mas rápidamente posible, procurando reducir al mínimo el tiempo que el producto a ser
ensayado permanezca en contacto con el aire.

Se mezcla la muestra invirtiendo el envase repetidas veces, también se puede transferir el

polvo a un frasco limpio bien seco y estéril de capacidad dos veces el volumen de la muestra.
 NB 32002

Pesar 25 g ó 50 g de muestra y suspenderla a 225 ml ó 450 ml respectivamente del diluyente

adecuado (Véase 5.1.2, 5.1.3 y 5.1.5).

7.2.3 Mantequilla, margarina y derivados lácteos para untar

Con la ayuda de una espátula esterilizada, pesar asépticamente en una balanza 25 g de

muestra tomando varios puntos de la superficie, colocar en un frasco o Erlenmeyer
previamente esterilizado en baño maría a 45 °C por un período máximo de 15 min. Una vez
fundida la muestra, añadir el diluyente el cual debe estar previamente calentado a 45 °C.
Mezclar de forma que se obtenga una suspensión homogénea.

7.2.4 Natas heladas y helados de leche

Para las muestras que fueron tomadas en unidades completas y pequeños envases, quitar el
envase y colocar la muestra en un recipiente estéril de vidrio provisto de tapa.

Para las muestras que fueron tomadas a granel o en envases grandes, mantener la muestra
en su recipiente.

Descongelar las muestras en refrigerador a una temperatura de 2 °C a 8 °C por un tiempo no

mayor a 2 h ó colocar los recipientes que contengan las muestras en baño maría a 43 C ± 2
C y mantenerlas el tiempo suficiente para la fusión del contenido, sin que sobrepasen los 30
min.

Tomar 25 ml ó 50 ml de la muestra fundida y mezclar con 225 ml ó 450 ml respectivamente

del diluyente (Véase 5.1.5).
NOTA

En caso de separación de fases en la muestra fundida, agitarla hasta lograr una mezcla homogénea antes de tomar
la muestra.

7.2.5 Quesos

En condiciones asépticas y usando los utensilios estériles necesarios para cada tipo de queso,
cortar la muestra de varios puntos (de superficie y profundidad).

Pesar 25 g ó 50 g y homogenizar con 225 ml ó 450 ml del diluyente correspondiente (Véase

5.1.5). En caso de usar licuadora o Stomacher ver anexo A.

7.3 Productos líquidos

Si se trata de alimentos líquidos o material que fluya libremente, el recipiente debe agitarse
hasta que su contenido sea homogéneo. Con el fin de asegurar un reparto uniforme de
microorganismos, mezclar cuidadosamente invirtiendo el recipiente varias veces. Igualmente
es posible agitar la muestra mecánicamente, si se obtiene el mismo resultado.

Si el recipiente esta completamente lleno, transferir a otro recipiente esterilizado y continuar

con el procedimiento.

Si el recipiente es demasiado grande para manejarlo convenientemente, deben tomarse

muestras con tubos de muestreo o toma-muestras, asegurándose de que las mismas sean
representativas del producto o muestra.
 NB 32002

En el caso de productos embotellados como refrescos, cerveza, aguas minerales; productos

enlatados líquidos y otros similares, lavar y desinfectar antes de la homogeneización el envase
de la muestra.

Tomar 25 ml ó 50 ml de muestra y mezclar con 225 ml ó 450 ml respectivamente del

diluyente (Véase [Link] - Solución diluida de trabajo).

NOTAS

1. En caso de productos que contienen gas, transferir a un recipiente esterilizado que contenga perlas de vidrio para
eliminar por agitación mecánica constante.

2. En el caso de la recepción de muestras congeladas, mantener a una temperatura entre 2 °C a 8 °C por un tiempo no
mayor a 2 h.

7.4 Salsas y aderezos

En condiciones asépticas y utilizando cucharas estériles realizar el pesado tomando de

diferentes partes de la muestra asegurándose que está sea representativa.

Pesar 25 g ó 50 g homogeneizar con 225 ml ó 450 ml del diluyente correspondiente (Véase

5.1.1 ó [Link]).

7.5 Productos sólidos

7.5.1 Productos en polvo

Seguir procedimiento 7.2.2.

NOTA

Si el producto tiene un contenido de grasa mayor al 10 %, utilizar el diluyente (Véase 5.1.5). En caso contrario el diluyente (Véase
[Link] - Solución diluida de trabajo).

7.5.2 Granos y subproductos de cereales

Se usará para cereales en grano, almendras, nueces, etc.

Se toma asépticamente 25 g ó 50 g de muestra y se mezcla con 225 ml ó 450 ml

respectivamente de los diluyentes (Véase 5.1.5 y [Link] - Solución diluida de trabajo) y se
homogeneiza en licuadora, ver anexo A.

7.6 Conservas

Se usará para productos alimenticios enlatados o embotellados, que fueron sometidos a un

tratamiento de esterilización durante el proceso de elaboración. En este caso la investigación
microbiológica se realizará sobre tres series de muestras paralelas del mismo lote.

La primera serie será analizada al momento de su recepción al laboratorio. Se abre en el

interior de la campana estéril, con todas las condiciones de asepsia requeridas, luego se
reemplaza la tapa con la base de una caja de petri estéril.

La segunda serie será analizada después de una incubación a 35 C ± 2 C durante 10 días.

La tercera serie será analizada después de una incubación a 55 C ± 2 C durante 5 días.

 NB 32002

Posteriormente se procede al procesamiento de la muestra según procedimiento para

alimentos de esterilidad comercial.

7.6.1 Preparación de muestras para esterilidad comercial

- Retirar la etiqueta e identificar la muestra

- Revisar y anotar los detalles de alguna alteración y dejar un registro de cualquier
evidencia de daño físico, oxidación, abombamiento, abolladura, particularmente en el
sello lateral y doble sello en el caso de envases de hojalatas.
- Conservar las etiquetas por un periodo de tres (3) meses
- Lavar los envases con detergente, enjuagar y secar con papel absorbente

8 BIBLIOGRAFÍA

Análisis microbiológico de Alimentos

Melida Sánchez Arias, Graciela Díaz Figueroa, Lucy Rubio de Ricante, Isabel Higuera de
Roso, Mercedes Vargas Llanosa, Martha Holgin Hernández, Ana Isabel Muñoz Cajiao,
Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud
Bogotá D. I. Colombia - 1990

COMITE ESTATAL DE NORMALIZACION

NC 76-03-1982 - Método de ensayo microbiológico - Preparación de la porción de ensayo

COMISION VENEZOLANA DE NORMAS INDUSTRIALES

COVENIN 1126 - 77 Codificación y preparación de muestra para el análisis microbiológico

INSTITUTO CENTRO AMERICANO DE INVESTIGACION Y TECNOLOGÍA

ICAITI 34046 h 23:9 Leche y productos lácteos - Recuento de bacterias coliformes y
Echerichia Coli

ICAITI 35015 h4 Pescado y productos pesqueros - Detección y recuento de bacterias

coliformes y Echerichia Coli

INSTITUTO ESPAÑOL DE NORMALIZACION

IRANOR 34817 - 85 Leche y productos lácteos - Recuento de bacterias coliformes (método de
referencia y método de rutina)

Norma método de la AOAC Edición 1990

Manual de técnicas microbiológicas para alimentos y agua 1998; Ministerio de Salud –

Instituto de Salud Pública de Chile – Subdepartamento Laboratorios del Ambiente
 NB 32002

ANEXO A (Informativo)

HOMOGENEIZADOR DE ALIMENTOS (Stomacher)

El homogeneizador de alimentos utilizado en los laboratorios de microbiología, se utiliza para

la siguiente variedad de productos alimenticios y las revoluciones por minuto rpm. indicadas:

Alimento r.p.m. Tiempo

Mayoría de los alimentos 230 30 s

Carnes, grasas, pastelería 230 60 s

Pulpa de frutas 230 60 s

Mezcla de polvos 230 15 s

Extracción de lípidos 230 120 s

Extracción de toxina 230 60 s

Productos líquidos 260 30 s

HOMOGENEIZADOR TIPO LICUADORA

Alimento r.p.m. Tiempo

Mayoría de los alimentos 15 000 a 20 000 2 min
 NB IBNORCA: Instituto Boliviano de Normalización y Calidad

32002 IBNORCA creado por Decreto Supremo N 23489 de fecha 1993-04-29 y

2002 ratificado como parte componente del Sistema Boliviano de la Calidad
(SNMAC) por Decreto Supremo N 24498 de fecha 1997-02-17, es la
Organización Nacional de Normalización responsable del estudio y la
elaboración de Normas Bolivianas.

Representa a Bolivia ante los organismos Subregionales, Regionales e

Internacionales de Normalización, siendo actualmente miembro activo del
Comité Andino de Normalización CAN, del Comité Mercosur de
Normalización CMN, miembro pleno de la Comisión Panamericana de
Normas Técnicas COPANT y miembro correspondiente de la International
Organization for Standardization ISO.

Revisión

Esta norma está sujeta a ser revisada permanentemente con el objeto de

que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

Características de aplicación de Normas Bolivianas

Como las normas Técnicas se constituyen en instrumentos de

ordenamiento tecnológico, orientadas a aplicar criterios de calidad, su
utilización es un compromiso conciencial y de responsabilidad del sector
productivo y de exigencia del sector consumidor.

Información sobre Normas Técnicas

IBNORCA, cuenta con un Centro de Información y Documentación que

pone a disposición de los interesados Normas Internacionales, Regionales,
Nacionales y de otros países.

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IBNORCA tiene derecho de propiedad de todas sus publicaciones, en

consecuencia la reproducción total o parcial de las Normas Bolivianas está
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