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BIOPROCESOS
CUANTIFICACIÓN RENDIMIENTOS DE UNA FERMENTACIÓN
BATCH/DISCONTINUA
Parte A y B
Número de la práctica 01 y 02
Normas de seguridad:
• Hacer uso de bata blanca y limpia.
• Hacer uso de prendas de vestir y calzado que no dejen al descubierto la piel
• Contar con cada uno de los elementos de protección personal: guantes, gafas de laboratorio, cofia,
tapabocas
• El distanciamiento durante la jornada de trabajo, conforme los lineamientos de bioseguridad del
Distrito y la Universidad
Objetivo general de la práctica:
Determinar los coeficientes de rendimiento de los compuestos que intervienen en la fermentación
batch, mediante el uso de técnicas experimentales y teóricas
Objetivos específicos:
Evaluar la formación de biomasa por parte de Saccharomyces cerevisiae a partir de distintas
concentraciones de la principal fuente de carbono
Establecer y comparar los rendimientos Yxs para cada uno de los medios preparados por los grupos
de trabajo
Responsable de la práctica:
Docente de la asignatura, Coordinación de laboratorios
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Clasificación del documento: determinar publico / privado / confidencial
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1. Introducción de la práctica:
Un proceso de fermentación involucra el crecimiento celular a partir del consumo de un sustrato
principal o nutriente limitante, sin embargo, sobre dicho crecimiento, inciden otra serie de factores que
afectan directamente la fisiología celular, tales como la temperatura y el pH que intervienen sobre la
actividad enzimática y la permeabilidad de la membrana citoplasmática, otros factores son la actividad
de agua (aw), el tipo de respiración celular, la presión, entre otros. Para lograr evidenciar los consumos
de sustrato y los productos (biomasa, compuestos oxidados/reducidos) resultado del metabolismo
celular, es importante realizarlo sobre una fermentación tipo batch o discontinua, que se caracteriza por
ser un sistema cerrado en el que, durante un tiempo de incubación determinado, no se alimenta
nuevamente ni sustrato, ni biomasa, por ende, es posible determinar cada una de las fases de
crecimiento que experimenta la población celular.
2. Marco teórico:
La complejidad del proceso de crecimiento microbiano comprende miles de reacciones intracelulares,
que corresponden a procesos catabólicos, anabólicos y anfibólicos que obedecen a la ley de la
conservación de la materia, por tal motivo es importante identificar el tipo de reacciones metabólicas
que se estimulan sobre el bioproceso y por ende los productos obtenidos. Es importante identificar que
según dicha ruta catabólica el flujo de carbono favorecerá unos productos que otros. Por ejemplo, la
Respiración consiste en el uso del oxígeno molecular como aceptor final de electrones. Este proceso es
mucho más eficiente que el proceso de fermentación anaeróbico, ya que produce 38 moles de ATP por
mol de azúcar utilizado, por tanto, se da una mayor producción de biomasa celular (Doran, P., 2010).
Los productos de la fermentación varían de acuerdo al tipo de microorganismo, tipo de sustrato y otros
factores ambientales, sin embargo, en términos generales esta comprende los procesos de
oxidoreducción a partir de un compuesto orgánico (nutriente limitante), energéticamente menos
eficiente, pero con una gran variedad de productos obtenidos. La forma de cuantificar o describir el flujo
de carbono se conoce como rendimiento, el rendimiento global representa la cantidad de producto
formado o acumulado por la cantidad de reactante suministrado o consumido. El producto puede
corresponder a biomasa, compuestos orgánicos como resultado el metabolismo celular. En el caso de
una fermentación alcohólica se cuenta con el rendimiento teórico de etanol es 51,1% en peso. El proceso
genera dos moléculas de ATP por molécula de azúcar utilizada. Para efectos de la práctica el
microorganismo a utilizar es Saccharomyces cerevisiae, una levadura capaz de crecer ya sea con
presencia de oxígeno o sin presencia de este compuesto (Facultativo) y los rendimientos dependerán
precisamente de la ruta favorecida durante el bioproceso. Si hay suficiente O2 disponible, la levadura,
preferirá el uso de la ruta metabólica de la respiración (ácidos tricarboxílicos), reduciendo la producción
de etanol. Sin embargo, hay una mayor generación de biomasa por unidad de azúcar consumido.
3. Equipos requeridos para la práctica:
Parte A
• Medidor de pH (1)
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• Centrífuga (1)
• Shaker o agitador mecánico a 30°C (2)
• Microscopio (3)
• Cámara de flujo laminar (1)
• Espectrofotómetro UV-vis (1)
• Celdas para espectrofotómetro (2)
• Micropipeta (3)
Parte B
• Planchas de calentamiento (4)
• Espectrofotómetro UV-vis (1)
• Celdas para espectrofotómetro (2)
• Micropipeta (3)
4. Materiales requeridos para la práctica por grupo (son 7 grupos, para cada práctica)
Parte A
• Asas redondas (1) estériles
• Erlenmeyer de 250 mL (1) con medio A o medio B, estériles
• Puntas de 1000 uL azules estériles (6)
• Puntas de 1000 uL azules sin esterilizar (10)
• Portaobjetos y laminillas para microscopio (2)
• Tubos falcon para centrífuga (3)
Parte B
• Vaso de precipitado de 500 ml
• Vaso de precipitados de 250 ml
• 1 Gradilla
• 7 tubos de ensayo
• 1 pipeta de 10 ml
• 1 pipeteador
• Toallas desechables de papel (lo trae el estudiante)
• Marcador permanente punta delgada (lo trae el estudiante)
5. Medios y reactivos (1 para todos los grupos)
Parte A
- Medio requerido para todo el grupo: 4 Erlenmeyer de 100 ml con 40 ml de medio A, y 4 Erlenmeyer de
100 ml con 50 ml de medio B, cerrados con tapón de algodón y esterilizados.
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Medio A Medio B
Glucosa (g/L) 10 15
Extracto de levadura (g/L) 2 2
NaH2PO4*H2O (g/L) 0,8 0,8
MgCl2*6H2O (g/L) 0,6 0,6
NaCl (g/L) 0,4 0,4
Na2SO4 (g/L) 0,5 0,5
CaCl2*2H2O (g/L) 0,1 0,1
pH 5 5
- Azul de lactofenol para tinción de levaduras (20 ml).
- Solución salina (NaCl) isotónica 0.9 g de NaCl/100 ml agua destilada (500 ml) estéril
- Agua desionizada (1L)
- Solución de alcohol antiséptico para limpieza (500 ml)
Parte B
- Reactivo DNS (500 ml)
- Solución de glucosa 2 g/L (250 ml)
- Agua desionizada (1L)
- Hielo
6. Métodos y procedimientos
PARTE 1
MONTAJE DE LA FERMENTACIÓN: Cada grupo trabajará con un Erlenmeyer con 40ml de Caldo (100ml).
INOCULACIÓN: La inoculación por parte de los estudiantes se realizará en la primera práctica y se retirará
a las 24h de incubación.
Bajo condiciones asépticas adicione 1 colonia de levadura en una lámina para microscopio.
Bajo condiciones asépticas inocular el medio de cultivo, utilizado el preinóculo que le será suministrado
y proceder a tomar de 4 ml de medio que corresponde al tiempo inicial, usando una micropipeta de 1mL
con una punta azul estéril en un tubo falcon.
También,
Llevar el erlenmeyer a incubar a 30°C y agitación de 100 rpm durante 24horas (** ó las condiciones
sugeridas por el profesor) **. Esto dependerá del número de grupos.
TINCION: Adicione a la lámina con el medio de cultivo 2 gotas de colorante azul y mezcle con un asa
estéril coloque un portaobjetos y lleve al microscopio. Observe a 10x y 40x.
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ANALISIS DE CONCENTRACIÓN DE BIOMASA INICIAL: En la centrífuga se deben colocar los tubos en
pares, 2,4,6… para que quede balanceada. Llevar el tubo falcon a la centrifuga por 15 minutos a 8000rpm,
pasar el sobrenadante a un tubo falcon limpio, etiquetarlo y colocarlo en el congelador.
Re-suspenda el centrifugado con 4 ml de solución isotónica estéril y agite.
Leer la muestra en espectrofotómetro a 600 nm: Para realizar este procedimiento, limpie la celda con
agua destilada y luego escurra sobre papel absorbente. Como blanco coloque la solución isotónica
estéril. Adicione 2 ml de muestra a una celda y realice la lectura. Registre el valor de la absorbancia. Deje
limpia la celda, lavandola con agua desionizada.
FIN DE FERMENTACIÓN: Pasadas las 24 horas tome nuevamente 4 ml de muestra del medio de cultivo
en un tubo falcón.
Tome el valor final del pH del medio. Saque una muestra en un vaso de precipitados de 100 ml y lea con
el pHmetro. Limpie primero el electrodo con agua desionizada, luego sumerja el electrodo en la muestra
y registre el valor. Al finalizar lave nuevamente el electrodo con agua desionizada y colóquele el
capuchón.
ANALISIS DE CONCENTRACIÓN DE BIOMASA FINAL: Llevar el tubo falcon a la centrifuga por 15 minutos
a 8000 rpm, retirar el sobrenadante en un tubo falcon limpio, etiquetarlo y colocarlo en el congelador.
Re-suspenda el centrifugado con 4 ml de solución isotónica estéril y agite. Diluir la muestra 1:3 antes de
leer absorbancia.
Leer la muestra en espectrofotómetro a 600 nm: Para realizar este procedimiento, limpie la celda con
agua destilada y luego escurra sobre papel absorbente. Como blanco coloque la solución isotónica
estéril. Adicione 2 ml de muestra a una celda y realice la lectura. Registre el valor de la absorbancia. Deje
limpia la celda, lavándola con agua desionizada.
Tenga en cuenta que el valor de absorbancia no debe ser superior a 1.000. Si da un valor superior a 1.000
debe diluir la muestra y volver a leerla.
Si realizó dilución, tenga en cuenta que el valor de la dilución debe ser multiplicado con la concentración
resultante. Concentración real = Concentración dada por la ecuación x Factor de Dilución
PARTE 2
ANÁLISIS DE CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA:
Descongelar las muestras.
Marcar los tubos de ensayo.
Diluya la muestra según indicación del docente.
Adicionar a un tubo de ensayo 150 μl de la muestra diluida.
Adicionar 350 μl de agua destilada.
Adicionar 500 μl de reactivo DNS (Solución A).
Agitar para mezclar.
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Adicionar a otro tubo de ensayo 500 μl de agua destilada y 500 μl de reactivo DNS.
Colocar en un vaso de precipitado con agua en ebullición los tubos durante 5 minutos, deben colocarse
solo hasta que el agua ya se encuentre en ebullición, no antes. Pasado este tiempo se debe observar un
color que va desde amarillo hasta café, pasando por el naranja, de acuerdo con la concentración de
azúcares reductores; a mayor concentración más oscuro será el color desarrollado por la muestra.
Pasar los tubos a un vaso con mezcla de hielo y agua.
Adicionar 5 ml de agua destilada a cada tubo.
Agitar y dejar en reposo durante 15 minutos.
Leer a 540 nm de absorbancia.
TABLA DE DATOS
Tabla 1. Tabla de datos experimentales parte 1
t = 0 min inicio t = 24 h (final)**
# Medio Absorbancia Factor de Absorbancia Factor de pH
600 nm dilución* 600 nm dilución*
*Si no realizó una dilución el valor es 1
** Si no realizó la medición a 24 horas exactas, especificar el tiempo en el que se realizó
Tabla 2. Tabla de datos experimentales parte 2
t = 0 min inicio t = 24 h (final)**
# Medio Absorbancia Factor de Absorbancia Factor de
540 nm dilución* 540 nm dilución*
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*Si no realizó una dilución el valor es 1
** Si no realizó la medición a 24 horas exactas, especificar el tiempo en el que se realizó
7. Cálculos y resultados
Conforme el formato sugerido por el docente para el informe de laboratorio, reporte los resultados de
la siguiente forma. Calcule con los datos de todos los grupos la concentración inicial y final de la biomasa.
Para eso utilice la curva de peso seco que se obtiene a partir de los datos de la tabla 2. Linealice y
determine la ecuación que relacione la concentración en función de la absorbancia. Use esa ecuación
resultante para determinar la concentración y completar la tabla 3.
Tabla 3. Datos de curva de peso seco
Absorbancia Concentración de
biomasa (X) [g/L]
0.110 0.03
0.280 0.08
0.421 0.13
0.598 0.18
0.730 0.23
0.904 0.28
Tabla 4. Resultados parte 1
# Medio X X pH
inicial final final
(g/L) (g/L)
Con los datos de la curva de calibración de concentración de glucosa dados por el docente, realice la
regresión de los datos de concentración vs absorbancia para determinar biomasa realice los cálculos
para obtener la siguiente tabla:
Tabla 5. Resultados parte 2
# Medio S inicial S final
(g/L) (g/L)
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Realice los cálculos y coloque la siguiente tabla:
Tabla 6. Resultados finales
# Medio Yxs Productividad
[g /(L*h)]
Realice la regresión de los datos de concentración vs absorbancia para determinar biomasa
Realice la regresión de los datos de concentración vs absorbancia para determinar concentración de
glucosa
Grafique pH versus # de experimento
Grafique Yps versus # de experimento
Analice los datos obtenidos en las tablas 4, 5 y 6 y las gráficas. Discuta los valores de pH, concentración
de biomasa Yxs y productividad obtenidos. Analice si hay diferencias entre los experimentos realizados
con 10 g/l de glucosa, con respecto a los realizados con 15 g/L. Responda en el análisis preguntas como:
o ¿Con cuál experimento se obtuvo mayor consumo de glucosa?
o ¿Con cuál experimento se obtuvo mayor cantidad de biomasa?
o ¿Cuáles condiciones son más apropiadas para obtener mayor rendimiento y mayor
productividad?
Coloque conclusiones y bibliografía.
8. Formato de presentación
Realice el documento en formato IEEE a una sola columna. El documento debe contener: Título de la
práctica, integrantes, % de participación de cada integrante, Objetivos, Procedimiento en forma de
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Proceso: Guía de laboratorio Formato: Guía de laboratorio Bioprocesos
diagrama de flujo, materiales, reactivos y equipos. Datos, Cálculos, resultados y análisis de resultados,
Conclusiones y Bibliografía. Si se toma alguna fotografía colocarla como anexo. Crear un documento en
PDF y subir un documento por grupo.
9. Bibliografía - Referencias:
Doran, Pauline M., (2010). Principios de la Ingeniería de los Procesos. (4a. edición.) Editorial Acribia.
Madigan M.T, Martinko J.M., Dunlap P.V. and Clark D.P. Brock. (2009). Brock: Biología de los
microorganismos (12a edición), Madrid, Pearson
Shuler M.L, Kargi F.,(2002). Bioprocess Engineering Basic Concepts. (2nd Edition). United States of
America, Prentice Hall.
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