Bioquímica General (BIO-003)

Guía de actividades prácticas

Primer Semestre de 2023

Compilado elaborado por los profesores Robert Cancino, Sebastián Ramírez y el Dr Pablo
Nelson, Sede Santiago.

Última actualización: 23-03-2022

 NORMAS DE SEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN LOS LABORATORIOS

Durante el trabajo en el laboratorio pueden ocurrir accidentes. El objetivo de estas normas es prevenir
tales accidentes.

Se debe ser muy cuidadoso mientras se esté al interior de un laboratorio, vistiendo de una manera
adecuada y protegiéndose convenientemente con un delantal apropiado. No se debe comer ni utilizar el
celular, pues conducen a conductas riesgosas que potencialmente pueden traducirse en un accidente.
No se debe circular o trabajar descuidadamente en los laboratorios; tampoco se debe jugar.

Las siguientes normas, comunes a todos los laboratorios de Ciencias Básicas, buscan propiciar el correcto
desarrollo de su trabajo y el de sus compañeros en el laboratorio, en un ambiente de seguridad personal,
previniendo potenciales accidentes.

Si tiene alguna duda, consulte a su profesor.

VESTIMENTA

 El delantal es una prenda que le protegerá de posibles accidentes por derramamiento o contacto. Por
tanto, debe utilizarlo siempre que trabaje en el laboratorio. Su uso es obligatorio; no traerlo a un
práctico le inhabilita para asistir a la actividad.
 El delantal debe estar abrochado mientras dure la actividad práctica. Se recomienda utilizar delantal
de manga larga, para proteger los antebrazos, y de un largo cercano a las rodillas, para proteger las
piernas.
 Evite el uso de lentes de contacto: al contacto con algunos gases, éstos se pueden secar y/o absorber
los gases.
 Use ropa adecuada: No se permiten sandalias o zapatos abiertos, así como pantalones y faldas cortas.
Recuerde que al trabajar en un laboratorio debe proteger su cuerpo.
 Evite el uso de accesorios: anillos, pulseras, o prendas sueltas (bufandas, pañuelos); éstos pueden
enredarse y causarle un accidente.
 Use el pelo tomado (si corresponde).
 Si presenta heridas, éstas deben estar cubiertas, aunque utilice guantes para trabajar.
 En algunos trabajos prácticos se requiere el uso de guantes y gafas de seguridad. Salpicaduras de
reactivos son posiblemente el riesgo más importante en el laboratorio.
HÁBITOS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

 Siga el protocolo de trabajo indicado por el profesor; NO realice actividades por su cuenta o no
autorizadas por el profesor.
 Lea atentamente la ficha de seguridad de los reactivos a usar en el práctico.
 Antes de utilizar un compuesto, lea el rótulo.
 Utilice sólo los reactivos dispuestos en los mesones de trabajo. No manipule otros reactivos o
instrumentos. No utilice reactivos no etiquetados.
 Nunca trabaje solo en el laboratorio; si debe realizar observaciones a experimentos de más de un día,
coordínese con el encargado del laboratorio.
 No trabaje lejos del mesón, ni ponga objetos en su borde; pueden caerse y provocar un accidente.
 Cuando caliente tubos, siempre emplee pinzas para coger los tubos. El vidrio caliente no se distingue
del vidrio frío.
 Asegúrese que los materiales estén fríos antes de tomarlos. Recuerde que vidrio y metales calientes
no se diferencian a simple vista de los materiales fríos.
 Utilice campana extractora de gases para las operaciones con sustancias tóxicas o volátiles, según le
indique el profesor.
 Cuando determine masas de productos químicos, debe colocar un papel de filtro sobre los platos de
la balanza; esto evitará perder muestra. Si el producto fuera corrosivo, debe utilizar un vidrio de reloj.
 Cuando deba masar reactivos, al retirar la tapa del envase NUNCA la deje apoyada boca abajo. Debe
cerrar los envases inmediatamente después de su uso.
 No fuerce la separación de material de vidrio adherido u obturado. Avise al profesor.
 Verifique que el material que se le entregue esté en buen estado. El empleo de aparatos de vidrio
rotos o trizados pueden hacer fracasar un experimento o bien puede causarle heridas. Evite
accidentes.
 Antes de usar un mechero, se recomienda asegurarse de la ausencia de solventes orgánicos en las
cercanías. Existen solventes orgánicos que son altamente inflamables.
 Lave las manos con abundante agua si toca algún reactivo. Evite llevarse las manos a la cara u ojos.

MANEJO DE RESIDUOS

 Los residuos líquidos se desechan en recipientes adecuados según informaciones dadas por el
profesor. No deseche residuos en el desagüe del laboratorio.
 Si recibe la instrucción de desechar líquidos en el desagüe, debe mantener el agua de la llave siempre
corriendo.
 Los residuos sólidos se depositan en recipientes especiales.
 La gestión de otros residuos peligrosos será informada por el profesor cuando sea necesario.
 Evite riesgos; sea cuidadoso al manipular residuos peligrosos.
 Nunca caliente un tubo de ensayo dirigiéndolo hacia sí o hacia algún compañero; generalmente
cuando se calientan sustancias líquidas éstas se proyectan violentamente.
 Cuando encienda un mechero abra parcialmente la llave del gas, manteniendo su cara lejos del
mechero. Si abre totalmente la llave de gas y/o mantiene su la cara sobre el mismo, puede provocar
un accidente (la presión del gas produce una llama bastante larga que podría causarle quemaduras).
 Mantenga el rostro lejos de toda clase de reactivos cuando va a verificar por primera vez alguna
reacción química.
 No huela u olfatee las sustancias directamente. Si desea conocer el olor de una sustancia, abanique
un poco de vapor, moviendo la mano sobre la sustancia o el recipiente que la contiene.
 No toque los productos químicos con las manos ni los pruebe o acerque a su boca. Así mismo, debe
evitar exponerse a sus vapores.
 No introduzca objetos dentro de los envases de reactivos (espátulas o cucharillas) sin asegurarse que
estén completamente limpios. No cambie la tapa de los envases por ningún motivo.
 No devuelva los sobrantes de reactivos a los frascos de origen.
 No pipetee reactivos con la boca. Utilice una bomba manual, propipeta o jeringuilla. Si el envase es
muy grande, saque un volumen de reactivo en un vaso de precipitado o en un tubo de ensayo y mida
desde allí el volumen deseado.
 CUANDO PREPARE SOLUCIONES ÁCIDAS, NUNCA AGREGUE AGUA AL ÁCIDO, pues podría provocar
una proyección altamente peligrosa. Siempre agregue el ácido al agua lentamente, procurando alejar
su rostro de la solución.
 Los productos químicos inflamables (gases, alcohol, éter u otros), no deben estar cerca de fuentes de
calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará a baño María, nunca directamente a la
llama.

EN CASO DE ACCIDENTES

ACCIDENTES - EN TODOS LOS CASOS AVISE AL PROFESOR.

 Si vierte cualquier ácido o producto corrosivo sobre la piel, lávese inmediatamente con abundante
agua durante 10-15 minutos. Quítese la ropa y objetos mojados por el derrame.
 Si la salpicadura es en los ojos, emplee el lavaojos durante 10-15 minutos.
 Ácidos en la ropa: Si cae ácido en la ropa, aplique inmediatamente una solución de amoniaco.
 En cualquier tipo de incendio, cierre inmediatamente toda llave de salida de gas.
 Fuego en la ropa: Cubra inmediatamente con una manta o con una toalla. Si es necesario, use la
ducha de agua.
 Incendio de reactivos: Cuando hay incendios en vasos o frascos de laboratorio, tape inmediatamente
la boquilla de éstos con una plancha de asbesto o con una toalla húmeda. Para incendios mayores use
el extinguidor de anhídrido carbónico.
 ESTRUCTURA DEL REPORTE DE ACTIVIDADES DE LABORATORIO

REPORTE DE ACTIVIDAD PRÁCTICA

Generalidades: El trabajo debe ser escrito en letra Times New Roman, Calibrí o Arial tamaño 12, con un
interlineado de 1,5 y el texto ajustado a la derecha. La hoja debe ser tamaño carta, con márgenes derecho e
izquierdo de 3 cm. La extensión máxima del trabajo son 3 páginas, sin considerar la portada o los anexos con
tablas, gráficos y figuras.

Portada (sin numeración) (0, 5 puntos) + (0,5 puntos ortografía)

REPORTE DE LABORATORIO

Título del Trabajo Práctico

Asignatura: BIO-003

Nombre de Autores (Orden alfabético por Apellidos: elimine todo este paréntesis)
Nombre de Docentes del práctico (Primero el profesor y luego el ayudante: elimine
todo este paréntesis)

Fecha de realización: X de XX de 2023

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PÁGINA 1

Resumen de la actividad (entre 10 y 15 líneas) + Objetivos (1,0 punto)

Breve descripción del trabajo práctico efectuado en uno o dos párrafos de máximo 15 líneas. Al final se
incluyen los objetivos. Estos no son considerados en las 15 líneas.

Se debe presentar en forma resumida la información del tema al lector, para que éste se forme una idea
general y completa del trabajo realizado. Primero, una breve reseña del tema a tratar (ej: Las enzimas son…).
Posteriormente lo que se realizó, sin incluir detalles del procedimiento experimental, los resultados obtenidos
y la conclusión general que se desprende de ellos.

Finalmente, se deben incluir los objetivos del trabajo, redactados en el párrafo, y no como punteo.

Metodología (0,5 puntos) (media página)

Describe el trabajo práctico paso a paso según el método y las técnicas utilizados, tal como se procedió en el
laboratorio, no como se hubiera querido realizar, sino que como se hizo realmente.

La elaboración de esta sección no es la copia del protocolo experimental de la guía de laboratorios. Tampoco se
debe realizar un listado de los materiales utilizados en el desarrollo del práctico, sino mencionarlos a medida
que se describe el procedimiento. Siempre en tiempo pasado, porque ya ocurrió.

PÁGINA 2
Resultados (1,0 punto) (media página)

Contiene un registro cuidadoso, ordenado y completo de todos los datos e información recopilados, así como
una descripción de los resultados obtenidos. Los resultados deben estar apoyados en tablas, gráficos o figuras,
los que pueden ir como anexo a este reporte. En el texto, éstas deben ser citadas o referidas (Ej: Como se
observa en la Figura XX, o Según los datos de la Tabla XX). Además, debe ser cuidadoso en el uso unidades de
medida, y cada y cada tabla, figura o gráfico debe tener su propia leyenda explicativa.

Los resultados se refieren solo a lo que ud obtuvo en el laboratorio, y no a lo que indica la literatura. En esta
sección, no debería haber referencias.

7
PÁGINAS 2 y 3

Discusión (1,5 puntos) (una página)

Es un análisis de la calidad de los resultados experimentales obtenidos, comparándolos con referencias

conocidas u otros datos en la bibliografía. Se dan explicaciones oportunas, coherentes y basadas en evidencia
entregada en las referencias. Se aportan ideas basadas en otros estudios similares sobre cómo interpretar
dichos resultados. En esta etapa es de vital importancia consultar la literatura pertinente.

La discusión siempre debe estar formulada en base a los resultados obtenidos, sin estar repitiendo la
información. No es un resumen de resultados. Debe restringirse a los aspectos significativos del trabajo, sus
implicancias y proyecciones. Es necesario que conecte los resultados y proyecciones con su futuro laboral como
personal del área de la salud.

Durante la actividad práctica, el profesor le hará preguntas críticas, que deben ser abordadas en esta sección,
de manera conectada a el resto del texto. No responda como cuestionario, sino que redacte coherentemente
en el contexto de la discusión.

PÁGINA 3

Conclusión (0,5 puntos) (entre 3 a 5 líneas)

Las conclusiones están directamente referidas a los objetivos del práctico, por tanto, generalmente son pocas y
puntuales. Evite como conclusiones, afirmaciones (aunque correctas) que no sean consecuencia directa del
experimento realizado. Verifique hasta qué punto los objetivos de la experiencia fueron alcanzados. Evite
colocar como conclusión: “los objetivos se lograron”; “aprendimos mucho”; “fue bonito”; etc.

Referencias (0,5 puntos) (no menos de 3 referencias)

Incluye un listado de referencias bibliográficas (libros y revistas en papel), páginas Web, archivos informáticos u
otra, especificadas claramente, y con detalles para ser rastreadas y encontradas fácilmente para consulta. Esta
Guía de Prácticos no es una fuente bibliográfica.

Las citas bibliográficas se indican en números arábigos entre ( ) enumeradas de acuerdo a su orden de
aparición, y debe utilizarse la norma de referencia tipo Vancouver.

Existen numerosos gestores de referencias online y gratuitos a los cuales puede recurrir. Además, existen
plataformas como Mendeley o EndNote, que se acoplan a su procesador Word para desarrollar referencias.

8
ANEXO N° 1: Reforzamiento de pH.

Disociación del agua.

El agua como electrolito débil, es capaz de disociarse en muy escasa proporción según la siguiente
reacción:
−¿K eqH O =¿¿¿
+¿+ OH ¿
H2O ↔ H
2

Esta reacción es capaz de originar tanto protones (H +) e hidroxilos (OH-), dándole al agua características
anfotéricas (sustancia capaz de recibir y donar protones). El producto iónico del agua (K w) viene
determinado por la multiplicación de la K eq de la disociación del agua con la concentración del agua no
disociada (55.5 M), siendo su valor igual a 1x10 -14.

K w =¿

En el agua pura, la concentración de [OH -] y [H+] es igual a 1x10-7M. Como Kw es una constante, las
concentraciones de H+ y OH- guardan una relación inversa: si una de ellas aumenta, la otra disminuye.

El pH

El pH es una medida que nos permite calcular la acidez o basicidad de una solución a partir de la
concentración de protones presentes en la muestra. Los valores de pH están comprendidos en una
escala de 0 a 14. El valor medio es 7, el cual corresponde a una solución neutra. Para los valores que se
encuentran por debajo de 7, se consideran soluciones ácidas ([OH -] < [H+]) y todos los valores por encima
de 7 corresponden a soluciones básicas o alcalinas ([OH -] > [H+]).

Para poder calcular el pH, pOH o pKa se utiliza la función matemática p, que es igual a – log de lo que se
quiere determinar. Por lo tanto, en una solución se podría determinar tanto el:

pH=−log ¿ ¿

Debido a que el pH es una medida inversa de la concentración de protones en una solución, se puede
afirmar entonces que, a mayor valor del pH, menor es la concentración de protones y por tanto es
menor acidez de la solución o viceversa.

Naturaleza de los Ácidos y Bases

La fuerza de un ácido o de una base está determinada por su tendencia a perder o a ganar protones.
Para esto poseemos distintas referencias sobre el comportamiento de estas especies. En el caso de un
ácido, tenemos la constante de disociación ácida (K a), y para una base, la constante de disociación básica
(Kb). Ambas son medidas cuantitativas que nos ayudan a saber la fuerza de un ácido o una base en
solución. Es así que a mayor Ka o Kb, mayor es la fuerza del ácido o la base (relación directamente
proporcional).

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A partir de su comportamiento en solución, los ácidos y bases pueden dividirse en fuertes y débiles.

 Ácidos y Bases fuertes: Se disocian completamente en solución, o sea tienen el equilibrio de

disociación muy desplazado hacia los productos. Los valores de las constantes son mayores a
uno (Ka>>1).

−¿¿
+¿+ A ¿
a) HA → H (Ácido Fuerte (HA), libera protones al medio)
−¿¿
b) BOH → B+¿+OH ¿
(Base Fuerte (BOH), libera hidroxilos al medio)

Nota que la flecha de la ecuación es unidireccional, lo que indica que el

equilibrio está totalmente desplazado hacia los productos

 Ácidos y Bases débiles: Se disocian parcialmente en solución. Posee el equilibrio de disociación

desplazado hacia los reactantes. Sus constantes poseen valores bajo uno (K a<1) y existe un
equilibrio entre reactantes y productos.

−¿¿
a) HA ↔ H +¿+ A ¿
(Ácido débil (HA), Ka<1)
−¿¿
b) BOH ↔ B+¿+OH ¿
(Base débil (BOH), Kb<1)

Nota que la flecha de la ecuación es bidireccional, lo que indica un

equilibrio entre reactantes y productos.

En el caso de los ácidos débiles (HA) al disociarse forman una sal o base conjugada (A -), en cambio las
bases débiles (BOH) forman un ácido conjugado (B +). En el estudio del metabolismo nos encontraremos
con diversos ejemplos de ácidos débiles y su disociación. Así, por ejemplo, el ácido láctico se disocia
dando protones y su sal o base conjugada, denominada lactato, mientras que el ácido pirúvico se disocia
para dar protones y piruvato.

Soluciones Amortiguadoras

Las células que conforman a los seres vivos funcionan de manera adecuada cuando se mantiene entre
ciertos parámetros relativamente constantes, como son la temperatura, la adecuada producción de
energía, los niveles de sales, agua y nutrientes, así como el pH intra y extra celular. Una característica
importante de los seres vivos es su capacidad de mantener estos parámetros constantes, a pesar de
cambios en el medio ambiente, lo que se denomina homeostasis. Sin embargo, como los fluidos que
rodean a las células están formados por agua y sustancias disueltas, son susceptibles a tener variaciones

10
en su pH dependiendo de la nutrición del organismo o de reacciones metabólicas normales. Si estos
cambios en el pH son bruscos, pueden llegar a afectar la homeostasis del organismo, produciendo graves
alteraciones a nivel funcional, lo que puede causar enfermedades o incluso la muerte. Para mantener la
homeostasis del pH, o sea que no existan cambios bruscos de pH, a pesar de adición de ácidos o bases,
los seres vivos utilizan soluciones denominadas amortiguadoras o tampones.

Un sistema amortiguador es una solución de dos o más sustancias cuya combinación evita variaciones
extremas de pH al agregar un ácido o base. Generalmente está constituido por un ácido débil (AH) y su
correspondiente sal o base conjugada (A). Su poder amortiguador está dado por la proximidad de su pK
(pK= -log Ka) al valor normal del pH y por la concentración de sus componentes. Es así que, cuando las
concentraciones del ácido débil y su base conjugada tienden a ser iguales, se alcanza la máxima
eficiencia amortiguadora.

El pH de una solución amortiguadora se puede determinar mediante la ecuación de Henderson –

Hasselbalch, que permite el cálculo del pH para determinar el grado de acidez o alcalinidad de una
solución. En la formula expuesta a continuación, la variable [A -] representa la concentración de la sal o
base conjugada y [AH] la concentración del ácido débil.

pH = p K a + log¿ ¿ ¿

a)

11
ANEXO N° 2: Funciones y Gráficas.

Las funciones permiten describir el mundo real en términos matemáticos. Ejemplos de esto son: las
variaciones de temperatura, el movimiento de los planetas, las ondas cerebrales, los ciclos comerciales,
el ritmo cardiaco y el crecimiento poblacional entre otros fenómenos.

La función más usual utilizada en la modelación de fenómenos es la función lineal (y = mx + n), aplicadas
generalmente a la realización de curvas de calibración en laboratorios.

Y=mX+n

Existen otras funciones que grafican comportamientos bioquímicos, las que no siguen una tendencia
lineal. De este modo, la ecuación matemática de una recta no aplicaría. En los animales, tanto la
Hemoglobina (Hb) como la Mioglobina (Mb) son proteínas que tienen la capacidad de unir oxígeno. Al
graficar su comportamiento se obtienen curvas con tendencia sigmoidea e hiperbólica, respectivamente.

12
En el caso de las enzimas, los catalizadores biológicos, también tienden a generar gráficas con
comportamiento sigmoideo e hiperbólico. Una característica matemática de las funciones hiperbólicas es
que, si los ejes x e y son graficados en forma recíproca, se obtienen datos con tendencia lineal, siendo
esta última de mayor utilidad para efectos prácticos y son denominadas gráficas de doble recíproco.

Cinética Michaelis Menten

(Comportamiento Hiperbólico)

Dobles recíprocos - Ecuación

Lineweaver - Burk
(Comportamiento lineal)

Regresión lineal en la calculadora.

La regresión lineal es una herramienta de estadística que

sirve para predecir una medida en función de otra medida.
La fórmula que representa una regresión lineal simple es:
y = mx + n,

en donde “x” es la variable explicativa (independiente) e “y”

la variable explicada (dependiente). La variable “m”
representa la pendiente de la recta y “n” la intercepción de
la recta con el eje y (valor de y, cuando X=0).

En la calculadora la formula viene representada por:

y = Bx + A,

13
en donde B representa la pendiente y A el intercepto.

¿Cómo ingresar los datos a la calculadora?

1) La fórmula de regresión lineal viene dada por y = Bx + A.

2) Previamente se tabulan los datos, generando una tabla que se divide en variables x e y, para esta
explicación se utilizara la siguiente tabla, en donde se describe el comportamiento de presión
atmosférica en relación a la temperatura.

Temperatura Presión
(°C) Atmosférica (hPa)
10 1003
15 1005
20 1010
25 1011
30 1014

3) Para ingresar los datos a la calculadora previamente se debe borrar la memoria, presionando
SHIFT + MODE + “3” + =.

4) Luego para ingresar al modo de regresión lineal, se debe presionar la tecla MODE y buscar la
opción REG, y elegir la opción LIN (identifica con ese nombre la opción de regresión lineal).

5) Ingresar las coordenadas x e y en este mismo orden. Ejemplo; la primera coordenada viene dada
por 10°C y 1003 hPa. El modo de ingreso es anotar 10 + + 1003, y por último la tecla M+ para
grabar la coordenada ingresada. Se debe repetir el mismo procedimiento con todas las
coordenadas.

6) Por último, para obtener el valor de B (la pendiente) se debe presionar el botón SHIFT + 2, y
seleccionar la opción B y presionar la tecla =. Para obtener el valor de A (intercepto con el eje y)
se debe presionar el botón SHIFT + 2, seleccionar la opción A y presionar la tecla =.

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 ACTIVIDAD N° 2
pH y Soluciones Buffer.

APRENDIZAJES ESPERADOS

 Determinar gráficamente la curva de titulación de un ácido.

 Determinar los intervalos de pH en que una especie se comporta como buffer.

INTRODUCCIÓN

La regulación del pH es importante en muchas reacciones químicas, como así también en el control de
procesos metabólicos dentro de nuestro organismo y la mantención de la homeostasis.

Una solución amortiguadora (tampón o buffer) corresponde a la combinación de un ácido débil y su base
conjugada, y tienen la propiedad de mantener estable el pH de una solución frente a la adición de
cantidades pequeñas de ácidos o bases fuertes. Debido a que las soluciones amortiguadoras presentan
efecto de ión común, es posible aplicar la ecuación de Henderson – Hasselbalch con la finalidad de
prepararlas:

[ base conjugada ( sal )]

pH = p K a + log
[ácido]

En la mantención de la homeostasis, encontramos diversos sistemas de soluciones amortiguadoras,

como por ejemplo el buffer fosfato o bicarbonato. El ácido fosfórico (H 3PO4, pK1= 2,14; pK2= 6,86;
pK3=12,4) es un ácido poliprótico que presenta tres equilibrios de ionización, asociado cada uno a una
constante de disociación ácida distinta.
−3
+ ¿+ PO ¿
−2 4
+ ¿+ HP O ↔ H ¿
−¿↔ H 4
¿
+¿+H 2 P O 4 ¿
H 3 P O4 ↔ H

Dentro de las células, la alta concentración de fosfato favorece la formación de soluciones

amortiguadoras en base a este compuesto. A pH fisiológico la especie ácida del buffer es un fosfato
monobásico (H2PO4-), mientras que la base conjugada corresponde a un fosfato dibásico (HPO 4-2).
−2
+ ¿+ HPO 4 pK 2 =6.86 ¿
−¿ ↔ H ¿
H 2 P O4

Químicamente, el valor del pK indica que a ese pH el equilibrio de la reacción dictamina una disociación
del 50%, es decir tendremos igual cantidad de ácido (H 2PO4-) y de base conjugada (HPO 4-2). La capacidad
buffer de esta mezcla se mantendrá en un rango de ±1 el valor del pK, o sea, entre 5,86 y 7,86.

15
Adicionalmente, especies como los aminoácidos pueden actuar como agentes tamponantes, variando su
grado de disociación o desprotonación. Estas especies biológicas pueden actuar como ácidos dipróticos o
tripróticos, donde siempre el pK1 corresponderá a la reacción de desprotonación del ácido carboxílico,
mientras que el pK2 se asocia a la desprotonación del grupo amino. En el caso de ser un aminoácido con
su radical ácido o básico, la desprotonación de esta especie estará ligada al pK R.

Como ejemplo de un aminoácido que se comporta como ácido diprótico encontramos a la glicina, cuyos
valores de pK son 2,34 y 9,60 (pK 1 y pK2, respectivamente). Debemos recordar que la capacidad
tamponante se asocia a la mezcla, en concentraciones similares de un ácido y su base conjugada, por lo
que la capacidad de servir como un buffer para la glicina está en torno a sus valores de pK. Es por ello
que, este aminoácido al ser titulado presentará dos regiones de acción característica para un buffer,
entre los rangos de pH 1,34 – 3,34 y 8,60-10,60, lo que implica que no serviría como tampón fisiológico.

16
MATERIALES, REACTIVOS Y SOLUCIONES

1. Comparación entre la capacidad amortiguadora del suero salino, un buffer y un aminoácido.

 Pipetas plásticas 3 mL.
 Gradilla con tubos de ensayo.
 Solución de suero salino (NaCl 0,9% p/v).
 Buffer Fosfato pH 7 (100 mM Na2HPO4; 72 mM NaH2PO4).
 Glicina 0,05M; pH 7 (alternativamente puede ser otro aminoácido: alanina, histidina glutamato)
 Solución de HCl 0,1 M.
 Solución de NaOH 0,1 M.
 Solución de Azul de Timol.

2. Determinación de la curva de titulación para un ácido débil.

 pHmetro – Mínimo 3 unidades
 Vaso precipitado 100 mL o más - 7 unidades
 Matraz Erlenmeyer 250 mL – 7 unidades
 Bureta 50 mL, pinzas y soporte universal - 7 unidades
 Probeta 50 mL - 7 Unidades
 Solución de ácido láctico 0,05 M, ajustado a pH 1,5 a 2,0 – 400 mL
 Solución de NaOH 0,1 M – 400 mL
 Solución de Azul de Timol.

METODOLOGÍA

Uso pHmetro

1. Retire la cubierta protectora del electrodo.

2. Lave electrodo con agua destilada.
3. Calibre el pHmetro con soluciones estándar.
4. Lave el electrodo con agua destilada.
5. Sumerja el extremo inferior del electrodo
completamente en la solución que desea medir.
6. Cuando el valor en el medidor digital se estabilice, registre el valor pH.
7. Retire el electrodo de la solución y lave con agua destilada.
8. Al finalizar, coloque nuevamente la cubierta protectora del electrodo y apague el equipo.

Para mayor información, vea el siguiente link:

17
[Link]

ACTIVIDADES

1. Comparación entre la capacidad amortiguadora del suero salino, un buffer y un aminoácido.

a) Prepare un set de 9 tubos que contengan:

Tubo
Solución
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Suero salino (mL) 11 10 10 -- -- -- -- -- --
Buffer fosfato pH 7 (mL) -- -- -- 11 10 10 -- -- --
Glicina 0,05M; pH 7 (mL) -- -- -- -- -- -- 11 10 10
Azul de timol 5 gotas a cada tubo

b) Homogenice los tubos y registre el color inicial de los tubos.

c) Adicione el ácido fuerte (HCl) o base fuerte (NaOH) a los tubos correspondientes:

Tubo
Solución
1 2 3 4 5 6 7 8 9
HCl 0,1M (mL) -- 1 -- -- 1 -- -- 1 --
NaOH 0,1M (mL) -- -- 1 -- -- 1 -- -- 1

d) Homogenice los tubos y registre el color final de los tubos.

e) Analice e interprete los resultados obtenidos.

RESULTADOS

Tabla 1: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
Tubo
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Color
inicial
Color
final

Modificaciones de protocolo y apuntes

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

18
2. Determinación de la curva de titulación para un ácido débil.

a) Mida con probeta 50 mL de una solución de ácido láctico 0,05 M. Posteriormente, transfiéralos a
un matraz Erlenmeyer 250 mL limpio.

b) A la solución dispuesta en el matraz, adicione 10 gotas de azul de timol y mida el pH, utilizando
pHmetro. Registre el valor y el color de la solución en la Tabla 1.

c) Llene una bureta de 50 mL con solución patrón de NaOH 0,1 M.

d) Incorpore una alícuota de 5 mL de NaOH a la solución de ácido láctico en el matraz, luego, mida
el pH con pHmetro. Registre el valor y el color de la solución en la Tabla 1.

e) Repita adición de NaOH hasta completar los 50 mL de solución patrón. Registre el valor y color
de cada medición en la Tabla 1, y determine la concentración de OH - añadidos al matraz en cada
punto de adición.

RESULTADOS I

Tabla 1: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
Volumen Color
[OH-] (M) pH
NaOH (mL) solución
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50

19
 RESULTADOS II

1. Construya un gráfico de dispersión de puntos, con la curva de titulación del aminoácido,

utilizando como variable dependiente (Y)_________________ y variable independiente
(X)___________________.

Gráfico 1: (agregue su descripción) ____________________________________________________

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

Analice y explique cada zona de amortiguación y punto de inflexión de la curva obtenida.

Determine donde se encuentra el punto isoeléctrico (pI).
Modificaciones de protocolo y apuntes

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

20
 ACTIVIDAD N° 3
Cuantificación Espectrofotométrica de Proteínas.

APRENDIZAJES ESPERADOS

 Aplicar los fundamentos teóricos la espectrofotometría.

 Determinar la concentración de proteínas en solución.

INTRODUCCIÓN

Los aminoácidos son moléculas biológicamente relevantes ya que cumplen una serie de funciones en los
organismos vivos: pueden participar como agentes transportadores, en señalización intercelular
(neurotransmisores), precursores energéticos, reguladores del pH, y constituyen la unidad básica en la
formación de proteínas. Las proteínas son clave en la función y arquitectura celular: las enzimas, los
transportadores, los receptores, los anticuerpos o el citoesqueleto están constituidos por proteínas.

La determinación de la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina

básica a la hora de purificar una proteína y determinar su actividad, o para el diagnóstico clínico de
enfermedades. Se han descrito numerosos protocolos que permiten determinar la concentración de
aminoácidos y proteínas en una muestra, aunque la elección del método dependerá del origen de la
muestra, los posibles interferentes que estén presentes o de la sensibilidad del método.

Uno de los métodos más sencillos para el reconocimiento y cuantificación de proteínas se basa en la
propiedad intrínseca que presentan los aminoácidos aromáticos para absorber luz en el espectro
ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 280nm. Por otra parte, existen diversos métodos que se
basan en la generación de complejos de coordinación coloreados con las proteínas, y permiten la
cuantificación de estas moléculas en el espectro visible (Vis), destacándose los ensayos de Biuret, Lowry
y Bradford.

En todo método espectrofotométrico, la cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al

espesor del medio y a la concentración de la proteína. De esta manera, si se mantiene constante el
espesor del medio, la absorción de luz por una proteína en solución acuosa será proporcional a su
concentración molar, según la ley de Lambert-Beer:
DO=ε 0 ×C ×l

Donde DO es la Densidad Óptica o Absorbancia de la sustancia, medida por el espectrofotómetro; Ɛ0 es

el coeficiente de extinción molar o absortividad molar, que define cuan fuertemente una molécula
absorbe la luz a una longitud de onda particular; C es la concentración y l es el espesor de la celda
utilizada para la medición. Si las sustancias siguen la ley de Lambert-Beer, entonces hay una relación
lineal en ciertos rangos, entre la Absorbancia (DO) y su concentración. Si hay una relación lineal entre la
absorbancia y diferentes diluciones (soluciones de diferentes concentraciones, de valor conocido) de una

21
sustancia conocida (estándar), se puede confeccionar una curva de calibración para determinar la
concentración de la otra solución de concentración desconocida

MATERIALES, REACTIVOS Y SOLUCIONES

1. Reconocimiento y cuantificación de aminoácidos y proteínas por absorbancia a 280 nm (A 280).

 Baño Termoregulado.
 Espectrofotómetro UV-Visible.
 Cubetas de cuarzo de 3 mL.
 Gradilla con tubos de ensayo.
 Micropipetas p1000 y cajas puntas azules.
 Pipeta graduada 10 mL.
 Guantes S/M/L.
 Solución de suero salino (NaCl 0,9% p/v).
 Solución de Glicina 0,025 mg/mL, preparada en suero salino.
 Solución de Triptófano 0,025 mg/mL, preparada en suero salino.
 Solución Seroalbúmina de bovino (SAB) 1 mg/mL, preparada en suero salino

2. Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

 Baño Termoregulado – 1 Unidad a 50°C.
 Espectrofotómetro UV-Visible – Mínimo 2 unidades
 Gradilla con tubos de ensayo – 7 unidades
 Cubetas de plástico de 3 mL – Una caja
 Micropipetas p1000 y cajas puntas azules – Mínimo 3 unidades
 Pipeta graduada 10 mL – 7 unidades
 Propipeta – 7 Unidades
 Guantes S/M/L.
 Solución de suero salino (NaCl 0,9% p/v) – 200 mL
 Solución Seroalbúmina de bovino (SAB) 12mg/mL preparada en suero salino - 200 mL
 Reactivo de Biuret – 200 mL
 Muestra Problema.

22
METODOLOGÍA

Uso espectrofotómetro

1. Encienda el equipo.

2. Seleccione la longitud de onda (λ) en la que

desea medir sus muestras.

3. Coloque la cubeta con su solución blanco en el

carril. Verifique que la cubeta queda en la
posición correcta, y cierre la tapa.

4. Ponga autocero en el equipo.

5. Coloque su muestra en el carril

correspondiente, cierre la tapa y espere a
que el valor de absorbancia se estabilice.

23
 ACTIVIDADES

1. Reconocimiento y cuantificación de aminoácidos y proteínas por absorbancia a 280 nm (A 280).

a) Utilice micropipeta p1000 para preparar un set de 4 tubos de ensayo con las siguientes
soluciones:

Tubo
Solución
1 2 3 4
Suero fisiológico (mL) 3 -- -- --
Glicina (mL) -- 3 -- --
Triptofano (mL) -- -- 3 --
Seroalbúmina de
-- -- -- 3
bovino (SAB) (mL)

b) Mida correctamente la absorbancia a 280 nm (A 280), utilizando cubeta de cuarzo.

RESULTADOS

Tabla 1: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
Concentración Concentración
Muestra A280 teórica experimental
(mg/mL) (mg/mL)
Suero fisiológico
Glicina
Triptófano
SAB
1.
2. Determine la concentración experimental de las muestras, utilizando la ecuación de Lambert-
Beer (asuma espesor de la celda, l= 1cm). Exprese sus resultados en unidades de mg/mL.
3.
A280 =ε 280 ×C × l

Glicina Triptófano SAB

-1 -1
Absortividad molar a 280 nm [ε280] (M cm ) 1.990 5.690 43.824
Peso molecular (g/mol) 75,07 204,23 66.463
4.
5. Analice y compare las concentraciones obtenidas con los valores teóricos.
6.

24
2. Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.

En esta actividad, se determinará la concentración de proteínas en dos muestras problema a partir de la

construcción de una curva de calibración utilizando una solución estándar de Seroalbumina de Bovino
(SAB) de concentración conocida de 5 mg/mL.
a) Utilice micropipeta p1000 para preparar un set de 8 tubos de ensayo con las siguientes
soluciones:

Tubo
Solución
1 2 3 4 5 6 MP1 MP2 MP3
Suero salino (mL) 2,0 1,9 1,8 1,5 1,0 0,5 -- --
SAB 12mg/mL (mL) -- 0,1 0,2 0,5 1,0 1,5 -- --
Muestra Problema [MP] (mL) -- -- -- -- -- -- 2,0 2,0 2,0
Reactivo Biuret (mL) 2,0 a cada tubo
b) Mezcle suavemente y sin agitar, luego, incube durante 5 minutos a 50°C o 10 minutos a
temperatura ambiente.
c) Transcurrido el tiempo, mida la absorbancia a 540nm (A540), utilizando cubetas plásticas.

RESULTADOS I

Tabla 1: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
[Proteínas]
Tubo A540
(mg/mL)
1
2
3
4
5
6
MP1
MP2
MP2

Determine la concentración de proteínas [Proteínas] de los tubos 1-6, utilizando la fórmula de

diluciones:
C 1 ×V 1 =C2 ×V 2

Siendo C1 la concentración de proteínas (SAB) original desde donde se prepararon todos los
tubos, correspondiente a _________ mg/mL; V1 es el volumen de SAB tomado para preparar
cada uno de los tubos (distinto en cada uno); V2 es el volumen final de todos los tubos, que
corresponde a _________ mL. Finalmente, C2 es la concentración de proteínas presente en el

25
 tubo, que es lo que se quiere determinar.
RESULTADOS II

2. Construya un gráfico de dispersión de puntos, con la curva de calibración, utilizando como

variable dependiente (Y) ______________________ y como variable independiente (X)
________________________.

Gráfico 1: (agregue su descripción) ____________________________________________________

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
1. A partir del gráfico, es necesario obtener una regresión lineal de estos datos, representada de
manera general como:
y=m x+ n
La importancia de esta regresión lineal es que relaciona las dos variables representadas de tal
manera que, si se conoce una de ellas, es posible obtener el valor de la otra simplemente
reemplazando el dato de la variable conocida en la función matemática y despejando la
incógnita.

26
27
 RESULTADOS III

3. Utilice la ecuación de regresión lineal, para obtener los valores de [Proteínas] de las muestras
MP1 y MP2. Recuerde multiplicar los valores obtenidos por los correspondientes factores de
dilución.
4.
Tabla 2: (agregue su descripción) ______________________________________________________
______________________________________________________________________________
[Proteínas] obtenido [Proteínas] referencial
Muestra Problema (MP)
(mg/mL) (mg/mL)
1
2
3

2. Analice y compare los valores de [Proteínas] obtenidos con los valores referenciales disponible
en la literatura.

Modificaciones de protocolo y apuntes

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

28
 ACTIVIDAD N° 4
Enzimología: Efecto del pH y temperatura en la actividad enzimática.

APRENDIZAJES ESPERADOS

 Manejar procedimientos de laboratorio básicos para la manipulación de muestras biológicas.

 Evaluar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de una enzima.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metabólicos a
velocidades compatibles con la vida, contribuyendo además a su regulación. Debido a su naturaleza
proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que
pueden alterar su estructura nativa, provocando su desnaturación. En general una reacción química
aumenta su velocidad de reacción al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones
catalizadas por enzimas humanas, este efecto se observa hasta los 40 °C, ya que a temperaturas
mayores la enzima se desnatura. Existen otros casos, por ejemplo, las bacterias termófilas, en las cuales
las enzimas pueden funcionar en rangos de temperatura que llegan hasta los 100 °C.

Debemos considerar que las enzimas presentan numerosos grupos ionizables en su estructura, dados
por los radicales de sus aminoácidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de
ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad
catalítica.

29
Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad máxima a un valor de pH
denominado pH óptimo. Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia de tampones o
amortiguadores de pH. Cambios drásticos en la [H +] tienen la capacidad de desplegar la estructura
tridimensional nativa de una proteína provocando su desnaturalización.

MATERIALES, REACTIVOS Y SOLUCIONES

1. Actividad enzimática de la fosfatasa alcalina

 Baño Termoregulado.
 Espectrofotómetro UV-Visible.
 Cubetas de plástico 3 mL.
 Gradillas con tubos de ensayo
 Micropipetas p1000 y p100/200.
 Guantes S/M/L.
 Solución de NaOH 0,5M.
 Solución buffer citrato 0,3M pH 3.
 Solución buffer citrato 0,3M pH 6.
 Solución buffer Tris 0,5M pH 8.
 Solución buffer carbonato 0,1 M pH 10.
 Solución de p-nitrofenil fosfato (p-NPP) 0,02M.
 Solución de enzima fosfatasa alcalina 1 mg/mL.

30
ACTIVIDADES

1. Actividad enzimática de la α-amilasa salival

1.1 Extracción y tratamiento de la enzima α-amilasa salival (Preparación Enzimática).

a) Mida en un vaso de precipitado un volumen aproximado de 50 mL de suero salino.

Posteriormente, realice un enjuague bucal durante 30 segundos y devuelva la solución (muestra
de extracción) al vaso de precipitado.

b) Filtre, con ayuda de un embudo de vidrio cónico y una mota de algodón, la muestra de
extracción hacia un matraz Erlenmeyer. Hacia el final del proceso, presione enérgicamente el
algodón para enriquecer su preparación enzimática, asegurándose de tener al menos 40 mL para
trabajar.

c) Con pipeta graduada, prepare un set de 4 tubos que contengan:

Tubo
Solución 1a 2a 3a 4a
Preparación enzimática (mL) 10 10 10 10
HCl 0,5M -- 1 gota* 6 gotas* --
* Asegúrese de adicionar el ácido correctamente en la solución y no por la pared del tubo.

d) Homogenice y determine el pH de cada tubo con ayuda de un papel pH.

e) Incube las preparaciones durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.

RESULTADOS I

Tabla 1: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
Tubo
1a 2a 3a 4a
pH solución
Los tubos 1a, 2a y 3a se utilizarán en las actividades 1.2 y 1.3; el tubo 4a será para la actividad 1.4.

Modificaciones de protocolo y apuntes:

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

31
______________________________________________________________________________

32
1.2 Efecto de la disminución del pH en la catálisis de la α-amilasa salival.

a) Utilice una micropipeta p1000 para preparar un set de 4 tubos de ensayo con las siguientes
soluciones:

Tubo
Solución 1b 2b 3b 4b
Suero salino (mL) 4 2 2 2
Preparación enzimática 2 mL 2 mL 2 mL
--
[preparado en 1.1] (mL) Tubo 1a Tubo 2a Tubo 3a
Almidón 1% p/v (mL) 2 2 2 2

a) Homogenice y determine el pH de cada tubo con ayuda de un papel pH.

b) Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, identifique el

control positivo, negativo y experimental para comparar el resultado de la catálisis.

c) Finalizado el tiempo de incubación, agregue 3 gotas de Lugol a cada tubo para visualizar el
resultado.

d) Medir la absorbancia de cada tubo a 570 nm.

RESULTADOS II

Tabla 2: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
Tubo
1b 2b 3b 4b
pH solución

Abs a 570 nm
7.
Modificaciones de protocolo y apuntes
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

33
1.3 Determinación de la actividad remanente de la enzima α-amilasa salival luego ser tratada con
ácidos y posterior amortiguación a pH 7.

a) Utilice una micropipeta p1000 para preparar un set de 4 tubos de ensayo con las siguientes
soluciones:

Tubo
Solución 1c 2c 3c 4c
Buffer fosfato pH 7 (mL) 2 2 2 2
Suero salino (mL) 4 2 2 2
Preparación enzimática 2 mL 2 mL 2 mL
--
[preparado en A] (mL) Tubo 1a Tubo 2a Tubo 3a
Almidón 1% p/v (mL) 2 2 2 2

b) Homogenice y determine el pH de cada tubo con ayuda de un papel pH.

c) Incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, identifique el

control positivo, negativo y experimental para comparar el resultado de la catálisis.

e) Finalizado el tiempo de incubación, agregue 3 gotas de Lugol a cada tubo para visualizar el
resultado.

f) Medir la absorbancia de cada tubo a 570 nm.

RESULTADOS III

Tabla 3: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
Tubo
1c 2c 3c 4c
pH solución

Abs a 570 nm
8.
Modificaciones de protocolo y apuntes
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

34
1.4 Determinación de las condiciones óptimas de Temperatura en la actividad de la α-amilasa salival.
a) Utilice una micropipeta p1000 para preparar un set de 4 tubos de ensayo con las siguientes
soluciones:

Tubo
Solución 1d 2d 3d 4d 5d
Buffer fosfato pH 7 (mL) 2 2 2 2 2
Suero salino (mL) 2 4 2 2 2
Preparación enzimática
2 -- 2 2 2
Tubo 4a (mL)
Temperatura incubación (°C) 0 37 37 42 90
*TA: Temperatura ambiente, incubar sobre el mesón.

b) Mezcle suavemente y pre-incube los tubos (sin almidón) a cada temperatura correspondiente
por 5 minutos.

c) Transcurrido el tiempo de pre-incubación, agregue a todos los tubos 2 mL de almidón 1% p/v,

mezcle suavemente y devuelva a cada temperatura correspondiente.

d) Incube durante 15 minutos. Durante la incubación, identifique los controles positivo y negativo
para comparar las catálisis.

e) Transcurrido el tiempo agregue 3 gotas de lugol, mezcle y anote sus observaciones.

g) Medir la absorbancia de cada tubo a 570 nm.

RESULTADOS IV

Tabla 4: (agregue su descripción) ______________________________________________________

______________________________________________________________________________
Tubo
1d 2d 3d 4d 5d
Temperatura
incubación (°C)
Abs a 570 nm
9.
Modificaciones de protocolo y apuntes
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

35
36