Universidad Mariano Gálvez

Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud

Manual de prácticas de laboratorio

Biología Celular y Molecular Humana II

2019

Dra. Jeannette Ruíz-Robleto

M.A. Amparo Ordóñez de Mansilla
Lcda. Luisa Lemus
Lic. Josué Reyes Estrada
 Universidad Mariano Gálvez
Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud
Biología Celular y Molecular Humana II

ÍNDICE

Página

Índice………………………………………………………………………………………………………………………… 2

Calendarización de prácticas de laboratorio……………………………………………………………… 3

Guía de trabajo para el laboratorio de Biología Celular y Molecular Humana II…………. 4

Hoja para el control de entrega de reportes de laboratorio………………………………………. 9

Práctica No. 1
Manejo del microscopio óptico y observación e identificación de células procariotas y
10
eucariotas……………………………………….………….……………………………………………………………..
Práctica No. 2
Microarrays o chip de ADN…………………………….……………………………………………..…………… 15

Práctica No. 3
Replicación de ADN…………….……………………………………………………………………………………… 20

Práctica No. 4
Identificación de enlaces peptídicos……………..………………………..………………………………….. 25

Práctica No. 5
Acción enzimática…………………………….………………………………………………………………………… 32

Práctica No. 6
Síntesis de proteínas………….………………………………………………………………………………………. 37

Práctica No. 7
Estructura del ADN -Reacción en Cadena de la Polimerasa- (PCR)…………..…………………… 46

Práctica No. 8
Fermentación alcohólica de la glucosa…………………….…………………………………………………. 50

Práctica No. 9
Observación de células cancerosas……….……………………………………………………………………. 58

Práctica No. 10
Introducción a técnicas de biología molecular……….…………………………..………………………. 64

Práctica No. 11
Electroforesis………………………………………………………………….…..…………………………………….. 70

Práctica No. 12
Reacción inmune en eritrocitos humanos……………………….…..…………………………………….. 72

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Biología Celular y Molecular Humana II

Calendarización de prácticas de laboratorio Biología Celular y Molecular II

Fecha
Práctica No. 1
Manejo del microscopio óptico y observación e identificación de 15-16 de julio
células procariotas y eucariotas.
Práctica No. 2
22-23 de julio
Microarrays o chip de ADN.
Práctica No. 3
29-30 de julio
Replicación de ADN.

Semana de primeros exámenes parciales 5 al 10 de ago.

Práctica No. 4
12 -13 de ago.
Identificación de enlaces peptídicos
Práctica No. 5
19-20 de ago.
Acción enzimática.
Práctica No. 6
26-27 de ago.
Síntesis de proteínas.
Práctica No. 7
2-3 de sep.
Estructura del ADN -Reacción en Cadena de la Polimerasa- (PCR).
Práctica No. 8
9-10 de sep.
Fermentación alcohólica de la glucosa.

Semana de segundos exámenes parciales 17 al 21 de sep.

Práctica No. 9
23-24 de sep.
Observación de células cancerosas.
Práctica No. 10
30 sep.-1 de oct.
Introducción a técnicas de biología molecular.
Práctica 11
7-8 de oct.
Práctica demostrativa de electroforesis
Práctica No. 12
15-18 de oct.
Reacción inmune en eritrocitos humanos. (folder)

Asueto 21 de oct.

Final de laboratorio 4-5 nov.

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Biología Celular y Molecular Humana II

GUÍA DE TRABAJO PARA EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR HUMANA II

Reglamento para el estudiante

Para que un estudiante tenga derecho a participar en las sesiones del Laboratorio de Biología Celular
y Molecular Humana II, debe cumplir con las siguientes reglas:

1. Estar inscrito en el curso teórico. Para tener derecho a anotarse a uno de los grupos de
laboratorio, deberá mostrar su boleta de asignación correspondiente.

2. Comportarse adecuadamente en las actividades del laboratorio, siguiendo de manera estricta el

reglamento del laboratorio establecido. Las faltas al reglamento serán sancionadas, incluyendo
el retiro definitivo del laboratorio. Puede solicitar copia del reglamento a su instructor.

3. Asistir al laboratorio de manera puntual, de no asistir a una práctica, el alumno pierde

automáticamente el derecho a presentar todos los componentes de la nota de esa práctica,
teniendo un cero inmediato. Sin embargo, si el alumno justifica su ausencia de manera
anticipada, puede programarse un cambio de grupo durante una única ocasión. Si el estudiante
tuvo algún contratiempo justificado para faltar al laboratorio, deberá poseer una autorización
de la Coordinación de Medicina dentro de los primeros 3 días, después de la ausencia, para que
la nota de ese laboratorio sea eliminada del promedio al obtener la nota final. Es responsabilidad
del alumno ponerse al día con el contenido de la práctica perdida.

4. Haber cumplido con las tareas preparativas de cada práctica, las cuales incluyen: la información
solicitada en el fólder de laboratorio, una lectura a conciencia de la práctica. Se realizará un
examen corto al inicio de cada práctica para asegurar que el alumno conoce el tema a tratar y
procedimiento a seguir. Queda a discreción del instructor permitir la entrada de un alumno que
evidentemente no maneje el conocimiento previo requerido, es decir, el instructor tiene la
potestad de retirar de la práctica a aquel estudiante que obtenga un cero (0), en el examen.

5. Utilizar el equipo de protección personal todo el tiempo que se encuentre dentro de las
instalaciones del laboratorio. Como equipo de protección se incluye: bata hasta las rodillas
(siempre abotonada), de manga larga, anteojos de seguridad, zapatos cerrados, mujeres con el
pelo agarrado y sin aretes largos. El no cumplir con esta regla es causa justificada para retirar a
un alumno del laboratorio del día, perdiendo el derecho a presentar examen corto, fólder,
práctica y reporte. De reincidir, el alumno puede ser retirado definitivamente del laboratorio.

6. No ingresar al laboratorio bolsas, mochilas ni artículos de uso personal (celulares, localizadores,

joyas, etc.) para almacenarlos, se cuenta con un mueble adecuado en el corredor del laboratorio.
En caso de portar objetos de alto valor (computadoras, etc.), estos deberán depositarse con
anticipación en las Oficinas Administrativas del I2QB3, donde se le brindará una contraseña para
su devolución. Si algún alumno entra al laboratorio una de las pertenencias antes mencionadas,
se confiscará y se devolverá al final de la práctica.

7. Cada estudiante tendrá un microscopio específico el cual será asignado en el primer día de
laboratorio. El alumno será responsable del cuidado del mismo durante la práctica.
Adicionalmente deberá recordar anotarse en la hoja de control de USO DEL MICROSCOPIO.

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Fólder de Laboratorio

1. El fólder de laboratorio está diseñado para cumplir como evidencia del trabajo que se ha
realizado durante cada práctica, por lo que en dicho fólder se deberán anotar de forma
INMEDIATA todos los datos y observaciones de cada práctica, de manera ordenada, legible y
limpia. Un trabajo que no puede leerse, no tendrá validez alguna.

2. Cada estudiante deberá tener un fólder debidamente identificado con nombre completo,
número de carné y sección asignada. Durante la primera sesión de laboratorio se decidirá
sobre el color a utilizarse para la sección y posteriormente deberá ser forrado adicionalmente
con plástico para salvaguardar la integridad del mismo dentro.

3. El fólder de laboratorio de cada estudiante se evaluará al final del semestre con un valor sobre
100 puntos, donde el valor neto será de 2 puntos, considerando los siguientes aspectos:

Aspecto
1. Sellos o firmas del instructor.
2. Presentación (bien forrado e identificado).
3. Legibilidad, limpieza y orden.

Requerimientos para el ingreso al laboratorio

Al inicio de cada práctica el estudiante deberá llevar dentro de su fólder y sostenido con gancho
(fástener) lo siguiente:

1. Control de entrega de reportes de laboratorio (adjunto a este manual).

2. Práctica a realizarse impresa e identificada.
3. Número y nombre de la práctica.
4. Reporte de laboratorio engrapado.

Trabajo dentro del laboratorio

El trabajo que se realice dentro del laboratorio, deberá ser asignado por cada estudiante, a manera
de poder comprobar, qué se hizo, cómo se hizo y cuándo lo hizo. Para este propósito, es necesario
que cada uno lleve un fólder de laboratorio y anote los datos y resultados relevantes para realizar
su reporte de laboratorio.

Sin embargo, antes de poder realizar cualquier práctica dentro del laboratorio, el estudiante deberá
demostrar que tiene el conocimiento adecuado para poder realizar dicho trabajo. Cada práctica de
laboratorio cuenta información relevante, el cual queda como responsabilidad del alumno leer
previo a la práctica, como preparación a la prueba escrita que se llevará a cabo al inicio del
laboratorio y que evaluará la práctica a punto de realizarse. Cabe resaltar que el corto de
laboratorio, tendrá un tiempo aproximado de 3 minutos y sumarán una nota de 5 puntos.

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Dibujos en el laboratorio

En algunas prácticas de laboratorio se deberán realizar dibujos de las observaciones al microscopio,

así como la identificación de las partes y descripción de las mismas. Para ello, cada práctica en la
que se deben realizar dibujos, cuenta con hojas de microscopía adjuntas en las cuales deberá estar
lleno cada aspecto que se solicite, previo a su retiro del laboratorio. Para la elaboración de los
dibujos, se le solicitará traer en cada práctica lápiz.

Trabajo posterior al laboratorio

La principal forma de evaluación del trabajo hecho durante el laboratorio, así como la comprensión
obtenida después de realizada la práctica, es el reporte de laboratorio. En éste se evidencia el nivel
de comprensión y la calidad del trabajo realizado por el estudiante.

Reporte de laboratorio

El reporte de laboratorio tiene doble función: 1) permite al estudiante entrenarse en el arte de la

escritura científica y 2) le brinda la oportunidad de demostrar qué tanto aprendió durante la
realización de la práctica.

Para presentar un buen reporte de laboratorio, el estudiante debe esforzarse en varios aspectos:
Primero, debe asegurarse que el contenido del reporte sea acorde al tema que se trató en el
laboratorio. Segundo, es necesario que demuestre una buena redacción como una buena
ortografía.

Cada reporte será evaluado sobre 100 puntos y durante cada práctica, su instructor le informará lo
que debe llevar el mismo. Al final, el valor neto de los reportes de todas las prácticas del cuso es de
7 puntos. A continuación, se le presenta un formato de encabezado, el cual deberá tomar como
ejemplo para entregar su reporte:

Ejemplo de encabezado para reportes de laboratorio

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Instructor:

Nombre del estudiante: Carné: Sección:

No. de la práctica
Nombre de la práctica

-----------------------------------------------------Cuerpo del reporte--------------------------------------------------

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En los casos que sea necesario y que el instructor lo indique, su reporte deberá contener las
siguientes secciones (OJO, no todos los reportes se solicitarán con las siguientes secciones):

Valor1
Sección Descripción
(pts.)
Encabezado Ver ejemplo en la página anterior. -
Resultados (Tablas) Deben presentarse de la manera más ordenada posible, los 20
datos y resultados obtenidos durante la práctica. De
preferencia, debe hacerse en tablas de fácil lectura, a manera
que alguien que no haya estado en el desarrollo de la práctica,
pueda entenderlas con facilidad. NO se aceptarán resultados
escritos a mano, de presentarlos así, se calificará con un cero (0)
la sección completa. Cada tabla debe ir identificada con número
y título, además de ser citada (mencionada) durante la discusión
de resultados.
Discusión de En esta sección se interpretan y relacionan los resultados 35
resultados obtenidos con la teoría estudiada y justificando cualquier
explicación en material teórico de apoyo. Tome en cuenta que
la discusión de resultados, NO es una explicación del
procedimiento, ni mucho menos una revisión bibliográfica.
Tome en cuenta que si utiliza libros o sitios web de apoyo, debe
citarlo dentro del texto en formato VANCOUVER.
Conclusiones Esta sección se deriva de la sección de discusión de resultados. 15
(Mínimo 3) No debe incluirse algo que no se haya mencionado en la sección
anterior. Tampoco deben concluirse cosas que no fueron
determinadas. Recuerde, las conclusiones deben corresponder
o estar relacionadas con los objetivos planteados en cada
práctica.
Anexos (Cuestionario En esta sección se incluyen los cuestionamiento o ejercicios que 20
Post-Laboratorio) se encuentran en la sección de Cuestionario Post-Laboratorio de
cada práctica. Esta sección complementa la información
planteada en la práctica. En algún caso que usted requiera
consultar material teórico recuerde citarlo al final de cada
pregunta en formato VANCOUVER.
Bibliografía Se debe hacer un listado numerado de las referencias 10
empleadas que respalden lo discutido o que hayan servido de
apoyo para responder las preguntas del cuestionario, conforme
al orden en que fueron utilizadas y aparecen a lo largo del
reporte. Recuerde, el formato bibliográfico será VANCOUVER.
En caso que usted desconozca este formato, puede acercarse a
la biblioteca de la facultad para que le proporcionen una guía
detallada de cómo citar el mismo.
Nota total del reporte 100
Valor1: Algunas secciones no tiene valor asignado, ya que su presencia no agrega puntos de nota al
reporte. Sin embargo, su ausencia si resta puntos de la nota. El comportamiento y actitud
inadecuada en alguna práctica de laboratorito, restará puntos en el reporte correspondiente.

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Examen final de laboratorio

Al final del semestre se realizará un examen final acumulativo de todas las prácticas realizadas. Este
será calificado con una nota sobre 100 puntos que equivale a 6 puntos de la zona de laboratorio.
Recuerde que el laboratorio forma el 20% de la zona final del curso.

Ausencia a Prácticas de Laboratorio

Todo estudiante deberá cumplir con el 80% de asistencia al laboratorio. El alumno que se haya
ausentado por cualquier motivo a una práctica de laboratorio, NO tiene derecho a entregar el
reporte, sin importar si la falta ha sido justificada o no. De ser justificada la ausencia, la nota de
dicho laboratorio se eliminará, a manera de no ser tomada en cuenta en el cálculo de la nota final.
Sin embargo, esto no quiere decir que el estudiante se libere de la evaluación del tema de la práctica
durante el examen final de laboratorio del curso. ES RESPONSABILIDAD DEL ALUMNO investigar el
tema tratado durante la práctica en la que se ausentó, independientemente si la falta ha sido
justificada o no.

IMPORTANTE: NO se tolerará ningún tipo de copia en los reportes de laboratorio. Cualquier indicio
de plagio será castigado con una nota de cero (0) en el reporte y una tarjeta de amonestación.
Cualquier indicio de copia (entrega de reportes idénticos por parte de dos o más alumnos) será
evaluado como un cero (0) para todos aquellos estudiantes que tengan el reporte igual, sin importar
quién lo generó ni quién lo copió. Todo caso quedará documentado, y una reincidencia puede
significar el retiro definitivo del o los alumnos involucrados del laboratorio del curso.

Los reportes se corregirán durante la semana y se devolverán en la siguiente práctica. Si algún

alumno tiene cualquier reclamo sobre la forma en que se ha calificado su reporte, debe hablar con
el instructor DENTRO DE LA PRIMERA SEMANA después de haberlo recibido corregido. No se
aceptarán reclamos posteriormente.

Evaluación Final de Laboratorio

Aspecto a evaluar Valor (pts.)

Exámenes cortos 5
Fólder de laboratorio 2
Reportes de laboratorio 7
Examen Final 6
Total 20

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

HOJA PARA EL CONTROL DE ENTREGA DE REPORTES DE LABORATORIO

No. Nombre de la práctica Fecha de entrega Firma del docente

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Y

1 OBSERVACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE
CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

2 MICROARRAYS O CHIP DE ADN

3 REPLICACIÓN DE ADN

4 IDENTIFICACIÓN DE ENLACES PEPTÍDICOS

5 ACCIÓN ENZIMÁTICA

6 SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

ESTRUCTURA DEL ADN -REACCIÓN EN

7
CADENA DE LA POLIMERASA- (PCR)

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE LA
8
GLUCOSA

9 OBSERVACIÓN DE CÉLULAS CANCEROSAS

INTRODUCCIÓN A TÉCNICAS DE BIOLOGÍA

10
MOLECULAR

REACCIÓN INMUNE EN ERITROCITOS

12
HUMANOS

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

PRÁCTICA No. 1
MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Y
OBSERVACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

Introducción

Uno de los avances más considerables de la biología ha sido el descubrimiento de las profundas
diferencias entre los organismos celulares y acelulares (virus) y a nivel celular las diferencias entre
células con y sin núcleo.

Los términos Procariotas y Eucariota se deben a E. Chatton (1883-1947) y se empezaron a usar a

principios de 1950. La principal diferencia radica en que en los procariotas el material genético no
está separado del citoplasma y los eucariotas presentan el material genético organizado en
cromosomas rodeados por una membrana que los separa del citoplasma.

Diferencias entre célula procariotas y eucariotas

El microscopio compuesto es un instrumento óptico que se emplea para aumentar o ampliar las
imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio óptico común está
conformado por tres sistemas:

a. El sistema mecánico está constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las
lentes que permiten el movimiento para el enfoque.
b. El sistema óptico comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce
el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas.
c. El sistema de iluminación comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y
regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio.

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Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

1. Identifique las diferentes partes del microscopio óptico y sus funciones.
2. Maneje correctamente el microscopio óptico.
3. Diferencie células procariotas de eucariotas y células animales de vegetales.
4. Diferencie organelos de células animales y vegetales.

Procedimiento

Identificación de partes del microscopio

Instrucciones: Identifique las estructuras señalizadas en la imagen.

1.
2.
1
3. 3

4. 2

5.
4
5
6.
6
7.
8 7
8.
9. 9 10
12
10. 11

13 14
11.
12.
15
13.
14.
15.

Observación de láminas fijas:

1. Observe con la ayuda del microscopio compuesto las distintas láminas proporcionadas en
el laboratorio.
2. Diferencie si son células procariotas o eucariotas.
3. Determine si es célula animal o vegetal.
4. Identifique las estructuras observadas.
5. Dibuje las láminas en las hojas de microscopía.
6. Haga los esquemas de sus observaciones.

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HOJA DE MICROSCOPÍA “CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS”

Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

Muestra: ___________________________________
Preparación: ________________________________
Aumento:___________________________________
Descripción:_________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________

Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
Descripción:________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________

Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
Descripción:________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________

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HOJA DE MICROSCOPÍA “CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS”

Muestra: ___________________________________
Preparación: ________________________________
Aumento:___________________________________
Descripción:_________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________

Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
Descripción:________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________

Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
Descripción:________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________

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Preguntas Post-Laboratorio

Instrucciones: Marcar con una “X” una de las casillas para verdadero ó falso.

V F Pregunta
X 1. Las células eucariotas no presentan núcleo.
X 2. La membrana plasmática separa el medio interno celular del externo.
X 3. El citoplasma está formado por los orgánulos celulares, el citosol y el núcleo.
X 4. Una célula eucariota típica mide entre 10 y 50 µm.
X 5. Las células eucariotas tienen forma muy variada, desde estrellada a ovalada. Las
formas redondeadas no son en realidad las más frecuentes.
X 6. No se había observado ninguna célula hasta la invención del microscopio.
X 7. Los primeros microscopios se inventaron a principios del siglo XVII.
X 8. R. Hook, en su publicación Micrographia (1664), da nombre a las estructuras que
hoy llamamos células.
X 9. El postulado de la teoría celular: "todos los organismos están formados por unidades
denominadas células", fue enunciada por Schwann y Schleiden.
X 10. La ultraestructura celular se observó gracias a los microscopios ópticos compuestos.
X 11. El enunciado " toda célula proviene de otra célula" es uno de los que forman parte
de la teoría celular.
X 12. Las teorías científicas sobre el origen de la vida apoyan la idea de que la vida puede
aparecer en otros planetas.
X 13. Las moléculas orgánicas las forman sólo los seres vivos.
X 14. Las primeras células aparecieron hace uno 350 millones de años.
X 15. Las moléculas orgánicas a partir de las cuales se formaron las primeras células
podrían tener origen extraterrestre.
X 16. Las leyes de la evolución darwiniana (descendencia con variabilidad más selección
natural) pudieron actuar antes de que aparecieron las primeras células.
X 17. Todas las células actuales proceden de una célula inicial o ancestro común.
X 18. En el origen de la vida, la formación de la membrana celular de las primeras células
necesitó de la participación de enzimas.
X 19. El mundo ARN es la única teoría que explica la evolución molecular en el mundo
prebiótico o precelular.
X 20. El código genético es un hecho que apoya la idea de que todas las células actuales
provienen de un ancestro común (LUCA) .
X 21. La teoría autógena se propone para explicar la aparición de los cloroplastos y las
mitocondrias en las células eucariotas.
X 22. En la teoría de la endosimbiosis se propone que durante la evolución los ancestros
de los que descienden las mitocondrias fueron incorporados en las células
eucariotas antes que los de los cloroplastos.
X 23. Todas las células con cloroplastos proceden de una célula ancestral que incorporó el
primer cloroplasto, al igual que ha ocurrido con las mitocondrias.
X 24. Las mitocondrias son similares a las bacterias aerobias actuales.
X 25. Hay asociaciones actuales entre procariotas y eucariotas que apoyan la teoría de la
endosimbiosis.

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

PRÁCTICA No. 2
MICROARRAYS O CHIP DE ADN

Introducción

Los microarrays son en la actualidad una poderosa herramienta de análisis de expresión de genes,
debido al mayor número de secuencias que se pueden analizar por prueba y tienen grandes ventajas
sobre otras técnicas, en las cuales sólo se pueden analizar un número muy limitado de genes de
manera simultánea, debido a que en la mayoría de los casos se requiere montar un ensayo por cada
gen a analizar.

En términos generales, un microarray se encuentra integrado por dos partes, el material biológico
(ácidos nucleicos, enzimas, anticuerpos, células, tejidos, etc.) denominado como prueba, y el
soporte sólido en cual se inmovilizan o adsorbe el material biológico. En la siguiente práctica se
realizará un ensayo de microarrays en un laboratorio virtual para evaluar la expresión de genes en
dos tipos de tejido (1).

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

1. Conozca los pasos para realizar un microarray.
2. Identifica que tipos de muestras se pueden emplear en la técnica.
3. Se familiarice con los términos empleados en la técnica.

Antecedentes

Un microarray de ADN, consiste en una superficie sólida donde se han adherido fragmentos de ADN
(oligonucleótidos o ADN complementario -ADNc-), estas secuencias se adhieren en unos
micropuntos conocidos como spots. Los microarrays se utilizan para el estudio de secuencias de
genes conocidos o bien para determinar los niveles de expresión genética de un tipo celular o tejido.

En oncología los microarrays se han usado para identificar y diagnosticar algunos tipos de cáncer
que son difíciles de establecer de manera clínica y que muchas veces sólo se establecen por
patología. En otros tipos de cáncer, el perfil de expresión de genes ha permitido diseñar mejores
esquemas de tratamiento y de la misma forma ha permitido hacer predicciones de la respuesta al
tratamiento con quimioterapia (1).

Por esta razón, en la siguiente práctica se evaluará la expresión génica de dos diferentes tipos de
tejidos; sano y cancerígeno, a través de un laboratorio virtual. En esta ocasión, el material genético
a ser analizado es ARN mensajero (ARNm), el cual se obtiene tras la separación selectiva de cada
tejido por medio de la extracción de ARN total. Una vez aislado el ARNm se procede a realizar la
transcripción reversa, para convertir el ARNm en ADNc y simultáneamente marcar con fluorescencia

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el ADNc del tejido sano y el ADNc del tejido cancerígeno. El ARNm se digiere con una RNAasa para
evitar interferencias con en la hibridación.
Se colocan ambas muestras de ADNc, la del tejido sano y la del tejido cancerígeno, en el microarrays
y se procede a realizar la hibridación y a retirar la sonda que no se una al ADN diana mediante
lavados. Los últimos dos pasos corresponden a la detección de la fluorescencia y al análisis mediante
software especializado para determinar la expresión de cada uno de los genes analizados.

Imagen de la técnica de Microarrays

Fuente (3)

Procedimiento

Durante la práctica el estudiante realizará la simulación al mismo tiempo que el instructor, quién
explicará paso a paso el experimiento.

1. Iniciar la computadora.
2. Conectarse a internetr y dirigirse a la página:
[Link]
3. Iniciar la simulación AL MISMO TIEMPO que se realizará en la pantalla.
4. Resolver cualquier duda mientras se realiza la simulación.

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Cuestionario Post-Laboratorio

1. ¿A qué se refiere el término genómica?

2. ¿En qué tipo de células podemos aplicar microarrays?
3. ¿A qué se refiere el término “Perfil de expresión genética”, entre células diferentes?
4. ¿Un chip de ADN en lo mismo que un microarray de ADN?
5. ¿Qué otros nombres pueden recibir los microarrays de ADN?
6. El microarrays se compone de múltiples puntos (spots) ¿Qué contiene cada uno de estos
puntos?
7. ¿Cuál es la diferencia entre una célula sana y una célula de cáncer?
8. Mencione al menos 5 materiales que se utilizan para realizar la técnica microarray.
9. ¿Cuáles son los 7 pasos de la técnica de microarrays de ADN?
10. ¿Por qué razón se agrega un solvente a las muestras de tejido?
11. ¿Cuál es el objetivo de mezclar en el vórtex y luego centrifugar las muestras de tejido?
12. ¿Qué tipos de ARN se encuentran en la muestra y cuál es tipo de ARN de interés en el
experimento?¿Por qué?
13. ¿Qué se utiliza para separar el ARNm, del ARNt y ARNr?
14. ¿Para qué se adiciona una solución buffer?
15. ¿Cuál es la función de la enzima transcriptasa reversa?
16. ¿A qué se refiere el término, hibridación?
17. ¿Cada spot o poro del chip de ADN posee una secuencia de ADN igual o diferente entre sí?
18. ¿Qué representan los puntos amarillos en la imagen obtenida?
19. ¿Cómo se obtiene la coloración amarilla en los poros?
20. ¿Qué representan los puntos rojos en la imagen obtenida?
21. ¿Qué representan los puntos verdes en la imagen analizada?
22. Para investigar el cáncer, ¿qué color de poro escogería evaluar y por qué?
23. ¿Qué color de poro está afectado por el gen 4263?
24. ¿Por qué se ha de estudiar el gen 6219 en los poros amarillos?
25. Mencione las ventajas y desventajas de esta técnica.

Referencias
1. Medina Torres, E. A., 2009. Microarreglos. [Internet] Volumen 18, Núm. 2. Recuperado de:
[Link]
2. Sitio web. Laboraorio Virtual [Internet]. Recuperado de:
[Link]
3. Zúñiga, I. 2012. Aplicación de Microarrays para determinar la expresión génica de Cirrosis.
[Internet]. Recuperado de: [Link]
[Link]

Material de apoyo adicional

[Link]

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

PRÁCTICA No. 3
REPLICACIÓN DE ADN

Introducción

La replicación del ADN es la síntesis de nuevas cadenas complementarias para dar lugar a dos
moléculas idénticas de ADN doble. Este proceso debe ser muy exacto, ya que la obtención de
cadenas idénticas es necesaria para proveer a la célula de la información genética cuando ocurra la
división celular. Para garantizarlo, existen mecanismos enzimáticos que revisan y corrigen los
errores.

La replicación empieza en una secuencia específica de nucleótidos denominada Origen. Se ha

determinado que participan una serie de enzimas: Topoisomerasa I y II y ARN primasa, helicasa,
ADN polimerasa I, II y III y ligasas.

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

1. Comprenda el proceso de replicación del ADN mediante una simulación del mismo.
2. Conozca qué enzimas están involucradas en el proceso de replicación del ADN así como su
función.
3. Analice la actividad enzimática en la replicación del ADN.

Antecedentes

El significado genético de la replicación es el de conservar la información genética. La estructura del

ADN en doble hélice permite comprender como dicha molécula puede dar lugar a copias sin perder
su conformación. En principio, las dos hebras deberían separarse. Después, mediante la acción de
otra enzima, a partir de desoxirribonucleótidos sueltos y según la complementariedad de bases,
podría irse construyendo las hebras complementarias de las dos hebras “modelo” iniciales.

La enzima que lleva a cabo la replicación del ADN es la ADN polimerasa, esta enzima tiene unos
requerimientos específicos para trabajar, que le imponen restricciones:

1. Sólo añade nucleótidos en la dirección 5’→ 3’.

2. Necesita para poder empezar a copiar y unir nucleótidos un molde de ADN.
3. Necesita un pequeño trocito de ARN al cual unir los nucleótidos, ya que ella no puede
empezar a unir los nucleótidos sin tener una pequeña cadena ya formada.

Dadas las necesidades de esta enzima y sabiendo que la molécula de ADN está formada por dos
hebras antiparalelas, se plantea un problema en la cadena de ADN que va en la dirección 5’→ 3’,
porque aquí ́ la enzima estaría trabajando en la dirección contraria, y sin embargo, se observa que
las dos hebras se van replicando.

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La solución al dilema la dio el descubrimiento, en 1968, por Okazaki de unos fragmentos constituidos
por unos 50 nucleótidos de ARN y entre 1.000 y 2.000 nucleótidos de ADN, denominados
fragmentos de Okazaki. Así se podía explicar cómo se copia esta cadena, siendo de forma
discontinua en la dirección 5’→3’ y la otra cadena de forma continua.

Veamos ahora como se lleva a cabo el proceso:

1. Existe una secuencia de nucleótidos en el ADN llamada origen de replicación que actúa
como señal de iniciación.

2. Las cadenas de ADN están unidas por puentes de hidrógeno, que debemos romper para
facilitar la separación de las cadenas para ser copiadas, esta separación la lleva a cabo las
enzimas helicasas.

3. Como el desenrollamiento de la doble hélice da lugar a superenrollamientos en el resto de

la molécula, capaces de detener el proceso, se hace preciso la presencia de las enzimas
topoisomerasas que eliminen las tensiones en la fibra.

4. A continuación, para evitar que las dos hebras vuelvan a reunirse y formar los puentes de
hidrógeno se colocan unas proteínas llamadas SSB (Single-Strand DNA Binding proteins),
que estabilizan las cadenas sencillas.

5. El proceso es bidireccional, es decir, hay una helicasa trabajando en un sentido y otra

trabajando en sentido opuesto. Se forman pues las llamadas burbujas u ojos de replicación.

6. Como ninguna ADN-polimerasa puede actuar sin cebador, interviene primero una ARN
polimerasa (primasa) que si lo puede hacer, sintetiza un corto fragmento de ARN de unos
10 nucleótidos denominado primer que actúa como cebador.

7. Después interviene la ADN polimerasa III, que a partir de este cebador comienza a sintetizar
en dirección 5’→ 3’ una hebra de ADN partir de nucleótidos trifosfato. La energía necesaria
para el proceso es aportada por los propios nucleótidos que pierden dos de sus fósforos al
momento de unirse en la cadena. Esta nueva hebra se sintetiza en el sentido que se abre la
horquilla de replicación, es de crecimiento continuo y se denomina hebra conductora.

8. Sobre la otra hebra (hebra discontinua o retardada) la ARN polimerasa sintetiza unos 40
nucleótidos de ARN en un punto que dista unos 1.000 nucleótidos de la señal de iniciación.
A partir de ellos la ADN polimerasa III sintetiza unos 1.000 nucleótidos de ADN, formándose
un fragmento de Okazaki. Este proceso se va repitiendo a medida que se van separando las
dos hebras patrón.

9. A continuación interviene la ADN polimerasa I, que, primero, gracias a su función

exonucleasa, retira los segmentos de ARN, y que luego, gracias a su función polimerasa,
rellena los huecos con nucelótidos de ADN.

10. Finalmente, la ADN ligasa unirá los dos extremos, tanto en la cadena continua como los
sucesivos fragmentos de Okazaki que se van formando en la cadena discontinua.

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Cuando se observa cómo se produce la replicación se ve que la cadena continua va más rápida que
la discontinua, esto es debido a que cada vez que se forma un fragmento de Okazaki hay que realizar
todo este proceso como si se comenzara la síntesis de nuevo, formando el primer y el resto de pasos,
sin embargo, en la continua solo se realizará una vez. (1)

Imagen de la Replicación del ADN

Fuente (2)

Procedimiento

Durante la práctica el estudiante observará la simulación de cómo se da la replicación del ADN.

1. Observar la explicación proyectada y responda su cuestionario post-práctica.

2. Conectarse a internet y dirigirse a la página y realizar el ejercicio:
[Link]
3. Conectarse a internet y dirigirse a la página, realizar el ejercicio:
[Link]
VHS_BIO_05_04_103_drag_and_drop_replication.swf

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Cuestionario Post-Laboratorio

1. __________________________ 6. ________________________
2. __________________________ 7. ________________________
3. __________________________ 8. ________________________
4. __________________________ 9. ________________________
5. __________________________ 10. _______________________
11. ¿Por qué razón se dice que la replicación es semiconservativa?_______________________
__________________________________________________________________________
12. ¿Qué enzima es la encargada de romper los puentes de hidrógeno de la doble hélice de
ADN? _____________________________________________________________________
13. ¿Qué tipo de molécula es la desoxirribosa? _______________________________________
14. ¿Qué es una horquilla de replicación? ___________________________________________
15. ¿En qué dirección lee la ADN polimerasa la cadena molde? __________________________
16. ¿En qué dirección construye la ADN polimerasa la nueva cadena? _____________________
17. ¿Qué enzimas evitan que las dobles hélices se vuelvan a unir? ________________________
18. ¿Qué enzima coloca los primeros nucleótidos de la cadena? _________________________
19. ¿Con qué nucleótido se aparea la timina? ________________________________________
20. ¿Qué es la polimerización? ____________________________________________________
21. ¿De dónde se obtiene la energía para polimerizar la nueva cadena de ADN? _____________
22. ¿Cuántos puentes de hidrógeno se forman de la unión de G-C? _______________________
23. ¿Cómo se denominan los fragmentos discontinuos de la hebra rezagada? ______________
24. ¿Qué tipo de ADN polimerasa cambia el ARN por ADN? _____________________________
25. Si la secuencia de ADN en la hebra molde (3’→5’) que va a replicarse es:
A T T C G G A T A A C G G A C T T A C G

¿Cuál será la secuencia de ADN complemento de esa cadena?

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Referencias

1. Alonzo, B. Replicación del ADN. [Internet]. Ciudad de México. Pág. 1-4. Disponible
desde:[Link]
ci_C3_B3n_del_ADN.pdf
2. Figueroa Castañeda, Z. Mecanismos de replicación y regulación genética. Tijuana, México.
Diciembre 12, del 2012. Disponible desde:
[Link]
replicacion-y-regulacion-genetica

Material de apoyo adicional

[Link]
[Link]/people/giannini/flashanimat/molgenetics/[Link]

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

PRÁCTICA No. 4
IDENTIFICACIÓN DE ENLACES PEPTÍDICOS
Introducción

Los aminoácidos son las unidades elementales constitutivas de las denominadas proteínas. Son
sustancias cristalinas, casi siempre de sabor dulce y tienen tanto actividad ácida como propiedad
básica y presentan actividad óptica. Químicamente son ácidos carbónicos con, por lo menos, un
grupo amino por molécula.

En la naturaleza existen unos 20 aminoácidos que pueden ser codificados por el ADN humano. Cada
uno de ellos tiene una estructura química diferente, pero tienen en común, un grupo carboxilo y un
grupo amino (excepto la prolina que tiene un grupo imino) unidos al denominado carbón quiral
(excepto la glicina).

La fórmula general para los 20 L- alfa aminoácidos, a pH fisiológico, es la siguiente:

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

1. Comprenda la estructura, propiedades, funciones y clasificación de los aminoácidos,
péptidos y proteínas.
2. Conozca y demuestre pruebas que identifiquen aminoácidos y proteínas así como su
utilidad.

Antecedentes

El término "proteína" proviene de la palabra griega proteous, que significa primero. Las proteínas
son los compuestos bioquímicos más abundantes en los seres vivos. Son verdaderamente especiales
por ser las sustancias centrales en casi todos los procesos biológicos y son polímeros de aminoácidos
unidos mediante un enlace peptídico. El enlace peptídico es un enlace formado por un grupo
carboxilo (COOH) de un aminoácido con un grupo amino de otro aminoácido. El compuesto formado
es denominado péptido.

Así se pueden ir formando nuevos enlaces peptídicos, dando lugar a cadenas más largas que
constituyen tripéptidos, oligopéptidos polipéptidos y luego proteínas. Una proteína difiere de otra
en cuanto al número, tipo y secuencia de aminoácidos que la conforman.

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A primera vista podría pensarse en las proteínas como polímeros lineales de aminoácidos unidos
entre sí por medio de enlaces peptídicos. Sin embargo, la secuencia lineal de aminoácidos puede
adoptar múltiples conformaciones en el espacio.
• La estructura primaria viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena
proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados.
La conformación espacial de una proteína se analiza en términos de estructura secundaria
y estructura terciaria.
• La estructura secundaria es el plegamiento que la estructura primaria adopta gracias a la
formación de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace peptídico.
• La estructura terciaria, en cambio, se refiere a la disposición tridimensional de todos los
átomos que componen la proteína.
• La asociación de varias cadenas polipeptídicas origina un nivel superior de organización, la
llamada estructura cuaternaria.
• Por último, la asociación de proteínas con otros tipos de biomoléculas para formar
asociaciones supramoleculares con carácter permanente da lugar a la estructura quinaria.

Las proteínas presentan numerosas funciones. Por ejemplo, casi todas las enzimas están
compuestas de estructuras proteicas. Las enzimas son los catalizadores que permiten que ocurran
casi todas las reacciones químicas en los seres vivos. La vida, como la conocemos no sería posible
sin las enzimas. Junto con los lípidos, las proteínas son los componentes estructurales de las
membranas celulares. Las proteínas de las membranas ayudan a transportar sustancias a través de
la doble capa lipídica y trabajan como sitios receptores de los neurotransmisores y de las hormonas.

Las proteínas son responsables del soporte estructural y del movimiento del cuerpo humano. El
tejido conectivo está compuesto de fibras proteicas fuertes que ayudan a unir la piel y el hueso. Los
tejidos musculares están compuestos de proteínas que se contraen; los huesos se mueven por
músculos que se contraen. Otras funciones de las proteínas incluyen el transporte y
almacenamiento de iones y moléculas; por ejemplo, transportar el oxígeno de los pulmones a las
células (hemoglobina). Numerosas hormonas, agentes de comunicación química, son estructuras
proteicas. Una de las líneas de defensa más importantes contra los agentes infecciosos son las
proteínas denominadas inmunoglobulinas.

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1. Reacción de Ninhidrina

Esta prueba detecta y cuantifica aminoácidos libres los cuales reaccionan en presencia de ninhidrina
cuando son calentados en dicho reactivo. Todos los aminoácidos que poseen un grupo amino libre
reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído que contiene un átomo de
carbono menos que el compuesto original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto
color azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido).

La reacción entre un aminoácido y la ninhidrina es la siguiente:

Procedimiento

1. Tome y rotule 7 tubos de ensayo (1, 2… 7).

2. En cada tubo deposite lo siguiente:

Muestra Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Muestra 1 2mL
Muestra 2 2mL
Muestra 3 2mL
Muestra 4 2mL
Ovoalbúmina al 10% 2mL
Agua destilada 2mL
Leche . 2 ml
Ninhidrina 5gts. 5gts. 5gts. 5gts. 5gts. 5gts. 5 gts.

3. Coloque los seis tubos en un baño María a 80°C por 1 minuto.

4. Deje enfriar y anote resultados en la siguiente tabla:

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Tabla No. 1 “Prueba para identificación de aminoácidos libres.”

Resultado
Tubo Muestra Observaciones
(+ ó -)*
1 Muestra 1
2 Muestra 2
3 Muestra 3
4 Muestra 4
5 Ovoalbúmina al 10%
6 Agua destilada
7 Leche

*(+): positivo, (-): negativo.

2. Reacción Xantoproteica

Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos. Esta reacción se debe la presencia de un
grupo fenilo en la molécula proteica. Los complejos de la molécula proteica que son de importancia
en esta reacción son la tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que
se realiza en el laboratorio.

Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos
obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjados en medio
fuertemente alcalino (formación de ácido picrámico o trinitrofenol).
La reacción del grupo fenilo, se detalla en la siguiente ecuación:

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Procedimiento

1. Tome y rotule 7 tubos de ensayo (1, 2… 7).

2. En cada tubo deposite lo siguiente:

Muestra Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7

Muestra 1 2ml
Muestra 2 2ml
Muestra 3 2ml
Muestra 4 2ml
Ovoalbúmina al 10% 2ml
Agua destilada 2ml
Leche 2 ml
HNO3 concentrado 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 ml

3. Coloque los seis tubos en baño María a 80°C por 1 minuto.

4. Observe los cambios y deje enfriar.
5. Añada cuidadosamente solución de hidróxido de sodio (NaOH) concentrado en exceso.
6. Observe la coloración nuevamente y anote lo resultados en la siguiente tabla:

Tabla No. 2 “Caracterización de aminoácidos aromáticos.”

Observaciones Resultado
Tubo Muestra
Post baño María Post NaOH (+ ó -)*
1 Muestra 1
2 Muestra 2
3 Muestra 3
4 Muestra 4
5 Ovoalbúmina al 10%
6 Agua destilada
7 Leche
*(+): positivo, (-): negativo.

3. Reacción de Biuret

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos
moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Esta reacción está dada por aquellas sustancias
cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-[Link]) unidos directamente o a través de un
solo átomo de carbono o nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa
alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un complejo
de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que
forma parte de los enlaces peptídicos.

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Esta última reacción provoca un cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debe
señalarse que el color depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color
rosado; la gelatina da un color azul.

Procedimiento

1. Tome y rotule siete tubos de ensayo

2. En el tubo 1, deposite 2mL de solución de ovoalbúmina 10%; 2mL de leche en el tubo 2 y
2mL de orina, en el tubo 3.
3. En el tubo 4 agregar 2 ml de la M1, en el tubo 5 agregar 2 ml de la M2, en el tubo 6 agregar
2 ml de la M3 y en el tubo 7 agregar 2 ml de la M4.
4. Añada 2mL del reactivo de Biuret a cada tubo y anote los cambios observados en la siguiente
tabla:
Tabla No. 3 “Reacción de Biuret”
Tubo Muestra Cambios observados Resultado
(+ ó -)*
1 Ovoalbúmina al 10%
2 Leche
3 Orina
4 M1
5 M2
6 M3
7 M4
*(+): positivo, (-): negativo.

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Cuestionario Post-Laboratorio

1. ¿De dónde se extrae la ovoalbúmina?

2. ¿Qué es la caseína?
3. ¿Cuál es el nombre químico de la ninhidrina?
4. Investigue, qué tonalidad de color se obtiene si se hace reaccionar la ninhidrina con la
prolina(aminoácido).
5. ¿Para qué se utiliza el ácido nítrico (HNO3) en la reacción xantoproteica?
6. ¿Qué papel juega el NaOH en la reacción xantoproteica?
7. Investigue, cuáles son los compuestos orgánicos nitrogenados que están presentes en la
orina.
8. Investigue, cuáles son los aminoácidos esenciales para los humanos.
9. Investigue, cuáles son los aminoácidos no esenciales para los humanos.
10. En la siguiente imagen, identifique, el grupo amino y el grupo carboxilo.

Referencias
1. Quiñónez, Z. 2004. Identificación de Carbohidratos y Proteínas. Práctica de Laboratorio.
Departamento de Ciencias Fisiológicas. Departamento de Medicina. PUCMM. República
Dominicana.
2. Ruiz-Robleto, J. 2008. Identificación del Enlace Peptídico por Reacciones Químicas. Práctica
de Laboratorio. Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, UMG. Guatemala.
3. Identificación de Carbohidratos y Proteínas. 2008. Práctica de Laboratorio. Facultad de
Ciencias Médicas y de la Salud, UMG. Guatemala.

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PRÁCTICA No. 5
ACCIÓN ENZIMÁTICA

Introducción

Las reacciones químicas en sistemas biológicos raramente ocurren en ausencia de un catalizador.

Estos catalizadores se denominan enzimas y son en su totalidad moléculas de naturaleza proteica.
Las funciones vitales de cualquier célula serían imposibles de mantener si las reacciones que ocurren
en ella fueran extremadamente lentas.

Además de incrementar la velocidad, las enzimas exhiben una elevada especificidad y en algunos
casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, aumentando y otras veces disminuyendo,
de acuerdo a las necesidades del momento, su actividad.

Presentan las siguientes propiedades:

1. Son termolábiles y su actividad depende en ciertos casos del pH del medio.

2. El reconocimiento de la enzima con el reactivo a procesar (denominado sustrato) es
altamente específico.
3. Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran número de moléculas de sustrato por
unidad de tiempo.
4. Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y alostéricos.

Como todos los catalizadores las enzimas aceleran notablemente la velocidad de una reacción
química y cumplen con las siguientes características:

1. Son efectivas en pequeñas cantidades

2. No sufren modificaciones químicas irreversibles durante la catálisis. Es decir que luego de la
reacción enzimática, las moléculas de enzimas que reaccionaron son indistinguibles de las
que no lo han hecho, (la estructura de la molécula se mantiene, al principio y final de la
reacción, exactamente igual).
3. No afectan la posición de equilibrio de la reacción que catalizan. El estado inicial y final de
la reacción es el mismo, solo que se llega al equilibrio mucho más rápidamente.

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

• Interprete los mecanismos subyacentes de la acción enzimática sobre sustratos específicos.
• Compruebe la acción enzimática de la amilasa salival sobre el almidón y de la renina sobre
la caseína de la leche.
• Interprete las pruebas de lugol y Benedict.

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Antecedentes

Acción de la renina sobre la caseína de la leche

La caseína se encuentra en la leche en forma de partículas coloidales de fosfocaseinato de calcio. La

quimosina o renina, aunque también en menor cantidad la pepsina, son responsables de la acción
proteolítica ejercida sobre la caseína de la leche.

La enzima renina tiene un punto isoeléctrico de 5.3 y su mayor efectividad se logra al pH 3.8 – 4.0 y
actúa sobre el fosfocaseinato de calcio rompiendo enlaces peptídicos y transformándolo en
parafosfocaseinato de calcio, lo que provoca la precipitación y formación del coágulo. La efectividad
del cuajo está en función de la temperatura, la concentración del sustrato (la leche), concentración
de calcio, y la acidez. La siguiente ecuación ejemplifica la reacción:

Fosfocaseinato de calcio Renina

Parafosfocaseinato de calcio + caseino macropéptido soluble

Saliva

Es una mezcla derivada de la secreción de 3 pares de glándulas, las parótidas, submaxilar y

sublingual, como también de pequeñas glándulas mucosas ubicadas difusamente sobre la mucosa
de la boca. La cantidad normal secretada en una persona adulta es de 1 a 1.5 Iitros en 24 horas. La
composición de la saliva es un 99,5% H2O y 0,5 % de sólidos orgánicos e inorgánicos, el pH oscila
entre 6,2 y 7,4. Los principales componentes orgánicos son las glicoproteínas, proteínas (albúmina,
globulinas) y carbohidratos. Los componentes inorgánicos principales son calcio, sodio, potasio,
magnesio y fósforo.

Acción de amilasa salival

La amilasa es una enzima que cataliza la hidrólisis del almidón en moléculas de carbohidratos más
pequeñas. La -amilasa, se encuentra en la saliva, jugo pancreático, malta y algunas bacterias. La
enzima -amilasa, presente en la saliva, inicia la degradación del almidón, la principal fuente de
carbohidratos de la dieta humana. Esta enzima hidroliza al azar los enlaces  que unen residuos de
glucosa en el almidón, a excepción de los enlaces cercanos a los extremos y a los puntos de
ramificación de las cadenas. Por la acción de esta enzima activada por iones cloruro, en la boca la
longitud de la cadena del almidón se reduce de varios miles a unas ocho unidades de glucosa. La
alta concentración de protones del estómago inactiva la -amilasa salival. La digestión del almidón
continúa en el intestino delgado por la acción de la -amilasa pancreática, como producto se forma
una mezcla del disacárido maltosa, el trisacárido maltotriosa y oligosacáridos conocidos como
dextrinas.

Almidón Amilasa Maltosa + Maltotriosa + Dextrinas

La maltosa y otros carbohidratos reductores producidos en la reacción pueden ser detectados por
el test de Benedict. Este método es cualitativo, consiste en una solución alcalina de Cu2+ que se
encuentra formando un complejo con citrato.

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El ión cúprico es reducido a Cu+ por compuestos reductores con formación de hidróxido cuproso
amarillo o de óxido cuproso rojo. El cambio de coloración o la formación de un precipitado rojo-
ladrillo (Cu2O) indica la presencia de un compuesto reductor. El almidón y dextrinas complejas al ser
tratados con una solución de yodo dan un complejo de coloración azul, mientras que las dextrinas
más simples, la maltotriosa y maltosa, no dan una reacción positiva. Así, la acción de la -amilasa
sobre polisacáridos puede ser seguida midiendo la decoloración del complejo azul hasta alcanzar el
punto acrómico (solución incolora).

Procedimiento

Acción de la renina sobre la caseína de la leche

1. Disuelva 1/4 de pastilla de renina (cuajo) en 25ml de agua destilada.

2. Numere dos tubos de ensayo (1 y 2).
3. Trabaje cada tubo en base a la siguiente tabla:

Reactivo Tubo 1 Tubo 2

Leche 5ml 5ml
HCl al 10% 2gts.
Solución de renina 10gts. 10gts.

4. Observe, anote e interprete los resultados en la tabla No. 1:

Tabla No. 1 “Acción enzimática de la renina”

Tubo Resultado Interpretación Observaciones
( + / -)* (Formación de cuajo / Sin formación de cuajo)
1
2
*(+): positivo, (-): negativo.

5. ¿Qué puede concluir acerca de cómo afecta a la actividad enzimática, el tiempo, la

concentración y la temperatura? (Anotar en observaciones).

Acción de la amilasa salival sobre el almidón de la papa.

A. Obtención de la solución base de enzima amilasa.

1. Cortar un pequeño trozo de papa sin cáscara.

2. Lavar trozo de papa con agua del grifo.
3. Colocar el trozo pequeño de papa en la boca; masticar y mezclar con la saliva por un tiempo
de 6 a 7 minutos (No se lo trague).
4. Escupir la papa triturada junto con 1.5ml de saliva en un beaker pequeño y continuar
deshaciendo con un agitador de vidrio.
5. Tome 1mL de la saliva resultante (sin papa) y dilúyala en 10mL de agua destilada. Esta será
la solución base de enzima.

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B. Hidrólisis enzimática del almidón

1. Numere 4 tubos de ensayo (1, 2, 3 y 4).

2. Trabaje cada tubo en base a la siguiente tabla:

Reactivo Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Solución de almidón 2ml 2ml 2ml 2ml
Solución base de enzima 2ml 2ml
Agua destilada 2ml 2ml

3. Colocar todos los tubos en baño María a 37°C, durante 15 minutos.

4. Transcurrido el tiempo, sacar los tubos del baño María.
5. Realizar la prueba de lugol, únicamente a los tubos 1 y 3, agregando 5 gotas de lugol a cada
tubo.
6. Observe, anote e interprete los resultados, en la tabla No. 2. Si no existe hidrólisis del
almidón, se observará un color azul-violeta y la prueba será positiva.
7. Realizar la prueba de Benedict, únicamente a los tubos 2 y 4, agregando 10 gotas del
reactivo de Benedict a cada tubo.
8. Volver a colocar los tubos 2 y 4, en baño María.
9. Observe, anote e interprete los resultados, en la tabla No. 2. Si existe hidrólisis del almidón,
se formará un precipitado rojo-ladrillo que indica la presencia de azúcares reductores.

Tabla No. 2 “Acción enzimática de la amilasa”

Tubo Prueba Observaciones Resultado Interpretación
(Lugol/Benedict) (Coloración) ( + / -)* (Con hidrólisis / Sin hidrólisis)
1
2
3
4
*(+): positivo, (-): negativo.

Cuestionario Post-Laboratorio

1. Describa la función de dos enzimas que participen en nuestro metabolismo (excluyendo las
evaluadas en la práctica).
2. ¿De qué se conforma una enzima desde el punto de vista químico?
3. Describa la especificidad que existe entre enzima-sustrato.
4. ¿Cómo afecta el pH la actividad enzimática? Ejemplifique.
5. ¿Cómo afecta la temperatura la actividad enzimática? Ejemplifique.
6. ¿Qué es desnaturalización?
7. ¿Cómo está formado el almidón químicamente?
8. ¿Qué es la renina desde el punto de vista químico?
9. ¿Qué es la amilasa desde el punto de vista químico?
10. ¿Qué utilidad puede tener la pastilla de cuajo desde el punto de vista industrial?

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Bibliografía

1. Área de Biología. Fase I. Facultad de Medicina. 2005. Universidad de San Carlos de

Guatemala. CUM. Manual de Prácticas de Laboratorio.
2. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. 2005. Universidad de San Carlos de Guatemala.
Manual de Prácticas de Laboratorio.

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PRÁCTICA No. 6
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

Introducción

Los aminoácidos son compuestos químicos formados por un grupo amino y un grupo carboxilo.
Cuando dos aminoácidos se combinan se obtiene un dipéptido, tres aminoácidos un tripéptido y
mayor cantidad de uniones de aminoácidos forman polipéptidos. Cuando el polipéptido consta de
más de medio centenar de aminoácidos se denomina proteína.

La década de los 50´s preparó el escenario para el conocimiento que actualmente se posee del
proceso de síntesis de proteínas; todo esto se obtuvo al comprobar que el ARNt traduce la secuencia
nucleotídica de un ARNm a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. El proceso global de
síntesis de proteínas guiada por el ARNm es conocido como traducción.

Cada triplete de bases o codón representa a un aminoácido o indica el final de la cadena. Por otra
parte los codones no están separados, sino que son contiguos, por lo que la secuencia de una
proteína está definida por una secuencia lineal de codones contiguos. Varios codones tienen
funciones especiales. El codón de inicio “AUG” señala el principio de las cadenas polipeptídicas,
tanto en procariotas como en eucariotas, pero también es el codón que codifica Metionina en
posiciones internas en los péptidos. De los 64 codones posibles, tres de ellos (UAA, UAG y UGA) no
codifican para ningún aminoácido, sino que son codones de terminación (“stop”). Quizás el rasgo
más notorio del código es que es degenerado, es decir que un aminoácido puede resultar
especificado por más de un codón (1, 2, 3).

Objetivos
Que el estudiante a través de la práctica:
• Reconozca los pasos con los que se forman las proteínas a partir de la información contenida
en el código genético.
• Determine el orden de las bases de ADN o codones necesarios para poder formar una
proteína.
• Se ejercite en la práctica de resolución de problemas que involucran el código genético.

Antecedentes

Describir la síntesis de proteínas y del DNA dentro de una célula es como describir un círculo: el ADN
dirige la síntesis del ARN; y éste a su vez, dirige la síntesis de proteínas y, finalmente, una serie de
proteínas específicas catalizan la síntesis tanto del ADN como del ARN.

Las instrucciones para construir las proteínas están codificadas en el ADN y las células tienen que
traducir dicha información a las proteínas. El proceso consta de dos etapas:

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Transcripción

Es el proceso durante el cual la información genética contenida en el ADN es copiado a un RNA de

una cadena única llamado ARN-mensajero (ARNm). La transcripción es catalizada por una enzima
llamada ARN-polimerasa. El proceso se inicia separándose una porción de las cadenas de ADN: una
de ellas, llamada hebra molde, que es utilizada como guía por la ARN-polimerasa para incorporar
nucleótidos con bases complementarias dispuestas en la misma secuencia que en la hebra
codificante, complementaria de la hebra molde. La única diferencia consiste en que la timina del
ARN inicial es sustituida por uracilo en el ARNm. Así, por ejemplo, una secuencia ATGCAT de la hebra
molde del ADN inicial producirá una secuencia UACGUA en el ARNm.

Además de las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas, el ARNm copia del ADN inicial
unas regiones que no codifican proteínas y que reciben en nombre de intrones. Las partes que
codifican proteínas se llaman exones. Por lo tanto, el ARN inicialmente transcrito contiene tanto
exones como intrones. Sin embargo, antes de que abandone el núcleo para dirigirse al citoplasma
donde se encuentran los ribosomas, este ARNm es procesado mediante operaciones de "corte y
empalme", eliminándose los intrones y uniéndose entre sí los exones. Este ARNm maduro es el que
emigra al citoplasma. Un único gen puede codificar varias proteínas si el ARNm inicial puede ser
cortado y empalmado de diversas formas.

Además de utilizarse como molde para la síntesis del ARNm, el ADN también permite la obtención
de otros dos tipos de ARN:

1. El ARN de transferencia (ARNt) que se une específicamente a cada uno de los 20

aminoácidos y los transporte al ribosoma para incorporarlos a la cadena polipeptídica en
crecimiento.
2. El ARN ribosómico (ARNr) que conjuntamente con las proteínas ribosómicas constituye el
ribosoma.

Traducción

El RNAm maduro contiene la información para que los aminoácidos que constituyen una proteína
se vayan añadiendo según la secuencia correcta. Para ello, cada triplete de nucleótidos consecutivos
denominado codón, codifica específicamente un aminoácido. Dado que el ARNm contiene 4 bases,
el número de combinaciones posibles de grupos de 3 es de 64, número más que suficiente para
codificar los 20 aminoácidos. De hecho, un aminoácido puede ser codificado por varios codones. La
síntesis de proteínas tiene lugar de la manera siguiente:


1. Iniciación: Un factor de iniciación, GPT y metionil-ARNt[met] forman un complejo que se
une a la subunidad ribosómica grande. El metionil-ARNt[met] está posicionado enfrente del
codón de iniciación (AUG). El GPT y los factores de iniciación de desprenden quedando el
ARNt[Met] unido al ribosoma.

2. Elongación: Un segundo ARNt (por ejemplo Phe-ARNt[Phe]) se coloca en la posición A de la

subunidad grande del ribosoma. Un complejo activado por GPT se ocupa de formar el enlace
peptídico entre la [Met] y el [Phe] y seguidamente el primer ARNt se separa del aminoácido

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[Met] y el péptido en crecimiento unido se desplaza a la posición P de la subunidad grande

del ribosoma. En cuanto al primer ARNt se desplaza a la posición E (de la subunidad grande
del ribosoma) para ser expulsado. Un tercer ARNt (por ejemplo Leu-ARNt[Leu]) se coloca en
la posición A y se repite el proceso de formación del enlace peptídico, quedando el péptido
en crecimiento unido a la [Met] y el [Phe]. Al final de este proceso estaría quedando una
secuencia de péptido [Met]-[Phe]-[Leu] (Ver imagen adjunta).

3. Terminación: El ARNm que se está traduciendo lleva un codón de terminación (UAG).

Cuando el ribosoma llega a este codón, la proteína ensamblada es liberada y el ribosoma se
fragmenta en sus subunidades quedando listo para un nuevo proceso. Cabe resaltar que
este condón de terminación, NO codifica para ningún aminoácido.

En el proceso que acabamos de describir, el ribosoma se desplazaba a lo largo de una hebra de

ARNm leyendo los tripletes de uno en uno. La síntesis de proteínas progresa a razón de 15
aminoácidos/segundo. Dada la longitud del ARNm, varios ribosomas pueden ir leyendo codones y
sintetizando proteínas (4).

Imagen de los sitios y proceso de unión de los aminoácidos en el ribosoma

Fuente (5)

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Procedimiento
Realice la serie de ejercicios que se le presentan de manera INDIVIDUAL, a lápiz. La siguiente tabla
le puede servir de ayuda para la resolución de los siguientes problemas. Abreviaturas utilizadas en
los ejercicios: ADN molde (ADNm), ADN codificante (ADNc), ARN mensajero (ARNm), ARN de
transferencia (ARNt) y aminoácidos (Aa).
Tabla No. 1 “Cuadro de ARNm para la identificación de aminoácidos”

A. Complete el recuadro que a continuación se le presenta:

ADNm ACT

ADNc TCT

ARNm CUG

ARNt AUU

Aa Metionina

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B. Formar una secuencia de codones de ADNm, ADNc, ARNm y anticodones de ARNt. NOTA:
en caso de que existan dos o tres codones para un mismo aminoácidos, escoger el primero.

Aa Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Stop

ARNt

ARNm

ADNc

ADNm

C. Se le presenta a continuación una serie de fragmentos de ADN. En base a esa secuencia de

nucleótidos, deberá formar los codones (ARNm), los anticodones (ARNt) y finalmente el
correspondiente aminoácido para sintetizar la proteína. NOTA: Recuerde que la síntesis de
proteínas se inicia con AUG y se concluye con los tripletes de “Stop”.

ADNm TAC TTT TAA AAA CCC CTA GTA GTT GGG AGC AGC CCT TTA GCT ATT

ARNm

ARNt

Aa

ADNm TAC AAA CCC GGG TAC CAT CAT GGG GCG CGC TCA TAT CAT AAA ATT

ARNm

ARNt

Aa

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ADNm GTG GCG TAC GAT AGG ACC TTA GTC CCG GGG GTT AGG GGG ATT

ARNm

ARNt

Aa

ADNm TAC CCC CCG GGG TTT TTG GGG GGG ATT CCG GGG TTT TTC CCC ATT

ARNm

ARNt

Aa

ADNm CAT GGG GGG GGC CCC CCA AAA GAG AGA GAG ACA CAC ATT AGT

ARNm

ARNt

Aa

ADNm TAC CGC GCG CGT TGT GTG ATC GAG AGA GAG CGC GCG TTA GGA

ARNm

ARNt

Aa

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ADNm TAC TAC TAC TTA CTA TCA AAA GGG CGC CGC TTA GGC CCG GTC ACT

ARNm

ARNt

Aa

ADNm TAC TTA TTA CTA CTA CTA GTT GTC GTA GTG TGG ATA AGA AAG ATT

ARNm

ARNt

Aa

ADNm TAC CTT CTC CTA CTG ACA ACA ACG AAG AAT GCG CGC GAT GCT ATC

ARNm

ARNt

Aa

ADNm TAC GCG GCC CTT ACT TAG AGA GCT TAC CTC TCT AGA GAT TTT ACT

ARNm

ARNt

Aa

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Cuestionario Post – Laboratorio

1. ¿En dónde se encuentra codificada la información genética?

2. ¿En qué parte de las células se sintetizan las proteínas?
3. ¿En qué sitio de las células se sintetiza el ARNm?
4. ¿Qué partes componen la estructura del ARNt?
5. Nombrar 4 proteínas y su función.
6. ¿Cuántos aminoácidos diferentes pueden formar una proteína?
7. ¿Cómo se llama al enlace entre un aminoácido y otro?
8. ¿Cuántas y cuáles son las subunidades que componen un ribosoma?
9. ¿Qué significa E, P, A en la subunidad grande del ribosoma?
10. ¿En dónde encontramos los anticodones?

Referencias

1. Solomon, E.P., Berg, K.R (2008). Biología. Trad. de la 8ª ed. En inglés por Nuria Andreu, et
al. McGraw Hill Interamericana.
2. Becker, W. Keinsmith, L.J. y Hardin, J (2007). El mundo de la célula. Trad de la 6ª.ed en
inglés por Iñigo Azcoitia Elías y Alberto Muñoz Céspedes, 6ª ed. Madrid, España, Pearson.
3. Reece J, Urry L, Cain M, Wassermann S, Minorsky P, Jackson R. (2009). Campbell Biology.
United States of America: Pearson.
4. Cursos de fisiología: Síntesis de proteínas y ácidos nucleicos. [Internet]. Disponible desde:
[Link]
5. Toledo G. Expresión genética: traducción, diapositiva 14 [Internet]. Departamento de
Ciencias. Disponible desde: [Link]
traduccin-de-protenas-powerpoint-para-cuartos-medios-biologa

Material de apoyo adicional

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PRÁCTICA No. 7
ESTRUCTURA DEL ADN -REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA- (PCR)

Introducción

La gran complejidad de los procesos biológicos en los seres vivos ha sido por años la razón por la
que los investigadores han centrado su atención en descifrar los mecanismos que se esconden
detrás de esos procesos. Desde las primeras observaciones de Gregorio Mendel hasta la actualidad,
se tiene la noción de que parte de la explicación de los diferentes fenómenos biológicos se
encuentra escondida en lo más recóndito del genoma celular y que una de las claves para entender
dichos fenómenos es el estudio de los genes. Uno de los descubrimientos más importantes de la
historia que marcó el inicio de una nueva era en el estudio y conocimiento de los ácidos nucleicos
fue el de Watson y Crick, al descifrar la estructura del ADN (ácido desoxirribonucleico). Desde
entonces, varios grupos han mostrado un gran interés por desarrollar métodos sensibles y
reproducibles que les permitan estandarizar protocolos experimentales para estudiar los ácidos
nucleicos.

Es así como han ido apareciendo diferentes tecnologías cuyos protocolos están dirigidos al estudio
del ADN; probablemente, la más importante sea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por
sus siglas en inglés), desarrollada por Kary Mullis y que revolucionó la biología molecular y la forma
en cómo se estudiaban los ácidos nucleicos en ese momento. Actualmente sabemos que la misión
de la PCR es copiar millones de veces una secuencia específica de ADN blanco, mediante una enzima
conocida como ADN polimerasa termoestable, de tal manera que cantidades pequeñas de ADN
pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con diferentes fines. Hoy en día, la PCR
se aplica en diferentes áreas de las ciencias biológicas y de la salud, formando parte del quehacer
científico de muchos laboratorios de investigación que la utilizan principalmente para expresión
genética, genotipificación, detección de patógenos y análisis de mutación (1).

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

• Analice la estructura de la molécula de ADN, mediante una simulación.
• Comprenda la metodología empleada en la técnica de PCR y su aplicación científica.
• Conozca los elementos implicados en la realización de una PCR.

Antecedentes

La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN
polimerasa termoestable, que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células.

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En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una
PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico
mensajero) se le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). El ADNc
se utiliza cuando analizamos la expresión del ARNm de algún gen de interés.

Los elementos importantes en la reacción son:

• Templado o molde (ADN o ADNc): Son cadenas de ADN que se separan y funcionan como
molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de
interés.
• Enzima ADN polimerasa termoestable: Se encarga de la catálisis de la reacción,
sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más
usada con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa.
• Oligonucleótidos o primers: Son secuencias que delimitan la secuencia blanco que se desea
amplificar y son complementarios a ésta.
• Desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina): Son
bases nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN.
• Ión magnesio (Mg+): Es un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la reacción.
En ocasiones ya viene incluido en el buffer.
• Solución buffer: En la solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente
tiene un pH de 8.
• Agua: Es el disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada libre de nucleasas
(enzimas que degradan a los ácidos nucleicos).

Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se compone la PCR:

• Desnaturalización: En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del
templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario más tiempo para romper sus
uniones debido a que el apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces, uno
más que las bases de A-T. Al final de esta etapa tendremos las cadenas separadas que
servirán como templado para el siguiente paso.
• Hibridación o alineamiento: En esta etapa, los primers se alinean al extremo del templado
previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el
complejo templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación sea la
óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60°C. Si el diseño de los primers es el correcto y
la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.
• Extensión o elongación: En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-
primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s
complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La temperatura óptima para la
reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del ciclo, se
habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de pares de
bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.

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Imagen de los componentes y proceso de la PCR

Fuente (2)

Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están
diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y
tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar
si se amplificó la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR son analizados en geles de
agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa (1).

Procedimiento

Práctica virtual
1. Realizar la simulación en la siguiente website: [Link]
2. Dirigirse a la parte inferior de la página y seleccionar: Virtual Labs.
3. Seleccionar la opción de PCR.
4. Realizar la práctica virtual, haciendo clic en: Begin.

Cuestionario Post-Laboratorio

1. ¿Por qué existen 2 difrentes primers que se utilizan en PCR?

2. ¿De qué bacteria se obtiene la Taq ADN polimerasa?
3. ¿Por qué se utiliza una Taq ADN polimerasa y no una ADN polimerasa en PCR?
4. Menciones 2 secuencias que se pueden amplificar con una PCR.
5. ¿Cuántos ciclos pueden llevarse a cabo por un termociplador en una PCR?
6. ¿Cuántas copias de ADN pueden generarse al finalizar una PCR de 30 ciclos?
7. ¿Qué significa dATP, dGTP, dCTP y dTTP?
8. Menciones 2 apliaciones en las que se utilice una PCR.

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Referencias
1. Tamay de Dios L., Ibarra C., Velasquillo C. [Internet].“Fundamentos de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real”. Tecnología en Salud, Vol. 2. [2013].
Disponible en: [Link]
2. PCR. [Internet]. PCR components. Disponible desde: [Link]
level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/[Link]

Material de apoyo adicional

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PRÁCTICA No. 8
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE LA GLUCOSA

Introducción

La fermentación es un proceso catabólico (rompimiento de compuestos complejos a compuestos

sencillos) oxidativo (intercambio de electrones) de cuyo resultado se obtiene un compuesto
orgánico. En los seres vivos, la fermentación es un proceso anaeróbico donde no interviene el
proceso de respiración celular. La fermentación la realizan los microorganismos, como las bacterias
y las levaduras (1). También se produce la fermentación en la mayoría de las células de los animales
(incluido el hombre), excepto en las neuronas que mueren rápidamente si no pueden realizar la
respiración celular. Algunas células, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias y se ven obligadas
a fermentar (2). Aunque bajo ciertas condiciones este proceso puede darse en el tejido muscular de
los animales, este ocurre cuando hay insuficiencia de oxígeno a las mismas; bajo esta circunstancia
se produce ácido láctico, el cual se acumula en los músculos y es el causante de dolor (1).

Objetivos

Que el estudiante a través de práctica:

• Identifique el proceso de fermentación alcohólica por medio de la observación en la
producción de CO2.
• Reconozca en los experimentos de la fermentación, los cambios físicos de los reactivos
utilizados.
• Compare e interprete los resultados obtenidos durante la práctica.

Antecedentes

Según la teoría evolutiva acerca del origen de la vida en la Tierra, se considera que la fermentación
es el proceso de obtención de energía más antiguo. Sobre esa base se considera que, dadas las
condiciones de la Tierra primitiva, en la que no existía oxígeno libre y donde los rayos del sol no
llegaban a la superficie terrestre, los primeros organismos solo podían obtener la energía de los
compuestos orgánicos mediante la fermentación (2).

El fenómeno de la fermentación debió llamar la atención del hombre desde las épocas más remotas,
pero sin el conocimiento de la naturaleza de los fenómenos químicos y biológicos que rigen las
manifestaciones de la vida, no se puede dar una explicación, ni lejanamente probable sobre este
fenómeno y su realidad quedó envuelta en los velos del misterio hasta mediados del siglo XIX. Para
entonces, sin conocer las causas ni los agentes que determinaban su formación, se sabía que los
líquidos azucarados, una vez fermentados, contenían alcohol y anhídrido carbónico.

El sabio Lavoisier en 1789, llevó a cabo estudios cuantitativos sobre la fermentación alcohólica y
halló además de etanol y dióxido de carbono, otro producto al que le dio el nombre de ácido acético
(3).

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Por otra parte, las fermentaciones pueden ser: naturales, cuando las condiciones ambientales
permiten la interacción de los microorganismos y los sustratos orgánicos necesarios, o pueden ser
artificiales, cuando el hombre favorece estas condiciones.

Tipos de Fermentación

Los tipos de fermentación que existen son:

• Alcohólica: Se lleva a cabo fundamentalmente por levaduras del género Saccharomyces,

que son hongos unicelulares que, en dependencia de la especie, se utilizan en la producción
de pan, cervezas o vinos.

• Láctica: Es una ruta metabólica anaeróbica que ocurre en el citosol de la célula, en la cual
se oxida parcialmente la glucosa para obtener energía y donde el producto de desecho es
el ácido láctico.

• Acética: Es la fermentación bacteriana por Acetobacter, un género de bacterias aeróbicas,

que transforma el alcohol en ácido acético. La fermentación acética del vino proporciona el
vinagre debido a un exceso de oxígeno y es considerado uno de los fallos del vino.

• Butírica: es la conversión de los glúcidos en ácido butírico por acción de bacterias de la

especie Clostridium butyricum en ausencia de oxígeno. Se produce a partir de la lactosa con
formación de ácido butírico y gas. Es característica de las bacterias del género Clostridium y
se caracteriza por la aparición de olores pútridos y desagradables (2).

Fermentación alcohólica

La fermentación alcohólica (denominada también como fermentación del etanol o incluso

fermentación etílica), es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de aire (oxígeno
O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono
(azúcares como: glucosa, fructosa, sacarosa, almidón, etc.) para obtener como productos finales: un
alcohol en forma de etanol, dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP que
consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. La
fermentación alcohólica es la base de las siguientes aplicaciones en la alimentación humana como
pan, cerveza, vino y otras bebidas fermentadas (1).

Las levaduras tienen ciclos reproductivos cortos, lo que hace que el inicio de la fermentación sea
tan rápido. La temperatura es un factor preponderante para la vida de las levaduras, no se
desarrollan bien más que en una escala de temperaturas relativamente corta, hasta 30ºC. Las
levaduras hacen fermentar mejor los azúcares en un medio neutro o poco ácido. Cuando una
fermentación se detiene no se debe a una falta de acidez, sino a un exceso de temperatura que
asfixia las levaduras.

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Imagen del proceso de fermentación alcohólica

Fuente: (5)
Procedimiento

A. Preparación de soluciones:

1. Cada mesa contará con 1 erlenmeyer de 100mL, proceder a servir lo siguiente:

Mesa Solución Reactivo 1 Reactivo 2 Agitación

1 A 40mL de agua. 1 cucharadita de levadura. Si
2 B 40mL de agua. 1 cucharadita de azúcar. Si
3 C 40mL de Coca-Cola. 1 cucharadita de levadura. Si
4 D 40mL de Coca-Cola light. 1 cucharadita de levadura. Si
5 E 40mL de jugo de piña. 1 cucharadita de levadura. Si
6 F 40mL de jugo de tomate. 1 cucharadita de levadura. Si

A. Preparación de tubos de ensayo:

2. Cada mesa identificará 6 tubos de ensayo con la letra de la solución que prepararon.
3. Servir a los 6 tubos, 6ml de la solución preparada.
4. Colocar en la boquilla de cada tubo de ensayo, un globo.
5. Repartir a cada mesa, un tubo de ensayo preparado. Al finalizar el intercambio cada mesa
deberá contar con 6 soluciones distintas.
6. Colocar los 6 tubos en baño María a 37ºC por un tiempo de 15 a 20mins.
7. Transcurrido el tiempo, observar, anotar y concluir en la siguiente tabla:

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Tabla No. 1 “Producción de CO2, por fermentación alcohólica”

Producción de
Solución Reactivos CO2* Conclusión
(con cruces)
A Agua + levadura.

B Agua + azúcar.

C Coca-Cola + levadura.

D Coca-Cola light + levadura.

E Jugo de piña + levadura

F Jugo de tomate + levadura.

*Calificar con 5 cruces (+), la solución con el globo más inflado y con guion (-), la solución con el globo menos inflado.

B. Observación microscópica:
8. Tomar un portaobjetos y colocar una gota de la solución con levaduras preparada.
9. Agregar 1gt. de azul de metileno y colocar cubreobjetos.
10. Observar al microscopio la estructura de la levadura.
11. Dibujar la preparación, en la siguiente hoja de microscopía:

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HOJA DE MICROSCOPÍA “FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE LA GLUCOSA”

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Muestra: ___________________________________
Preparación: ________________________________
Aumento:___________________________________
Descripción:_________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________

Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
Descripción:________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________
__________________________________________

Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
Descripción:________________________________
__________________________________________
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__________________________________________
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Cuestionario Post-Laboratorio

1. ¿Qué tienen en común las soluciones que produjeron CO2?

2. Cree usted que las bebidas carbonatadas utilizadas en la práctica, pudieron provocar un
sesgo en los resultados del experimento. Si o no, ¿por qué?
3. ¿Cuál fue el papel de la levadura en el proceso de la fermentación?
4. Indique qué factores internos influyen en el proceso de fermentación.
5. Menciones qué factores externos físicos influyen en el proceso de fermentación.
6. Nombre al menos 3 microorganismos fermentativos (distintos a los mencionados en esta
práctica) que se utilizan en procesos de la industria alimentaria.
7. ¿Qué son los productos metabólicos primarios y secundarios de la fermentación?
8. Escriba un ejemplo de producto metabólico primario y de producto metabólico secundario.
9. ¿Qué es la gluconeogénesis?

Referencias

1. Serrano, Y. El proceso de fermentación. [Internet]. Disponible en :

[Link]
[Link]
2. L/T. Biología 4, enseñanza preuniversitaria, 10º. grado. [Internet]. 2008. Editorial Pueblo y
Educación. Disponible en: [Link]
3. García, M. Fermentación alcohólica. [Internet]. 2008. Disponible en:
[Link]
4. Lucas, J. Fermentación alcohólica. [Internet]. 1994. Disponible en:
[Link]
5. Nave, R. Fermentación. [Internet]. Disponible en: [Link]
[Link]/hbase/biology/[Link]

Material de apoyo adicional

[Link]

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PRÁCTICA No. 9
OBSERVACIÓN DE CÉLULAS CANCEROSAS

Introducción

Una neoplasia es “una masa anormal de tejido cuyo crecimiento es excesivo y está descoordinado
con el del resto de tejidos normales del organismo, y que persiste de la misma manera excesiva una
vez que ha cesado el estímulo que lo ha originado”. La diferenciación entre neoplasias benignas y
malignas o cánceres se basa en criterios histológicos y biológicos. Estas diferencias sin embargo no
son absolutas siendo la capacidad de invasión de los tejidos circundantes al tumor y la posibilidad
de producción de metástasis las que mejor las diferencian.

Las células cancerosas presentan cuatro características esenciales:

• Clonalidad: cada tumor maligno se origina en una única célula que prolifera y da lugar a un
clon de células malignas.

• Autonomía: el crecimiento y desarrollo de la célula cancerosa no es regulado de forma

correcta por los moduladores hormonales y bioquímicos normales.

• Anaplasia: las células tumorales tienen una pérdida de diferenciación celular. En líneas
generales, cuanto mayor sea el grado de anaplasia de un tumor mayor será su potencial
metastásico y más intensa su diseminación.

• Metástasis: la célula cancerosa tiene capacidad de difundir (invadir otros tejidos) a distancia
de su lugar de origen.

En la etiología del cáncer se encuentran una serie de factores tanto de tipo exógeno como endógeno
que hoy en día se encuentran ya plenamente contrastados. Entre los de tipo exógeno destacan: el
tabaco, el alcohol, la dieta, las radiaciones, factores ocupacionales asociados a determinadas
sustancias (asbesto, arsénico, cuero, níquel, etc.), algunos fármacos y determinados virus. Los
factores endógenos se encuentran ligados a determinadas alteraciones genéticas reconociéndose
hoy en día, como principales implicados los oncogenes dominantes y los genes supresores de
tumores o antioncogenes (1).

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

• Identifique por medio de la observación microscópica las diferencias entre un tejido normal
y un tejido canceroso.
• Compare los aspectos morfológicos de un tejido enfermo y de uno sano.

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Antecedentes

En algunos casos, el control que regula la multiplicación celular se altera y una célula puede empezar
a crecer y a dividirse, aunque el organismo no necesite de ella. Cuando las células descendientes de
dicha célula heredan la capacidad de crecer y dividirse sin responder a la regulación, el resultado es
un clon de células que pueden alcanzar un tamaño considerable. Esta masa de células es llamada
tumor y está formada por un clon no deseado. Debido a que los tumores tienen efectos
devastadores en los animales que los desarrollan, gran parte de la investigación se ha encaminado
a entender su mecanismo.

Los eventos genéticos no son heredados por los gametos, son cambios en el ADN de las células
somáticas. El principal cambio es la alteración de genes preexistentes a oncogenes, cuyos productos
causan crecimiento celular inapropiado. La investigación de las bases moleculares de cáncer, utiliza
el cultivo celular, de ésta forma se pueden ver las características de la enfermedad y explicar sus
propiedades por el análisis de células y moléculas.

Existen tumores benignos que poseen células que recuerdan células normales con actividad normal
y son localizados, y los tumores malignos que se diferencian de los benignos por su capacidad de
invasión y diseminación y tienen la capacidad de producir metástasis.

Imagen comparativa de tumor benigno y maligno

Fuente: (2)

Las células cancerosas tienen suficientes características para ser diferenciadas de una célula normal;
esta observación se hace al microscopio y analizando lo siguiente:

• Pérdida de relación núcleo-citoplasma.

• Nucleolo prominente.
• Aumento en la tasa de mitosis.
• Estructura pobremente especializada.

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Las células tumorales tienen una morfología alterada que depende de la diferenciación y de la
anaplasia:

• La diferenciación celular de un tumor es el grado en el que las células cancerosas se

asemejan a las células normales de las que proceden, tanto morfológica como
funcionalmente. Las células normales que constituyen el organismo están muy
diferenciadas, lo que les permite realizar funciones específicas. Generalmente, los tumores
benignos son bien diferenciados y los cánceres varían desde bien diferenciados a
indiferenciados. Un grado de diferenciación bajo indica que las células tumorales son muy
diferentes a lo que deberían ser para desarrollar funciones habituales en el organismo.

• La anaplasia es la ausencia de diferenciación que conlleva a una falta de especialización o

de función celular y, generalmente, cuanto más indiferenciado sea un cáncer, más alta es
su velocidad de crecimiento. En general, lo que diferencia un cáncer maligno de otro
benigno, es la capacidad que poseen sus células de lograr una trasvasación exitosa (o
metastatizar), que se define como la capacidad que posee una célula tumoral de infiltrarse
al torrente sanguíneo (o linfático), mediante la ruptura de moléculas de adhesión celular
que sujetan a las células a la membrana basal, con posterior destrucción de esta última. Esta
característica que se adquiere luego de sucesivas alteraciones en el material genético
celular, donde es común observar cromosomas fragmentados, pérdida de genes supresores
de tumores receptores de señales mutados autoinductivos (etapa avanzada de
diferenciación), es la que origina el proceso de metástasis; es decir, la invasión y destrucción
de tejidos.

Las diferentes células del cuerpo pueden desarrollar células cancerosas, las cuales tienen
características muy parecidas a una célula inmadura normal en cuanto a sus propiedades. La
transformación de células normales a cancerosas incluye efectos sobre el control de crecimiento,
morfología celular, interacción de célula a célula, propiedades de membrana, estructura de
citoesqueleto, secreción de proteína, expresión de gen y mortalidad (células transformadas pueden
crecer indefinidamente).Más de 20 distintos genes celulares normales, pueden convertirse en
oncogenes por alteración genética. Las anormalidades genéticas encontradas en las células
cancerosas pueden ser de tipo mutación puntual, translocación, amplificación, deleción, y
ganancia/pérdida de todo un cromosoma.

Existen genes que son más susceptibles a sufrir mutaciones que desencadenen cáncer. Esos genes,
cuando están en su estado normal, se llaman protooncogenes, y cuando están mutados se llaman
oncogenes. Lo que esos genes codifican suelen ser receptores de factores de crecimiento, de
manera que la mutación genética hace que los receptores producidos estén permanentemente
activados, o bien codifican los factores de crecimiento en sí, y la mutación puede hacer que se
produzcan factores de crecimiento en exceso y sin control.

Procedimiento

1. Observar al microscopio láminas fijas de tejido canceroso de estómago.

2. Realizar detalladamente, los dibujos de los tejidos, tomando en cuenta forma y tamaño
relativo de las células e identificando estucturas principales.

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HOJA DE MICROSCOPÍA “OBSERVACIÓN DE CÉLULAS CANCEROSAS”

Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

Muestra: ___________________________________
Preparación: ________________________________
Aumento:___________________________________
Descripción:_________________________________
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Muestra: __________________________________
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Muestra: __________________________________
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HOJA DE MICROSCOPÍA “OBSERVACIÓN DE CÉLULAS CANCEROSAS”

Muestra: ___________________________________
Preparación: ________________________________
Aumento:___________________________________
Descripción:_________________________________
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Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
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Muestra: __________________________________
Preparación: _______________________________
Aumento:__________________________________
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Biología Celular y Molecular Humana II

Cuestionario Post-Laboratorio

1. ¿Qué tipos de terapias existen para el tratamiento del cáncer?

2. Mencione qué gen se encuentra asociado al cáncer mamario y qué tipo de anormalidad
genética se encuentra implicada en el mismo.
3. ¿Qué significan las siglas TNM y cómo se cuantifican para un tumor primario?
4. Investigue qué tipo de cáncer tiene mayor incidencia población a nivel nacional.
5. ¿Qué centros hospitalarios brindan ayuda en el diagnóstico, tratamiento y seguimiento a
pacientes con cáncer en Guatemala?
6. El gen de la proteína p53 es uno de los genes supresores de tumores conocidos que con más
frecuencia aparece mutado en diferentes tumores humanos. ¿Cuál sería el fenotipo de una
célula que sobreexpresarse niveles muy elevados de p53?
7. Distingue entre genes supresores de tumores y oncogenes.
8. Mencione un cáncer detectado por anomalía cromosómica.
9. Dibuje el esquema del crecimiento normal de una célula.
10. Defina pérdida de la heterocigosidad.

Referencias

1. Cajaraville, G.; Carreras, M. J.; Massó, J. y Tamés, M. J. Oncología: farmacia hospitalaria.

[Internet]. Disponible desde: [Link]
2. Bruce, A. [et. al.] Biología Molecular de la Célula. 5ª edición. Porto Alegre: Artmed. 2010

Material de apoyo adicional

[Link]

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

PRÁCTICA No. 10
INTRODUCCIÓN A TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Introducción

En principio se denomina técnicas de biología molecular a todas las técnicas de laboratorio que se
usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para determinar su estado, cortarlo y
pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas, corte de una determinada
región con enzimas de restricción, etc.

Todas estas técnicas tienen diversas aplicaciones, generalmente en el diagnóstico de enfermedades

hereditarias, búsqueda de alelos frecuentes asociados a una característica de interés, diagnóstico
de contaminación bacteriana en alimentos, diagnóstico viral o de infección viral, selección de
marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento genético de una especie, test de
paternidad, diagnóstico de identidad forense, entre otras (1).

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

• Conozca y se familiarice con los principios básicos de la biología molecular.
• Comprenda el fundamento de las técnicas de rutina de biología molecular y sus aplicaciones
en el diagnóstico clínico.
• Analice y explique la función de una enzima de restricción.
• Realice una simulación de virtual de la técnica de electroforesis.

Antecedentes

ADN recombinante

La tecnología del ADN recombinante se originó con el descubrimiento de las endonucleasas o

enzimas de restricción, enzimas capaces de realizar el corte específico del ADN en fragmentos
determinados.

En las últimas décadas la tecnología de recombinación del ADN también conocida como ingeniería
genética, o más acertadamente recombinación genética in vitro, ha revolucionado la biología. El
campo de la salud es uno de los más beneficiados con el desarrollo de esta tecnología. Las
investigaciones que se realizan en esta área están enfocadas al diagnóstico oportuno de
enfermedades, así como su posible tratamiento a través de la terapia con moléculas recombinantes
e introducción de genes. Además, la manipulación de genes proporcionará en el futuro una
herramienta fundamental para la eliminación de enfermedades mortales para el hombre (2).

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El ADN recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan
para manipular las moléculas de ADN. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un
organismo, sea un virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo
dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresión de un gen e incluso en
algunos casos, para tratar una enfermedad genética en cualquier especie con fines económicos y
científicos.

Por estas razones resulta útil que el médico esté familiarizado con conceptos básicos sobre biología
molecular, su aplicación en la investigación biomédica, y en especial con sus posibles aplicaciones
clínicas, conceptos que aparecen cada vez con mayor frecuencia en toda la literatura biomédica,
tanto básica como clínica (2).

Ejemplo de la inserción de ADN recombinante

Fuente (3)

Enzimas de restricción

El descubrimiento de las enzimas de restricción ha permitido a los investigadores manipular

segmentos específicos de ADN, facilitando enormemente el estudio de esta molécula de gran
tamaño.

Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, reconocen secuencias de bases

específicas en el ADN doble hélice y cortan en lugares concretos ambas hebras del dúplex que
contienen las secuencias reconocidas. Las enzimas de restricción fueron obtenidas a partir de una
gran variedad de procariontes. Su función biológica en estos organismos consiste en eliminar
mediante su actividad de endonucleasa ADN externo que pudiera ingresar en una bacteria. El ADN
del propio microorganismo no se destruye porque los sitios reconocidos por sus propias enzimas de
restricción se encuentran metilados. Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas en
el ADN de entre 4 a 8 pares de bases e hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra de la región
reconocida. Una característica de estos sitios de corte es que casi siempre son palíndromos (que se
lee igual de izquierda a derecha, que de derecha a izquierda) y los puntos de corte están dispuestos
simétricamente (2). Estas enzimas hidrolizan en una forma específica puentes fosfodiéster 3' - 5'
entre pares de bases adyacentes en la doble cadena de ADN.

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Imagen de los cortes de una enzima de restricción

Fuente (4)

Electroforesis

Tras la utilización de las enzimas de restricción, es necesario llevar a cabo técnicas de transferencia
molecular como lo son Southern blot para la separación de ADN, Northern blot para la separación
de ARN y Western blot para la separación de proteínas.

Sin embargo, en todas estas técnicas se realiza primero una electroforesis en gel con el objetivo de
separar las moléculas por su tamaño y carga, posteriormente la transferencia a una membrana para
finalmente identificar un fragmento específico de ADN, una molécula de ARN particular o una
proteína de interés.

La electroforesis en gel es una técnica en la que se aplica un campo eléctrico para separar moléculas
en base a su tamaño y a su carga. Debido a que los ácidos nucleicos contienen grupos fosfatos
cargados negativamente, migran hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico. El ADN cortado
previamente por una o más enzimas de restricción, al aplicarse el campo eléctrico los fragmentos
se separan por tamaño. Luego pueden ser visualizados, detectándose hasta pequeñas diferencias
de peso molecular. Se utilizan dos tipos de geles: de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta
unos miles de pares de bases y geles de agarosa, más porosos, para separar mezclas de fragmentos
de hasta 20.000 bases (20 kilobases (kb)), utilizados para Southern blot. Luego de la corrida
electroforética, los fragmentos de ácidos nucleicos no se visualizan directamente sino que debe
teñirse el gel con un agente que se intercala entre las bases de la doble hélice y que fluoresce al ser
irradiado con luz ultravioleta (como el bromuro de etidio). De esta manera se observan los
fragmentos de ADN de una intensa fluorescencia anaranjada cuando se expone el gel a luz
ultravioleta (2).

Procedimiento

Simulación de la técnica de electroforesis.

1. Ingresar al siguiente sitio web: [Link]

2. Realice cada uno de los pasos de la técnica de electroforesis.

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Cuestionario Post-Laboratorio

A. Enzimas de restricción y ADN recombinante

1. Las enzimas de restricción se nombran con una abreviatura de tres letras que se refieren al
organismo hospedador, por ejemplo, Eco de Escherichia coli. En base a esta información,
complete el siguiente cuadro:
Enzima de restricción Organismo de donde se extrae
Hin
Providencia stuartii
Haemophilus aegyptius
Hpa
Bacillus globiggi

2. Investigue cúales son las secuencias de reconocimiento de las siguientes restrictasas:

Restrictasa Organismo origen Secuencia de reconocimiento
EcoRI E. coli
EcoRII E. coli
BsuRI B. subtilis

Dada la siguiente secuencia de ADN:

5’…ATGCGAATTCCCGCCAGGTTATGCAATTCATG…3’
3’…TACGCTTAAGGGCGCTCCAATACGTTAAGTAC…5’

3. ¿Cuántos y cuáles serían los fragmentos que originaría si se corta con la enzima de
restricción EcoRI?

4. ¿Cuántos y cuáles serían los fragmentos que originaría si se corta con la enzima de
restricción EcoRII?

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5. Las siguientes moléculas de ADN fueron hidrolizadas por la restrictasa EcoRI. Determiner el
ADN recombinante.
Molécula de ADN I Molécula de ADN II
C-G-A-T-C-C-A-G-G-A-A-T-T-C-A-T-C-C-A-G-C-C A-G-G-C-T-C-T-A-G-A-A-T-T-C-T-T-C-T-A-G-C-T
G-C-T-A-G-G-T-C-C-T-T-A-A-G-T-A-G-G-T-C-G-G T-C-C-G-A-G-A-T-C-T-T-A-A-G-A-A-G-A-T-C-G-A
ADN recombinante I: ADN recombinante II:

B. Electroforesis
1. ¿Qué carga tiene el ADN y el ARN?
2. ¿Una molécula de ADN de 450pb se desplaza por el gel a mayor o menor distancia que una
de 1000 pb? ¿Por qué?
3. En una cámara electroforética, ¿qué nombre reciben los electrodos negativo y positivo?
4. ¿Qué tipos de geles se pueden utilizar para realizar una electroforesis?
5. Un fragmento de ADN fué incubado por separado con dos enzima de restricción 1, 2 y
luego con ambas. Se le sometió una electroforesis en gel de agarosa obteniéndose las
siguientes bandas:

Enzima 1: 1 banda de 45 Kb, 1 de 15 Kb

Enzima 2: 1 banda de 43 Kb, 1 de 10 Kb, 1 de 7 Kb
Enzima 1/ 2: 1 banda de 35 Kb, 1 de 23 Kb, 1 de 10 Kb, 1 de 7 Kb

¿Cuál de las siguientes corridas electroforéticas representa el resultado? Justifique su

razonamiento.

1 2 3 4 1 2 3 4

A B

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Referencias
1. Iglesias, G. M. Desde Mendel hasta las moléculas [Internet]. Universidad Nacional de Río
Negro, Argentina. Disponible desde: [Link]
molecular/
2. Tecnología del ADN recombinante y sus aplicaciones en la Medicina [Internet]. Argentina.
Disponible desde:
[Link]
3. Biotecnología: Ingeniería genética. [Internet]. Disponible desde:
[Link]
4. ¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias? [Internet]. Disponible desde:
[Link]
a_nucleo_tic

Material de apoyo adicional

[Link]

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

PRÁCTICA No. 11
ELECTROFORESIS (Práctica demostrativa)

Introducción

Como anteriormente se mencionó, el término electroforesis se usa para describir la migración de

una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Muchas moléculas importantes
biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas nucleótidos, ácidos nucleicos) poseen grupos
ionizables y existen en solución como especies cargadas -cationes o aniones- (1). En esta práctica
demostrativa, se pretende que el alumno comprenda el fundamento teórico de esta técnica y sus
aplicaciones en el campo de la medicina, observando el proceso que se lleva a cabo para realizar la
separación electroforética en gel de agarosa del ADN.

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

• Comprenda las bases teóricas de la técnica de electroforesis.
• Conozca la aplicación que tiene la técnica de electroforesis en el campo de la medicina.
• Aprenda los pasos que se realizan paa llevar a cabo una electroforesis en gel.

Antecedentes

La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos
nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permite
separar moléculas en función con su tamaño y forma. Tras la realización de una electroforesis, los
componentes en la muestra migran en forma de pequeñas bandas, también llamadas zonas.

Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como la
poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan dentro de una cubeta de electroforesis,
sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma las moléculas van a migrar de forma
distinta en el gel. La distancia recorrida por cada fragmento, va ser acorde al tamaño del mismo,
siendo los tamaños más grandes los que se desplazan menos (son más pesados) y los de menor
tamaño recorren más distancia (son más ligeros).

Es importante, al realizar una corrida electroforética, la utilización de marcadores de tamaño

conocido (llamados popularmente como escalera), los cuales permitirán calcular los pesos
moleculares de las muestras problema.

En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, la cual es una sustancia que se
intercala entre las bases de ADN y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Al finalizar
la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV (transiluminador), y se verán bandas
correspondientes a las muestras y marcadores de peso molecular (1).

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El procedimiento general de la técnica de electroforesis se ilustra en la siguiente imagen. La imagen

a la derecha, es un gel de agarosa donde la muestra fue visualizada con bromuro de etidio, (carril
uno (C1) marcador de pesos moleculares; carriles (C2, C3 y C4) muestras problema).

C1 C2 C3 C4

Referencias
1. Padillas, C., Diez, J., Martínez, E., Bárcena, J. y García, C. “Electroforesis de ácidos nucleicos
en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de ADN plasmídico.”
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales.
Córdoba.

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Nombre:_________________________________ Carné:___________ Puesto: _____ Sección:____

PRÁCTICA No. 12
REACCIÓN INMUNE EN ERITROCITOS HUMANOS

Introducción

A comienzos del siglo pasado, Landsteiner descubrió que los individuos podían ser agrupados en A,
B, AB, u O de acuerdo a la presencia (grupos A, B o AB) o ausencia (grupo O) de antígenos
fuertemente inmunogénicos en la superficie de los glóbulos rojos. También demostró la existencia
de anticuerpos (aglutininas) dirigidos contra los antígenos A y B y que el suero de un individuo no
contiene anticuerpos para el antígeno presente en sus propios glóbulos rojos pero si contra los que
no posee. Actualmente, todas estas observaciones revelaron la importancia de la compatibilidad
ABO en la práctica transfusional (1).

Objetivos

Que el estudiante a través de la práctica:

• Comprenda las bases teóricas de la reacción antígeno-anticuerpo.
• Interprete visualmente por medio de reacciones de aglutinación el grupo sanguíneo y Rh de
diferentes muestras sanguíneas.

Antecedentes

Grupo sanguíneo

La sangre de distintas personas tiene características que las diferencian entre sí. Esto se debe a unas
proteínas llamadas antígenos
que se hallan en la superficie de
las células rojas de la sangre
(hematíes).

Hay dos tipos de antígenos: A y

B. Cada persona tiene un
antígeno heredado de cada
progenitor (uno del padre y
otro de la madre). Según estén
o no estos antígenos se habla
de cuatro tipos sanguíneos: A,
B, AB y O.

En la sangre de cada persona puede haber anticuerpos contra el grupo sanguíneo que no está
presente en sus hematíes. Estos anticuerpos están presentes desde el embarazo y van a condicionar
la compatibilidad al momento de poder recibir sangre de otra persona.

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Los grupos sanguíneos están definidos por

antígenos: Estos, son la cadena de
carbohidratos unidas a una ceramida que
componen las glicoproteínas de la
membrana de algunos eritrocitos en la
sangre:

 Grupo A: Posee N-acetil galactosamina.

 Grupo B: Posee D-galactosa.
 Grupo AB: Posee N-acetil galactosamina
y D-galactosa.
 Grupo O: No posee azúcar terminal (2 y
3).

Factor Rh

Es otro grupo de antígenos que hay en los hematíes. Hay seis antígenos distintos. De ellos, el más
importante es el “D”. Si el antígeno D está presente, se dice que esa persona es “Rh positivo” y si no
lo está será “Rh negativo”.

Es muy importante que cada persona sepa cuál es su grupo sanguíneo y su factor Rh. Este grupo
condicionará la administración de sangre en caso de hacer falta (intervención quirúrgica, accidentes,
enfermedades hematológicas, etc.), ya que si entran en contacto sangre de distinto grupo se pueden
producir reacciones graves, incluso pueden causar la muerte del paciente. Los anticuerpos que
tenga en la sangre una persona, reconocen los antígenos de la sangre de otros grupos y pueden dar
lugar a la rotura de esos hematíes.

Fundamento del método de aglutinación en lámina

La determinación de grupos sanguíneos del sistema ABO se efectúa enfrentando los glóbulos rojos
del paciente con anticuerpos monoclonales Anti-A, Anti-B o Anti-AB. La aglutinación o no de los
hematíes ensayados frente a cada uno de los reactivos indica la presencia o ausencia de los
correspondientes antígenos. La interpretación de los resultados para esta prueba es la siguiente:

• Reacción positiva: Los hematíes aglutinan en segundos y permanecen aglutinados al

balancear la lámina. Indica la presencia del antígeno eritrocitario correspondiente.

• Reacción negativa: No se observa aglutinación al minuto, indicando ausencia del antígeno

correspondiente (1).

En otras palabras, donde exista aglutinación se considera como positivo para ese grupo sanguíneo
o factor Rh.

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Procedimiento

A. Obtención de la muestra
1. Colocarse los guantes previos a realizar el procedimiento. Recuerde que la sangre es
potencialmente infectiva, por lo que deben adoptarse medidas universales de
bioseguridad.
2. Humedecer una torunda de algodón con alcohol y limpiar perfectamente dos láminas
portaobjetos.
3. Secar el exceso de alcohol del portaobjetos con papel absorbente.
4. Limpiar el dedo anular (de la mano con la que no escribe) con otra torunda de algodón con
alcohol.
5. Estimule la circulación del dedo a puncionar, masajeando la zona del mismo.
6. Tomar una lanceta y retirar el capuchón amarillo.
7. Presionar la lanceta con firmeza contra el dedo y realizar la punción presionando el extremo
blanco.
8. Descartar la lanceta, en el recipiente de punzocortantes.
9. Colectar 2 gotitas de sangre en los extremos de cada lámina portaobjetos previamente
limpias.

B. Reacción antígeno- anticuerpo

1. Agregar al lado de cada gotita de sangre una gota de reactivo Anti-A, Anti-B, Anti-AB y
Anti-D (Anti-Rh), respectivamente. Tenga el cuidado de no contaminar la punta de los
goteros de los reactivos con la muestra de sangre.
2. Mezclar el reactivo y la muestra de sangre con un palillo de madera en forma circular. Utilice
un palillo diferente para mezclar cada reacción. Descartar los palillos en el recipiente de
punzocortantes.
3. Homogenizar manualmente la lámina con movimiento circular durante 1 minuto.
4. Observar aglutinación visible macroscópicamente hasta el minuto.
5. Reportar por medio de cruces (+), el grado de aglutinación en la siguiente tabla e interprete
el resultado:

Tabla No. 1 “Aglutinación de la reacción inmune de eritrocitos humanos”.

Lámina 1 Lámina 2
Interpretación
Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-D

*Calificar con cruces, el grado de aglutinación de la reacción: (+++) muy aglutinado; (++) medianamente aglutinado;
(+) levemente aglutinado y guión (-), ausencia de aglutinación.

Tipo de sangre: _____________________________ Factor Rh: __________________

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Cuestionario Post-Laboratorio

1. ¿Qué es un antígeno?
2. ¿Qué es un anticuerpo?
3. ¿En qué consiste la reacción antígeno-anticuerpo?
4. ¿En qué consiste una reacción post-transfusional?
5. ¿Qué grupo sanguíneo es considerado como el donador universal de sangre?
6. ¿Qué grupo sanguíneo es considerado como el receptor universal de sangre?
7. Interprete el grupo sanguíneo y factore Rh de las siguientes muestras:

Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-D Interpretación

Referencias
1. Wiener Laboratorios. Inserto Anti-A, Anti-B o Anti-AB monoclonal. 2000. Argentina.
2. Rose NR [et al.] Manual of Clinical Laboratory Immunology. 6th ed. Washington, ASM, 2000.
3. Stites D [et al.] Inmunología Clínica. México, El Manual Moderno, 1998.

Material de apoyo adicional

[Link]

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