INFORME 1ER LABORATORIO: ANÁLISIS DE PAJILLAS
Karen Sofia Parrado Godoy
Karent Paola Valderrama Garcia
Santiago Jose Bustamante Morales
Janier Stiven Salazar Cordero
Bryan Stiven Sanchez Beltran
Vanessa Alexandra Murillo Lesmes
Presentado a : Diego Riveros
Curso de Reproducción Animal
Universidad de los Llanos
Sexto Semestre
Villavicencio
2022
OBJETIVOS
● Aprender a realizar de forma manual los distintos parámetros de evaluación
seminal, tales como concentración, motilidad, morfología y vitalidad dentro de
el laboratorio de reproducción
● Reconocer que se encuentran distintos métodos para una buena evaluación
seminal, siendo análisis computarizados o manuales
● Diferenciar los resultados que se pueden obtener en los diferentes
parametros y metodos de muestras de semen congelado y fresco
INTRODUCCIÓN
Actualmente entre las biotecnologías que se aplican en la reproducción, la
inseminación artificial (IA) ha sobresalido como uno de los instrumentos más
exitosos para el avance genético de los animales de gran importancia en la
zootecnia, en particular en la producción bovina. De una precavida evaluación de la
fertilidad dependerá la utilización del semen en el futuro y su nivel de
aprovechamiento de los eyaculados que han sido recolectados a lo largo de su vida,
teniendo en cuenta su rentabilidad y el número de espermatozoides viables.
(Hidalgo, et. al., 2005)
Gran cantidad de investigadores que pertenecen al área de reproducción están
buscando la forma de diseñar un análisis seminal ideal, que pueda valorar y predecir
adecuadamente la fertilidad de una muestra seminal; más hoy en la actualidad el
análisis seminal es llevado a cabo de forma manual, en otras palabras es realizada
mediante la observación y visualización de los espermatozoides en el microscopio,
siendo los encargados los expertos en reproducción; sin embargo este proceso
tiene un margen de error debido a factores como la subjetividad en el diagnóstico, la
falta de repetitividad en los resultados y el cansancio ocular del experto por largas
jornadas de trabajo, afectando de esta manera el resultado del análisis (Roa, et al.,
2012)
La IA tiene entre sus objetivos principales la predicción de la capacidad fecundante
del semen que se comercializa; con este propósito se han ido incrementando a
través del tiempo distintos métodos diagnósticos, desde la evaluación de la
motilidad, la morfología, concentración y vitalidad espermática de los eyaculados
hasta la contrastación de dosis de semen congelado por medio de procedimientos
de análisis computarizados, citometría de flujo y test de funcionalidad espermática
basados en la fecundación in vitro. (Otero,2008)
METODOLOGÍA
Posterior al almacenamiento y conservación de la pajilla con semen en nitrógeno
líquido a una temperatura de -160 °C se procede a colocar la pajilla en baño Maria
durante 40 segundos a una temperatura de 37 °C para descongelarla y
posteriormente poder utilizarla.
Explicación teórica:
Motilidad masal: Se refiere al movimiento de onda de todos los espermatozoides.
Procedimiento: Para esto, se tomó una gota de semen a examinar con una pipeta,
se coloca la gota sobre un portaobjeto a 37 °C y se observa al microscopio en
aumento de 10X.
Motilidad individual:Se expresa como el porcentaje de células móviles bajo un
campo microscópico.
Procedimiento: Se usó una gota de 4 μL de la muestra diluida con solución isotónica
de Cloruro de Sodio (0,9%) manteniendo una temperatura de 37 °C, en un
portaobjetos y cubreobjetos precalentados a 37° y mediante la ayuda del
microscopio (a un aumento de 100X) se realiza la observación de los
espermatozoides.
Vitalidad: Mediante esta, se mide el número de espermatozoides vivos y se expresa
como el porcentaje de células muertas.
Se utilizó el colorante eosina-nigrosina, con el cual los espermatozoides muertos
serán teñidos de color rojo o en rosa, mientras que los vivos quedan sin teñir. La
explicación de la coloración o no del espermatozoide reside en la integridad de la
membrana celular, ya que un espermatozoide vivo, conserva su membrana en
condiciones optimas impidiendo que este se tiña (Pérez y Pérez, 1985).
Morfología y vitalidad: Morfología: Relacionada con la motilidad espermática en
forma más directa, y se mide en porcentaje de espermatozoides con defectos de
morfología. Debido a que los espermatozoides son traslúcidos (invisibles al
microscopio de luz directa), se hace necesario el uso de colorantes que provean de
un fondo oscuro para visualizarlos. Para el caso de la práctica, se utiliza la
coloración eosina-nigrosina.
Vitalidad: Mediante esta, se mide el número de espermatozoides vivos y se expresa
como el porcentaje de células muertas. Se utilizó el colorante eosina-nigrosina, con
el cual los espermatozoides muertos serán teñidos de color rojo o en rosa, mientras
que los vivos quedan sin teñir. La explicación de la coloración o no del
espermatozoide reside en la integridad de la membrana celular, ya que un
espermatozoide vivo, conserva su membrana en condiciones optimas impidiendo
que este se tiña (Pérez y Pérez, 1985).
Procedimiento: El procedimiento seguido en el laboratorio consistió en la colocación
de una gota de aproximadamente 4 μL de semen diluido sobre un portaobjetos
limpio y desengrasado y se adicionó en el portaobjetos una gota de colorante, paso
siguiente de realiza el frotis, guardando las proporciones en el portaobjetos. Se
esperan aproximadamente 10 minutos para que el frotis seque y luego de secado se
coloca en el microscopio a aumento de 100X para la lectura y el conteo de los
espermatozoides. Se cuentan 100 espermatozoides por muestra para determinar el
porcentaje de espermatozoides normales, el porcentaje de espermatozoides
anómalos (y diferenciar los tipos de malformaciones espermáticas).
Concentración espermática: La concentración de los espermatozoides se expresa
como el número de espermatozoides por mL de semen. La determinación de la
concentración espermática se lleva a cabo mediante el conteo de células, a través
de la cámara de Neubauer. La cámara de Neubauer consiste en una laminilla
especial que tiene 2 cámaras de conteo. Las cámaras de conteo poseen 0,1 mm de
profundidad y un área graduada en el fondo de la cámara de 1 mm². Este cuadro se
divide en 25 cuadros más pequeños. Al conocerse la profundidad y el área se puede
determinar el área se puede determinar el número de espermatozoides en un
volumen dado.
Procedimiento: En el laboratorio se utilizó un diluyente para inmovilizar a los
espermatozoides para poder realizar el conteo. Se usó una solución hipertónica,
haciendo que la célula no sea viable. La dilución utilizada en el caso para la muestra
del semen bovino fue de 1:19, una relación mayor a la reportada por Bearden (1982)
que fue 1:200 para bovinos, imposibilitando la lectura en el microscopio por la
densidad espermática. Adicionalmente, se utilizó agua como agente espermicida
(inmovilizante).
Para el cálculo de la concentración de espermatozoides se realiza la siguiente
ecuación:
(Espermatozoides/mL)= Número de espermatozoides contados en 5 cuadrados
(puede ser 4 esquinas + el centro) * (total de cuadrantes de la cámara) 25 * dilución
(1:19) * 100 * 1000.
RESULTADOS
Dentro de los parámetros analizados en el laboratorio se
logró observar la motilidad espermática que presentaba una
muestra extraída del esperma, de la cual se ofreció una
descripción general limitando su exactitud a un análisis
cualitativo, y se estableció que exhibían una clara motilidad,
otorgándole un valor de 30%.
En cuanto a su morfología, al observar al microscopio las
placas obtenidas durante el proceso de tinción se observaron
las características generales sin analizar a detalle las
propiedades que permiten clasificar anormalidades.
Para la vitalidad es necesario resaltar que no se obtuvieron
resultados determinantes, pues los tiempos en que las
muestras permanecieron por fuera del calentador de láminas
fueron mayores a lo recomendado para obtener resultados confiables, por lo tanto
es posible que dicho inconveniente influenciara la muerte de los espermatozoides.
Con respecto a la concentración no se obtuvieron
resultados confiables, esto debido a que en el proceso
realizado con la cámara de Neubauer, el esperma fue
diluido en una concentración demasiado escasa, alterando
los resultados reales que se debían obtener por este
método.
DISCUSIÓN
La inseminación artificial abarca una de las estrategias más usadas e implementables a
nivel de seguridad reproductiva, ya que este hace parte de estrategias ganaderas que
acompañadas con acciones complementarias para organización de Hato, puede generar
una mayor cantidad de ganancias económicas, por mayor natalidad y con ella mayor
producción de leche según sea el objetivo a alcanzar. Como segundo beneficio de las
nuevas tecnologías está la mejora genética que se presenta en calidad seminal y un
proceso de selección del toro donador a continuación la discusión irá orientada a este
componente seminal.
La calidad del semen en cuanto a sus células como a sus componentes extracelulares
requieren un diagnóstico funcional, este diagnóstico se aplica tanto para ejemplares que se
encuentran en pastoreo en el hato (sementales) o pajillas de semen compradas por las
diferentes casas comerciales, pues “se forma una opinión del potencial de fertilidad del toro
de ese momento, ya que la calidad seminal puede cambiar bastante y rápidamente,
dependiendo de si un toro está pasando o recuperándose de un proceso que afecte la
espermatogénesis” (Pari,2016).
Los objetivos de la evaluación diagnóstica seminal tiene objetivos claros frente a un semen
de calidad para hacer uso de este en ese sentido “La fertilidad potencial de una muestra de
semen probablemente va a depender de que contenga un número suficiente de
espermatozoides viables, morfológicamente normales y funcionalmente competentes,
capaces de alcanzar el oviducto y de establecer un reservorio oviductal, de llevar a cabo la
fecundación del ovocito, y de contribuir al desarrollo embrionario” (Pari,2016).
La estrategia de conservación de semen tiene como objetivo preservar el espermatozoide
de tal forma pueda cumplir con su función de aportar genética a el nuevo individuo, de
conservar los parámetros funcionales que se han discutido en el presente informe, sin
embargo la crioconservación que es la forma en la cual por congelación se mantiene la
integridad de las células no es del todo efectiva en cuanto a su propósito pues “El proceso
de criopreservación presenta ventajas como las anteriormente descritas, también puede
causar efectos sobre la supervivencia y migración de los espermatozoides en el tracto
reproductivo de la hembra, lo cual es atribuido al shock térmico, velocidad de congelación,
constitución de los diluyentes y estrés osmótica, así como también la metodología de
congelación y descongelación, la concentración espermática en el diluyente y el envasado.
La alteración causada por la criopreservación en el espermatozoide debido a la congelación
y su posterior descongelación puede presentarse a nivel estructural y//o funcional, razón por
la cual no se ha establecido un método de criopreservación espermática universal que
alcance tasas superiores de crio supervivencia. Durante el proceso de congelación y
descongelación aproximadamente el 50 % de la población inicial de espermatozoides se
pierde debido a los efectos de la criopreservación sobre las membranas, citoesqueleto,
aparato motor y núcleo del espermatozoide” ( Moncayo, 2016).
*Morfología (Anormalidades):
El análisis morfológico de los espermatozoides es uno de los principales
componentes de la evaluación de las características de una muestra seminal. La
valoración de la morfología del espermatozoide se basa en la relación directa que
haya entre la proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo de
defecto morfológico y su relación con la fertilidad in vivo de los toros. Atendiendo a
una clasificación estrictamente morfológica, las anomalías que puedan generarse se
clasifican en anomalías en la cabeza, en el tracto intermedio y en la cola. Según el
órgano donde pueden haberse generado diferenciamos las anomalías primarias y
secundarias.
Esta evaluación de la morfología espermática puede ser utilizada para eliminar toros
con pobre calidad seminal y refleja la funcionalidad de los testículos, epidídimos y
glándulas accesorias, por lo que siempre deben estar incluidas en las pruebas de
evaluación espermática. (Hidalgo, Tamargo, Diez,P.5).
TINCIONES
Diff-Quik
La tinción de Diff-Quik colorea al acrosoma de morado pálido, mientras que la región
post acrosomal, la pieza media y el flagelo se tiñen de morado oscuro. El análisis
morfológico con esta tinción provee de resultados similares comparándolo con
Papanicolaou. Un efecto negativo de esta tinción es que puede ocurrir una tinción
excesiva de la célula y del fondo o background, lo cual se puede contrarrestar
lavando primero la muestra de semen antes de realizar el frotis. (Brufman,2020).
Papanicolaou
El método de Papanicolaou ofrece una buena definición tanto de células
espermáticas como de otros tipos celulares. Esta tinción colorea al acrosoma de
azul claro, la región post-acrosomal de azul oscuro, la pieza media de verde y el
flagelo de rojo. Su tiempo de procesamiento es de dos horas.
Giemsa
La tinción de Giemsa no se usa tan comúnmente como los demás, ya que los
espermatozoides sin acrosoma teñidos pueden aparecer como normales y los
flagelos pueden no teñirse.
Spermac
El método de Spermac tiñe la porción nuclear de rojo, mientras que el acrosoma, la
pieza media y el flagelo se tiñen de verde. (Brufman,2020).
*Concentración:
Cámara de Makler
Es una cámara alternativa para la evaluación de concentración de espermatozoides,
la ventaja de esta cámara frente a la de Neubauer es que ésta utiliza las muestras
sin diluir, aumentando la precisión del procedimiento y la reproducibilidad de los
resultados.
La cuadrícula de la cámara de recuento Makler® mide 1 x 1 mm, y tiene una
profundidad de sólo 0,01 mm, y está subdividida en 100 cuadros de 0,1 x 0,1 mm,
cada uno. El recuento de espermas se realiza de la siguiente manera: se transfieren
a la cámara 3-5 μl de muestra de semen previamente inmovilizada por incubación a
60ºC durante 10 minutos y el recuento se realiza después de 5 minutos en los 10
cuadrados de la cámara. El número total de espermas contados es la concentración
final. (BRUFMAN, 2020, p.15).
*Motilidad: Evalua:
1) Progresividad: se analiza si la movilidad es progresiva o no. Si los
espermatozoides no consiguen avanzar en distancia, atravesar el aparato
reproductor femenino hasta llegar al óvulo será muy complicado.
2) Forma de movimiento: se indica si los espermatozoides se mueven de forma
rectilínea o en círculos o en zigzag.
3) Velocidad: se anota si el movimiento es rápido o lento.
Existen tres tipos de movilidad: (Catena et al., 2014)
● Móviles progresivos(MP): son espermatozoides que se mueven activamente
tanto linealmente como en grandes círculos, independientemente de su
velocidad.
● Móviles no progresivos (MNP): todos los otros tipos de movilidad presentes
que tengan ausencia de desplazamiento. Por ejemplo: nadan en círculos
pequeños, se mueve el flagelo pero no se desplaza, o cuando se observan
pequeños movimientos del flagelo.
● Inmóviles (I): no presentan movilidad.
Sistema CASA(computer assisted semen analysis)-->
El sistema consta de un microscopio con contraste de fases conectado a una platina
que permite mantener las muestras a 37ºC, una cámara de vídeo de alta resolución
conectada a una pantalla de televisión y un software de análisis de imágenes. El
análisis se realiza al capturar imágenes de los espermatozoides en movimiento y
luego la información es transferida al procesador matemático, que organiza y
proporciona datos de la movilidad espermática (Brufman,2020).
Las muestras se deben procesar de la misma manera que en el método manual,
deben mantenerse a 37ºC ya que la motilidad de los espermatozoides es afectada
por la temperatura.
En el sistema CASA permite medir varias clases de velocidad de la trayectoria:
VCL: velocidad curvilínea, representa la distancia recorrida por la cabeza del
espermatozoide por unidad de tiempo (μm/s).
VSL: velocidad progresiva, es una medida de la distancia recorrida en línea recta
por
unidad de tiempo (μm/s).
VAP: velocidad media de la trayectoria, expresa la velocidad media con la que la
cabeza
del espermatozoide recorre su trayectoria espacial (μm/s).
ALH: amplitud de de la trayectoria del espermatozoide, se representa por la
amplitud del
desplazamiento lateral de la cabeza del espermatozoide (μm).
LIN: la linealidad de la trayectoria curvilínea del espermatozoide, se expresa como
el
cociente de las velocidades progresiva y curvilínea (VSL/VCL x100).
WOB: es una medida de la oscilación sobre el camino del espermatozoide
(VAP/VCL).
STR:índice
Técnica de Biospeckle Laser :
El equipo utilizado para la aplicación de Biospeckle Laser (BSL) consta de una
fuente de luz láser de baja potencia, un expansor de haz, un espejo, una cámara
CCD y una microcomputadora equipada con un procesador de imágenes.
El origen del fenómeno speckle se presenta cuando luz coherente con λ ≈ 10-7 m
incide sobre un objeto que presenta una superficie rugosa para la longitud de onda
del láser y se produce una interferencia aleatoria que se traduce en regiones
brillantes y oscuras. El speckle dinámico o biospeckle se manifiesta por el
movimiento aleatorio o el cambio de propiedades de: fuente, dispersores, índice de
refracción, detector, etc. Por ser un fenómeno que ocurre cuando la luz coherente es
dispersada por objetos que presentan algún grado de actividad constituye una
técnica apropiada y no destructiva para la prueba y el monitoreo sin contacto de
algunos fenómenos industriales y biológicos de interés práctico. Además, de contar
con la cámara CCD que reportara el movimiento del espermatozoide con una series
de imágenes tomadas durante la muestra. (García et al., 2009)
Analizador calidad SQA:
El SQA-Visión es un dispositivo que combina tecnología en optoelectrónica,
algoritmos de computadora y video microscopía, dando por resultado una
plataforma semiautomatizada de análisis de semen, que permite analizar muestras
normales de semen en 75 segundos. Se puede utilizar con muestras de semen
fresco, semen lavado, muestras tratadas por medios de técnicas de swim up,
gradiente de densidad, congeladas, estudios de longevidad, morfología manual y
vitalidad. (SQA-Vision, 2021)
Mide:
• Concentración espermática
• Movilidad
• Movilidad progresiva
• Movilidad no progresiva
• Velocidad
• Porcentaje de espermatozoides inmóviles
• Porcentaje de formas normales
* Vitalidad:
Aunque la movilidad nos indica vitalidad, no todos los espermatozoides inmóviles
están muertos. El índice de vitalidad no se mide en todos los espermogramas;
únicamente en aquellos casos en los que existe más de un 40% de
espermatozoides inmóviles (Betancur et al., 2013).
Además del método puesto en práctica durante el laboratorio para medir la vitalidad
espermática, encontramos uno diferente llamado Preparación y evaluación de
muestras utilizando HOST: Consiste en:
-Preparación de reactivos: Solución para fines de diagnóstico: disolver 0,735 g de
citrato de sodio
deshidratado y 1,351 g de D-fructosa en 100 ml de agua purificada. Congelar una
alícuota de 1mL
a -20 C.
-Procedimiento:
1. Descongelar la solución de diagnóstico y mezclar bien antes de usar.
2. Caliente 1 ml de solución de diagnóstico en microcentrífuga a 37 ° C durante 5
minutos.
3. Mezclar bien la muestra de semen.
4. Tomar una alícuota de 100L de semen y añadir a la solución de diagnóstico,
mezclar suavemente con pipeta.
5. Incubar a 37 ° C durante 5 minutos o 30 minutos, luego se transfieren una
alícuota de 10L a un portaobjetos limpio y cubrir con un cubreobjetos.
6. Realizar un replicado.
7. Examine cada replicado en el microscopio.
8. Contabilizar el número de espermatozoides no hinchados (muertos) y las células
hinchadas (vitales).
9. Evaluar 200 espermatozoides en cada repetición, a fin de disminuir el error de
muestreo. 10. Calcular el promedio y la diferencia de los dos porcentajes de células
vitales de las preparaciones.
11. Si la diferencia entre los porcentajes es aceptable puede ser informada, en caso
contrario repetir la evaluación. (Brufman,2020).
Test de la solución hipoosmótica : Es un método para determinar la integridad de
la membrana espermática de la cola del espermatozoide. Los espermatozoides son
diluidos con una solución hipoosmótica y el agua entra a la célula. Un
espermatozoide intacto se observa un englobamiento de la cola en diferentes
tamaños. Este test sirve para diferenciar un espermatozoide vivo inmóvil de uno
muerto.(Gomez,2007)
CONCLUSIONES
Se establecieron las características de los diversos métodos para llevar a cabo un
buen análisis seminal, especificando aquellos que se realizaron y aprendieron en el
laboratorio tales como la motilidad, la concentración, la morfología y vitalidad del
semen, distinguiendo las peculiaridades de este cuando se encuentra congelado o
en fresco, y diferenciando los variados procesos que se realizan con estas
muestras, tanto computarizados como manuales.
BIBLIOGRAFÍA
● Muiño Otero, R. (2008). Evaluación de la motilidad y viabilidad del semen
bovino mediante el uso de sistemas CASA y citometría de flujo: identificación
de subpoblaciones espermáticas. Universidad de Santiago de Compostela.
● Hidalgo Ordóñez, C. O., Tamargo Miguel, C., & Díez Monforte, C. (2005).
Análisis del semen bovino. Tecn Agro, 2, 39-43.
● Roa, E. y otros, 2012. Evaluación asistida por computador de la viabilidad
espermática en humanos. Revista Ingeniería Biomédica, pp. 17-28.
● Rodríguez Montaña, D. F. (2016). Diseño e implementación de una
herramienta computacional para el análisis asistido de motilidad espermática
en bovinos mediante técnicas de visión artificial (Doctoral dissertation).
● Agüero G, (2012). Evaluación de las características seminales de sementales
bovinos mediante el analizador seminal computarizado (CASA). Universidad
central de Venezuela.
● Veloz Veloz, D. M. (2017). Evaluación de la calidad espermática de
reproductores bovinos mediante el uso de sistemas de evaluación seminal
convencional y sistema CASA (análisis seminal asistido por computadora) y
su respuesta con la fertilidad por inseminación artificial (Master's thesis).
● Pérez, F. and Pérez, F. 1985. Dilución del esperma. Reproducción Animal,
Inseminación Artificial y Transplante de Embriones. Editorial
Científico-Médica, Barcelona, España. Capítulo 6: 215-249.
● Bearden, J., McCallow, G. and Smith, P. 1982. Sperm dilutions for
appropriate routine of semen evaluation. Theriogenology. 33: 157-160.
● Ferrian, S. (2007). INFLUENCIA DE LAS CARACTERÍSTICAS SEMINALES
DEL EYACULADO DE CONEJO SOBRE LA CALIDAD ESPERMÁTICA
POST-DESCONGELACIÓN. [Link]
● Benítez-González, Edgar, Chamba-Ochoa, Hermógenes, Sánchez-Sánchez,
Efrén, Luzón-Cevallos, Félix, & Sánchez-Carrillo, Jairo. (2018). Evaluación
comparativa de dos métodos de recuperación espermática de epidídimos
bovinos post-mortem. Abanico veterinario, 8(1), 59-74.
[Link]
● Pari, Q., & Nardelly, G. Evaluación Comparativa de la Calidad Seminal y
Funcional de Semen Crio Preservado Comercial de Origen Nacional en
Bovinos Lecheros de Tres Centros de Colección Seminal, Arequipa, 2016.
● C.M.J.C. (2014). EVALUACIÓN DE SEMEN BOVINO CONGELADO. Sitio
Argentino Producción Animal, 1(3), 18–31.
[Link]
icial/05-evaluacion_de_semen_bovino_congelado.pdf
● Brufman, A. (2020). Tecnicas de Evaluacion del Semen (1.a ed., Vol. 1).
FBIOyF.
● Garcia, M. (2009). Técnica de biospeckle para estudiar la dependencia de la
viabilidad de semillas de lupino con la temperatura. Rev. Cub. Física, 27(1).
Recuperado 26 de mayo de 2022, de
[Link]
/[Link]
● SQA-Vision. (2021, 9 noviembre). Diagnostika.
[Link]
n%20es%20un,de%20semen%20en%2075%20segundos.
● Restrepo Betanccur, G. (2013, junio). Vista de Técnicas para el análisis de la
fertilidad potencial del semen equino.(Techniques for analyzing the potential
fertility of stallion semen) (Métodos de avaliação do potencial de fertilidade do
sêmen equino). CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, 8(1). Recuperado 22
de mayo de 2022, de
[Link]
● Moncayo Picerno, S. A. (2016). Evaluación de la calidad seminal de reproductores bovinos
antes y después del proceso de crioprese (Bachelor's thesis).