UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA
PRACTICA 8
EXTRACCIÓN DE ADN DE ALETAS DE PESCADO
I. Objetivos
Aislar ADN de aletas de pescado.
Para obtener la forma purificada de ADN que se puede utilizar posteriormente para análisis
molecular.
Comprender el principio y el proceso de extracción de ADN.
II. Introducción teórica
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un ácido nucleico complejo que contiene el código genético
con las instrucciones para el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos
conocidos, con la excepción de algunos virus. Los segmentos de ADN que portan esta
información genética se denominan genes. El ADN se transcribe en ARN que luego se utiliza
como plantilla en la síntesis de proteínas.
El aislamiento de ADN se refiere al proceso de extraer ADN de una célula en forma pura. La
extracción de ADN es un paso preliminar importante en el que se obtiene ADN purificado a partir
de otros componentes celulares como proteínas, ARN y lípidos. El ADN se puede aislar de
cualquier célula nucleada de diversas fuentes, tanto vivas como muertas, como sangre total,
cabello, esperma, huesos, uñas, tejidos, heces, plumas mudadas, cáscaras de huevo, saliva,
células epiteliales, orina, bacterias, animales. tejidos o plantas.
El aislamiento de ADN es necesario para una variedad de aplicaciones en ciencia, medicina y
medicina forense. Por ejemplo, los científicos introducen ADN en las células de animales o
plantas para, análisis de metilación de ADN, análisis de variación del número de copias (CNV) o
hibridación genómica comparativa (CGH), Southern Blot (secuencia de ADN), PCR (reacción en
cadena de la polimerasa), etc. En medicina, el aislamiento de ADN es útil para fines de
diagnóstico. Además, la extracción de ADN es una herramienta importante en la ciencia forense
para la identificación de personas (por ejemplo, violadores, ladrones, víctimas de accidentes o
guerras), determinación de la paternidad, identificación del cuerpo, etc.
Hay varios procedimientos diferentes para la preparación de ADN genómico. Todos comienzan
con alguna forma de lisis celular, seguida de desprotección y recuperación de ADN. Las
principales diferencias entre varios enfoques radican en el grado de desprotección y en el peso
molecular del ADN producido. Los factores que afectan los métodos de aislamiento del ADN son
la edad, la fuente y el tamaño de la muestra.
La presencia de proteínas, lípidos, polisacáridos, etc. durante la preparación del ADN puede
interferir con los métodos de análisis de ADN al reducir la calidad del ADN. Los métodos de
extracción para purificar eficazmente el ADN de diversas fuentes deben adaptarse en función de
factores como el tamaño de la muestra, la frescura de la muestra y el contenido bioquímico de
las células de las que se extrae el ADN. El método de aislamiento debe variar según el tamaño
de la muestra. La frescura de la muestra también influye en la técnica de extracción. Los métodos
de extracción también varían según el contenido bioquímico de las células fuente. Por ejemplo,
en el caso de las bacterias, los principales bioquímicos presentes en un extracto celular son
proteínas, ADN y ARN. Por lo tanto, la extracción con fenol o el tratamiento con proteasa, seguido
de la eliminación del ARN con ribonucleasa, deja una muestra de ADN puro. Estos tratamientos
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Quim. Mijail Cjuno Quispe.
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pueden no ser suficientes si las células también contienen cantidades significativas de otros
bioquímicos. Los tejidos vegetales son particularmente difíciles a este respecto, ya que a menudo
contienen grandes cantidades de carbohidratos que no se eliminan mediante la extracción con
fenol.
Molécula de ADN
Las aletas de pescado son una fuente excelente y confiable de ADN de alta calidad con una serie
de ventajas. En la mayoría de los casos, el ADN se obtiene de la recolección de sangre de los
peces. En el caso de especies raras o en peligro de extinción, este método no es
recomendable. Por lo tanto, el tejido de la aleta se usa a menudo para la extracción de ADN
porque el muestreo es relativamente rápido, logísticamente simple y no letal. Un pequeño trozo
de tejido proporciona suficiente ADN para la PCR y la digestión de restricción. Lo más importante
es que la recolección de muestras de aletas de pescado no daña al pez. Esta es una
consideración muy importante, especialmente relevante con respecto a las especies raras y
ornamentales. Las muestras de aletas de peces se utilizan para estudios basados en ADN sobre
diversidad genética, sistemas de apareamiento y determinación de la paternidad de las
poblaciones de peces con una alteración mínima.
Aleta de pescado
2.1. Principio
El aislamiento del ADN suele comenzar con la lisis de células o tejidos con el fin de destruir las
estructuras de las proteínas y permitir la liberación de ácidos nucleicos del núcleo. La lisis se
lleva a cabo en una solución de lisis que contiene ingredientes importantes: cloruro de sodio que
proporciona un choque osmótico a las células; Tris HCl (trisaminometano), que es un tampón
para mantener un pH constante; EDTA, que secuestra los iones metálicos divalentes que se
requieren para la actividad nucleasa y por lo tanto inhibe su acción; un detergente, generalmente
SDS (dodecilsulfato de sodio), que altera la membrana celular y la envoltura nuclear, lo que hace
que las células se rompan y liberen su ADN. El ADN todavía está muy apretado alrededor de las
proteínas histonas.
A continuación, los ácidos nucleicos se purifican a partir del complejo proteína-ácido nucleico
mediante extracción de fase con una mezcla de disolventes orgánicos, a saber, fenol, cloroformo
y alcohol isoamílico en una proporción de 25: 24: 1. El fenol disocia las proteínas del ADN. El
cloroformo desnaturaliza las proteínas y los lípidos y ayuda a mantener la separación de la fase
orgánica y acuosa. También hace que el ADN sea menos soluble en el fenol, reduciendo así las
pérdidas a la fase orgánica. A menudo se agrega alcohol isoamílico para evitar la formación de
espuma. A pH 7-8, el ADN se divide en la fase acuosa mientras que la proteína se desnaturaliza
y se extrae en una fase orgánica inmiscible en agua, que se separa de la fase acuosa que
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contiene ácido nucleico por centrifugación. Cuando hay una gran cantidad de proteína, se forma
un precipitado blanco entre la fase orgánica y acuosa.
A continuación, el ADN se precipita con etanol frío o isopropanol después del ajuste con acetato
de sodio 3 M y luego se centrifuga. El ADN es insoluble en el alcohol y saldrá de la solución, y el
alcohol sirve como lavado para eliminar las sales residuales. Luego se elimina el alcohol y el
ADN se almacena en un tampón biológico, como el tampón TE (Tris-EDTA). El ARN
contaminante de la muestra de ADN puede eliminarse mediante digestión con una ARNasa.
Sin embargo, dado que las fuerzas de cizallamiento se generan en cada paso, las moléculas de
ADN resultantes en la preparación final rara vez superan los 100-150 kb (kilobase) de longitud. El
ADN de este tamaño es adecuado para el análisis de Southern en geles de agarosa estándar,
como molde en PCR y para la construcción de bibliotecas de ADN genómico en vectores de
bacteriófago λ.
III. Materiales y reactivos
Reactivos
• Tris Cl 1 M (pH 8,0) - 2,5 ml.
• EDTA 0,5 M (pH 8,0) - 50 ml.
• ARNasa pancreática - 5 mg.
• Proteniase K - (obligatorio).
• Base Tris - 10 mM.
• EDTA - 1 mM.
• Tampón de extracción 200ML
• Búfer TE:
• Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico (50 ml) - (25: 24: 1).
• Cloroformo: alcohol isoamílico (50 ml) - (48: 2).
• 70%, 100% de etanol (helado).
• Acetato de sodio 3M.
Materiales y muestras
• Aletas de pescado.
• Bisturí.
• Pinzas.
• Mortero y maja.
• Centrífugo.
• Viales.
• Puntas de micropipeta y pipeta.
• Baño de agua.
• Papel de filtro / papel secante.
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IV. Procedimiento experimental
1. Extraiga de 20 a 100 mg de aleta de pescado con un bisturí esterilizado y unas pinzas.
2. Homogeneizar las aletas en 600μl de tampón de extracción utilizando mortero y mano de
mortero estériles.
3. Recoja la pasta en un tubo de microcentrífuga (MCT) de 1,5 ml.
4. Incubar a 37 ° C durante 1 hora en un baño de agua.
5. Incubar nuevamente a 55 ° C durante 1 hora en el baño de agua.
6. Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos.
7. Retire el sobrenadante, póngalo en un nuevo MCT y agregue un volumen igual de Fenol:
Cloroformo: Alcohol isoamílico (25: 24: 1). Mezcle lenta y completamente mediante la
inversión repetida del MCT.
8. Centrifugar a 12000 rpm durante 10 minutos y recoger la capa acuosa superior en un MCT
nuevo. No moleste la capa intermedia.
9. Agregue cloroformo: alcohol isoamílico en una proporción de 24: 1. Mezclar lenta y
completamente invirtiendo el tubo.
10. Centrifugue el tubo a 12000 rpm durante 10 minutos.
11. Recoger la capa acuosa en un MCT nuevo y agregar 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M y
un volumen igual de etanol helado (100%). Mezclar bien la solución hasta obtener el
sedimento de ADN. (Ahora puede ver los grupos de ADN en el tubo).
12. Incube el MCT a -20 ° C durante 1 hora.
13. Sacar el tubo y centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos y decantar el sobrenadante
(Etanol).
14. Lavar el tubo con etanol al 70%, centrifugando a 1000 rpm durante 10 minutos y decantar el
etanol con cuidado sin perder el sedimento. (Si tiene dificultades, utilice una pipeta para
extraerlo).
15. Seque al aire los gránulos de ADN a temperatura ambiente manteniendo el tubo abierto y
también secar con papel de filtro / papel secante.
16. Resuspenda el sedimento en 50-100μl de tampón TE o agua destilada triple estéril.
17. Añada 2,0 μl de RNasa a 100 μl de solución de ADN y luego mantenga la muestra a 37 ° C
durante 2 horas. (Para purificación).
18. Electroforesis de la muestra sobre gel de agarosa al 0,7%.
19. Estime la concentración de ADN a 260 nm. (DO a 260 nm correspondiente a 50 μg / ml de
ADN de doble patrón). Concentración de la muestra = Factor de dilución X Absorbancia.
20. Diluir el ADN para hacer la concentración entre 10-100μg / ml.
21. Utilice 1 μl de muestra de ADN para PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
22. Mantenga la muestra a -20 ° C o liofilice la muestra con nitrógeno líquido.
Tarea 8
• Realizar un diagrama de flujo de la practica 8.
• Comentar sobre el sistema CRISPR/Cas9, un breve resumen
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