UNIVERSIDAD NACIONAL DE CUYO

FACULTAD DE CIENCIAS APLICADAS A LA INDUSTRIA

Profesor Tit.: Esp. Ing. Laura E. Najar.
JTP: Mgter. Ing. Adriana B. Guajardo.
Alumno:
Nº Legajo:

Cátedra: CATÁLISIS
Práctico Nº 1: Catálisis Enzimática
Introducción

La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v0 frente a [S]) es una

hipérbola. Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo
utilizar la representación doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), ya que es una línea
recta. Esta representación doble recíproca recibe el nombre de representación de
Lineweaver-Burk
Los inhibidores enzimáticos reversibles pueden ser clasificados como competitivos,
acompetitivos, no competitivos y mixtos, según el efecto que produzcan en las
constantes cinéticas Km y Vmax. Este efecto dependerá de que el inhibidor se una a
la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES o a ambos, como se puede observar en
la figura de la derecha y en la tabla inferior. Para clasificar correctamente un
inhibidor pueden llevarse a cabo estudios de su cinética enzimática en función de la
concentración de inhibidor. Los cuatro tipos de inhibición dan lugar a diagramas de
Lineweaver-Burke y de Eadie-Hofstee que varían de diferente forma con la
concentración de inhibidor. Para abreviar, se usan dos símbolos:

      y      
donde Ki y K'i son las constantes de disociación para unirse a la enzima y al complejo
enzima-sustrato, respectivamente. En presencia de un inhibidor reversible, los
valores aparentes de la Km y la Vmax pasan a ser (α/α')Km y (1/α')Vmax,
respectivamente, como se puede apreciar en la tabla inferior para los casos más
comunes.
Tipo de Vmax
Km aparente
inhibición aparente
solo (
competitiva
Ki )
solo (
acompetitiva
Ki' )
(
Ki = no
Ki' competitiva
)
(
Ki ≠
mixta
Ki'
)
Los ajustes por regresión no lineal de los datos de cinética enzimática pueden
proporcionar estimaciones muy precisas de las constantes de disociación Ki y Ki'.

Problemas:

Problema N°1:
¿Qué relación numérica existe entre Km y [S] cuando una reacción catalizada
enzimáticamente alcanza el 80% de la Vmax?
V max [ S ]
V 0=
K M +[ S ]
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1 1 K 1
= + M
V 0 V max V max [ S ]

V max [ S ]
0,80 V max =
K M +[ S ]

0,80 K M + 0,80 [ S ] =[ S ]

0,80 K M =[ S ] ( 1−0,80 )

KM
=0,25
[S]
Problema N°2
Considere a la enzima Invertasa, que cataliza la hidrólisis de Sacarosa a fructosa y
glucosa. Esta enzima posee una Km para sacarosa de 0.5 mM y una constante
catalítica de 175 min-1. Si se mide su actividad en presencia de 0.25 mM de sacarosa
con 25 pmol de enzima en la cubeta - ¿qué velocidad de catálisis se observará? - ¿qué
fracción representa esto de la Vmax que se podría calcular en esta reacción si se
variase la cantidad de sacarosa? - ¿Cuánto sustrato habría que añadir para que la
velocidad observada alcanzase 0.95% de la Vmax? - ¿Qué importancia podría tener
esto para la posible aplicación industrial de la enzima? - Explique sus respuestas.

b)
V max =K [ E ]
−1 −6 −3
V max =175 min ∗2510 mM=4,375 10 mM /min

V0 [S]
=
V max K M + [ S ]

V0 0,25
= =0,33
V max 0,5+0,25
a)
−3 −3
V 0=4,375 10 mM /min∗0,33=1,44 10 mM /min
c)
V0 [ S]
=0,95=
V max K M +[ S ]

0,95 K M + 0,95 [ S ]= [ S ]

0,95∗0,5 mM =[ S ] ( 1−0,95 )

[ S ] = 0,475 =9,5 mM
0,05
d) Es importante tener un sustrato concentrado
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Problema N°3
Se dan a continuación algunos datos para la hidrólisis del hidrocianato de metilo en
presencia de la enzima quimotripsina, a 25ºC y pH=7,6.
Calcular la velocidad límite y la constante de Michaelis para la reacción.

Concentración [S ]mol/dm3 Veloc. Inicial Vo mol/dm3s

(10-4) (10-9)
3,08 2,0
1,46 1,75
0,857 1,5
0,46 1,15
0,224 0,75
0,128 0,50
0,0320 0,15

Concentració Veloc.
n [S Inicial Vo
]mol/dm3 mol/dm3
(10-4) s (10-9) 1/[S] 1/Vo
3.25E- 5.00E-
3.08E+04 2.00E+09 05 10
6.85E- 5.71E-
1.46E+04 1.75E+09 05 10
1.17E- 6.67E-
8.57E+03 1.50E+09 04 10
2.17E- 8.70E-
4.60E+03 1.15E+09 04 10
4.46E- 1.33E-
2.24E+03 7.50E+08 04 09
7.81E- 2.00E-
1.28E+03 5.00E+08 04 09
3.13E- 6.67E-
3.20E+02 1.50E+08 03 09
2.50E+09

2.00E+09

1.50E+09

1.00E+09

5.00E+08

0.00E+00
0.00E+00 1.00E+04 2.00E+04 3.00E+04 4.00E+04
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8.00E-09
7.00E-09
250000000
6.00E-09 f(x) = 1.99396792635162E-06 x
+ 4.3730099550119E-10 Vmax= 0
5.00E-09
4.00E-09 Km/Vmax=2E-06
3.00E-09 Km= 5000

2.00E-09
1.00E-09
0.00E+00 Problema N°4
0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 La velocidad inicial de oxidación del
succinato sódico a fumarato sódico en
presencia de la enzima succinato deshidrogenasa, para distintas concentraciones del
sustrato, se dan en la tabla siguiente:

Concentración [S] Veloc. Inicial mol/dm3s

mol/dm3 (10-3) Vo (10-7)
10,2 11,7
2,0 9,9
1,0 7,9
0,5 6,2
0,33 5,0

Determinar la velocidad límite y la constante de Michaelis para la reacción

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Concentració Veloc.
n [S] Inicial
mol/dm3 (10- mol/dm3
3) s 1/[S] 1/[Vo]
Vo (10-7)
9.80E- 8.55E-
1.02E+04 1.17E+08 05 09
5.00E- 1.01E-
2.00E+03 9.90E+07 04 08
1.00E- 1.27E-
1.00E+03 7.90E+07 03 08
2.00E- 1.61E-
5.00E+02 6.20E+07 03 08
3.03E- 2.00E-
3.30E+02 5.00E+07 03 08
1.40E+08
1.20E+08
1.00E+08
8.00E+07
6.00E+07
4.00E+07
2.00E+07
0.00E+00
0.00E+00 5.00E+03 1.00E+04 1.50E+04

2.50E-08

2.00E-08
f(x) = 3.89258388924203E-06 x + 8.32678010301194E-09
Vmax 125000000
1.50E-08

1.00E-08 Km 500

5.00E-09
Problema N°5
0.00E+00 Las velocidades iniciales a varias
0.00E+00 1.00E-03 2.00E-03 3.00E-03 4.00E-03 concentraciones de sustrato para
una reacción catalizada por un
enzima hipotético son:
[S] (moles/l) V (μmoles/min)
5x10-2 0.25
5x10-3 0.25
5x10-4 0.25
5x10-5 0.20
5x10-6 0.071
5x10-7 0.0096
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a) ¿Cuál es la velocidad máxima para esta reacción?

b) ¿Por qué la velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M
c) ¿Cuál es la concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M?
d) ¿Cuál es la Km de la enzima?
e) Calcular la velocidad inicial para [S]=1x10-6 y [S]=1x10-1
f) Calcular la concentración de producto formado en los cinco primeros minutos de
reacción utilizando 10 ml de una disolución de sustrato 2x10-3 M

[S] V 3.00E-07
(moles (μmoles/m 2.50E-07
/l) in) 1/[S] 1/V 2.00E-07
5.00E- 1.50E-07
02 2.50E-07 20 4000000
1.00E-07
5.00E-
03 2.50E-07 200 4000000 5.00E-08
5.00E- 0.00E+00
04 2.50E-07 2000 4000000 0.00E+00 2.00E-02 4.00E-02 6.00E-02
5.00E-
05 2.00E-07 20000 5000000 120000000
5.00E- 20000 1408450
100000000
f(x) = 50.0926587470435 x + 3989044.26467759
06 7.10E-08 0 7
5.00E- 20000 1041666 80000000
07 9.60E-09 00 67
60000000

40000000

20000000 Vmax(mol/
min)
0
0 Km
0 00 0 00 0 00 0 00 0 00
00 00 00 00 50
0
5 10 15 20 2
Vmax(μmoles/
min) 0.25
Km 12.7325

b) La velocidad inicial permanece constante a una [S] mayor de 5x10-4 M porque la

enzima está saturada y no puede recibir más sustrato.
c) La concentración de enzima libre para una [S] de 5x10-4 M es cero porque ya está
V max [ S ]
saturada. e) V 0=
K M +[ S ]
Vo 1.96348E-08
Vo 0.00194817
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f)
Vmax*tiempo
[P] /vol
[P] 0.000125

Problema N°6
La hidrólisis de N-glutaril-L-fenilalanina-p-nitroanilida (GPNA) para dar p-nitroanilina
y N-glutaril-L-fenilalanina, está catalizada por la enzima α-quimotripsina. En unas
determinadas condiciones de pH y temperatura, los datos cinéticos obtenidos han
sido los siguientes:

[GPNA] / 10-4 M 2.50 5.00 10.0 15.0

v / mmol L-1 min-1 2.11 3.73 5.90 7.10

a) Asumiendo una cinética de tipo Michaelis-Menten, calcúlense gráficamente los

valores
de Vmax y KM .
b) Determine el valor del nº de recambio (k2) sabiendo que la concentración de
enzima empleada fue de 4.00.10-6 M.

v / mmol
[GPNA] / L-1 min-
10-1 mM 1
2.50E-01 2.11 4.00E+00 0.47393365
5.00E-01 3.73 2.00E+00 0.26809651
1.00E+00 5.9 1.00E+00 0.16949153
1.50E+00 7.1 6.67E-01 0.14084507
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0.00E+00 5.00E-01 1.00E+00 1.50E+00 2.00E+00

0.5
0.45 f(x) = 0.100485863098442 x
0.4 + 0.070493785698155
0.35 Vmax(mmol/ 14.1843
0.3 lmin) 972
0.25
0.2
1.42553
0.15 Km 191
0.1
0.05 Vmax=kcat[Eo
0
0.00E+00 2.00E+00 4.00E+00 6.00E+00
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]
3546.09
kcat(l-1min-1) 929
59.1016
(l-1seg-1) 548

Problema N°7
La Hidratación del Fumarato a malato por la enzima fumarasa es inhibida por el
succinato. Las velocidades iniciales a distintas concentraciones de fumarato, en
ausencia y en presencia de succinato 0,05 mol/dm3 se dan a continuación.
Determinar si la acción del succinato sobre la enzima se ajusta al mecanismo de
inhibición competitiva y en caso afirmativo determine el valor de la constante KI
para la disociación del complejo succinato-fumarasa.
Concentración Veloc. Inicial
mol/dm3 mol/dm3s
S/I C/I
5,00 10-4 3,36 2,74
1,50 10-4 2,45 1,72
8,00 10-5 1,79 1,13
5,00 10-5 1,33 0,79

Veloc.
Concentració Inicial
n mol/dm3 mol/dm3s
S/I C/I 1/[] 1/Vsi 1/Vci
0.2976190
5.00E-04 3.36 2.74 2.00E+03 50.3649635
0.40816320.5813953
1.50E-04 2.45 1.72 6.67E+03 7 5
0.55865920.8849557
8.00E-05 1.79 1.13 1.25E+04 2 5
1.2658227
5.00E-05 1.33 0.79 2.00E+04 0.7518797 8

1.4
1.2 f(x) = 5.03234506048803E-05 x + 0.256372168235448
1
0.8 sin inhibidor
0.6 f(x) = 2.53332981734319E-05 x + 0.24335844714436
Linear (sin inhibidor)
0.4 con inhibidor
0.2 Linear (con
0 inhibidor)
0 4 4 4
E+0 E+0 E+0 E+0
0 0 0 0 0 0 0 0
0. 1. 2. 3.
Podemos ver que sí es competitiva y la velocidad máxima es aproximadamente 4
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1/Vmax 0.2499

Km´=Km*α
α=Km´/Km=1+([I]/KI)

con inhibidor:
Vmax 4.00160064
Km´ 0.00020008
sin inhibidor:
Vmax 4.00160064 α 1.66666667
Km 0.00012005 KI 0.075

Problema N°8
El salicilato inhibe la acción catalítica de la glutamato deshidrogenasa. Determinar el
tipo de inhibición mediante el análisis gráfico de los siguientes datos. Suponer que la
concentración de salicilato se mantiene constante y es de 40 mM. Calcular también la
KM para el sustrato y la Ki.

mg P/min sin mg P/min con

[S] mM salicilato salicilato
1,5 0,21 0,08
2 0,25 0,1
3 0,28 0,12
4 0,33 0,13
8 0,44 0,16
16 0,4 0,18

mg P/min mg P/min
sin con
[S] mM salicilato salicilato 1/[] 1/Vss 1/Vcs
1.5 0.21 0.08 0.66666667 4.76190476 12.5
2 0.25 0.1 0.5 4 10
3 0.28 0.12 0.33333333 3.57142857 8.33333333
4 0.33 0.13 0.25 3.03030303 7.69230769
8 0.44 0.16 0.125 2.27272727 6.25
16 0.4 0.18 0.0625 2.5 5.55555556
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14

12
f(x) = 11.109128375077 x + 4.80121005908082
10

4 f(x) = 4.04919355706431 x + 2.04850851992525

2

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
Es no competitiva ya que la diferencia está en la velocidad y no en la K

Con inhibidor:
Vmax 0.20828126
Km´ 2.31379655

Sin inhibidor:
Vmax 0.48816207
Km 1.97666585

α´=Vmaxsi/Vmaxci
α´ 2.34376373

α=1+([I]/KI)
KI 29.7671377

Problema N°9
A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar el tipo de
inhibición, la KM del sustrato y la Ki para el complejo enzima-inhibidor

g P/h con inhib.

[S] mM g P/h sin inhib. 6 mM
2 139 88
3 179 121
4 213 149
10 313 257
15 370 313

g P/h sin g P/h con

[S] mM inhib. inhib. 1/[] 1/Vsi 1/Vci
6 mM
0.0071942 0.0113636
2 139 88 0.5 4 4
0.3333333 0.0055865 0.0082644
3 179 121 3 9 6
0.0046948 0.0067114
4 213 149 0.25 4 1
0.0031948 0.0038910
10 313 257 0.1 9 5
0.0666666 0.0031948
15 370 313 7 0.0027027 9
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0.012
0.01 f(x) = 0.0187982700375881 x + 0.00198552195702263
0.008 sin inhibidor
0.006 f(x) = 0.0102694123830066 x + 0.00210729957333937
Linear (sin inhibidor)
0.004 con inhibidor
Linear (con inhibidor)
0.002
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Es competitiva, la velocidad máxima es aproximadamente 500.
Con inhibidor:
Vmax 500
Km´ 9.4
Sin hinibidor:
Vmax 500
Km 5.15

α 1.82524272
KI 7.27058824

Problema N°10
La cinética de una enzima viene determinada como función de la concentración de
sustrato en presencia y ausencia del inhibidor I.
[S], Mx10-5 0.3 0.5 1.0 3.0 9.0
V(μmol/min) sin 10.4 14.5 22.5 33.8 40.5
inhibidor
V(μmol/min) con 2.1 2.9 4.5 6.8 8.1
inhibidor 10-4 M

a) Calcular la Km y la Vmax en presencia y ausencia de inhibidor

b) Qué tipo de inhibidor es? Calcular la Ki

V(μmol/
V(μmol/ min) con
[S], Mx10- min) sin inhibidor
5 inhibidor 10-4 M 1/[] 1/Vmaxsi 1/Vmaxci
3.3333333 0.0961538 0.4761904
0.3 10.4 2.1 3 5 8
0.0689655 0.3448275
0.5 14.5 2.9 2 2 9
0.0444444 0.2222222
1 22.5 4.5 1 4 2
0.3333333 0.1470588
3 33.8 6.8 3 0.0295858 2
9 40.5 8.1 0.1111111 0.0246913 0.1234567
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1 6 9

0.5
0.45 f(x) = 0.110835317542107 x + 0.112507749208526
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
f(x) = 0.0223988316800025 x + 0.0224053322144047
0.05
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Es no competitiva.
Con inhibidor:
Vmax 8.88888889
Km´ 0.98488889
Sin inhibidor:
Vmax 44.6428571
Km 1

α´ 5.02232143
KI 0.00024861