Aminoácidos
Identificación y titulación de aminoácidos
• Identifica aminoácidos mediante pruebas
de laboratorio.
1
• Observa la titulación de un aminoácido
2 mediante el uso del potenciómetro.
Los aminoácidos (AA) son compuestos orgánicos que
contienen, al menos, un grupo básico (amino) y un grupo
acido (carboxilo). Aunque existe la probabilidad de un
número ilimitado de AA, en la naturaleza se encuentran
solo una veintena de ellos como parte de proteínas simples
y conjugadas. La mayoría de los AA naturales son α-L-
aminoácidos.
Estructura general
de un aminoácido
Estructuras de los aminoácidos naturales
mas comunes:
Características de los aminoácidos
Los aminoácidos poseen propiedades diferentes a los compuestos orgánicos
de peso molecular bajo y se semejan bien a las sales inorgánicas.
Son insolubles en disolventes no polares, como éter de petróleo,
benceno o éter, son apreciablemente solubles en agua.
Poseen puntos de fusión altos en comparación con otros compuestos
orgánicos.
La presencia de cargas eléctricas les permite recurrir a técnicas eficientes
tanto para su detección y separación como para su cuantificación.
Los aminoácidos migran a un campo eléctrico lo que les
permite separarlos por electroforesis, la dirección y
magnitud de esta migración depende en gran parte de la
forma iónica predominante del AA en solución, estructura
que a su vez depende del pH del medio en el que se
encuentra. El pH al cual un AA tiene carga neta de 0 y por
ende, no migra en un campo eléctrico se conoce como
punto isoeléctrico o pH isoeléctrico(PI).
Funciones de los aminoácidos:
Los aminoácidos tienen diferentes funciones,
pero la más importante es ser los constituyentes
básicos de péptidos y proteínas. Entre las
funciones restantes se tiene que los aminoácidos
son componentes de algunos lípidos, pueden
actuar como neurotransmisores o ser precursores
de neurotransmisores, de mediadores o de
hormonas, entre otras.
Nomenclatura de los aminoácidos
Los nombres de los aminoácidos inicialmente se definieron para
indicar la fuente de la que habían sido aislados, por ejemplo la
asparagina debe su nombre a los espárragos. Posteriormente,
para facilitar el uso de la nomenclatura a nivel internacional, se
definieron dos sistemas: uno de tres letras (generalmente son las
tres primeras del nombre) y otro de una sola letra
(generalmente la primera del nombre).
Nomenclatura de los aminoácidos
Nombre completo Tres letras Una letra
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparragina Asn N
Ácido aspártico Asp D
Cisteína Cys C
Glutamina Gln Q
Ácido glutámico Glu E
Glicina Gly G
Histidina His H
Isoleucina Ile I
Leucina Leu L
Lisina Lys K
Metionina Met M
Fenilalanina Phe F
Prolina Pro P
Serina Ser S
Treonina Thr T
Triptófano Trp W
Tirosina Tyr Y
Valina Val V
Clasificación de los aminoácidos
Según su obtención: Aminoácidos esenciales y no esenciales.
Existen 10 aminoácidos que los seres humanos no podemos
sintetizar, por lo que se conocen como esenciales: Arg, Val, Leu,
Ile, Phe, Trp, Thr, Met, Lys e His. Los demás se consideran no
esenciales ya que nuestro organismo los puede sintetizar.
Además, los aminoácidos también se clasifican de acuerdo a la
naturaleza de la cadena lateral (R) en los siguientes siete grupos:
1. Aminoácidos neutros o alifáticos:
Ala, Gly, Val, Leu e Ile. Tienen una cadena hidrocarbonada.
2. Aminoácidos aromáticos:
Trp, Phe y Tyr. Poseen un anillo aromático.
3. Hidroxiaminoácidos o aminoácidos hidroxilados:
Ser y Thr. Presentan un grupo alcohol en su cadena lateral.
4. Tioaminoácidos o aminoácidos sulfurados:
Cys y Met. Contienen en su cadena lateral átomos de azufre.
5. Iminoácidos o amino:
Es únicamente la prolina. Tiene el grupo a-amino sustituído
por la propia cadena lateral, formando un anillo pirrolidínico.
6. Aminoácidos básicos:
Lys, Arg e His. Contienen cadenas laterales muy polares con
carga positiva.
7. Aminoácidos ácidos (dicarboxilícos) y sus amidas (de
aminoácidos ácidos):
Asp y Glu y sus amidas correspondientes: Asn y Gln. Los dos
primeros contienen cadenas laterales de naturaleza ácida y
sus amidas poseen un grupo amida terminal en lugar del
carboxilo libre.
Separación de aminoácidos
Hay varias técnicas para separar una mezcla de aminoácidos,
como: electroforesis, cromatografía en papel, cromatografía en
capa fina y cromatografía de intercambio iónico.
Electroforesis
Técnica de separación de aminoácidos con base en sus valores de
pI (punto isoeléctrico). Un aminoácido con pI mayor que el pH de
la disolución (pH del medio) tendrá una carga total positiva y
migrara hacia el cátodo (el electrodo negativo). Un aminoácido
con pI menor que el pH de la disolución (pH del medio) tendrá
una carga total negativa y migrara hacia el ánodo (el electrodo
positivo).
Formula para determinar la carga neta de
un aminoácido:
pH de la disolución
Δp=pI-pH(medio)
Punto Isoeléctrico
Δp= valor negativo (-) Migrara al ánodo (electrodo positivo+)
Δp= valor positivo (+) Migrara al cátodo (electrodo negativo-)
Ejercicio pHm
Determine la carga neta de los siguientes aminoácidos a pH 7 e
indique hacia donde migran en la placa electroforética.
Glicina: pI= 5.97
Lisina: pI= 9.74
Ácido aspártico: pI= 2.77
Glicina
Δp= 5.97-7= -1.03 Migrara al ánodo (electrodo positivo+)
Lisina
Δp=9.74-7= +2.74 Migrara al cátodo (electrodo negativo-)
Ácido aspártico
Δp=2.77-7= - 4.23 Migrara al ánodo (electrodo positivo+)
Pruebas de identificación de aminoácidos
Procedimiento Observación Aminoácidos/proteínas
1. Prueba de Ninhidrina
Se forma un color que Todos los aminoácidos que contienen
Solución de muestra (1 ml) + reactivo de Ninhidrina (2-3
gotas). Observar el color en frío o de lo contrario, hervir en varia de azul violeta a -NH2, a excepción de la prolina e
un baño de agua por 5 min y enfriarlo hidroxiprolina.
púrpura.
2. Prueba de Millon
Esta reacción da una Tirosina y proteínas que la contienen
Solución de muestra (1 mL) + 1 mL del reactivo de Millon
(HgS04 0.5 ml + 0.5 ml tonalidad rosa o un
2M HNO3). Hervir en un baño de agua por 2 min y enfriarlo.
precipitado rosa.
3. Prueba de Xantoproteica Formación de un Aminoácido que contienen grupos
Solución de muestra (1 mL) + 1 mL del HNO3concentrado. color amarillo. aromáticos o derivados del benceno,
Calentar en un baño de agua por 2 min y enfriarlo. Agregar
gota a gota de NaOH concentrado hasta la aparición de color. y proteínas que los contienen.
4. Prueba de Nitroprusiato (Mörner test) Formación de una
coloración negra o gris. Cisteína y cistina (-SH) y proteínas
Solución de muestra (1 ml) de proteína/ que la contienen.
aminoácido que contiene Cisteína. Agregar 3
gotas de la solución de nitroprusiato de sodio + 3-
5 gotas de la solución de amoniaco.
5. Prueba Sakaguchi
Formación de color rojo. Arginina (contiene el grupo
Solución de la muestra (1 ml) + 2-3 gotas del guanidina) y proteínas que
reactive de Sakaguchi (4 gotas de NaOH al 40 % + contienen restos de la misma.
solución etanólica de α- Naftol]. Agregar 1-2 gotas
de agua de bromo (por seguridad, usar agua de
cloro).
6. Prueba de Hopkin-Cole (prueba de aldehído) Triptófano (grupo indol) y proteínas
La positividad se reconoce que la contienen.
Solución de muestras (1 ml) + 2-3 gotas de del por la aparición de un anillo
reactive de Hopkin-Cole (2 gotas de Formalina color violeta rojizo.
diluida + 4 gotas de sulfato de mercurio 10 %).
Mezclar bien, agregar 1-2 mL de H2SO4 por un lado
del tubo de ensayo.
Titulación de aminoácidos
Titulación de glicina 0.025 M a pH1 con KOH 0.1 M
▪ Limpie escrupulosamente su material volumétrico.
▪ Calibre el potenciómetro.
▪ Obtenga de su instructor una solución de aminoácido de glicina 0.025 M a pH
ácido igual a 1.
▪ Titule 10 ml de solución del aminoácido con KOH estándar 0.1M. Si la adición de
titulante causa un cambio muy grande en pH, reduzca considerablemente el
ácido o base.
❖ Realice una tabla que contenga lo siguiente:
Vol. de KOH (ml) pH registrado
Solución de KOH
0.1 M
❖ Construya un grafico (preferible si recurre al
uso de Excel) con lo siguiente:
a) pH vrs Volumen de titulante
b) Presente un valor experimental
aproximado para pKa1, pka2, pl y βi.
10 ml de glicina
0.025 M
Ionización de un aminoácido sin cadena
lateral ionizable
Glicina: pKa (carboxilo)=2.34, pKa (amino)=9.60
Ejercicio:
OH- OH-
2.34 9.60
pI= 2.34+9.60
2
pI=5.97
El pI para un aminoácido
sin cadena lateral
ionizable o con dos
grupos ionizables es
igual al promedio de sus
2 pKa.
Ionización de un aminoácido con
cadena lateral ionizable
Ejercicios:
a) Con el siguiente aminoácido que se le proporciona, dibuje las estructuras del mismo
en sus diferentes estados de ionización, sabiendo que inicialmente este aminoácido
en solución tiene un pH=1. Titular el aminoácido con una solución de NaOH o KOH al
0.1 M para ionizar cada uno de los grupos ionizables presentes en el aminoácido.
Lisina: pKa (carbóxilo)=2.18 pKa (amino) = 8.95 pKa (R) =10.79
2.18
8.95
OH- OH- OH-
2.18 8.95 10.79
10.79
Zwiiterión
Al asignar los valores de pKa a cada grupo ionizable tomar en cuenta los siguiente: el pKa mas cercano a 2 será del carboxilo de la estructura general, el
valor de pKa que se acerque mas a 9 pertenecerá al amino de la estructura general y el tercer pKa pertenecerá al grupo R.
En la ionización de la lisina, el hidroxilo (OH-) que procede de la base usada para
titular el aminoácido (NaOH o KOH al 0.1 M) desprotonara (quitara un H+) a cada
uno de los tres grupos ionizables de la lisina, en el siguiente orden: El OH-
primero atacara al grupo mas ácido de la estructura, el cual tendrá el valor de
pKa mas pequeño en este caso 2.18 perteneciente al carboxilo alfa de la
estructura general, luego el grupo que posee el pKa intermedio 8.95
perteneciente al amino de la estructura general y finalmente el OH- desprotonara
al ultimo grupo el cual posee el valor pKa mas grande 10.79 perteneciente al
amino distal o grupo R. Cada vez que el hidroxilo quita un protón H+ a cada
grupo ionizable forma agua (OH- y H+) como producto.
b) Determine el punto isoeléctrico (pI) de la lisina
El punto isoeléctrico (pI) para un aminoácido con cadena lateral ionizable o con
tres grupos ionizables es el promedio de los valores de pKa de los grupos que se
ionizan en forma similar (ya sea grupos con carga positiva que se ionizan a
grupos sin carga, o grupos sin carga que se ionizan a grupos con carga negativa).
El punto isoeléctrico de
pI= 8.95+10.79 la lisina es el promedio 8.95 2.18
2 de los valores de pKa de Grupo sin
carga
pI= 9.74 los dos grupos que
tienen carga positiva en Grupo con
su forma ácida y que no carga positiva
tiene carga en su forma
básica.
Grupos que se
ionizan en
forma similar, 10.79
ambos son
grupos con
carga positiva Grupo con
carga positiva
Otra forma que existe para obtener el punto isoeléctrico para un aminoácido con cadena lateral
ionizable (el cual posee 3 pKa) es calculando el promedio de los pKa’s para las 2 ionizaciones
involucradas en la generación de la especie neutra (zwitterión). Es decir, se debe tomar en cuenta los
dos valores de pKa de las ionizaciones que franquean o rodean al zwitterión así;
Zwiiterión
pKa perteneciente a la
ionización del grupo R,
el cual rodea al
zwitterión
pKa perteneciente a la OH- OH-
ionización del amino, el
cual rodea al zwitterión 8.95 10.79
c) En el siguiente grafico de la titulación de lisina, ubique los siguientes puntos:
pka1, pKa2, pka3, pI y βi.
βi
βi: capacidad amortiguadora instantánea esta presente en toda la curva, cada punto que une a la grafica es un Bi.
d) Determine la carga neta del aminoácido a pH 6 e indique hacia donde migra en
la placa electroforética.
Δp= 9.74-6 = +3.74 Migrara al cátodo (electrodo negativo-)
Ejercicio 2:
a) Con el siguiente aminoácido que se le proporciona, dibuje las estructuras del mismo en
sus diferentes estados de ionización, sabiendo que inicialmente este aminoácido en
solución tiene un pH=1. Titular el aminoácido con una solución de NaOH o KOH al 0.1 M
para ionizar cada uno de los grupos ionizables presentes en el aminoácido.
Ácido aspártico: pKa (carbóxilo)= 2.0 pKa (amino) =9.8 pKa (R) =3.9
9.8 2.0
OH-
OH- OH-
2.0 3.9 9.8
3.9
Asp +1 Asp 0 Asp -1 Asp -2
Zwiiterión
Al asignar los valores de pKa a cada grupo ionizable tomar en cuenta los siguiente: el pKa mas cercano a 2 será del carboxilo de la
estructura general, el valor de pKa que se acerque mas a 9 pertenecerá al amino de la estructura general y el tercer pKa
pertenecerá al grupo R.
En la ionización de el ácido aspártico, el hidroxilo (OH-) que procede de la base
usada para titular el aminoácido (NaOH o KOH al 0.1 M) desprotonara (quitara un
H+) cada uno de los tres grupos ionizables del aminoácido, en el siguiente orden:
El OH- atacara primero al grupo mas ácido de la estructura, el cual tendrá el valor
de pKa mas pequeño 2.0 en este caso perteneciente al carboxilo alfa de la
estructura general, luego el grupo que posee el pKa intermedio 3.9
correspondiente a la cadena lateral (el grupo carboxilo distal o R) y finalmente el
OH- desprotonara al ultimo grupo el cual posee el valor de pKa mas grande 9.8
perteneciente al amino alfa de la estructura general. Cada vez que el hidroxilo
quita un protón H+ a cada grupo ionizable se forma agua (OH- y H+) como uno de
los productos.
b) Determine el punto isoeléctrico (pI) del ácido aspartico
El punto isoeléctrico (pI) para un aminoácido que posee tres grupos ionizables es
el promedio de los valores de pKa de los grupos que se ionizan en forma similar
(ya sea grupos con carga positiva que se ionizan a grupos sin carga, o grupos sin
carga que se ionizan a grupos con carga negativa).
Grupo sin
El punto isoeléctrico (pI) carga
del acido aspártico es el
pI= 2.0+3.9 promedio de los valores 9.8 2.0
2 de pKa de los dos
Grupos que
pI= 2.95 grupos que no tienen se ionizan
Grupo en forma
carga en su forma ácida similar,
con carga ambos son
y que tienen carga positiva grupos sin
carga
negativa en su forma
básica.
3.9
Grupo sin
carga
Otra forma que existe para obtener el punto isoeléctrico para un aminoácido con cadena lateral
ionizable o tres grupos ionizables (el cual posee 3 pKa) es calculando el promedio de los pKa’s para las
2 ionizaciones involucradas en la generación de la especie neutra (zwitterión). Es decir, se debe tomar
en cuenta los dos valores de pKa de las ionizaciones que franquean o rodean al zwitterión así;
pKa perteneciente a la
ionización del grupo R
carboxilo distal, el cual
OH- OH- rodea al zwitterión
pKa perteneciente a la
ionización del carboxilo 2.0 3.9
alfa, el cual rodea al
zwitterión
Asp +1 Asp 0 Zwiiterión
c) En el siguiente grafico de la titulación del ácido aspártico, ubique los siguientes
puntos: pka1, pKa2, pka3, pI y βi.
βi
pI:2.95
βi: capacidad amortiguadora instantánea del aminoácido esta presente en toda la curva, cada punto que une a la
grafica es un Bi.
d) Determine la carga neta del aminoácido a pH 5 e indique hacia donde migra en
la placa electroforética.
Δp= 2.95-5 = -2.05 Migrara al ánodo (electrodo positivo+)