INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATIA.
BIOQUIMICA MEDICA II
DESHIDROGENASA LACTICA Y NAD.
GRUPO: 2HM7
PROFESOR: Omar Domínguez Acosta.
Integrantes:
Calzada López Yutsil Deni.
Chavez Castillo Omar.
Gutiérrez Tolentino Natalia.
Deshidrogenasa Láctica y NAD.
Objetivo:
El alumno determinará cualitativamente, mediante la observación de los grados de decoloración, las
relaciones existentes entre la actividad de la deshidrogenasa láctica (LDH) y la presencia de nicotinamida
adenin dinucleótido (NAD), en función de los siguientes aspectos:
Determinar si la actividad de LDH depende de la presencia de NAD.
Especificar la actividad de indicador redox del azul de metileno
Introducción. Marco teórico.
Las reacciones de óxido-reducción consisten en la transferencia de electrones de una molécula a otra. La
partícula que cede los electrones tiene un proceso de oxidación. La molécula aceptora se dice que se ha
reducido.
Aquellas moléculas que tienen un potencial más positivo tienden a retener sus electrones, por ende las
moléculas con potencial negativo tienen tendencia a ceder electrones. Las reacciones de óxido reducción en
las células son catalizadas por enzimas que actúan como intermediarios hasta el aceptor final.
Lactato Deshidrogenasa es una enzima que se encuentra en muchos tejidos pero su actividad es
significativa en aquellos cuyas necesidades energéticas deben ser ininterrumpidas para su correcto
funcionamiento como es el caso de corazón, hígado, riñones, musculo, eritrocitos, pulmones y cerebro.
Trabaja exclusivamente en condiciones de anaerobiosis principalmente en musculo.
En condiciones de ejercicio intenso y prolongado, el oxígeno utilizado por la mitocondria para producir energía
se ve comprometido llegando incluso a momentos de trabajo sin oxígeno. Ante esto la célula convierte la
glucosa por fermentación obteniendo lactato como producto final.
Oxida el piruvato y transfiere el electrón a NAD+ reduciéndolo y formando NADH. Este paso es fundamental
ya que la relación NAD/NADH a favor de NAD en presencia de glucosa es el paso limitante de la vía
glucolítica.
En condiciones estándar la variación de energía libre de la reacción es de -25kj/mol, estando muy desplazada
a la formación de lactato, pero puede invertirse en relación a la concentración de sus sustratos y productos.
El lactato se transporta al hígado por vía hemática y en el hígado se invierte la reacción transformando el
lactato en piruvato para producir glucosa por via gluconeogenica la cual es liberada de nuevo al torrente
sanguíneo, completándose el llamado ciclo de Cori.
Con este experimento se pretende demostrar que la LDH es una enzima que funciona normalmente,
basándose en la concentración de NAD y anaerobiosis promoviendo la reducción del piruvato en presencia de
NADH + H, entones aumentando la concentración de NAD podemos revertir la reacción para oxidar al lactato
y generar NADH + H.
CUESTIONARIO.
Explique como funciona el ciclo de Cori.
Es el proceso de transporte de lactato desde las celulas que experimentan un metabolismo anaerobio
hasta el higado donde se utiliza para reconvertirlo en glucosa mediante gluconeogenesis y devolverlo a
las celulas.
Es decir, cuando no hay oxigeno suficiente en el musculo, laglucolisis genera 2 ATP, 2 moleculas de
acido lactico y el NADH consumido queda regenerado. El lactato pasa a la circulaci´on sanguinea y a
traves de ellaalcanza el higado comenzando la segunda etapa del ciclo de Cori.
En el higado el lactato es transformado de nuevo en glucosa ( gluconeogenesis. Esta glucosa pasa a la
circulacion sanguinea y puede volver a ser utilizada por la celulas musculares como fuente energetica.
Si la intensidad de la actividad muscular sigue siendo intensa, la glucosa genera de nuevo acido lactico
y comienza un nuevo ciclo de Cori. Si la actividad ha disminuido la glucosa podra seguir la respiracion
aerobia normal, mucho mas eficiente que la fermentacion lactica o utilizarse para sintetizar glucogeno y
reponer los depositos musculares que se habia utilizado previamente.
De donde obtiene energia el higado para la sintesis de glucosa a partir de lactato.
El higado utiliza poca glucosa para la produccion de energia. La mayor parte de energia la obtirnr por
la oxidacion del FADH2, FMNH2 y NADH, asi como por la descarboxilacion oxidatia del acetil CoA,
todo ello proveniente de la beta oxidacion de acidos grasos y aminoacidos.
Explique el fundmento quimico de la reaccion deter el azul de metileno y el NAD
En esta practica el azul de metileno es utilizado como aceptor de equivalentes reducidos y en
presencia de estos el azul de metileno se decolora a blanco. En la reaccon de oxidacion de lactato a
piruvato ocurre una reduccion de la coenzima NAD a NADH+ produciendo decoloracion del azul de
metileno.
En que otra parte del organismo aparte del musculo se realiza la conversion de lactato y cual es el fin
metabolico de la reaccion en este tejido.
Esta reaccion tambien tiene lugar en eritrocitos y neurona y tiene el objetivo de que estas celulas
tengan una fuente de energia constante.
Reactivos a utilizar:
Pierna de pollo (fresco)
A partir de la muestra se obtendrá tanto la enzima Lactato Deshidrogenasa, como la coenzima NAD
( aceptor de electrones en la reacción)
Arena de cuarzo.
Funciona como filtro tras la preparación en un mortero.
KCN al 0.5% - Cianuro de potasio.
Venenoso, soluble en agua. Interfiere en la capacidad del organismo de utilizar oxigeno causando
hipoxia. Impide la respiración celular. En esta práctica se utiliza para desviar la reacción enzimática
hacia producto.
Agua destilada:
Iguala volumen de tubos.
Lactato de sodio al 1%
Es el sustrato de la reacción a estudiar. Proviene del piruvato.
Azul de metileno 0.002M
Es el indicador de la reacción. Se utiliza como aceptor de hidroogeno, pues posee la propiedad de
cambiar de color al pasar de oxidado a reducido. ES azul cunado esta oxidado y blanco de metileno
cuando esta reducido.
El azul de metileno se utiliza como aceptor d e hidrogeno, pues posee la propiedadde cam biar de
color al pasar de oxidado a reducido. Es azul de metileno cuando esta oxidado y blanco (incoloro) de
metileno cuando esta reducido
Aceite mineral
Aislante de oxígeno. Tiene la función de evitar el contacto de los reactivos con oxígeno y asegurar en
el tubo de ensayo una condición de anaerobiosis. Evita la reoxidación del azul de metileno.
DESARROLLO
Efecto de la Nicotinamida Adenin Dinucleótido (NAD) en la actividad de la enzima Lactato
Deshidrogenasa (LDH)
. 1. Obtención de la enzima LDH.
a) Con ayuda de un bisturí limpiar de grasa la pierna de pollo, y cortar de 2 a 3 gramos de músculo.
b) Colocar el tejido en un mortero frío, añadir un poco de arena de cuarzo y triturar perfectamente.
c) Añadir 10 ml de NaCl al 0.9% por gramo de tejido y dejar reposar la mezcla en el mortero por 15 minutos en
el refrigerador.
d) Filtrar el contenido del mortero en un embudo con la gasa sobre un vaso de precipitados de 100 ml.
e) Vaciar la solución obtenida en 2 tubos de 13 X 100 mm.
f) Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y con ayuda de una pipeta Pasteur recuperar el sobrenadante en un
tubo de 13 X 100 mm etiquetándolo como LDH.
g) Lavar el mortero y dejar escurrir.
2. Obtención de la coenzima NAD.
a) Obtener otros 3 g de tejido muscular de la pierna.
b) Cortar el músculo en fragmentos más pequeños y ponerlo con 8 ml de agua destilada por gramo, en un
matraz Erlenmeyer de 125 ml. Calentar a ebullición por 5 minutos.
c) Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena de cuarzo y triturar perfectamente.
d) Filtrar el contenido del matraz en un embudo con la gasa sobre un vaso de precipitado de 100 ml.
e) Vaciar la solución obtenida en 2 tubos de 13 X 100 mm.
f) Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos y con ayuda de una pipeta Pasteur recuperar el sobrenadante en un
tubo de 13 X 100 mm y etiquetarlo como NAD.
3. Detección de la actividad enzimática de LDH.
a) Preparar una serie de cuatro tubos de ensaye de 16 X 150 mm como se indica a continuación,
agitando después de agregar cada reactivo:
b) Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar 1 ml de aceite mineral (no agitar).
c) Incubar en baño maría a 37°C todos los tubos.
d) Observar sin mover los tubos, los cambios de color ocurridos cada 5 minutos durante 20 minutos.
ANALISIS DE RESULTADOS.
Tubo 1
No se agregó la coenzima NAD. Hay una ligera pero perceptible muestra de decoloración. La reacción se
lleva a cabo con NAD endógeno derivado del tejido muscular del pollo. Se realiza la reacción en pequeñas
cantidades. Al ser una reacción que se da durante condiciones donde no hay oxígeno, la decoloración del
tubo empieza en la parte más baja porque la reacción es anaeróbica y el fondo es donde menos oxigeno hay
Tubo 2
Cambio d coloración azul a blanca. En este tubo se tienen las condiciones adecuadas para realizar la
oxidación del piruvato. El NAD se reduce reponiendo NAD+H. Y este producto final es el que decolora el azul
de metileno donándole electrones..
Tubo 3.
No se agrego lactato que es el sustrato de la reacción enzimática. Se esperaría que no se
muestre reacción, pero hay una decoloración un poco mayor que el tubo 1, esto se debe a que en
el extracto de NAD también hay contenido pequeñas cantidades de lactato que utiliza la enzima LDH
efectuando la reacción y por lo tanto la decoloración mostrada.
Tubo 4.
Sin cambios en la coloración ya que no se agregó la enzima, lo que demuestra que la reacción no se lleva a
cabo en ausencia de esta.
CONCLUSION GENERAL.
Se ha demostrado experimentalmente la relación que existe entre el NAD y la actividad de la deshidrogenasa
láctica tomando en cuenta las condiciones anaeróbicas reproducidas de manera experimental, asi como la
actividad de transferencia de electrones que realiza esta enzima a través de la observación de los resultados
finales en la decoloración del azul de metileno ( dador de electrones)
La enzima LDH permite que se lleve a cabo la reacción redox oxidando el lactato a piruvato y reduciendo el
NAD a NADH reflejado en el azul de metileno que presenta una coloración azul y reducido una coloración
blanca debido a que es el último aceptor de electrones en la reacción proveniente del lactato.
BIBLIOGRAFIA.
Voet D, VOet J. 2006. Fundamentos de Bioquímica 2da edición. Editorial Médica Panamericana. Madrid,
España.
Nelson, David. Cox, M. Lehninger. Principios de Bioquimica. Septima edición. Editorial Omega.