4TH
CROMATOGRAFÍA
DE LÍQUIDOS
(HPLC)
Maya Arroy Jorge Luis, Palomino Jimenez
Monserrat, Chávez Juárez María de Lourdes,
Olvera Vargas AndreaMariana
Cromatografía
Un cromatograma es una representación de la
separación que se ha producido químicamente en el
sistema HPLC. Se dibuja una serie de picos que se
elevan desde una línea base en un eje de tiempo. Cada
pico representa la respuesta del detector para un
compuesto diferente. La estación de datos del
ordenador traza el cromatograma
Imagen 1. Esquema del funcionamiento de HPLC
Imagen2. Partes del cromatograma
Principales características:
Aplicaciones: Técnica de separación para los materiales menos volátiles e iónicos;
análisis cuantitativo de multicomponentes.
Fenómeno molecular: reparto entre una solución líquida y un substrato
Ventajas en el análisis cualitativo: separa materiales para su examen por medio de
otras técnicas.
Ventajas en el análisis cuantitativo: aplicación amplia a los materiales menos volátiles,
análisis de multicomponentes.
Muestra promedio deseable: 10 mg
Columnas: Miden de 25-50 cm y el diámetro interno es de 2-5 mm y el diámetro de la
particula es de 5 -15 µm.
Número de platos teórico:
Es la longitud de columna requerida para que se establezca un equilibrio del
soluto entre la fase móvil y la estacionaria. Es una medida estimada de la
agudeza del pico y es característico de cada soluto en cada sistema
cromatográfico.
Imagen 3. Ejemplo de cromatograma obtenido por
HPLC
N, Número de platos teórico
Esquema de separación:
Imagen 4. Esquema donde se muestra el camino de los analitos
con tiempos diferentes.
Fundamentación:
Consiste en una fase estacionaria no polar (columna)
y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se
ha tratado con RMe2SiCl .
La muestra en solución se inyecta en la fase móvil.
Los componentes de la solución emigran de acuerdo
a las interacciones no-covalentes de los compuestos
con la columna.
Fundamentación:
Estas interacciones químicas, determinan la
separación de los contenidos en la muestra.
La utilización de los diferentes detectores dependerá
de la naturaleza de los compuestos a determinar.
Imagen 5. Esquema general de la HPLC.
Imagen 6. Movimiento de las muestras en HPLC.
Tipos de muestras
● Aguas
● Suelos
● Alimentos
● Extractos
Ventajas
Amplio rango de aplicabilidad debido a la alta disponibilidad de equipos, columnas y
demás materiales, que la hacen capaz de analizar casi cualquier mezcla deseada
Alta precisión en sus resultados (±0.5 % o menor)
Variedad de técnicas, entre las cuales están la cromatografía por partición, adsorción,
intercambio iónico y exclusión molecular
Fácil manipulación de los gradientes generados en la fase móvil
No es destructiva, es decir, los compuestos separados en la columna pueden ser
recolectados, lo que permite el uso de la HPLC como una técnica de preparación o
purificación de muestras
Ventajas
Tiempo de separación menor a 30 min por muestra analizada
Alta reproducibilidad en los análisis cuantitativos
Alto poder de separación con detección sensible
Fácil manipulación de los gradientes generados en la fase móvil
La operación es flexible, personalizable y automatizada
No está restringida por la volatilidad o estabilidad térmica de la muestra
Desventajas
Emplea mayor uso de solventes
Tiempo de análisis muy prolongado
Altos costos de equipos
Requiere de un técnico especializado para operar
Residuos químicos difíciles de tratar (impacto ambiental)
Difícil detectar coelución y baja sensibilidad a algunos compuestos
Criterios a considerar:
Imagen 7. Selección del sistema cromatográfico en función del tipo de muestra
Mecanismos de reparto:
Referencias:
● Cortínes, V. (2010). Comparación de pretratamientos en residuos forestales
para la producción de bioetanol de segunda generación: hidrólisis ácida y
líquidos iónicos (tesis de maestría). Maestría en Ciencias de Ingeniería
Química, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Departamento de
Ingeniería Química y Biotecnología, Universidad de Chile, Santiago de Chile,
Chile.
● Dong, M. (2013). The essence of modern HPLC: advantages, limitations,
fundamentals, and opportunities. LCGC North America, 31(6), 472-479.
● Giri, D. (2015). High performance liquid chromatography (HPLC): principle,
types, instrumentation and applications. LaboratoryInfo. Recuperado de
[Link]
Referencias:
● Fallon, A., Booth, R., y Bell, L. (1987). Applications of HPLC in biochemistry (1.ª
ed.). EE. UU.: Elsevier Science Ltd.
● Agilent Technologies. (s. f.). The secrets of rapid HPLC method development.
Choosing columns for rapid method development and short analysis times.
Recuperado de [Link]
library/eseminars/Public/Microsoft%20PowerPoint%20-%20Rapid%20HPLC
%20Method%20
● [Link] Alphacrom. (s. f.). Chromatography Basics. Recuperado de
[Link]