PCR
Introducción
La gran complejidad de los procesos biológicos en los seres vivos ha sido por años la razón por la
que los investigadores han centrado su atención en descifrar los mecanismos que se esconden detrás
de esos procesos. Desde las primeras observaciones de Gregorio Mendel hasta la actualidad, se tiene
la noción de que parte de la explicación de los diferentes fenómenos biológicos se encuentra
escondida en lo más recóndito del genoma celular y que una de las claves para entender dichos
fenómenos es el estudio de los genes. Uno de los descubrimientos más importantes de la historia que
marcó el inicio de una nueva era en el estudio y conocimiento de los ácidos nucleicos fue el de
Watson y Crick, al descifrar la estructura del ADN (ácido desoxirribonucleico). Desde entonces,
varios grupos han mostrado un gran interés por desarrollar métodos sensibles y reproducibles que les
permitan estandarizar protocolos experimentales para estudiar los ácidos nucleicos. Es así como han
ido apareciendo diferentes tecnologías cuyos protocolos están dirigidos al estudio del ADN;
probablemente, la más importante sea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en
inglés), desarrollada por Kary Mullis y que revolucionó la biología molecular y la forma en cómo se
estudiaban los ácidos nucleicos en ese momento. Actualmente sabemos que la misión de la PCR es
copiar millones de veces una secuencia específica de ADN blanco mediante una poderosa catálisis
llevada a cabo por una enzima conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades
pequeñas de ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con diferentes fines.
El desarrollo de esta técnica permitió estudiar y manipular mejor al ADN, facilitando el
establecimiento de protocolos experimentales en biología molecular. El progreso de esta técnica ha
sido muy notable y ha ido en paralelo con los nuevos retos para estudiar y comprender mejor el rol
de los genes, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Es por ello que una de las formas
recientes para detectar y cuantificar a los ácidos nucleicos es a través de la PCR en tiempo real, la
cual es una modalidad de la PCR considerada como una técnica cuantitativa. Hoy en día, la PCR se
aplica en diferentes áreas de las ciencias biológicas y de la salud, formando parte del quehacer
científico de muchos laboratorios de investigación que la utilizan principalmente para expresión
génica, genotificación, detección de patógenos y análisis de mutaciones. En esta revisión se hace una
descripción de los fundamentos de la PCR convencional o también conocida como punto final;
además se explica qué se necesita para que la reacción sea exitosa, cómo se lleva a cabo y cómo se
analizan los resultados.
Fundamentos
¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de
veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN
polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción, si
usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si usamos
ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce
como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en inglés). Esta conversión se logra
mediante una reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa
reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. Este método fue copiado de los
retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse
en millones de partículas virales. El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresión del ARNm de
algún gen de interés. Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o
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ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs:
adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o buffer y
H2 O. Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se compone la PCR:
desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados
termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las
condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos.
Al final de la reacción, para corroborar si se amplificó la secuencia blanco de interés, los productos
de la PCR o también llamados amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la
reacción fue exitosa.
. ¿Qué elementos químicos se necesitan? El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya
naturaleza química ofrece ventajas para su manipulación. Para entrar en contexto, es importante
recordar que la molécula de ADN está formada por tres componentes: un azúcar (desoxirribosa), un
grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, timina, guanina o citosina) que es complementaria
con la base de otra cadena (Figura 1), de tal forma, que el ADN se estructura en una doble hélice. La
complementariedad entre las bases está dada por puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas,
generando estabilidad a la doble hélice, la carga eléctrica del ADN es negativa y está dada por los
grupos fosfatos. En la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan como
molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de interés. Por
su parte, la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas cadenas
de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada con frecuencia se llama Taq ADN
polimerasa, que proviene de una bacteria termófila llamada Thermus aquaticus, la cual vive en
condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar ese tipo de
temperaturas. El rasgo que distingue a esta enzima bacteriana de otras ADN polimerasas de otros
organismos es su capacidad para mantener su funcionalidad a temperaturas altas, por lo que se le
considera una enzima termoestable. También hay otras enzimas que se utilizan como la Vent,
obtenida de la bacteria Thermococcus litoralis. Normalmente, casi todas las enzimas que se venden
comercialmente son eficientes y generalmente cuando fallan lo hacen por una manipulación
incorrecta del usuario. Para que la enzima funcione con alta especifi cidad y la reacción transcurra
exitosamente, también se necesita de los elementos ya mencionados como primers, dNTPs, Mg +,
buffer y H2 O. Los primeros son secuencias de oligonucleótidos que flanquean y delimitan la
secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Generalmente su tamaño
oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la secuencia. Si
no se respetan estas reglas, existe la posibilidad de la formación de dímeros de primers, es decir, de
productos inespecíficos. Esto repercutiría en el rendimiento de la reacción, así como en la
especificidad del producto esperado. Son dos secuencias diferentes de primers las que se utilizan en
la PCR, una denominada «forward» o sentido y otra «reward» o antisentido; ambas deben estar
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diseñadas para que hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq
polimerasa en dirección 5’-3 (como sucede endógenamente). Con la fi nalidad de garantizar la
formación de un complejo estable entre el templado y los primers, hoy en día existen programas
informáticos para diseñar primers con alta especificidad, por lo que se evita la formación de
productos inesperados. Incluso, hay laboratorios de biología molecular que se dedican a diseñarlos,
sintetizarlos y validarlos para garantizar su especificidad, facilitándole el trabajo al usuario que sólo
elige el de su interés y los manda a comprar. Por su parte, los dNTP’s son los ladrillos o bases
nitrogenadas con los que la Taq polimerasa construye las nuevas cadenas de ADN. Son factores
importantes que contribuyen a la especificidad de la reacción, por ello es importante que su
concentración sea la adecuada ya que de lo contrario pueden afectar la función de la Taq polimerasa.
Normalmente, se utilizan a una concentración que oscila entre 0.2 a 1.0 mM. El buffer es la solución
amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está compuesta de Tris-HCL (pH = 8) cuya
concentración final de trabajo debe ser 1X. También se usan otros buffers de composición distinta
que son fácilmente comprados en el mercado. El magnesio es un cofactor enzimático que influye en
la especificidad de la reacción, por eso se debe tener una concentración adecuada para que no afecte
el rendimiento de la Taq polimerasa; regularmente su concentración oscila entre 0.5 y 2.5 mM. En
ocasiones ya viene incluido en el buffer, pero en otras se le tiene que agregar. El agua es el
disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada libre de nucleasas, enzimas que degradan a
los ácidos nucleicos.
¿Cómo funciona la reacción?
Recordemos que cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalización,
hibridación y extensión (Figura 2). A continuación explicaremos qué sucede en cada una.
Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una temperatura
de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del templado, es decir, si la
cantidad de G-C es alta, será necesario más tiempo para romper sus uniones debido a que el
apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces, uno más que las bases de A-T. Además,
depende de la velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al
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modelo del equipo. Al final de esta etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como
templado para el siguiente paso.
Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente separado
e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo templado-primers, es
importante que la temperatura de hibridación o temperatura melting (Tm) sea la óptima; ésta
generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los primers es el correcto y la temperatura es la
adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo será eficiente.
Extensión. En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo templado-primers y empieza su
función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega dNTP’s complementarios para crear las
cadenas completas de ADN. La extensión de las cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es
decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la
enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por
el número total de pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.
¿Cómo se analiza el producto de amplificación?
Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los amplicones son
visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa. La electroforesis consiste en la
separación de grandes moléculas como los ácidos nucleicos a través de una matriz sólida que
funciona como un filtro para separar las moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y
carga eléctrica. Esta separación se hace bajo un buffer o tampón que puede ser TAE o TBE. En el
caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato les proporciona la carga negativa, por lo que durante la
electroforesis migran hacia el polo positivo. Para ello, se prepara un gel diluyendo una cantidad de
agarosa en el buffer, se calienta hasta que la agarosa hierva lo suficiente y posteriormente se vacía a
un recipiente que sirve de base para que solidifique. Generalmente el porcentaje al que se prepara el
gel es al 1.2% aunque, dependiendo del tamaño de las moléculas, puede ser de hasta el 2%. Otro
ingrediente que se agrega al gel es un compuesto conocido como bromuro de etidio, una molécula
intercalante capaz de unirse al ADN de doble cadena. Cuando es excitado con luz UV emite una
señal que permite la visualización de los amplicones en forma de bandas. Es importante manipular
con mucho cuidado este compuesto porque se sabe que es mutagénico y teratógeno.
Cuando los amplicones son corridos en el gel, éstos deben ser cargados junto con un marcador
molecular que contenga un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo que facilita la
identificación de los amplicones y si su tamaño corresponde con el esperado. El tamaño está dado
por el número de pares de pases del amplicón. El marcador de peso molecular es fácilmente
adquirido en el mercado, ya que se ofrece una gama de marcadores con distintos pesos moleculares
para elegir el de nuestro interés. Finalmente, la visualización de los amplicones se lleva a cabo
tomando una foto digital al gel de agarosa expuesto a luz UV (Figura 3); adicionalmente un
procesador de imágenes se encarga de analizar las bandas observadas.
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PCR
La combinación adecuada de todos los elementos químicos mencionados hacen posible la síntesis in
vitro del ADN utilizando la PCR. Los cambios que ha sufrido la PCR como plataforma tecnológica
han sido muy notables; conforme los paradigmas de estudio de los ácidos nucleicos han ido
cambiando, la necesidad de ir mejorando la técnica se convirtió en una prioridad para los
investigadores; es por ello que la PCR ha sufrido modificaciones para ofrecer una tecnología más
innovadora apegada a los retos inherentes que implica el estudio del ADN. Actualmente, el
panorama de la PCR promete estar a la altura de los objetivos de los investigadores, tan es así que
ahora la modalidad de la PCR en tiempo real ofrece la gran ventaja de usar un sistema cuantitativo.
PCR en tiempo real: fundamentos
Los primeros que sentaron las bases para desarrollar la PCR en tiempo real fueron Higuchi y
colaboradores, en 1992, al videograbar en tiempo real la incorporación de bromuro de etidio al ADN
durante cada ciclo de la PCR realizada bajo luz UV. Desde entonces, el objetivo de la PCR en
tiempo real ha sido detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante el
uso de reporteros fluorescentes en la reacción.
El principio de la técnica se basa en la PCR punto final, sólo que la forma en cómo se detectan y
analizan los productos de la amplificación es diferente. El término en tiempo real se refiere a que la
detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el término
cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra, a
diferencia de la PCR punto final en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la
secuencia blanco. Precisamente, estas últimas dos características representan grandes ventajas de la
PCR en tiempo real, ya que el producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la
reacción8 sin que haya la necesidad de que sea manipulado en un gel de agarosa para conocer si la
reacción fue exitosa como sucede en la PCR punto final. La nomenclatura que se usa también es
diferente, si utilizamos ADN genómico entonces hablamos de una qPCR (quantitative PCR), si por
lo contrario, primero obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR, nos referimos a una RT-qPCR.
Actualmente, la PCR en tiempo real es el método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos
nucleicos. Aun teniendo una cantidad muy pequeña de templado, el sistema garantiza una alta
sensibilidad, especificidad y eficiencia. Una de sus aplicaciones más usadas es para cuantificar
cambios muy pequeños en la expresión génica mediante la detección de los niveles del ARNm
procedente de células o tejidos. La cantidad de ARNm que puede detectar la reacción puede ser a
partir de concentraciones bajas a diferencia de la PCR, punto final que necesita una mayor
concentración.
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Los ingredientes químicos en la PCR en tiempo real, son los mismos utilizados en la PCR punto
final, sólo que generalmente la enzima, dNTP’s, Mg +, el buffer y el sistema reportero de fl
uorescencia para detectar los productos amplificados se venden juntos en una solución conocida
como «Master mix», el agua es proporcionada por separado y también es libre de nucleasas. Los
primers deben ser diseñados especialmente para garantizar una alta especificidad y para que generen
amplicones de un tamaño que oscile entre 100-150 pb; si éstos son más grandes, la eficiencia de la
reacción disminuye considerablemente. Para evitar estos problemas, una alternativa es diseñar los
primers, utilizando programas informáticos disponibles, o comprarlos ya validados de las compañías
de biología molecular, quienes garantizan resultados altamente eficientes y satisfactorios para los
usuarios.
¿Cuáles son los métodos para detectar los productos
amplificados?
El monitoreo de los productos amplificados conforme transcurre la reacción es un paso importante
en la PCR en tiempo real, para ello la estrategia tecnológica que ha dado buenos resultados es los
sistemas basados en reporteros fluorescentes. En general, estos sistemas pueden ser clasifi cados en
dos métodos diferentes: específicos y no específicos.
Los métodos no específicos se basan en el uso de moléculas intercalantes que tienen afinidad por el
ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan una señal fluorescente. La fluorescencia emitida
es capturada en la etapa de extensión de cada ciclo y es proporcional al número de copias de ADN
de doble cadena obtenidas en cada ciclo de la PCR. El reportero más usado para estos fines se llama
SYBR Green, la cual es una molécula cargada positivamente que, mientras esté en solución sin
unirse al ADN de doble cadena, prácticamente no emite fluorescencia; sin embargo, cuando se une
al surco menor del ADN incrementa hasta 1,000 veces su fluorescencia (Figura 4). Aunque el SBYR
Green es uno de los reporteros fluorescentes más utilizados por los investigadores debido a su bajo
costo, la principal desventaja es que puede unirse a cualquier molécula de ADN de doble cadena,
incluyendo dímeros de primers. Muchos laboratorios, para evitar esta situación, optimizan sus
reacciones realizando una «curva melting» o «curva de disociación» al final de la reacción, cuya
función es la de evaluar si se formó un producto único o si hay presencia de dímeros de primers. Hoy
en día la mayoría de los software de los termocicladores ofrecen esta función que es fácil de aplicar
y analizar.
Los métodos específicos parten de principios distintos a diferencia de los no específicos y tienen en
común la señal de fluorescencia emitida para detectar los productos amplificados. Estos métodos
siguen el principio conocido como «transferencia de energía de resonancia fluorescente» (FRET, por
sus siglas en inglés) para generar la señal; este método consiste en transferir energía desde un
donador o reportero fluorescente a un aceptor o «quencher». Para ello, existen dos métodos
específicos, éstos son: pruebas basadas en hidrólisis y por hibridación. Los primeros se basan en
sondas fluorescentes de oligonucleótidos etiquetados con un reportero fluorescente y un «quencher»,
ambos se encuentran en estrecha unión mientras la sonda no hibride a su secuencia blanco. Cuando
hibrida, ocurren cambios conformacionales en el reportero y el quencher, lo cual permite que la
actividad exonucleasa 5’-3’ de la Taq polimerasa rompa esta unión, logrando que la fluorescencia
emitida por el reportero sea liberada y capturada por el equipo. Estos métodos son muy seguros, ya
que mientras no haya unión de la sonda a su blanco, no habrá amplificación y tampoco señal de
fluorescencia; es por eso que la especificidad es muy alta. Un ejemplo de estos sistemas son las
sondas comerciales conocidas como TaqMan12 (Figura 5), aunque existen otras en el mercado.
Los métodos por hibridación consisten en una sonda unida a un reportero fluorescente que está en
estrecha proximidad con un aceptor fluorescente unido a otra sonda. Tanto el reportero como el
aceptor presentan un espectro de excitación y de emisión similar, de tal forma que cuando las dos
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sondas hibriden a su templado blanco, el reportero es excitado y la señal emitida es transferida al
aceptor, generando un incremento en la cantidad de fluorescencia. Un ejemplo de este método son
las sondas molecular Beacons que también son comerciales.
Los métodos específicos son más costosos que los no específicos, pero son más eficientes al
garantizar la especificidad de la reacción, evitando la formación de productos inespecíficos.
Cualquiera que sea el método que se aplique, se pueden adquirir fácilmente, ya que la gama de
sondas para desarrollar, tanto los métodos específicos como los no específicos, es amplia.
¿Cómo se captura la señal de fluorescencia?
Cualquiera de los métodos que se utilicen para detectar los productos amplificados en cada ciclo de
la reacción necesita de la tecnología incluida en los termocicladores de PCR en tiempo real para: a)
excitar al reportero, b) capturar la señal de emisión del mismo y c) realizar el análisis cuantitativo.
En el mercado existen diferentes tipos de termocicladores para esta finalidad, cuyas diferencias
principales son la fuente de energía que utilizan para la excitación. En general son tres las fuentes:
las lámparas de luz, diodos de emisión de luz (LED, por sus siglas en inglés) y láseres. Cualquiera
que sea la fuente, primero el reportero es excitado y su señal de emisión colectada a través de un
filtro que permite el paso de la longitud de onda correspondiente que llega hasta un fotodetector que
captura la información proveniente de la muestra para su análisis en el software del equipo. Otros
rasgos característicos son las velocidades para incrementar o disminuir las temperaturas en cada
etapa de la reacción, el número de muestras que puede soportar, los consumibles para la reacción y
los kits que se utilizan para la amplificación; en algunos casos sólo se usan reactivos del proveedor
del termociclador, es decir, son sistemas cerrados y en otros casos, se pueden utilizar reactivos de
diferentes proveedores, es decir, son sistemas abiertos.
¿Cómo se analizan los resultados?
No es suficiente con detectar la amplificación en tiempo real y capturar la fluorescencia de cada
muestra, el análisis de la reacción es el paso final para determinar la cuantificación génica. Para ello,
los termocicladores están proveídos de una PC con un software que generalmente son fáciles de usar.
Este software genera una serie de gráficas en donde se muestran todos los datos necesarios para
conocer si la reacción fue exitosa. Una de estas gráficas es la de amplificación (Figura 6) que
muestra el curso y el progreso de la reacción, otra gráfica es la curva de disociación o curva melting
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(Figura 7) que muestra información sobre la especificidad de la reacción. Otro paso importante del
análisis es elegir el tipo de cuantificación que se usará para determinar la amplificación precisa del
blanco génico; este procedimiento depende de los intereses del investigador. Para ello existen dos
tipos de cuantificación: la absoluta y la relativa. La primera generalmente se utiliza para conocer el
número exacto de copias amplifi cadas del blanco o la concentración precisa de ácidos nucleicos en
una muestra. En la práctica, este tipo de cuantificación se usa para medir la carga viral o bacteriana
en diferentes tejidos. La segunda se aplica cuando se desean evaluar los cambios en la expresión de
genes en distintos estados fisiológicos. Estos cambios se basan en los niveles del ARNm del gen
blanco comparados con un gen de referencia (gen housekeeping) que no cambia su expresión a pesar
de que los estados fi siológicos se modifiquen por diversas causas. Los datos son expresados como
relativos al gen de referencia y generalmente son referidos como el número de veces en el que
aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm o en su caso, si no hubo cambios. Cualquiera que
sea el tipo de cuantificación que se elija, casi todos los software de los equipos están posibilitados
para llevar a cabo los análisis matemáticos y estadísticos que se requieren en cada tipo de
cuantificación
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