UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE MEDICINA
Escuela de estudios Generales
Área de Salud
Curso: Ciencias de la Naturaleza II
Practica N°6
CURVA ESPECTRAL
LEY DE LAMBERT Y BEER
I . COMPETENCIA ESPECÍFICA
Demuestra gráficamente la construcción de una curva espectral utilizando el biosimulador del
espectrofotómetro.
Interpreta la Ley de Lambert y Beer en la aplicación del método espectrofotométrico.
II. CONSIDERACIONES TEORICAS
Entre los métodos más usados en el laboratorio de análisis clínico, análisis biológicos, bioquímicos,
inmunológicos y también en investigación, uno de los más usados es el método espectrofotométrico
de luz ultravioleta (UV) y de luz visible (LV)
El análisis colorimétrico, como también se le conoce es un conjunto de métodos de análisis
cualitativo (identificación de sustancias) así como cuantitativo (determinación de la concentración)
que se fundamenta en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una solución
que contiene al analito que tiene la característica de absorber determinada parte del espectro de la
luz, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas o que se han hecho de tal calidad
mediante reacciones químicas adecuadas.
La longitud de onda en la que las moléculas absorben con mayor intensidad la luz, se denomina
longitud de máxima absorción o lambda máximo.
Las leyes que rigen la cuantificación de los analitos cromogénicos son la Ley de LAMBERT y la Ley de
BEER, sin embargo, tienen ciertas limitaciones y no incluyen todas las variables que influyen en la
aplicación como temperatura, pH, límites de concentración tanto mínima como máxima, entre otras
propias de las moléculas, por ello es que se cumple esta ley de Lambert y Beer, manteniendo algunas
condiciones constantes.
En el esquema la luz de determinada longitud de onda ( ) incide sobre el
recipiente de longitud de paso de luz o grosor (L) que contiene una solución
de determinada concentración de un analito (c), la luz que incide (Io) se hace
menor cuando atraviesa la solución (I).
Cuando Io así como I se expresan en porcentaje, se señala que la I es la luz
trasmitida (T%) o transmitancia
La luz que se pierde, que no atraviesa se señala que se extingue (E) o que es absorbida por las
moléculas del cromógeno y se expresa como densidad óptica (DO) o absorbancia (A)
La relación entre absorbancia y transmitancia es: E = DO = A = log (Io/I)
Si Io es toda la luz que interactúa en el sistema, podemos señalar que es el 100%, por lo tanto se
obtiene: A = 2 – log T%
LEY DE LAMBERT
Expresa la proporcionalidad que existe entre la DO de una solución de un cromógeno de
concentración contante, con la distancia que recorre el haz de luz o grosor del recipiente.
LEY DE BEER
Por el contrario, si se mantiene constante la longitud del paso de la luz (grosor del recipiente)
entonces existe una proporcionalidad entre la DO con la concentración del analito; la condición es
que el haz de luz debe ser monocromático.
FÓRMULA DE LA LEY DE LAMBERT Y BEER
DO = A = l. c.
donde:
DO es la densidad óptica.
A es absorbancia.
l es la longitud que atraviesa el haz de luz.
c es la concentración de la solución con el analito que absorbe la luz.
es el coeficiente de extinción.
El coeficiente de extinción ( ) puede ser coeficiente de extinción molar, cuando la concentración
del analito se expresa en mol/L o coeficiente de extinción específico, cuando se expresa en otras
unidades de concentración (mg/dl, g/L, etc)
CURVA ESPECTRAL
Es un procedimiento que se realizará para la selección de una región del espectro, en la cual un
analito absorbe con mayor capacidad la luz y si este varía con la concentración de dicho analito.
III: ACTIVIDAD SINCRÓNICA
EXPERIENCIA 1. La curva espectral (gruesa)
Realice los procedimientos usando el simulador:
Laboratorio de la Ley de Beer 1.4.19 ([Link])
A. Ingrese a la ventana “ley de Beer”
B. Verifique los componentes del simulador.
C. Seleccione la solución de Nitrato de cobalto II.
D. El docente le mostrará el uso del simulador para obtener la DO a una longitud dada y una
concentración determinada
E. Luego cada estudiante (A, B, C, D, E) hará una concentración diferente a las diferentes
longitudes de onda señaladas en el siguiente cuadro y registrará las DO obtenidas
F. Cada estudiante realizará el gráfico Log. Onda (VS) DO
G. Presentar cada estudiante el gráfico, comentar y llegar a una conclusión.
TUBO A B C D E
Log Onda 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM 250 mM
400
440
480
520
560
600
640
680
720
EXPERIENCIA 2. La curva espectral (fina)
Realzar los mismos pasos anteriores en el simulador, pero con las longitudes de onda señalas en el
nuevo cuadro.
Laboratorio de la Ley de Beer 1.4.19 ([Link])
TUBO A B C D E
Log Onda 50 mM 100 mM 150 mM 200 mM 250 mM
542
544
546
548
550
552
554
556
558
560
Cada estudiante presente el gráfico; comentar, llegar a una conclusión.