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Revista electrnica de Veterinaria 1695-7504 2010 Volumen 11 Nmero 03

REDVET Rev. electrn. vet. [Link] -[Link] Vol. 11, N 03, Marzo/2010 [Link]

Hallazgo de Ehrlichiosis canina causada por E. canis en una Comunidad del Municipio de Len, Nicaragua Find of canine Ehrlichiosis caused for E. canis in a Community of Len's Municipality, Nicaragua)
Vanessa Rivas Lara; Daniel Morales Arancibia; Milton Saenz; Jos Luis Bonilla. Centro Veterinario de Diagnstico e Investigacin (CEVEDI), Dpto. Sanidad Animal, Escuela de Veterinaria, Universidad Nacional Autnoma de Nicaragua, Len (UNAN - LEN) Tutor principal: MSc. Jos Luis Bonilla, DMV. Microbiologa e Inmunologa Veterinaria Director CEVEDI Dpto. Sanidad Animal Escuela de Veterinaria UNAN-LEON e-mail: jlbovibonilla81@[Link] , jlbones81@[Link] Resumen La ehrlichiosis es una enfermad producida por bacterias intracelulares obligadas del gnero Ehrlichia que en los canes (Canis familiaris) se caracteriza por pancitopenia. El objetivo del presente trabajo es dar a conocer la situacin de la Ehrlichiosis canina en una comunidad del municipio de Len, mediante una evaluacin sangunea, tincin y deteccin serolgica a travs de un test inmunocromatogrfico. Materiales y Mtodo: Tamao y toma de muestra; El estudio se realiz en 27 caninos (Canis familiaris) tomados al azar pertenecientes a la Comunidad Rubn Daro, Municipio de Len. Se realiz la toma de muestra de sangre entera mediante venopuncin ceflica y se deposit en tubos con y sin EDTA. Las muestras fueron remitidas al Centro Veterinario de Diagnstico e Investigacin (CEVEDI) de la Escuela de Veterinaria UNAN-LEON. Anlisis de las muestras; A todas las muestras se les realiz Biometra Hemtica Completa (BHC), extendido perifrico y una prueba rpida para la deteccin de Ehrlichia canis. Resultados: De un total de 27 muestras se encontr un 70% de los animales con valores bajos de hematocrito, un 77,7% tena los niveles de hemoglobina por debajo del parmetro fisiolgico y el 85% de los casos present un conteo eritrocitario bajo de lo normal. En el extendido perifrico no se identificaron cuerpos de inclusin intracitoplasmtico en eritrocitos o leucocitos compatibles con
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Ehrlichia. A las 27 muestras se les realiz tambin un ensayo inmunocromatogrfico (SNAP) donde se detect E. canis en un 63% de los casos. Conclusiones: La mayora de los animales present valores de hematocrito, hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los parmetros fisiolgicos. No se observaron cuerpos de inclusin intracitoplasmticos compatibles con erhlichia en trombocitos y monocitos con la tincin de Giemsa. Se detectaron anticuerpos frente a Ehrlichia canis, mediante el test inmunocromatogrfico. Palabras claves: Ehrlichia canis, perros (Canis inmunocromatografa, biometra hemtica completa. familiaris),

Abstract The ehrlichiosis is a disease produced by intracellular bacteria forced of the kind Ehrlichia that in the dogs (Canis familiaris) is characterized for pancytopenia. The aim of the present work is to announce the situation of the canine Ehrlichiosis in a community of Len's municipality, by means of a blood evaluation, tint and serologic detection across an immunochromatographic test. Materials and Method: Size and capture of sample; the study were carried out in 27 dogs (Canis familiaris) taken at random belonging to the Community Ruben Dario, Len's Municipality. There was realized the capture of sample of entire blood by means of cephalic venopuntion and settled in pipes with and without EDTA. The samples were sent to the Veterinary Center of Diagnosis and Research of the School of Veterinary, UNAN-LEON. Analysis of the samples; To all the samples they there was realized Complete Biometry Blood, extended peripheral and a rapid test for the detection of Ehrlichia canis. Results: Of 27 samples be found 70 % of the animals with low values of hematocrite, 77,7 % had the levels of hemoglobin below the physiological parameter and 85 % of the cases presented a count red blood low of the normal thing. In the widespread peripheral bodies of inclusion were not identified intracitoplasmic in red blood or leukocytes compatible with Ehrlichia. To 27 samples (SNAP) realized also an immunochromatographic test where it was detected E. canis in 63 % of the cases. Conclusions: The majority of the animals presented values of hematocrite, hemoglobin and count red blood below the physiological parameters. Bodies of inclusion were not observed intracitoplasmatics compatible with Erhlichia in trombocites and monocites with Giemsa's tint. Antibodies were detected opposite to Ehrlichia canis, by means of the immunochromatographic test.

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Keys Words: Ehrlichia canis, dogs (Canis immunochromatographic test, complete biometry blood.

familiaris),

Introduccin La Ehrlichiosis es una enfermedad causada por una bacteria intracelular obligada, Gram positiva, que requiere de un mamfero como reservorio y de un artrpodo como vector. Presenta tropismo por clulas sanguneas (leucocitos y plaquetas) de animales y humanos, e invade su citoplasma, alojndose dentro de vacuolas, donde se multiplica por fisin binaria, dando origen a un agregado de la bacteria o microcolonia, que por su apariencia se ha denominado "mrula" (Prez et al., 2006). Actualmente este gnero comprende cinco especies, de las cuales Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis y Ehrlichia ewingii tienen la capacidad de causar enfermedad en caninos y humanos (Buller et al., 1999; Prez et al., 2006). Ehrlichia canis es la especie representante del gnero y es el agente clsico causante de la ehrlichiosis monoctica canina o pancitopenia tropical canina, importante no slo por su amplia distribucin en el trpico y subtrpico de todo el mundo, sino tambin, por el hallazgo de afectacin de humanos (Prez et al., 2006). E chaffeensis fue inicialmente reportada en infecciones en humanos y posteriormente en caninos, mientras que E. ewingii se encontr en granulocitos de perros enfermos y ms tarde de forma inesperada en muestras de humanos, existiendo hasta el momento evidencia molecular de estos ltimos dos agentes nicamente en Estados Unidos, adems de un reporte de E. ewingii en perros de Camern. Para el diagnstico de la ehrlichiosis se emplean diversas tcnicas laboratoriales como la identificacin de cuerpos de inclusin en frotis sanguneos, el aislamiento primario mediante cultivo celular, la deteccin de anticuerpos, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciacin. La evaluacin microscpica de cuerpos de inclusin en frotis sanguneos resulta una tcnica rpida, sencilla y econmica, sin embargo, aproximadamente slo en un 4% de los casos agudos es posible demostrar la mrula intracitoplasmtica de E. canis (Waner y Harrus, 2000), mientras que para las dems especies no se reporta la eficacia de la prueba.

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En el caso del aislamiento in vitro de Ehrlichia, E. canis y E. chaffeensis han logrado cultivarse en la lnea celular macrfago-monoctica canina DH82, derivada de un caso de histiocitosis maligna canina (Dawson et al., 1991); sin embargo, E. ewingii no ha sido posible de aislar hasta la fecha (Dawson et al., 1996; Dumler et al., 2001). Desventajas importantes del aislamiento en cultivo celular, son la necesidad de experiencia tcnica y perodos prolongados de hasta 34 das para la obtencin de resultados (Waner & Harrus, 2000; Standaert et al., 2000; Iqbal et al., 1994), lo que convierte a esta tcnica en un proceso costoso, laborioso e imprctico para el diagnstico oportuno de la enfermedad. El aislamiento en cultivo celular es considerado, sin embargo, como la prueba de oro para el diagnstico de ehrlichiosis. Las tcnicas serolgicas han sido ampliamente utilizadas en el diagnstico de ehrlichiosis debido a que son pruebas altamente sensibles; sin embargo, presentan la desventaja de que nicamente evidencian un contacto con el agente sin determinar la existencia de la enfermedad o incluso la presencia o ausencia actual del agente en el animal (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al., 1998). Otra desventaja importante en el diagnstico serolgico, es el alto grado de reaccin cruzada existente entre E. canis, E. chaffeensis y E. ewingii (Liddell et al., 2003); que dificulta la diferenciacin entre especies (Waner et al., 2001) y para el caso de E. ewingii, no existen pruebas especficas disponibles, por no haberse logrado an ningn aislamiento del agente en cultivo celular. En relacin a las tcnicas moleculares, diversos estudios han mostrado a la tcnica de PCR como un mtodo efectivo y extremadamente sensible para la deteccin de especies de Ehrlichia, incluyendo a E. ewingii (Ndip et al., 2005). La tcnica de PCR convencional basado en la amplificacin de regiones del gen 16S ARNr de Ehrlichia ha demostrado efectividad en muestras de sangre de humanos y perros, con un lmite de deteccin de 20pg para ADN de E. canis extrado de clulas DH82 infectadas (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996), y se han obtenido an mejores resultados, utilizando una tcnica de PCR tipo anidado, que ha incrementado la sensibilidad de la prueba hasta 0.2 pg de ADN (Wen et al., 1997). Adems, la tcnica de PCR tipo anidado ofrece la ventaja de poder determinar las especies E. canis, E. chaffeensis y E. ewingii utilizando el mismo producto de la primera reaccin. Esta tcnica de PCR anidado, ha demostrado ser til para el diagnstico de ehrlichiosis en distintas partes del mundo como Israel, Espaa, Estados Unidos y Mxico (Aguirre et al., 2004; Hori-Oshima et al., 2006), ya sea para diagnosticar los agentes en muestras de humanos, venados, perros, garrapatas y coyotes (Kocan et al., 2000).
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Otra ventaja es, la capacidad de la prueba para detectar a los agentes an en la fase temprana de la enfermedad y en la fase subclnica, permitiendo determinar animales portadores, incluso cuando no se ha logrado establecer an una respuesta inmune (Standaert et al., 2000), permitiendo iniciar el tratamiento incluso antes de la manifestacin de signos clnicos. Estudios sobre ehrlichiosis en caninos de Nicaragua son bastante escasos. Aspectos epidemiolgicos de relevancia, tales como prevalencia, y especies involucradas son an poco comprendidos. Igualmente, se desconoce si la misma especie de ehrlichia que afecta a los caninos podra estar asociada a procesos febriles en humanos que han sido negativos por diagnstico laboratorial a malaria, dengue, leptospirosis, entre otras. Por lo que el objetivo del presente trabajo es dar a conocer el hallazgo de Ehrlichia canis en perros de la comunidad Rubn Daro del municipio de Len, mediante una evaluacin sangunea, tincin y deteccin serolgica a travs de un test inmunocromatogrfico. Material y Mtodo Tamao y toma de muestra. Un total de 27 muestras sanguneas fueron tomadas aleatoriamente por venopuncin ceflica y perifrica (oreja) en caninos (Canis familiaris). Los perros tenan aptitud de compaa con un estado nutricional regular (desperdicios de cocina) en su mayora, casi todos los canes tenan presencia de ectoparsitos (garrapatas); pero aparentemente no presentaban ningn estado patolgico, ya que tenan un buen estado de alerta. Es importante mencionar que se tuvo el consentimiento de los propietarios para realizar dicho trabajo, tomando en cuenta las buenas prcticas de asepsia y antisepsia a la hora de la toma de muestra por venopuncin, el cualse realiz en casa de habitacin de cada uno de los animales. Las muestras se depositaron en tubos con y sin EDTA y fueron remitidas al Centro Veterinario de Diagnstico e Investigacin (CEVEDI), laboratorio de Biopatologa de la Escuela de Veterinaria, UNAN-LEON. Anlisis de las muestras. A todas las muestras se les realiz Biometra Hemtica Completa (BHC) tomando en cuenta principalmente los valores de Hematocrito, Hemoglobina y niveles de eritrocitos; en el extendido perifrico se valor la presencia de cuerpos de inclusin compatibles con ehrlichia y finalmente a todas las muestras se les realiz una prueba rpida para la deteccin de Ehrlichia canis.
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La BHC se realiz segn el Manual Prctico de Anlisis Clnico en Veterinaria (Marca A., 1992). El frotis de sangre perifrica se ti con Giemsa. Primeramente el extendido es fijado con metanol (100%) dejndose 5 minutos a temperatura ambiente, luego se ti con solucin Giemsa a razn de 3 ml de solucin Giemsa diluido en 8 ml de agua destilada y se dej 15 minutos secndose a temperatura ambiente, finalmente se lav con agua de grifo y se dej secar para posteriormente ser observado al microscopio con un lente de 100X con aceite de inmersin (Marca A., 1992). Para la prueba serolgica se utiliz un kit inmuncromatogrfico canino para la deteccin de anticuerpos contra E. canis de IDEXX Laboratories, se les realiz a las 27 muestras, utilizndose sangre total con anticoagulante o suero y el procedimiento se llev a cabo segn las indicaciones del kit comercial. Resultados y Discusin De un total de 27 muestras de sangre completa con y sin EDTA recolectadas, se encontr un 70% de los animales con valores bajos de hematocrito, un 77,7% tena los niveles de hemoglobina por debajo del parmetro fisiolgico y el 85% de los casos present un conteo eritrocitario bajo de lo normal, tal como se muestra en la tabla 1. En base a los resultados obtenidos en la BHC se muestra una disminucin marcada de los valores hematolgicos (Hematocrito, hemoglobina y Glbulos Rojos) lo que significa que los pacientes caninos en su mayora presentaban sntomas de anemia. Tabla 1. Valores Hematolgicos (Hematocrito, Hemoglobina y Glbulos Rojos) y serologa encontrados en caninos (Canis familiaris) muestreados en la comunidad Rubn Daro, Municipio de Len. Tabla 2. Cantidad y Porcentaje de caninos (Canis familiaris) positivos al test Inmunocromatogrfico.
N C aso Rango fisiolgico 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Hematocrito Hemoglobina Glbulos Rojos Inmunocromatografa 37-55 (%) 30 44 32 36 37 34 30 36 26 38 35 31 39 40 32 30 28 28 22 34 45 29 22 30 26 20 41 12-18,0 (g/ dl) 5,5-8,5 (10 / l) 10 14,6 10,6 12 12,3 11,3 10 12 8,6 12,6 11,6 10,3 13 13,3 10,6 10 9,3 9,3 7,3 11,3 15 9,6 7,3 10 8,6 6,6 13,6 2,62 0,31 2,54 3,12 3,61 0,91 3,25 3,28 1,21 5,7 3,54 5,08 3,15 4,86 2,19 5,77 2,19 6,33 3,19 3,58 3,51 1,01 3,9 1,02 1,75 1,48 3,07
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Tcnica positivos Microscopa 0/ 27 S erologa 17/ 27

Porcentaje 0% 63%

+ + + + + + + + + + + + + + + + +

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De las 27 muestras que se les realiz el frotis del extendido perifrico teidos con Giemsa, ninguno present cuerpos de inclusin dentro de plaquetas ni monocitos compatibles con Ehrlichia; segn trabajos realizados en otras localidades hacen referencia a la sensibilidad baja de la tcnica de tincin, lo que difulta evidenciar hemoparsitos por mtodos convencionales de parasitologa o biopatologa, necesitndose para esto una alta parasitemia en el individuo; as lo confirma tambin estudios realizados en Costa Rica donde han utilizado por mucho tiempo tcnicas microscpicas y que a pesar de ser muy tiles presentan baja sensibilidad (Rmolo, 2006). Cabe mencionar que la muestra de los caninos fueron tomados aleatoriamente sin tomar en cuenta la edad, el sexo y la raza; Sin embargo todos presentaban ectoparsitos (garrapatas) unos en cantidades moderadas y otros en abundancia, esto pudo ser debido a las condiciones de la localidad, ya que es una comunidad donde las calles son de tierra, existen muchos rboles y no hay un buen sistema de alcantarillado (aguas residuales). Finalmente a las 27 muestras que se les realiz el ensayo inmunocromatogrfico un total de 17 (63%) muestras resultaron positivas a la prueba. Esto demuestra que el ensayo serolgico es mucho ms sensible. Es muy importante tomar en cuenta que sta prueba (inmunocromatografica) es de tipo serolgica y por ende puede presentar ciertas limitantes, como la imposibilidad de discernir entre una infeccin inicial, aguda, latente, crnica o pasada, ya que detecta anticuerpos (Iqbal et al., 1994; Dawson et al., 1996; Murphy et al., 1998). Estudios similares han demostrado la presencia de E. canis en perros, como el de Costa Rica, donde se identific a 8 de 30 perros seropositivos mediante serologa SNAP 3X IDEXX (Luis Romero, 2007). Conclusiones La mayora de los animales present valores de hematocrito, hemoglobina y conteo eritrocitario por debajo de los parmetros fisiolgicos. No se observaron cuerpos de inclusin intracitoplasmticos compatibles con erhlichia en trombocitos y monocitos con la tincin de Giemsa. Se detectaron anticuerpos frente a Ehrlichia canis, mediante el test inmunocromatogrfico. Es importante valorar en estudios posteriores la relacin que pueda tener E. canis detectada en el hombre, ya que por ser animales de
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compaa se mantienen en estrecha relacin, as como la presencia de garrapatas, as lo demuestra un estudio realizado en Venezuela donde se detect la presencia en sangre humana del ADN del microorganismo, diagnosticado morfolgicamente como Ehrlichia tromboctica, utilizando la prueba de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), observndose una migracin electrofortica igual a la de Ehrlichia platys, conocido agente de Ehrlichiosis tromboctica canina en el campo veterinario (Tam I, Jordn L, 2002). Bibliografa Anderson BE, Dawson JE, Jones DC, Wilson KH. 1991. Ehrlichia chaffeensis, a new species associated with human ehrlichiosis. J. Clin. Microbiol. 29:2838-2842. Aguirre E; Sainz A; Dunner S; Amusategui I; Lpez L; RodrguesFranco F; Luaces I; Corts O; Tesouro MA. 2004. First isolation and molecular characterization of Ehrlichia canis in Spain. Vet. Parasitol. 125:365-372. Buller RS, Arens M, Hmiel P, Paddock CD, Sumner JW, Rikihisa Y, Unver A, Gaudreault-Keener M, Manian FA, Liddell AM, Schmulewitz N, Storch GA. 1999. Ehrlichia ewingii, a new recognized agent of human ehrlichiosis. N. Engl. J. Med. 341:148-155. Dawson JE, Anderson BE, Fishbein DB, Sanchez JL, Goldsmith CS, Wilson KH, Duntley W. 1991. Isolation and characterization of an Ehrlichia sp. from a patient diagnosed with human ehrlichiosis. J. Clin. Mirobiol. 29:2741-2745. Dawson JE, Biggie KL, Warner CK, Cookson K, Jenkins S, Levine JF, Olson JG. 1996. Polymerase chain reaction evidence of Ehrlichia chaffeensis, an etiologic agent of human ehrlichiosis, in dogs from southeast Virginia. Am. J. Vet. Res. 57:1175-1179. Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, Rikihisa Y, Rurangirwa FR. 2001. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and HE agent as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:2145-2165. Hori-Oshima S, Tinoco GL, Barreras SA, Moro M, Viasco J. 2006. Deteccin de Ehrlichia canis mediante ELISA y PCR en perros de Mexicali, Baja California. In VII Congreso Nacional de Parasitologa Veterinaria. Set. 28 -30. Asociacin Mexicana de Parasitlogos Veterinarios, A.C., Mxico.
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REDVET: 2010, Vol. 11 N 03 Recibido: 09.11.09 Ref. prov. NOV0919B Revisado: 22.12.09 - Aceptado: 28.01.10 Ref. def. 031002_REDVET - Publicado: 01.03.2010 Este artculo est disponible en [Link] concretamente en [Link] REDVET Revista Electrnica de Veterinaria est editada por Veterinaria Organizacin. Se autoriza la difusin y reenvo siempre que enlace con [Link] [Link] y con REDVET - [Link]

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