UNIVERSIDAD NACIONAL DE SANTIAGO DEL ESTERO FACULTAD DE AGRONOMIA Y AGROINDUSTRIAS

Reactividad qumica de flavanonas presentes en ctricos: Su relacin con aplicaciones industriales y nutracuticas

TESIS DOCTORADO REGIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

EVANGELINA A. GONZALEZ
Diciembre 2005. Santiago del Estero. Argentina

Este trabajo fue realizado en el Instituto de Ciencias Qumicas de la Facultad de Agronoma y Agroindustrias de la Universidad Nacional de Santiago del Estero y se presenta para optar por el grado de Doctor en Ciencia y Tecnologa de los Alimentos

Director: Dr. Claudio D. Borsarelli (Universidad Nacional de Santiago del Estero) Co-Director Dra. Mnica A. Nazareno (Universidad Nacional de Santiago del Estero) Comisin de Supervisin de Tesis Dra. Carmen Viturro (Universidad Nacional de Jujuy) Dr. Maria Ins Isla (Universidad Nacional de Tucumn) Dr. Ferdinando Ferretti (Universidad Nacional de San Luis) Dr. Jorge Avanza (Universidad Nacional del Nordeste)

El trabajo ayuda siempre, puesto que trabajar no es realizar lo que uno imaginaba, sino descubrir lo que uno tiene dentro
Boris Leonidovich Pasternak 1890-1960

A mi madr e A Agustina, Gastn y Ariel

Agradecimientos
A todos los que de una manera u otra realizaron un aporte a este trabajo de tesis, gracias por haberme alentado, escuchado, ayudado. - A Ariel, Agu y Gastn, por ser la alegra y el motor de mi vida. - A mi madre y mis hermanas por el amor y el apoyo que siempre me brindan. - A Juana, Hctor, Nora, Diego, Fede y Edgar que me hicieron un lugar en su casa cuando necesite un lugar tranquilo para trabajar. - Al Dr. Claudio Borsarelli por la dedicacin brindada a mi formacin cientfica. - A la Dra. Mnica Nazareno por haberme alentado y apoyado constantemente en todos los mbitos de la vida, por ser mi amiga por sobre todo y por su mayor logro: que me guste la Qumica Orgnica!! - A la Dra. Beatriz Lpez de Mishima por su total predisposicin y colaboracin con esta etapa de mi vida. - A la Dra. Maria Ins Snchez de Pinto y el Bqco Roberto Umbides, mi equipo ctedra por su comprensin y apoyo constante todas las veces que lo necesite. - A mis compaeros del Instituto de Ciencias Qumicas y el Departamento de Ciencias Bsicas de la Facultad de Agronoma y Agroindustrias: Gisela, Mariana, Vernica, Titina, Lucrecia, Valeria, Fernanda, Karina , Hctor, Manuel y Eduardo gracias por su amistad, paciencia y apoyo constante. - A la Ing. Judith Ochoa por su asesoramiento en el rea de la industria citrcola. - Al Dr Paulo Bobbio por habernos cedido su Naringina Dihidrochalcona. - Al Dr Hctor Ferretti y la Dra. Sonia Blanco dos profesionales excelentes pero por sobre todo dos personas maravillosas, siempre dispuestos y amables. - A la Dra Carmen Viturro, por sus continuas palabras de aliento. - A los integrantes de la Comisin de Supervisin de este trabajo, Dra. Carmen Viturro, Dra. Maria Ins Isla, Dr. Hector Ferretti, Dr Jorge Avanza, por los aportes y el tiempo dedicado a la revisin de este trabajo. - A la Facultad de Agronoma y Agroindustrias, a la Universidad Nacional de Santiago del Estero y al CICyT por el apoyo financiero e institucional.

Gracias!! Evangelina

Abreviaturas y Smbolos
AA...........................................................................................................cido Ascrbico AAO...............................................................................................Actividad Antioxidante AAPH......................................................Hidrocloruro de 2,2-azobis(2-amidinopropano) AAR........................................................................................... Actividad Antiradicalaria AH. ........................................................................................................Radical Ascorbilo AH-..... Ion Ascorbato AO.................................................................................................................Antioxidante BiF...............................................................................................................Biflavonoides CAA................................................................................... Codigo Alimentario Argentino [Link] de Compensacin Entalpa-Entropa ChChalcona CoAO....................................................................................................... Coantioxidante DA ...Dehidroascorbato DHA.............................................................................................Acido Dehidroascrbico DhCh...................................................................................................... Dihidrochalcona DPPH........................................................................................ 2,2-Difenil Picril Hidrazilo [Link] estacionario F.....................................................................................................................Flavonoides Fl ..Flavanona FlO.........Radical Fenoxilo H..Hesperidina HCh..Hesperidina Chalcona HPLC..............................................................Cromatografa Lquida de Alta Resolucin LOX.................................................................................................Enzima Lipoxigenasa N........................................................................................................................Naringina NaOAc...................................................................................................Acetato de Sodio NCh......Naringina Chalcona NDhCh.........Naringina Dihidrochalcona NH............................................................................................................Neohesperidina NHDhCh....................................................................... Neohesperidina Dihidrochalcona O2(1g) Oxgeno Singulete ORAC......Capacidad de Absorcin de Radical Oxgeno REA....................................................................................Relacin Estructura-Actividad RNS................................................................................. Especie Reactiva de Nitrgeno ROS...................................................................................Especie Reactiva de Oxgeno T..................................................................................................Temperatura [Link] Antioxidante Equivalente de Trolox TLC.............................................................................. Cromatografa en Placa Delgada TOH.............................................................................................. Tocoferol (Vitamina E) Vit. C............................................................................................................... Vitamina C

ndice
INTRODUCCION GENERAL BIBLIOGRAFIA CAPITULO 1. FLAVONOIDES: ASPECTOS GENERALES 1.1- Introduccin 1.2- Propiedades Fisicas 1.3- Mtodos de Anlisis: Espectroscopa UV-Vis de Flavonoides Reactivos de reconocimiento de grupos funcionales Acetato de Sodio (NaOAc) Acetato de Sodio/cido Brico (NaOAc/H3BO3) Cloruro de Aluminio (AlCl3) Cloruro de Aluminio/Acido Clorhdrico (AlCl3/HCl) Metxido de Sodio (NaOMe) 1.4- Biosntesis 1.5- Distribucin y Estado Natural 1.5.1- Fuentes de Flavonoides 1.5.2- Flavonoides en Ctricos 1.6- Ingesta de Flavonoides 1.6.1- Biodisponibilidad de los Flavonoides 1.7- Flavonoides ctricos con aplicaciones industriales 1.7.1- Situacin de la Industria Citrcola Argentina 1.8- Flavonoides ctricos con Aplicaciones Nutracuticas Actividad antiinflamatoria, antialrgica y analgsica. Efectos sobre enfermedades cardiovasculares Efectos sobre enfermedades coronarias Propiedades anticarcinognicas BIBLIOGRAFIA CAPITULO 2. EQUILIBRIO DE ISOMERIZACION CHALCONA-FLAVANONA 2.1- Introduccin 2.2- Efecto de los sustituyentes sobre la reaccin de ciclizacin de chalconas 2.3- Efecto de los sustituyentes sobre la reaccin de apertura de flavanonas 23 23 24 27 i iv 1 1 3 3 5 5 5 5 5 5 7 8 9 10 11 12 14 15 16 18 17 18 17 20

2.4- Mecanismos de reaccin propuestos 2.5- Efecto del pH sobre la reaccin de isomerizacin 2.6- Conformaciones de las chalconas 2.7- Hidrogenacin de chalconas: dihidrochalconas BIBLIOGRAFA CAPITULO 3. PROPIEDADES ANTIOXIDANTES DE LOS FLAVONOIDES 3.1- Introduccin 3.2 - Oxidacin de lpidos en alimentos 3.3- Mecanismo de la oxidacin de lpidos Iniciacin Propagacin Terminacin 3.4- Factores que inducen estados prooxidantes 3.4.1-Oxgeno Anin Superxido Perxido de Hidrgeno Radical Hidroxilo 3.4.2- Calor 3.4.3- Fotosensibilizacin 3.4.3- Lipoxigenasas 3.4.4- Metales: Hierro y Cobre 3.5- Antioxidantes 3.5.1 Clasificacin de los antioxidantes AO tipo I AO tipo II 3.5.2. Sinergismo entre antioxidantes: co-antioxidantes (CoAO) 3.6- Mtodos de determinacin de la AAO y formas de expresarla Concentracin Eficiente (EC50) Parmetro Antioxidante de Captura de Radicales Total (TRAP) Actividad Antioxidante Equivalente de Trolox Capacidad de Absorcion de Radicales Oxigeno 3.7- Antioxidantes en alimentos 3.7.1- Antioxidantes permitidos por el Cdigo Alimentario Argentino 3.8- Antioxidantes naturales 3.9- Flavonoides como antioxidantes alimentarios naturales 3.9.1- Accin antioxidante in vitro 3.9.2- Influencia de la estructura sobre la Actividad AO de Flavonoides [Link]- Relacin estructura-actividad de los Flavonoides Grupos Hidroxilos La o- metilacin El doble enlace C-2,3 y la funcin 4-oxo

28 30 30 31 35

37 37 37 38 38 39 39 40 40 42 42 42 43 43 44 45 46 47 47 48 49 50 51 53 53 53 53 54 54 54 56 57 57 59 61 61

Glicosilacin 3.10- Interaccin Flavonoides y cido ascrbico 3.11- Actividad prooxidante de los Flavonoides 3.12- Accin Antioxidante in vivo de Flavonoides BIBLIOGRAFA CAPITULO 4. ESTUDIO CINETICO DEL EFECTO DEL SOLVENTE SOBRE EL EQUILIBRIO FLAVANONA-CHALCONA 4.1-Introduccin 4.2- Espectroscopia UV-Vis de flavanonas y chalconas 4.3- Efecto del agregado de NaOH sobre los espectros UV-Vis de Naringina y Hesperidina. 4.4- Anlisis cintico y termodinmico del equilibrio de isomerizacin flavanona-chalcona 4.5- Conclusiones BIBLIOGRAFA CAPITULO 5. ESTUDIO DEL EFECTO DE LA LUZ SOBRE EL EQUILIBRIO FLAVANONA-CHALCONA DE NARINGINA 5.1-Introduccin 5.2- Efecto de la luz sobre soluciones cidas y neutras 5.2.1- Soluciones acuosas cidas 5.2.2- Soluciones etanlicas neutras 5.2.3- Efecto de la temperatura para las reacciones en medio cido y neutro [Link] de cierre de NCh 5.3.1- Soluciones acuosas bsicas 5.3.2-Soluciones etanlicas bsicas 5.3.3- Mecanismo de reaccin de NCh en medio bsico con irradiacin 5.4-Conclusiones BIBLIOGRAFA CAPITULO 6. DETERMINACION DE LAS PROPIEDADES ANTIOXIDANTES DE FLAVANONAS Y SUS DERIVADOS 6.1- Introduccin 6.2- Fundamentos de las metodologas 6.2.1- Determinacin de la capacidad Antirradicalaria por el ensayo de decoloracin del radical libre estable 2,2-Difenil-1-Picrilhidracilo. (DPPH) 6.2.2- Determinacin de la capacidad Antioxidante por el sistema -caroteno- cido linoleico 6.3- Resultados y Discusin 6.3.1- Determinacin de la AAR de flavanonas y sus derivados 6.3.2- Determinacin de la AAO de flavanonas y sus derivados Fl en medio cido y neutro 5.3- Efecto de la luz sobre soluciones bsicas

62 62 64 66 68

71 71 72 74 77 88 89

91 91 92 92 92 93 95 96 96 100 101 105 107

109 109 110 110 111 112 112 115

6.3.3- Comparacin de la AAO y AAR de los Flavonoides 6.3.4- Determinacin de la AAR de combinaciones F-AA por el mtodo de decoloracin del DPPH 6.3.5- Determinacin de la capacidad antirradicalaria de jugos ctricos naturales. 6.4- Conclusiones BIBLIOGRAFIA CAPITULO 7. OBTENCION DE DIHIDROCHALCONA DE NARINGINA 7.1- Introduccin 7.2- Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina por hidrogenacin cataltica 7.3- Reaccin de obtencin de NDhCh por hidrogenacin cataltica BIBLIOGRAFIA CAPITULO 8. MATERIALES Y METODOS MATERIALES Y METODOS 8.1.- REACTIVOS Y SOLVENTES 8.1.1- Flavonoides [Link].- Obtencin de Chalcona de Naringina (NCh) 8.1.2- Reactivos de uso general 8.1.3-Reactivos especficos 8.2- METODOLOGIA e INSTRUMENTAL 8.2.1- Equipamiento utilizado 8.2.2-METODOLOGIAS CAPITULO 4: Efecto de la composicin del solvente sobre el equilibrio flavanona-chalcona de Naringina CAPITULO 5: Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Flavanona- Chalcona de Naringina CAPITULO 6. Determinacin de las propiedades AO de los Flavonoides Determinacin de la AAR de Flavonoides Determinacin de la AAO por el mtodo del -caroteno Determinacin de la AAR de combinaciones de AA con Flavonoides Determinacin de la AAR de jugos ctricos naturales CAPITULO 7. Obtencin de Dinidrochalcona de Naringina (NDhCh) BIBLIOGRAFA CAPITULO 9. CONCLUSIONES GENERALES

118 118 124 126 128 129 129 133 133 136 137 137 137 137 137 138 138 138 138 139 139 140 140 140 140 141 142 142 143 145

Introduccin General

ntroduccin eneral
Los flavonoides son un gran grupo de compuestos polifenlicos presentes en numerosas especies del reino vegetal. Estructuralmente, consisten en dos anillos aromticos unidos a travs de una cadena de tres tomos de carbono pudiendo en algunos casos formar un tercer anillo heterocclico. Los diferentes patrones de sustitucin, en general hidroxilaciones y metilaciones, originan subgrupos o familias entre las que se encuentran los flavonoles, flavanonas, flavonas, chalconas, etc. En los ltimos tiempos estos compuestos han despertado el inters de numerosos investigadores debido a que se ha comprobado que ejercen numerosos efectos benficos para la salud, entre los que se pueden citar propiedades anticarcinognicas y cardioprotectoras, [1], las cuales han sido atribuidas fundamentalmente a sus propiedades antioxidantes. Por otra parte son de gran inters para la industria tanto farmacutica como alimentaria ya que pueden ser utilizados como principios bioactivos en medicamentos, por ejemplo, la flavanona Hesperidina se usa en tratamientos de permeabilidad vascular, Naringina se utiliza como ingrediente en preparados nutracuticos, como antioxidante en formulaciones cosmticas, farmacuticas y de productos alimenticios, como saborizante de bebidas, golosinas, mermeladas y productos de panadera, entre otras, mientras que su dihidrochalcona derivada presenta un sabor dulce por lo que constituyen una alternativa a los edulcorantes utilizados actualmente. Los flavonoides se encuentran ampliamente distribuidos en casi todas las especies del reino vegetal, pero los ctricos son la principal fuente de flavanonas, especialmente glicosiladas, poco frecuentes en otras especies vegetales. Si bien la composicin depende de diversos factores entre los que se pueden citar variedad cultivada,

Introduccin General

factores climticos, caractersticas del suelo, entre otras, en general los ctricos contienen las flavanonas Naringina y su aglicona Naringenina, presentes en variedades amargas como pomelos y naranjas agrias, Hesperidina y Hesperetin, Neoericitrina, Eriodictiol, Narirutina y Neohesperidina y en menor proporcin los flavonoles Kaempferol, Quercetina y Rutina [2]. La mayor concentracin de flavonoides en los frutos ctricos se encuentra localizada en las cscaras, particularmente en el flavedo, ubicado en la parte interna de las mismas. La industrializacin de los ctricos genera toneladas de cscaras como subproductos que, para el caso particular de nuestro pas, son poco aprovechados ya que en algunos casos slo se extraen los aceites esenciales y en otros, las cscaras deshidratadas se comercializan como ingredientes para alimentos para animales. Dada la elevada concentracin de flavonoides en las cscaras, (1.7-2.0% en peso seco en naranjas y pomelos) este subproducto representa una fuente de flavanonas tanto agliconas como glicosiladas con fines de comercializacin. Esta alternativa resulta de gran inters ya que la regin del NOA, (principalmente la provincia de Tucumn) contribuye con el 40% de la produccin nacional de ctricos [3]. La industria citrcola es una actividad que ha tenido un gran crecimiento en los ltimos aos con posibilidades de continuar en expansin, por lo que es de gran importancia la caracterizacin y el aprovechamiento de los subproductos que genera.

De esta manera, la obtencin de flavanonas a partir de los desechos o subproductos de la industria es una alternativa viable, constituyendo un ingreso que se sumara a los ya existentes en la actualidad. Dado el inters en las flavanonas ctricas, ya sea desde el punto de vista alimentario o farmacolgico, es de vital importancia entender los procesos qumicos primarios que gobiernan la estabilidad y funcionalidad de este tipo de molculas, sobre todo teniendo en cuenta lo interesante de su reactividad qumica la cual depende de diversos factores entre los que se encuentran las condiciones de pH, temperatura, luz, etc. Sobre la base de lo expuesto los objetivos de este trabajo de tesis fueron: Estudiar los procesos qumicos que gobiernan la estabilidad y funcionalidad de las flavanonas presentes en ctricos con relacin a sus aplicaciones industriales y nutracuticas. Estudiar las cinticas y mecanismos de reaccin de diversas flavanonas y sus chalconas derivadas presentes en ctricos en funcin de diversos factores fisicoqumicos, especficamente estudiar y entender las etapas cinticas y mecanismos de reaccin por el efecto de variables tales como: temperatura, pH, composicin del medio, luz. Estudiar la capacidad antioxidante y antirradicalaria de las flavanonas presentes en ctricos.

ii

Introduccin General

Optimizar las condiciones para la sntesis del edulcorante Dihidrochalcona de Naringina mediante hidrogenacin cataltica. Este trabajo de tesis se presenta en nueve captulos. En los primeros tres captulos se desarrollan los antecedentes bibliogrficos. El Captulo 1 implica el desarrollo de los aspectos generales de los flavonoides: estructuras, propiedades y distribucin natural, entre otros. El Captulo 2 presenta una revisin acerca del equilibrio de isomerizacin Fl-Ch y el efecto sobre el equilibrio de los sustituyentes, el medio de reaccin, etc. En el Captulo 3 se presentan antecedentes acerca de las propiedades antioxidantes y antirradicalarias de las flavanonas ctricas. Los resultados de esta tesis se presentan en los captulos 4, 5, 6 y 7. En el Captulo 4 se presenta el estudio de las cinticas del equilibrio de isomerizacin Fl-Ch de Naringina y Hesperidina, analizndose el efecto del solvente (EtOH, H2O y sus mezclas), el pH y la temperatura. Debido a que la luz cataliza la formacin de compuestos secundarios sobre la reaccin de equilibrio de N, se estudi el efecto de la misma sobre la reaccin. Se determinaron los parmetros cinticos y se caracteriz el producto de reaccin, Captulo 5. En el Captulo 6 se presentan los resultados obtenidos durante la determinacin de la capacidad

antioxidante y antirradicalaria de las flavanonas ctricas Naringina y Hesperidina, sus agliconas y chalconas y los flavonoles Quercetina y Rutina, emplendose para ello el mtodo de decoloracin de -caroteno por cooxidacin con cido linoleico y el mtodo del consumo del radical libre DPPH (2,2-difenil picril hidracilo). En el Captulo 7 se obtuvo la dihidrochalcona derivada de Naringina mediante hidrogenacin cataltica de la forma chalcona. El Captulo 8 describe los diferentes materiales y mtodos utilizados en el presente trabajo de tesis y en el Captulo 9 se presentan las conclusiones generales obtenidas durante el presente trabajo.

iii

Introduccin General

Bibliografa
[1] Skibola, C. F.; Smith, M. Potential health impacts of excessive flavonoid intake. Free Rad. Biol. Med. 29.3-4. 375-383. 2000. Benavente-Garca, O.; Castillo, J.; Marin, F.; Ortuo, A.; Del Ro, J. Uses and Properties of Citrus Flavonoids. J. Agric. Food Chem.. 45. 12. 4505- 4515. 1997. Garca, M. A. Situacin de la Citricultura del Noroeste Argentino. Disertacin. Centro Regional Noroeste Argentino. EEA. Famailla. INTA. Tucumn. 2001

[2]

[3]

iv

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Flavonoides: Aspectos Generales

1.1-INTRODUCCIN En 1936, Rusznyak y col [1], informaron que los extractos crudos de jugo de limn o pimienta roja eran ms eficientes que el cido Ascrbico, AA, en aliviar lesiones capilares, mantener sanos los conductos sanguneos y regular la permeabilidad capilar. Al principio activo de este extracto lo denominaron tentativamente vitamina P por vitamina de la permeabilidad y tambin vitamina C2, porque se comprob que algunos flavonoides, F, tenan propiedades similares a la vitamina C [2]. Posteriormente se demostr que este principio, al cual tambin se denomin citrina, corresponda a una mezcla de los F; Hesperidina y Eriodictina. A pesar de haberse reportado que estas sustancias pueden modificar la permeabilidad de las membranas y presentar otros efectos biolgicos, no son nutrientes esenciales por lo que en el ao 1950 se recomend discontinuar con el nombre de vitamina P y se acord denominarlos Flavonoides, tal como se los conoce actualmente. Los F comprenden varias clases de sustancias naturales de gran importancia para las plantas, ya que cumplen diversas funciones entre las que se pueden citar su accin como atrayentes de animales en la oviposicin, especialmente aquellos que confieren color como las antocianinas; son agentes protectores contra la luz UV o contra la infeccin por organismos fitopatgenos y tambin son de vital importancia para la salud humana, especialmente por sus propiedades antioxidantes [3]. Estructuralmente los F consisten en dos anillos aromticos (A y B) unidos a travs de una cadena de tres tomos de carbono que puede formar un tercer anillo denominado C. Generalmente se denominan como compuestos C6C3C6. Las diferentes clases de F difieren en el nivel de oxidacin y del patrn de sustitucin del anillo C.

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

3'

B A
7 6

2' 8 9

4'

1' 2 3

B
6'

5'

O OH O Flavonoles

A
5 10

C
4

O Flavonas

O OH

O
3 4 5 6

Isoflavonas
3'

Flavanonas
2 1 2' 6'

Dihidroflavonoles
+

4' 5'

O Auronas

O Chalconas

Antocianidinas

O OH

Catequinas

Pterocarpanos

Rotenoides

Figura 1. 1: Estructuras bsicas y sistemas de numeracin de las diferentes clases de F.

Para su estudio sistemtico, los ms de 4000 F identificados en la actualidad se han clasificado en varias clases de acuerdo a las variantes estructurales que presentan en la cadena central [4]. De acuerdo con esto, los F se dividen en varios grupos o familias: flavonas, flavonoles, isoflavonas, flavanonas, dihidroflavonoles, auronas, chalconas antocianidinas, catequinas, pterocarpanos, rotenoides, etc [5]. En la Figura 1.1 se muestran las estructuras bsicas de las diferentes familias de F, junto al sistema de numeracin. En general, los anillos aromticos se denominan con las letras

A y B, mientras que al heterociclo se lo denomina anillo C. La mayora de los F poseen nombres triviales terminados en -INA u OL. Estos nombres les han sido asignados por los investigadores que los han descubierto, por ejemplo, Quercetina es un flavonol identificado inicialmente en una planta del gnero Quercus. Naringenina es una flavanona aislada inicialmente en naranjas. Sin embargo, dado que esta clase de nombres no es muy til cuando se requiere informacin sistemtica de estas sustancias se ha convenido en

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

llamarlos con nombres que representen su estructura qumica. As por ejemplo, Quercetina corresponde al 5,7,3,4tetrahidroxiflavonol y Naringenina es la 5,7,4-trihidroxiflavanona, etc. Los F naturales suelen presentar al menos tres hidroxilos fenlicos y se encuentran generalmente combinados con azcares en forma de glicsidos denominndose consecuentemente GLICOSIDOS, mientras que los F libres se denominan AGLICONAS. En cuanto a la posicin de los sustituyentes, para los grupos hidroxilos la mayora de estos compuestos muestra una estructura tipo resorcinol, es decir sustitucin en C-5 y C-7, en el anillo A, mientras que la glicosilacin es ms frecuente en C-7 para flavonas, isoflavonas y flavanonas, y en C-3 y C-7 para flavonoles y dihidroflavonoles. 1.2- PROPIEDADES FSICAS Las propiedades fsicas de los F dependen de la clase a la que pertenece y de la forma en que se presentan, ya sea aglicona o glicsido. Por ejemplo, las antocianidinas, de acuerdo a su patrn de sustitucin, son de colores rojo intenso, morado, violeta y azul. Las flavanonas y dihidroflavonoles debido a la quiralidad del C-2 presentan el fenmeno de actividad ptica. Por otra parte, los glicsidos son, en general slidos amorfos que se funden con descomposicin, mientras que las agliconas y los F altamente hidroxilados son cristalinos [5]. La solubilidad depende del nmero y clase de sustituyentes presentes. Los glicsidos, las 3

antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua y alcoholes tales como etanol, metanol y n-butanol, mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes menos polares como ter etlico, acetato de etilo y acetona. Las agliconas altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como el ter de petrleo y cloroformo. Por otra parte, los F con hidroxilos fenlicos son solubles en soluciones alcalinas, pero algunos altamente hidroxilados se descomponen por accin de bases fuertes, un hecho que permite reconocerlos y diferenciarlos de otros, y que desde hace aos se utiliza para su elucidacin estructural. En la Tabla 1.1 se muestran los F ms representativos junto a algunas caractersticas sobresalientes. 1.3METODOS DE ANALISIS: ESPECTROSCOPIA UV-VIS DE FLAVONOIDES Si bien los F pueden ser analizados por diferentes tcnicas entre las que se pueden citar: espectroscopia de resonancia magntica (RMN), Cromatografa en papel, Cromatografa en placa delgada (TLC), Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), entre otras, la espectroscopia UV-Vis es una de las principales herramientas utilizadas para el anlisis de F El espectro de la mayora de los F consiste en dos mximos de absorcin, uno en el rango de 240-285 nm (Banda II) y el otro en el rango de 300-400 nm (Banda I) [9].

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Nombre trivial
OH RO O

Nombre IUPAC 4,5-dihidroxiflavanona 7-neohesperidsido

OMe

Azcares Neohesperidsido (ramnosa + glucosa unin 1 2) Rutinsido (ramnosa + glucosa 1 6)

Propiedades Fsicas P.F. 83C SOL: agua (0,001 g/ml a 40C), acetona, alcohol, cido actico caliente [6]. P.F. 258-262C SOL: poco soluble en agua, soluble en formamida, cido actico, muy soluble en soluciones alcalinas [6]. P.F. 95-97C SOL: cido actico glacial, soluciones alcalinas, alcohol [6]. P.F.:125 SOL: 0,125 g/l en agua, soluble en sol alcalinas, alcohol, acetona, acetato de etilo [6].

OH

Naringina
RO O OH

OH

O
OH

4-metoxy -5,3dihidroxiflavanona 7-rutinsido

Hesperidina
HO O OH OH O OH

3,4,5,7-tetrahidroxi flavonol

(Aglicona)

Quercetina
OH HO O OR OH O OH

3,4,5,7tetrahidroxiflavonol 3-rutinsido

Rutinsido (ramnosa + glucosa 1 6)

Rutina
OMe RO OH OH

OH

Neohesperidin dihidrochalcona
OH RO OH

P.F. 156-158C Neohesperidsido 4-metoxy -5,3SOL: agua 0,5 g/l (25c) (ramnosa + dihidroxidihidrochalcona etanol 20,4 g/l a 25C:; glucosa 7- neohesperidsido acetona, lcalis diluidos [7]. union 1 2) Neohesperidsido P.F.170-183C (ramnosa + SOL: agua, alcoholes, cido glucosa actico [8]. unin 1 2)

OH

2,4,6trihidroxichalcona4neohesperidsido

Naringina Chalcona

Tabla 1. 1: Nomenclatura y propiedades fsicas de los F ms representativos

En trminos generales la Banda II puede considerarse originada a partir del anillo A o sistema benzolo y la Banda I se asocia al anillo B o sistema cinamolo. En la Figura 1.2 se muestran los espectros caractersticos de la flavanona N y su chalcona, NCh. En la Tabla 1.2 se muestran las regiones caractersticas del espectro UVVis para las diferentes clases de F. La utilizacin de la espectroscopia UV-Vis para el anlisis de F se encuentra fundamentada por dos razones principales: Se requiere muy poca cantidad de muestra.

Banda II

Banda I

0.4

O C O

Abs

Benzol
0.2

Cinamol

N Ch
0.0 300 400 500 600

(nm)
Figura 1.2: Espectros de absorcin de N y NCh

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Banda II (nm) 250 - 280 250 - 280 250 - 280 245 - 275 275 - 295 230 270 (baja intensidad) 230 270 (baja intensidad) 270 - 280

Banda I (nm) 310 - 350 330 - 360 350 - 385 310 330 (hombro) 300 330 (hombro) 340 - 390 380 - 430 465 - 560

Tipo de Flavonoide Flavonas Flavonoles (3-OH sustituido) Flavonoles (3-OH libre) Isoflavonas Flavanonas y dihidroflavonoles Chalconas Auronas Antocianidinas y antocianinas

Tabla 1. 2: Rangos de absorcin UV-Vis para Flavonoides

La informacin estructural obtenida a partir del espectro UV-Vis es considerablemente mejorada por el uso de reactivos especficos los cuales reaccionan con uno o ms grupos funcionales del ncleo F [9]. La adicin de cada uno de estos reactivos por separado a una solucin alcohlica del F induce corrimientos en el espectro, asociados a los patrones estructurales. Algunos de estos reactivos de reconocimiento de grupos funcionales son: Metxido de sodio (NaOMe): por ser una base fuerte, ioniza todos los grupos hidroxilos del ncleo del F. A mayor nmero de hidroxilos, mayor corrimiento batocrmico de las bandas del espectro. Acetato de sodio (NaOAc): al ser una base ms dbil que el NaOMe ioniza slo el hidroxilo fenlico ms cido. Acetato de sodio / cido brico (NaOAc/H3BO3): esta mezcla se utiliza para la deteccin de grupos hidroxilos en posicin orto, por formacin de

O B OH O O

OH

O
Figura: 1.3: Complejo formado entre cido brico y F.

quelatos, tal como se puede ver en la Figura 1.3. Cloruro de aluminio (AlCl3): este reactivo acompleja grupos funcionales tales como grupos hidroxilos en posicin orto e hidroxilos en posicin 5 y 3 los cuales se encuentran a ambos lados de la funcin ceto, con los cuales forma complejos estables en medio cido Cloruro de aluminio / cido clorhdrico (AlCl3/HCl): en presencia de cido clorhdrico acuoso, los complejos formados con los grupos en posicin orto se descomponen a diferencia de los formados por los grupos hidroxilos en posicin 3 y/o 5, Figura 1.4.

Captulo 1
OH OH
HO

Flavonoides: Aspectos Generales

O Al + O
HO

OH OH
HO

AlCl3
OH

HCl(ac)
O

O Al 2+

O Al 2+

Figura 1.4: Reacciones involucradas con AlCl3/HCl

Reactivo

Flavonas y Flavonoles - 4-OH: provoca +40 - 65 nm en Banda I con incremento en intensidad - 3-OH sin 4-OH: +50-60 nm sin incremento intensidad - Glicosilacin en C-7: ausencia Banda a 320330 nm. - 3,4 y/o 3,3,4-OH: Bandas que disminuyen con el tiempo -7-OH: +5-20 nm Banda II (reducido en presencia de oxigenacin en C-6 u 8).

Isoflavonas, Flavanonas y dihidroflavonoles - 5,6,7 y 5,7,8 triOH: degeneracin del espectro con el tiempo - 5,7-OH: +35-40 nm de Banda II con incremento de intensidad. - Corrimiento de BI a 400 nm: isomerizacin Fl-Ch. -7-OH (c/5-OH): +35 nm Banda II -7-OH (s/5-OH): +60 nm Banda II -Grupos sensibles a los lcalis ( 6,7 o 7,8 diOH): disminucin de la intensidad con el tiempo. - o-diOH anillo A (6,7 7,8): +10-15 nm. Banda II

Chalconas y Auronas

NaOMe

- 4-OH: +60-100 nm Banda I con aumento intensidad 2 4-OH: +60-100 nm Banda I sin aumento intensidad

NaAc

- 4 y/o 4-OH: corrimiento de Banda I con aparicin de hombro

NaAc/ H3BO3

AlCl3 y AlCl3/ HCl

- o-diOH anillo B: +1236 nm Banda I - o-diOH anillo A: pequeo corrimiento batocrmico. Banda I -5-OH: +35-55 nm Banda I -5-OH con 6oxigenacin: +17-20 nm. Banda I -3-OH: +50 -60 nm Banda I -o-diOH anillo B : +3040 nm Banda I -o-diOH anillo A (aditivo a o-diOH anillo B): +2025 nm Banda I

dem a flavonas flavonoles.

- 5-OH (isoflavonas): +10-14 nm Banda II - 5-OH (flavanonas, dihidroflavonoles): +2026 nm Banda II

-2-OH: +48-64 nm Banda I - 2-OH (con oxigenacin en C-3): +40 nm Banda I - o-diOH anillo B: +4070 nm. Banda I - Pequeo incremento Banda I: posiblemente odiOH anillo A

Tabla 1. 3: Interpretacin de los cambios espectrales observados frente a la adicin de reactivos de reconocimiento [9].

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

La interpretacin de los espectros obtenidos adicionando cada uno de los reactivos descriptos anteriormente ofrece una informacin muy completa acerca de la estructura de los F. En la Tabla 1.3 se muestran los corrimientos espectrales frente a los reactivos de reconocimiento para algunas familias de F.
Fenilalanina
HO OH OH

1.4- BIOSNTESIS La Figura 1.5 muestra las reacciones de biosntesis de los F. Los F se sintetizan en las plantas y participan en la fase dependiente de luz de la fotosntesis, durante la cual catalizan el transporte de electrones.[2]

OH

4-Cumaril-CoA
O O OH

3x MalonilCoA CHS
OH OH

HO

Retrochalcona

HO

HO

R1

Flavona
R1 O

FSI

R1

Flavona
OH
FSII

Chalcona CHI
OH HO O
2

HO

HO

HO

IFS
OH OH O R1 O

2-HIS, 2HID
R1 O

IOMT
R1 OH O
4'

Flavonol

F3-H
OH HO O

Flavanona

Isoflavona
OH
3' 4'

Formononetina (R1=H) I2'H

OMe

OH

F3'-5'H

HO

5'

OH

HO

OH OH O OH OH HO O HO O

OH

Dihidroflavonol

F3'H

OH OH

O R1 O HO OMe

OH

IFR

Reductasa
OH OH OH OH O OH

(R2)

HO

R1

DFR Reductasa
OH OH HO O HO OH OH O OH OH

HO

OMe

2'-hidroxi isoflavanona VR DMID

(R2) OH

HO

Reductasa
OH OH

Epicatequina
Polimerizacion

Leucocianidina (R2=H)

R1

ANS 3GT
O

OMe

OH OH

Medicarpina (Pterocarpano)

Taninos condensados

HO

+
OGlc OH

(R2)

Cianidin 3-glucsido (R2=H) (Antocianina)

Figura 1. 5: biosntesis de las principales clases de F. Las enzimas son: CHS, CHR ,CHI chalcona sintetasa, reductasa, isomerasa respectivamente. FSI, FSII: flavona sintetasa I y II respectivamente. FLS: flavonol sintetasa, IFS: isoflavona sintetasa, F3-H: flavanona 3- hidroxilasa, F39H, F3959 flavonoide 39 y 39-59-hidroxilasa respectivamente, DFR: dihidroflavonol reductasa, ANS, 3GT: antocianidina sintetasa y 3-glucosiltransferasa respectivamente, IOMT, IFR: isoflavona o-metil transferasa y reductasa respectivamente, entre otras [10]

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Los F se forman por la combinacin de derivados sintetizados a partir de fenilalanina (va cido shikmico) y cido actico, Figura 1.5. El primer paso implica la formacin de fenilalanina a partir de fenilpiruvato. La fenilalanina se transforma a cido trans-cinmico, el cual es hidrolizado a cido p-cumrico. El cido p-cumrico se condensa con tres unidades de malonilCoA para formar chalcona de 15 tomos de C. Subsecuentemente el cierre del anillo y la hidratacin originan compuestos tales como catequinas y flavonoles [10]. Los F comnmente se acumulan en las clulas epidrmicas de los rganos de las plantas tales como flores, hojas, tallos, races, semillas y frutos. Los F glicosilados se encuentran comnmente en regiones hidroflicas, tales como vacuolas y apoplastos, algunos tambin han sido encontrados en cloroplastos y etioplastos. Las agliconas por su parte se localizan en regiones hidrfobicas tales como las glndulas lipoflicas [11].

1.5-DISTRIBUCIN NATURAL.

ESTADO

La estructura base de los F puede sufrir varias modificaciones entre las cuales se puede citar: sustitucin por grupos hidroxilos, metilacin de dichos grupos, dimerizacin (biF), formacin de bisulfatos y glicosilacin. Los glicsidos suelen ser de dos tipos: los unidos a travs de tomos de oxgeno (enlace hemiacetal), es decir o -glicsidos o con los azcares ligados a travs de enlaces C-C, o c-glicsidos. (Figura 1.6) La glicosilacin en general implica una disminucin de la reactividad y un aumento en la solubilidad acuosa. Aunque todos los grupos hidroxilos del esqueleto flavonlico pueden glicosilarse, la hidrlisis en algunas posiciones es ms probable que en otras; ejemplo de sto es el grupo 7-OH en flavonas y los grupos 3-OH y 7-OH en flavonoles y dihidroflavonoles. El azcar que generalmente est presente en los N es la glucosa, aunque tambin se puede encontrar galactosa, ramnosa, xilosa y el disacrido rutinosa.

HO OH CH2OH HO HO O O HO OH O O OH CH2OH

OH O

HO

OH

Figura 1.6: Ejemplos de Flavonoides O- y C-glicosilados. Izq: Apigenina 7-O- -D-glicopiranosa. Der: Apigenina 8-C- -D-glicopiranosa

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

1.5.1- FUENTES DE FLAVONOIDES Los F estn ampliamente distribuidos en el reino vegetal, existiendo en todas las familias de plantas y se encuentran en considerables cantidades en frutas, vegetales, granos, bebidas cola, t, caf, cacao, cerveza, vino tinto. Son consumidos en la dieta humana en forma natural y tambin en forma de suplementos nutricionales, junto con ciertas vitaminas y minerales como as tambin en extractos de ciertas plantas como arndano, gingko biloba y cardo, entre otros que se expenden comercialmente. El vino tiene un alto contenido de compuestos polifenlicos, estimados en unos 500, los cuales provienen de las uvas y del proceso fermentativo. En la uva estas molculas se localizan en la piel, especialmente en las clulas epidrmicas, y en las pepitas.
Flavonoides CATEQUINAS Epicatequinas Catequizas Epigalocatequinas Galatos de Epicatequinas Galato de Epigalocatequinas FLAVANONAS Naringina Hesperidina Taxifolin FLAVONOLES Kaempferol Quercetina Miricetina FLAVONAS Crisina Apigenina ANTOCIANINAS Malvinidina Cianidina Fuentes

Su cantidad y tipo dependen de la variedad del clima, de las caractersticas del suelo y las prcticas del cultivo [12]. En cuanto a la ingesta, los F son los polifenoles ms abundantes en nuestra dieta. La principal fuente de isoflavonas es la soja, la cual contiene mayoritariamente genisteina. Esta familia de F ha recibido una considerable atencin debido a sus propiedades estrognicas y su posible rol en la prevencin de ciertos tipos de cncer y osteoporosis. Los frutos ctricos son la principal fuente de flavanonas, entre las que se destaca Hesperidina, una de las mayoritarias en la dieta debido al alto consumo de naranjas dulces, (125-250 mg/l de jugo). Otros tipos de F son comunes en varias fuentes alimentaras. Quercetina, el principal F de nuestra dieta, est presente en muchas frutas y vegetales y en ciertas bebidas.

T verde y negro Vino tinto

Piel de ctricos Frutos ctricos

Endivias, brcoli, pomelos, t negro Cebollas, lechuga, brcoli, manzanas con piel, aceitunas, t, vino tinto. Vino tinto, uvas. Piel de frutos apio, perejil, Uvas negras, vino tinto Cerezas. Frambuesas, uvas.

Tabla 1.4: Fuentes Naturales de F.

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Es particularmente abundante en cebollas (0.3 mg/g peso fresco) y t (1025 mg/L), el cual representa la principal fuente de flavonoles. Las flavonas son menos comunes y se han encontrado en pimienta roja por ejemplo luteolina. Las catequinas son abundantes en el t. Una infusin de t verde contiene 1g/l de catequina. En t negro, su contenido se reduce a la mitad de su valor debido a la oxidacin junto con polifenoles ms complejos durante la fermentacin. Otras fuentes de F, especficamente antocianinas, son el vino tinto (270 mg/l) y chocolate. En la Tabla 1.4 se describen las principales fuentes de F en alimentos. 1.5.2- FLAVONOIDES EN CTRICOS En trminos de la composicin de F, los ctricos son excepcionales ya que se han detectado en ellos, algunos F que no existen en ninguna otra especie, por ejemplo flavonas polimetoxiladas (nobiletina y tangeretina) de gran inters por sus propiedades farmacolgicas [15] y flavanonas, sustancias minoritarias en otras especies del reino vegetal. Dentro de las flavanonas, otro hecho interesante es que, a diferencia de
Flavanonas Eriocitrina Erodictiol Hesperidina Hesperetina Naringina Naringenina Narirutina Neohesperidina Neoeriocitrina 5 -OH -OH -OH -OH -OH -OH -OH -OH -OH 7 -O-Rut -OH -O-Rut -OH -O-Neo -OH -O-Rut -O-Neo -O-Neo

lo informado para otras plantas, las flavanonas ctricas existen usualmente como glicsidos. La glicosilacin generalmente ocurre en posicin C-7 por rutinosa o neohesperidosa, disacridos formados por una unidad de glucosa y una de ramnosa, que difieren solamente en el tipo de unin: 16 o 12 respectivamente. El punto de unin de ramnosa y glucosa en el disacrido es determinante para el sabor del compuesto [13]. En general, las flavanonas rutinsidos carecen de sabor mientras que flavanonas neohesperidsido presentan sabor amargo. Para el caso particular de N, Horowitz y Gentili [13], plantean que su sabor es alrededor de 1/5 del sabor amargo de quinina. El perfil de las flavanonas en los ctricos ha formado la base para la clasificacin quimiotaxonmica de los mismos. El cultivo ctrico ms comercial, naranjas dulces, contiene solamente los F rutinsidos sin sabor mientras que las naranjas amargas contienen solamente flavanonas neohesperidsido. El pomelo es considerado un hbrido debido a que contiene flavanonas rutinsidos y neohesperidsidos. Tres flavanonas agliconas son comunes en ctricos: Naringenina,
3 -OH -OH -OH -OH -OH -OH 4 -OH -OH -OCH3 -OCH3 -OH -OH -OH -OCH3 -OH

3' 2' 8 7 6 5 4' 5' 2 3 6'

Tabla 1. 5: Nombres y estructura qumica de flavanonas ctricas. (-O-Rut, rutinsido); O-Neo, neohesperidsido)

10

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Erodictiol y Hesperetina. Dentro de las flavanonas glicosiladas entre las ms comunes se encuentran Eriocitrina, Neoerioctrina Hesperidina, Naringina, Narirutina, Neohesperidina, Tabla 1.5. La presencia de N en variedades dulces est muy cuestionada. En general se acepta su ausencia en variedades dulces pero existen en la bibliografa datos acerca de su existencia en dichas variedades [14]. La resolucin de esta controversia es muy importante dado que N se utiliza como marcador quimiotaxonmico para distinguir naranjas dulces de otros cultivos de ctricos [13,14], adems de determinar el sabor amargo de los frutos. Dentro de los ctricos, la mayor concentracin de F existe en la cscara, especialmente en el epicarpio o flavedo, aproximadamente en un 1.7-2.0% en peso seco de cscaras de naranjas y pomelos. Dado que el procesamiento de naranjas para la elaboracin de jugos genera aproximadamente unas 20 tn de cscara por cada 45 tn de fruta [15], este subproducto de la industria citrcola representa un rica fuente de F. La Tabla 1.6 muestra la composicin de F de diferentes tipos de ctricos.

1.6- INGESTA DE FLAVONOIDES Si bien los F no son vitaminas, tanto por los efectos benficos para la salud que otorga su consumo, como por la imposibilidad del organismo humano de producirlos es que merecen ser incorporados al grupo de los nutrientes esenciales. Aunque los hbitos alimenticios son muy diversos en el mundo, el valor medio de ingesta de F se estima como 23 mg/ da, siendo predominantes los flavonoles, especialmente la Quercetina. De los alimentos, el t es una de las fuentes principales de Quercetina, especialmente en Japn y en los pases bajos, el vino tinto lo es en Italia y las cebollas en Estados Unidos y Grecia. La ingesta promedio de flavonoles y flavonas vara entre los 20 y 26 mg/ da. Excede por lo tanto, a la de otras sustancias en la dieta, tales como caroteno (2-3 mg/da) y la vitamina E (710 mg/da) y es aproximadamente un tercio de la vitamina C (70-100 mg/da) [18, 34]. Los F representan por lo tanto una contribucin importante de la dieta humana. Desde el punto de vista de la salud, es ms importante el consumo de ciertas clases de F que la ingesta total de los mismos.

Frutos Limn Pomelo Naranja dulce

ERI 87.718.4 3.11.8 3.60.8

NER 4.11.7 -

Flavanonas Glicsidos (mg/L) NAT H N 6.8 3.3 105.7 70.8 85.1 12.8 154.4 54.0 5.34.0 379.379.7 331.3 185.5 -

NH 7.8 6.5 -

Tabla 1. 6: Composicin de Flavanonas glicsidos en: Limones (C. limonia), Pomelos (C. paradisi white) y naranjas dulces (C. sinesis. Navel). ERI: eriocitrina, NER, neoeriocitrina, NAT: narirutina, H: Hesperidina, N: Naringina, NH, Neohesperidina.[16]

11

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Los hbitos culturales dictaminan la clase de F que se ingieren. Por ejemplo, la soja y los alimentos elaborados a partir de sta son altamente consumidos en Japn, lo que implica una ingesta considerable de isoflavonas. Por otra parte, debido a la costumbre de beber t, las catequinas son consumidas por una gran parte de la poblacin de Holanda. 1.6.1 BIODISPONIBILIDAD DE LOS FLAVONOIDES Las propiedades benficas para la salud de los F dependen de su biodisponibilidad. La absorcin de F por parte del organismo depende de muchos factores tales como el tipo de alimento, la heterogeneidad de la matriz alimentaria, el tipo de azcar, los grupos funcionales del ncleo F, la forma de administracin, el sexo, la poblacin microbiana del colon, entre otros. Es por estos muchos factores, que el mecanismo preciso por el cual los F ejercen sus propiedades benficas o txicas aun no est del todo claro [17]. De acuerdo a lo descrito anteriormente, la estructura qumica de los F determina la velocidad y extensin de la absorcin intestinal y la naturaleza de los metabolitos que circulan en el plasma. La glicosilacin influye en las propiedades qumicas, fsicas y biolgicas de los mismos, entre las que se pueden mencionar la afinidad relativa por una fase acuosa o lipoflica lo cual determina si el compuesto difundir a travs de las membranas biolgicas y la

forma en que ocurre la particin en las clulas. Esto sugiere que la remocin del glicsido es necesaria para que ocurra la difusin a travs de las paredes del intestino delgado, por lo tanto, una vez ingeridos, el primer paso es la separacin de los azcares, transformando los F glicosilados en agliconas. Este proceso se lleva a cabo por enzimas conocidas como glucosidasas entre las que se encuentran la -glucosidasa citoslica (CBG). Es importante destacar que a pesar de las condiciones cidas del estmago la deglicosilacin no enzimtica no ocurre en el organismo humano. La absorcin de F es por lo tanto controlada nicamente por enzimas especficas. Otro aspecto interesante lo constituye la ramnosa, ya que por no ser un sustrato para las glucosidasas humanas, la hidrlisis de F que la contengan ocurre nicamente por accin de la microflora del colon. Luego de la hidrlisis los grupos hidroxilos de las agliconas experimentan reacciones de metilacin, sulfatacin y glucuronidacin. En cada una de estas reacciones actan enzimas especficas por ejemplo para la metilacin estn involucradas catecol-O-metil transferasas (COMT), para la sulfatacin, la fenol sulfotransferasas (SULT) y, finalmente, para la glucuronidacin la UDP glucuronosil transferasa, (UDPGT). Estas reacciones pueden alterar drsticamente las propiedades biolgicas de los metabolitos. Adems de las reacciones descritas, los F en forma de glucurnidos, Figura 1.7, penetran en el

12

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

colon el cual contiene 1012 microorganismos/cm3 y un enorme potencial cataltico e hidroltico. Es aqu donde la microflora cataliza la ruptura de

los F a compuestos ms simples derivados del cido fenilactico y fenilpropinico y otros productos inertes [18].

Metilacin Oxidacin

OH OH
HO

O OH
OH
Cortes

Glucuronidacin Sulfatacin

A
HO O

OH OH
COO

OH OH
H O H H OH

UDPGT OH

O OH OH

OH OH H

OH Epicatequina

Epicatequina-7--D-glucurnido

B
HO O

OH OH HO COOH O-rutinsido OH O HO Acido 3,4-dihidroxifenilactico

Dehidroxilacin

Fisin del anillo Eliminacin de agua dehidroxilacin HO

COOH HO Acido 3-hidroxifenil actico

COOH Acido 3-(3-hidroxifenil)propinico

Figura 1. 7: A) Formacin de glucurnidos para Epicatequina. B) Degradacin de F por accin de microorganismos

13

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

A pesar de que la absorcin intestinal de los F es alta, la concentracin en plasma de algunos F individuales raramente excede 1M despus del consumo de 10-100 mg de compuesto simple. Las medidas de la capacidad antioxidante del plasma sugieren que los compuestos con varios sustituyentes fenlicos estn presentes principalmente en forma de metabolitos an desconocidos, producidos ya sea en tejidos o por la microflora colnica. Los metabolitos que circulan por el plasma, comparado con las agliconas originales, tienen una capacidad reducida para donar hidrgeno y son menos efectivos para desactivar especies reactivas de oxgeno y nitrgeno, ROS y RNS, respectivamente. Por otra parte, la concentracin de los F y sus metabolitos en plasma es muy baja comparada por ejemplo con AA y -TOH. Consecuentemente es improbable que los F ejerzan acciones como AO, sin embargo, las evidencias sugieren que los efectos benficos de los F pueden estar mediados por sus interacciones con protenas especficas actuando como molculas seales, es decir presentan actividad farmacolgica en receptores, enzimas y factores de transcripcin [17 ].

1.7- FLAVONOIDES CITRICOS CON APLICACIONES INDUSTRIALES La industrializacin de los ctricos debe estar relacionada con el aprovechamiento de los subproductos que genera. En la actualidad no se admite una industria que tenga como objetivo simplemente la obtencin de jugo, sino que los subproductos constituyen un valor agregado del proceso en s y es tambin una forma de disposicin de los residuos. Dentro de dichos subproductos, las cscaras son la principal fuente de F, especialmente flavanonas glicosiladas como se describi anteriormente El inters comercial por las flavanonas ctricas es considerable dado las numerosas propiedades que presentan. H, por ejemplo, al afectar la permeabilidad vascular es de gran inters para la farmacologa, N, ha sido adicionada a aceite de palma mostrando un efecto protector hacia la autooxidacin trmica, adems de ser antimutagnica por lo cual se utiliza en la formulacin de cosmticos [19, 20] y, debido a su sabor caracterstico, se utiliza tambin como saborizante de bebidas y golosinas. Adems, tanto N como NH tienen una importante aplicacin industrial dado que pueden ser convertidas, previa transformacin a sus formas isomricas
Poder edulcorante Relativo/ Sacarina 0.4 1.0 20.0

DhCh 1 2 3

R -D-glucosilo -Neohesperidosilo -Neohesperidosilo

R -H -H -OH

R -OH -OH -OCH3

RO

OH

R' R''

OH

Tabla 1.7: Estructura qumica de DhCh [22].

14

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

chalconas, en las correspondientes dihidrochalconas, (DhCh) que poseen una fuerte capacidad endulzante. Horowitz y Gentili [21,22] reportan que las DhCh derivadas de Prurina (1), N (2) y NH (3), (Tabla 1.6), presentan un sabor intensamente dulce siendo 0.4; 1 y 20 veces ms dulce que la sacarina en base molar. La obtencin de un edulcorante a partir de fuentes naturales, tales como cscaras de ctricos en el caso de NDhCh, constituye una alternativa interesante tanto para la industria como para la poblacin con necesidades de dietas restringidas en azcares o de menor poder calrico ya que seran potencialmente menos txicas que las sustancias empleadas actualmente [23]. Al respecto, en Diciembre de 1994 se public en el Diario Oficial de las Comunidad Europea la directiva 94/35/CE autorizando el empleo de NHDhCh en una amplia gama de productos alimenticios entre ellos, yogurt bajas caloras. Se ha demostrado [24] que esta DhCh es inocua en dosis de hasta 500 mg/kg de peso corporal y por da, estable bajo las condiciones normales de uso y 1800 veces ms dulce que el azcar a concentraciones umbrales [25]. Adems de las

propiedades edulcorantes presenta actividad como modulador y modificador del sabor, por lo que tambin se incluy como aditivo alimentario. En nuestro pas el Cdigo Alimentario Argentino (CAA) la incluye, dentro de los edulcorantes permitidos para su uso en alimentos. (Cp. XVIII. Res 1545, 12.09.90) 1.7.1- SITUACION DE LA INDUSTRIA CITRICOLA ARGENTINA Argentina se ubica en el octavo lugar como productor mundial de frutas ctricas con aproximadamente 2.000.000 tn, lo que representa un 2% de la produccin mundial [26]. Estos valores nos dan una idea acerca de la importancia de la citricultura tanto desde el punto de vista econmico como social para nuestro pas. La actividad citrcola argentina se encuentra localizada principalmente en las provincias del NEA (Entre Ros, Corrientes, Misiones) y el NOA (Jujuy, Salta, Tucumn y en menor produccin Santiago del Estero y Catamarca). El resto corresponde a la provincia de Buenos Aires y sur de Santa Fe. (Figura 1.8) En el NOA la Citricultura tiene una gran importancia sobre el producto

SUPERFICIE CITRICOLA ARGENTINA - Ao 2001

Buenos Aires 6% Entre Rios 30% Tucumn 24%

Salta 10%

Jujuy 5% Catamarca+ Santiago del Estero 1%

Corrientes 19%

Misiones 5%

Figura 1.8: Situacin de la citricultura del Noroeste Argentino. (INTA. Famaill. Tucumn. 2002)

15

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

bruto interno. Dentro de las actividades, tanto la exportacin de fruta fresca como la industrializacin en forma de jugos y el aprovechamiento de los subproductos como por ejemplo, aceites esenciales, cscaras junto a parte de la pulpa y eventualmente semillas, indican un firme crecimiento anual. En este marco, la provincia de Santiago del Estero, presenta caractersticas climticas benignas, tales como fuertes insolaciones y grandes amplitudes trmicas, que permite a la fruta ctrica madurar casi 20 das antes que la principal zona de frutas tempranas, Calileua, provincia de Jujuy. Sin embargo, a pesar de esta ventaja, la actividad citrcola provincial se encuentra en un franco descenso causado por la influencia de importantes factores limitantes tales como salinidad, heladas y la falta de una tecnologa apropiada para el manejo de los montes frutales [27]. La industrializacin de frutas ctricas es una actividad que ha tenido en los ltimos aos una llamativa dinmica exportadora y con interesantes posibilidades de continuar en expansin. El procesamiento industrial de los ctricos permite obtener una serie de productos y subproductos que se destinan a diversos usos: Para el consumo humano en Argentina, los jugos son la meta prioritaria de la industrializacin, para naranjas el 80% se destina a concentrados y 20% a cremogenados y son el principal producto de exportacin. Para el consumo animal, como subproducto del proceso de obtencin de jugos ctricos se aprovecha la corteza, membranas, parte de la pulpa y

eventualmente las semillas. Estos se emplean como forraje, destinndose en un 100% al mercado externo, principalmente Dinamarca y Holanda. Para la industria farmacutica de cosmticos y perfumes ya que los aceites esenciales se usan como aromatizantes y saborizantes y de las cscaras deshidratadas se obtienen pectinas. Sin embargo, es una preocupacin de las empresas citrcolas de nuestro pas lograr un mejor aprovechamiento de los desechos de la industria, entre los que se puede citar la obtencin de F cuyas utilidades se describieron anteriormente. Esto ha generado la necesidad de caracterizar estos subproductos y plantear nuevas estrategias para su obtencin, purificacin y utilizacin. En conclusin la obtencin de flavanonas particularmente, a partir de los desechos de esta industria es una alternativa viable de buena rentabilidad econmica y constituira otra fuente de ingreso para la industria de procesamiento de los ctricos [28]. 1.8- FLAVONOIDES CITRICOS CON APLICACIONES NUTRACEUTICAS En los ltimos aos, la evidencia cientfica ha demostrado que los alimentos contienen sustancias fisiolgicamente activas que, al igual que los nutrientes esenciales tales como las vitaminas, son necesarias para una vida saludable. Por su parte, los consumidores, cada vez ms concientes de la

16

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

importancia de llevar una vida saludable, han impulsado una nueva rea de desarrollo en las ciencias de los alimentos y la nutricin: la de los alimentos funcionales y nutracuticos. Los nutracuticos tambin llamados compuestos bioactivos o ingredientes funcionales se definen como aquellos suplementos dietticos que proporcionan una forma concentrada de un agente presumiblemente bioactivo de un alimento, presentado en una matriz no alimenticia y utilizado para incrementar la salud en dosis que exceden aquellas que pudieran ser obtenidas del alimento normal[29]. En Japn, pas pionero en el campo de alimentos funcionales y nutracuticos, se habla de la funcin terciaria de los alimentos (la primaria corresponde a la funcin organolptica y la secundaria a la nutricional) y est asociada al mantenimiento de una salud ptima y la prevencin de enfermedades. Los nutracuticos se han dado a conocer como suplementos alimenticios ya sea en forma de comprimidos o jarabes, y contienen sustancias naturales y/o sintticas. Algunos de estos suplementos estn constituidos directamente por extractos de plantas (hierbas) los cuales se derivan de tradiciones asiticas, como el ginseng, el ginkgo biloba o los extractos de semillas de uva, mientras que otros contienen mezclas de vitaminas y otras sustancias benficas para la salud. Este mercado, valuado en aproximadamente 70 millones de dlares anuales atrajo el inters tanto de la industria de alimentos como de la farmacutica, las cuales han apoyado el desarrollo de investigaciones, as como

tambin la bsqueda y comercializacin de nuevos productos destinados a varios segmentos de la poblacin [30]. Dentro de las sustancias utilizadas en las formulaciones de los nutracuticos se encuentran los F. Estos compuestos son activos en grado variable contra radicales libres, los cuales a su vez estn asociados a un mayor riesgo de contraer enfermedades cardiovasculares, cncer, y otros padecimientos. Particularmente en el caso de los F ctricos, se ha demostrado que exhiben diferentes efectos benficos para la salud entre los que se pueden citar: Propiedades anticarcinognicas: recientemente los F han atrado la atencin al ser considerados como agentes potencialmente importantes contra el cncer. Los resultados de las investigaciones indican que los F pueden actuar en todos los estadios del proceso carcinognico: dao al ADN (paso de iniciacin) atribuida a su capacidad de absorber luz UV actuando como filtros contra la radiacin daina, particularmente importante para el caso de cncer de piel, crecimiento del tumor (o paso de promocin) e invasin (paso proliferativo) [31]. Efectos sobre enfermedades cardiovasculares: Szent-Gyrgy y col en el ao 1938 descubrieron que ciertos F presentan efectos sobre la fragilidad capilar, debido a esto los consideraron inicialmente como vitaminas denominndolos vitamina P por su efecto sobre la fragilidad capilar.

17

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Enfermedad Bronquitis Prevencin Cncer Dolores por lceras Herpes labial Infeccin en odos Hemorroides Roscea Sinusitis

Dosis Aguda: 1 mg vit. C y 500 mg F dos veces al da. Crnica: 1 mg vit. C y 500 mg F una vez al da 1 mg vit. C y 500 mg F dos veces al da. 5001 mg vit. C y 250-500 mg F 3 veces por da hasta cicatrizacin, ms complemento vitamnico 1 mg vit. C y 500 mg F 3 veces al da 1 mg vit. C y 500 mg F 3 veces por dia hasta que la infeccin desaparezca. 1 mg vit C y 500 mg F 3 veces por da 1 mg vit. C y 500650 mg F 2 veces por da 1mg vit. C y 500 mg F 3 veces por da ms complejo vitamnico

Tabla 1.8: Recomendaciones de la firma comercial Whole Foods Market Health acerca de la ingesta de suplementos conteniendo F. Fuente: [Link].

El dao capilar provoca prdida de sangre y plasma junto con tejido seguido por una reaccin inflamatoria. Este proceso puede tratarse con muchas drogas las cuales se basan en F, principalmente derivados de H y Rutina las cuales actan reduciendo la hiperpermeabilidad y el edema. Efectos sobre enfermedades coronarias: Estudios in vitro han demostrado que los F inhiben la oxidacin de lipoprotenas de baja densidad (LDL) y reduce las tendencias trombticas. Es por esto que la ingesta de F ha sido asociada con la disminucin del riesgo de muerte por enfermedades coronarias como as tambin con la incidencia de infarto de miocardio. Los F ctricos ejercen una accin de regulacin sobre la agregacin de eritrocitos y la concentracin (hematocrito), los dos principales factores que afectan la viscosidad de la sangre y el flujo. Actividad antiinflamatoria, antialrgica y analgsica: La accin antiinflamatoria se ha asociado con la capacidad de actuar contra las histaminas y otros mediadores de los 18

procesos inflamatorios como son las prostaglandinas y los leucotrienos [31]. La actividad antialrgica est relacionada con la capacidad de afectar enzimas involucradas en la produccin de sustancias antiinflamatorias, lo que significa que son tiles para el tratamiento de asma, alergias, artritis, etc. Debido a estos efectos benficos para la salud es que los F han sido incluidos dentro de los suplementos dietarios. La forma general en que se presentan para el consumo es combinado con la vitamina C ya que ha sido demostrado que mejoran la absorcin de la misma [32]. En la Tabla 1.7 se da un ejemplo de recomendaciones de la firma comercial Whole Foods Market Health, para suplementos en cpsulas de vitamina C y F. El uso de suplementos debe ser tomado con precaucin. Si bien la ingesta de F en niveles normales presenta los efectos benficos antes mencionados, ingestas elevadas puede evidenciar un rol dual sobre la mutagnesis y carcinognesis.

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Los F pueden actuar como antimutagnicos/promutagnicos y antioxidantes/prooxidantes dependiendo de los niveles consumidos y de las condiciones del organismo que los ingiere. La exposicin a altos niveles de F, ya sea a travs de la dieta y por suplementacin, pueden originar especies reactivas de oxgeno, tales como oxgeno singulete, O2(1g) que daa el ADN. Al respecto existen estudios sobre la generacin de O2(1g) de las formas Fl y Ch de N cuyos rendimientos cunticos de 0.04 y 0.03 respectivamente [33].

Estos efectos se potencian durante el desarrollo fetal, donde hay un rpido crecimiento de clulas con una marcada sensibilidad a la exposicin de fitoqumicos. Todo esto sugiere que la comercializacin indiscriminada de suplementos ricos en F pueden afectar de modo adverso la salud humana[34], adems de la urgente necesidad de una reglamentacin en esta rea a fin de que las evidencias cientficas sean trasladadas correctamente al conocimiento pblico y de esta manera sean tiles para los consumidores.

19

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

Bibliografa
[1] [2] Rusznyak, S.; Szent-Gyrgy, A. Vitamin P: Flavonols as vitamins. Nature. 138: 27;1936. Martnez-Flrez, S.; GonzlezGallego, J.; Culebras, J. M.: Tun. M. J. Los Flavonoides: Propiedades y acciones antioxidantes. Nutr. Hosp.. XVII (6) 271-278. 2001. Cartaza, O.; Reynaldo, I. Flavonoides: Caractersticas qumicas y aplicaciones. Resea Bibliogrfica. Cultivos Tropicales. 22.2. 5-14. 2001 Heim, K. E.; Tagliaferro, A. R.; Bobyla, D. J. Flavonoids antioxidants: chemistry, metabolism and structureactivity relationships. J. Nutr. Biochem. 13. 572-584. 2002 Martnez, A. Los Flavonoides: unos amigos del corazn. Publicacin Facultad de Qumica Farmacutica. Universidad de Antioquia. Medelln. Colombia. 2000. The Index Merck. Twelfth Edition. Merck &Co. 1996. Cdigo Alimentario Argentino. (Cap XVIII. Res. 1545, 12.09.90). Miles, C. O.; Main, L. The kinetics and mechanism, and the equilibrium position as a function of pH, of the isomerisation of naringin and the 4rhamnoglucoside of 2,4,4,6tetrahydroxychalcone. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 195-198. 1988. Harborne, J. B.; Mabry, T. J.; Mabry, H. The Flavonoids. Parte [Link] 2. Academic Press. 1975. y referencas citadas all. Chauhan, G. Phenoxyl Radicals: Flavonoids. Publicacin on-line de la Universidad de Iowa. Departamento de Ingeniera Qumica y Bioqumica. Febrero 2003. Sakihama, Y.; Cohen, M.F.; Grace, S.C.; Yamasaki, H. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants. Toxicology. 177. 67-80. 2002. Infante, R. Polifenoles del vino y oxidabilidad de las lipoprotenas. Blanco o Tinto? Clin. Invest. Arterioesclerosis. 9.19-22.1997. [13] Horowitz, R.; Gentili, B. Flavonoids constituents of Citrus. In Citrus Science and Technology. Nagy S., Shaw, P.E., Vedhuis, M. K: Eds. AVI Publishing; Wesport, CT. 397426.1977. Robards, K.; Prenzler, P.D.; Tucker, G.; Swatsitang, P.; Glover, W. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chemistry. 66.401-436. 1999 y referencias citadas all. Manthey, J.; Grohmann, K. Concentrations of Hesperidin and other orange peel flavonoids in Citrus processing Byproducts. J. Agric. Food Chem. 44.811-814.1996 y referencias citadas alli. Mouly, P.; Arzouyan, C.; Gaydou, E.; Estienne, J. Differentiation of citrus juices by factorial discriminant analysis using liquid chromatography of flavanone glycosides. J. Agric. Food Chem. 42. 70-79. 1994. Willams, R.; Spencer, J.; Rice-Evans, C. Flavonoids: antioxidants or signaling molecules? Free Radic. Biol. 36.7. 838-849. 2004 . Scalbert, A.; Williamson, G. Dietary intake and bioavailability of poliphenols. J. Nutr. 130. 2073-2085. 2000. Ortuo, A.; Garcia-Puig, D.; Fuster, M.D.; Perez, M.L.; Sabater, F.; Porras, I.; Garcia-Lidon, A.; Del Rio, J. Flavanone and Nootkatone Levels in Different Varietes of Grapefruit and Pummelo. J. Agric. Food Chem. 43.1. 1-4. 1995. Braddock, R.J.; Cadwallader, K.R. Citrus By-Products. Manufacture for Food Use. Food Technology. 1992. 105-110. Horowitz, R.; Gentili, B. U.S. Patent. 3.087.82 . 1963 Horowitz, R. Taste Effects of flavonoids. Plant Flavonoids in Biology and Medicine: Biochemical, Pharmacological and StructureActivity Relationships. Alan. R. Liss. Inc. 163-175. 1986. Cattana, R.; Moressi, M; DEramo, F. Edulcorantes en los Alimentos. Revista Hoja Aparte. Publicacin de la Coordinacin de Comunicacin Institucional. Universidad Nacional de

[14]

[3]

[15]

[4]

[5]

[16]

[6] [7] [8]

[17]

[18]

[19]

[9]

[10]

[20]

[11]

[21] [22]

[12]

[23]

20

Captulo 1

Flavonoides: Aspectos Generales

[24]

[25]

[26] [27]

[28]

[29]

[30] [31]

[32]

[33]

[34]

Ro Cuarto. Crdoba. Ao XIV. N 401. Edicin Electrnica. 2004. Montijana, H. Aplicaciones de Neohesperidina DC en la formulacin de yogurt de bajo contenido calrico. Alimentaria. Abril 96-971994. Br, A.; Borrego, F.; Benavente, O.; Castillo, J.; Del Rio, J. A. Neohesperidin dihydrochalcone: Properties and applications. Lebensm. Wiss. U Technol. 23.371-376.1990. Base de Datos FAOSTAT. Pgina web FAO. Datos ao 2004. Targa Villalba, M. Diagnstico del manejo y estado sanitario de quintas ctricas de Santiago del Estero. Tesis presentada para optar al ttulo de grado de Ingeniero Agrnomo. Facultad de Agronoma y Agroindustrias. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Marzo de 2005. Boletn Frutas, Hortalizas y Legumbres. Secretara de Agricultura, Ganadera y Pesca. Boletn N3. 1994. Alvdrez-Morales, A.; GonzlezMartnez, B.; Jimnez-Salas, Z. Tendencias en la produccin de alimentos: alimentos funcionales. Revista Salud Pblica y Nutricin. Vol 3. N 3. Julio-Septiembre 2002. Lajolo, F. Alimentos Funcionales: Aspectos Cientificos y Regulatorios. Publicacin on-line. Benavente-Garca, O.; Castillo, J.; Martn, F.; Ortuo, A.; Del Rio, J. Uses and properties of citrus flavonoids. J. Agric. Food Chem. 45. 12. 4505-4515. 1997 y referencias citadas all. Hughes, R.E.; Wilson, H.K. en Progress in Medicinal Chemistry (Ellis, G. P. and West, G. B. Ed.) Vol 14, Elsevier, Amsterdam, p 185. 1977 Montenegro, M. Reactividad de Oxgeno Singulete frente a sustancias naturales presentes en alimentos. Tesis Doctoral. Facultad de Agronoma y Agroindustrias Universidad Nacional de Santiago del Estero. Octubre 2004 Skibola, C.; Smith, M. Potencial health impacts of excessive flavonoid intake. Free Radic. Biol. Med. 29. 34. 375-383. 2000

21

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

Equilibrio de Isomerizacin Flavanona-Chalcona

2.1-INTRODUCCION Las chalconas constituyen un importante grupo de sustancias comprendida dentro de los flavonoides. La estructura qumica y el sistema de numeracin utilizado se ilustran en la Figura 2.1, donde se aprecia que el ncleo fundamental de estas sustancias comprende dos anillos aromticos unidos entre s por un grupo carbonilo ,insaturado.
3 2 3' 4' 5' 2'

B
6

4 5

A
6' O

Figura 2. 1 Estructura qumica de Ch.

Las Ch experimentan reacciones qumicas de gran inters, por ejemplo, sirven como materiales de partida para la sntesis de otras clases de sustancias, como flavonas [1]. Otro aspecto interesante, especialmente desde el punto de vista de la industria de los alimentos, es que las chalconas, por 23

medio de una reaccin de hidrogenacin, originan dihidrochalconas algunas de las cuales presentan sabor intensamente dulce, como es el caso de las DhCh derivadas de N y de NH, por lo que constituyen una alternativa a los edulcorantes sintticos actualmente en uso [2]. Dentro de las chalconas, aquellas que presentan sustituyentes hidroxilos en posicin 2 o 6, exhiben la particularidad de experimentar una reaccin de cierre originando la estructura isomrica flavanona, Fl. Esta reaccin es reversible por lo cual ambas especies estn involucradas en un equilibrio que depende de los sustituyentes, el pH, la composicin del solvente, entre otros. Las primeras evidencias experimentales de la existencia del equilibrio de isomerizacin Ch-Fl fueron publicadas en el ao 1956 por Shimokoriyama, [3] el cual analizando los F (chalconas, flavanonas y auronas) de Coreopsis tinctoria, observ que, si bien la forma chalcona era fcilmente oxidada a aurona, al mismo tiempo

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

OH R R O Chalcona R

O R O Flavanona

Figura 2. 2 Equilibrio de isomerizacin Ch-Fl.

haba una gran tendencia de Ch a convertirse a la forma Fl. Esta conducta inusual para Shimokoriyama sugiri en aquella poca la existencia de un equilibrio de isomerizacin entre las formas Fl y Ch, Figura 2.2. La reaccin de ciclizacin de Ch a Fl constituye una etapa importante de la biosntesis de flavonoides y est catalizada por la enzima Ch isomerasa (CHI). Ambos ismeros son precursores del resto de los flavonoides, Figura 1.7. Existen datos en la bibliografa que indican que la reaccin de ciclizacin de Ch a Fl ocurre en presencia de cidos y est favorecida por un grupo hidroxilo en posicin 6 de Ch junto a una estructura tipo floroglucinol en el anillo A, (2,4,6triOH) [4]. Tambin se ha informado la ciclizacin fotoinducida de chalconas en solventes tales como benceno, acetato de etilo y etanol [5]. Por otra parte, las Fl pueden tambin experimentar la apertura del anillo heterocclico bajo condiciones alcalinas, por accin de ciertos microorganismos tales como Gibberella fukikuroi o por irradiacin UV dando como productos 2OH Ch (20%), 4-fenildihidrocumarina (13%) y cido saliclico (4%) [1] El mecanismo de la reaccin Fl-Ch ha recibido una gran atencin por 24

diversos grupos de investigadores [6-11] encontrndose algunos resultados aparentemente contradictorios. Sin embargo, esta controversia se debe a la complejidad intrnseca de los flavonoides, ya que dependiendo de las condiciones de pH y de los grupos sustituyentes pueden generarse diferentes especies con reactividades modificadas, produciendo cambios en los mecanismos de formacin de las Fl y/o Ch, tales como por ejemplo mediante un equilibrio de enolizacin o la formacin de un carbanin intermediario dependiendo de la concentracin de base presente [6, 8-12]. 2.2EFECTO DE LOS SUSTITUYENTES SOBRE LA REACCIN DE CICLIZACIN DE CHALCONAS. El efecto de los sustituyentes sobre la velocidad de ciclizacin de Ch ha recibido una gran atencin [6,8,9,12]. Los grupos sustituyentes estudiados generalmente son los grupos metoxilo e hidroxilo, muy frecuentes en los compuestos naturales. La Tabla 2.1 resume las constantes de velocidad obtenidas para

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

Ch (I) 2-OH (I) 2-OH (II) 2-OH-4-OMe (III) 2-OH-6-OMe (IV) 2-3-diOH (V) 2,4-diOH (VI) 2-4-diOH (VII) 2,6-diOH-4,4-diOMe (VIII) 2,6,4-triOH (NCh)

pH 11.0 9.55 (pK) 9.55 (pK) 8.95 (pK) 11.4 12.5 11.2 8.00 8.00

T (C) 23.3 30.0 30.0 30.0 24.4 22.7 24.0 30.0 30.0

k (s-1) 3.7 x10 7.5 x10 2.7 x10 0.5 x10 3.0 x10 1.8 x10 0.3 x10 4.0 x10 0.2 x10
-3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3 -3

Referencia [9] [7] [7] [7] [9] [9] [9] [8] [6]

Tabla 2.1: Efecto de los sustituyentes sobre la velocidad de reaccin de ciclizacin de Ch en soluciones acuosas

Ch con diferentes patrones de sustitucin. En la Tabla 2.1 puede observarse que la mayor velocidad de cierre a la forma Fl corresponde a la 2-OHCh (I), mientras que la 2,4,6-triOHCh, tambin denominada NCh, es la que cicliza a menor velocidad. Old y Main [7], establecieron los coeficientes de velocidad de ciclizacin de 2-OH Ch con sustitucin por un grupo metoxlo en posicin C-4 y C-6. (Tabla 2.1, compuestos II y III) y observaron que, a pesar de que la disminucin del pK de III con respecto a II (desde 9.55 a 8.95), la velocidad de ciclizacin de III es menor que la observada para II, esto es, considerando que la ciclizacin ocurre en forma apreciable cuando se ioniza el grupo hidroxilo en posicin C-2, la Ch III debera ciclizar a mayor velocidad que II ocurriendo lo contrario. Por esta razn, argumentan que una correlacin entre la velocidad y el pK es poco realista al igual que la correlacin entre la basicidad y la nucleofilicidad del grupo 2-O- y si bien indican que las diferencias en cuanto a la velocidad son de pequeo significado,

existira un cierto impedimento para la ciclizacin de ciertas Ch 6-sustituidas. Por otra parte Furlong y Nudelman [9], estudiaron la ciclizacin de las Ch IV, V y VI en soluciones alcalinas acuosas indicando que no existe efecto de los sustituyentes analizados sobre la velocidad de reaccin, excepto para la Ch VI la cual presenta una elevada energa de activacin debindose esto al efecto donor de electrones del grupo 4-OH (el oxianin) que complica el ataque del fenolato de C-2 sobre el C. Miles y Main [8], analizando la reaccin de ciclizacin de la Ch VII, indican que un grupo hidroxilo en posicin C-6, produce un efecto de catlisis cida intramolecular de adicin conjugada, no disponible para el caso de 2-OHCh simples, Figura 2.3. Dicha catlisis est fundamentada por el incremento en la velocidad observado con respecto a otras Ch sin ese patrn de sustitucin Este efecto lgicamente desaparece cuando se supera el valor de pK del grupo involucrado, es decir cuando se forma la Ch dianin

25

Captulo 2
OMe MeO O

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

OMe MeO O

O H

OMe MeO O

OH

Figura 2. 3: Catlisis cida general intramolecular por 6-OH.[8]

(pK=12.30) la cual es tres veces menos reactiva que la especie monoaninica. El efecto de la presencia de un grupo hidroxilo en posicin C-4 fue estudiado para la Ch VIII (NCh) [6]. En el caso de VIII, la ionizacin del grupo 4OH (pK=12.0) provoca una disminucin de la velocidad de reaccin con respecto a la forma monoaninica. Este efecto es pequeo desde el punto de vista electrosttico dado que el grado de deslocalizacin de la carga negativa junto al sistema enona, donde atacar el grupo 2-O-, hara esperar un efecto mayor. Sin embargo debe tenerse en cuenta que tal deslocalizacin incrementa la densidad de carga negativa sobre el C mucho ms que sobre el C. En general, para Ch polihidroxiladas, la mxima velocidad corresponde a la forma monoaninica ya que la ionizacin del resto de los grupos incrementa la deslocalizacin de la carga negativa y obstaculiza el ataque del fenxido en C-2 necesario para el cierre del anillo.

Furlong y Nudelman [11] estudiaron la reaccin de ciclizacin de una serie de Ch sustituidas por grupos OH, -OMe, -NO2 en las posiciones C-4, C-4 y C-3. En su trabajo proponen un mecanismo concertado en medio bsico en el cual el agua ataca el C seguido de un desplazamiento nucleoflico del hidroxianin (B) para formar el producto final. Sus resultados indican que las variaciones de las constantes de velocidad son pequeas para las diferentes sustituciones, excepto para la 2,4-diOH Ch, la cual presenta un coeficiente de velocidad mucho menor. Los resultados sugieren que un oxianin en posicin para del anillo B tiene el mismo efecto que un grupo nitro en la misma posicin. Esta prdida de sensibilidad con respecto a la sustitucin es consistente con el mecanismo concertado de catlisis cida general y est sustentado por el hecho de que un sustituyente donor de electrones (como

26

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

un oxianin) favorece el ataque de H+ sobre el C mientras que un aceptor de electrones como el grupo nitro facilita la adicin del fenxido sobre el C. En general la sustitucin por un grupo -OH o -NO2 en posicin C-4 disminuye la velocidad de reaccin con respecto a la 2-OH Ch. De ambas sustituciones, la presencia de un hidroxilo en posicin C-4 provoca la mayor disminucin en la velocidad de ciclizacin, por lo que postulan que el paso lento corresponde al desplazamiento nucleoflico del hidroxianin B. 2.3EFECTO SUSTITUYENTES REACCIN DE FLAVANONAS. DE LOS SOBRE LA APERTURA DE

Old y Main [7] estudiaron el efecto de la sustitucin de grupos -OMe en posicin C-4 (II) y C-6 (III) sobre la velocidad de ciclizacin y apertura del anillo. Plantean que la apertura del anillo para formar la correspondiente Ch depende, tanto de la concentracin del ion enolato en equilibrio con la Fl como de su velocidad de apertura, Figura 2.4. De acuerdo a esto, para la Ch III, la mxima estabilizacin del ion enolato requiere coplanaridad entre el oxgeno carbonlico y el grupo metoxilo. Esto hara que la concentracin en equilibrio

del enolato de III sea menor que el correspondiente de II en las mismas condiciones. Sin embargo, el grupo metoxilo presente en III puede colaborar, por interacciones no enlazantes, a la apertura del anillo, resultando en una disminucin de la energa libre de activacin. Por lo expuesto anteriormente, se postula que existe un efecto compensatorio asociado al sustituyente en posicin C-6, es decir, si bien la concentracin del ion enolato en equilibrio es menor para III que para II, esto es compensado por una velocidad mayor en la apertura del anillo, lo cual les permite predecir una velocidad de apertura del anillo similar para Ch II y III. Miles y Main [6] por su parte compararon la velocidad de apertura, en medio bsico, de N, (4,5,7trihidroxiflavanona) con la 5-OH-4,7dimetoxiflavanona las que difieren en la presencia de un grupo hidroxilo en posicin C-4 del anillo B. Los resultados indican que la reaccin de apertura del anillo de N dianin, es aproximadamente dos veces ms rpida que la Fl de VII al mismo pH. Esto es interesante dado que, sobre la base del mecanismo propuesto que implica el ataque de un hidroxilo, proveniente de una base, sobre el C, la repulsin de las cargas entre dicho grupo y el sistema deslocalizado de la Fl que va desde el grupo 4-O- hasta el carbonilo, hara esperar que la reaccin
R H2O OHO R O Flavanona

O R O Chalcona

R R

Enolato

Figura 2. 4: Esquema propuesto para la reaccin de isomerizacin Ch-Fl [7].

27

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

de HO- con la Fl dianinica sea ms lenta que con la correspondiente de VII. Este resultado indica la importancia de la presencia de un sustituyente hidroxilo en posicin C-4 ya que dada esta alta reactividad, se postula la posibilidad de que la donacin de electrones desde el grupo 4-O-, ausente en VII, sea suficiente para ayudar a la partida del fenolato (2-O-) en un estado de transicin, como lo indica la Figura 2.5, predominando por sobre el efecto de repulsin entre HO- y 4-O-.

2.4- MECANISMOS DE REACCIN PROPUESTOS. Los mecanismos de reaccin propuestos para la reaccin de isomerizacin son variados. Implican tanto, reacciones catalizadas por bases, enolizaciones y mecanismos carbaninicos. Furlong y Nudelman [9], proponen un mecanismo donde el primer paso implica la ruptura del enlace puente hidrgeno catalizada por una base la cual se protona y ataca el C, Figura 2.6. Old y Main en su trabajo [6] plantean tanto para la apertura como para el cierre la formacin de un enolato en equilibrio con la Ch y la Fl, Figura 2.4. Cisak y Mielczarek [12], en su estudio sobre los aspectos tericos y prcticos de la isomerizacin de Ch - Fl postulan que la transferencia de protn es la fuerza conductora para la reaccin de ciclizacin y apertura del anillo con un mecanismo carbaninico operando entre pH 10 a 12.

O
RO O

H
O O
-OH

Figura 2. 5: Estado de transicin para la reaccin de apertura del anillo de NCh [6].

+ BO H O H O

+ BH

O + BO

H B

Figura 2.6: Mecanismo de isomerizacin Ch-Fl [9].

28

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

H
O

H H
O

+ HOO

+ H2O

Figura 2.7: Mecanismo carbaninico para la isomerizacin Ch-Fl [12].

En soluciones menos alcalinas la enolizacin es el mecanismo principal. En su trabajo plantean que con el incremento del pH la concentracin del enol, originado por la deslocalizacin de la carga negativa del carbanin, disminuye exponencialmente aumentando la concentracin del carbanin De acuerdo con su hiptesis el mecanismo va carbanin intermediario (Fl-), Figura 2.7, interviene a pH >10, prevaleciendo entre pH 12 13 cuando la base fuerte (tal como HO-) deprotona
OMe
O O

eficientemente el C-3 del anillo C y se produce la apertura del anillo antes de la formacin del enolato. En otras palabras el par de electrones del carbanin puede directamente formar el doble enlace C2C3 como parte de una estructura resonante extensamente conjugada. En una etapa posterior, el enlace oxgenoC2 se disocia, el anillo pirona se abre y se forma el doble enlace. El oxgeno fenlico puede atacar el doble enlace olefnico para formar la correspondiente Fl, de esta manera la reversibilidad de la reaccin de isomerizacin est
OMe
O

OMe

+ HOO O

+ H2O
O

OMe

OMe

HO- +
OH O

+ H2O
O O

Figura 2.8: Mecanismo de isomerizacin va enolato [13].

29

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

asegurada por una simple adicin nucleoflica a un doble enlace conjugado con un carbonilo. Andjar y col.[13] en su trabajo acerca de la 4-OMe flavanona proponen un mecanismo de formacin de enolato intermediario similar al planteado en la Figura 2.4. La diferencia radica en que una vez abierta la Fl, plantean que se produce una rotacin de 180 alrededor del eje C-4-C1. El mecanismo se detalla en la Figura 2.8. 2.5- EFECTO DEL pH SOBRE LA REACCIN DE ISOMERIZACION La reaccin de isomerizacin depende, en forma marcada, del pH del medio. A pH cidos y neutros predomina la forma Fl mientras que en pH alcalinos la reaccin se desplaza hacia la forma chalcona. Sin embargo la regin de pH en la cual son estables ambas formas depende de los sustituyentes, especialmente en el caso de grupos hidroxilos ya que la ionizacin de los

mismos, en general, afecta la velocidad de ciclizacin de la chalcona, como se detall en la seccin 2.2. La Figura 2.9 muestra la composicin relativa de las especies Fl y Ch para el sistema 2-hidroxiCh.[12] La grfica muestra, de acuerdo a lo planteado anteriormente que la forma Fl es estable en un rango de pH de 0 a 10 mientras que en la regin alcalina prevalece la forma aninica de Ch. 2.6- CONFORMACIONES DE LAS CHALCONAS
H

trans s-cis
O H O H

Figura 2.10: Conformacin trans-s-cis de Ch.

100

100

% Chalcona

60

60

40

40

20 Flavanona Chalcona 10 11 12 13

20

pH
Figura 2.9: Composicin relativa del sistema Fl / 2-OH Ch [12].

% Flavanona

80

80

Furlong y Nudelman [11] determinaron los cambios conformacionales de las Ch en medio bsico aplicando 1H NMR. Aromaticsolvent-induced shifts (ASIS) indicando que las Ch existen en la conformacin trans- s-cis, Figura 2.10. Utilizando cloroformo deuterado analizaron las seales del grupo 2-OH indicando la existencia de una interaccin intramolecular con el grupo carbonilo. Cuando adicionan hidrxido de sodio deuterado, comprueban que el anillo A rota 180 sobre el eje C-4-C1 existiendo una fuerte interaccin entre el oxianin de C-2 y el H, Figura 2.11. Miles y Main [8] plantean el efecto de la ionizacin sobre la posicin del equilibrio entre la poco reactiva trans-

30

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

O CH3OD CH3OO

Figura 2.11: Cambios conformacionales de Ch ante la adicin de base [9].

s-cis y la reactiva trans-s-trans para la Ch VII, Figura 2.12. En su trabajo plantean que la barrera energtica de rotacin alrededor del enlace C-CO se espera que sea menor para la especie dianinica que para la monoaninica, de acuerdo con la disminucin del orden de enlace. Dado que, desde el punto de vista cintico, la especie Ch monoaninica es ms rpida que la dianin, argumentan que la prdida del enlace hidrgeno en la forma dianinica y la consecuente repulsin electrosttica entre los oxgenos fenlicos con el carbonilo favorecen la conformacin s-cis donde el C se encontrara muy alejado del 2-O- dificultando la reaccin de cierre. 2.7HIDROGENACION DE CHALCONAS: DIHIDROCHALCONAS En el ao 1960, Horowitz y Gentilli, obtuvieron NHDhCh, a partir de la Fl Neohesperidina (NH).

Sorprendentemente, el nuevo compuesto no era amargo como su precursor, sino que al contrario, presentaba un sabor intensamente dulce, 1800 veces mayor que la sacarosa. Este resultado los impuls a convertir otras Fl ctricas a su correspondiente DhCh. En este trabajo [14] determinaron que dentro de las Fl con sustituyente neohesperidosa slo N y NH presentan DhCh intensamente dulces. Todas las Fl rutinsido generan compuestos sin sabor, sin embargo la presencia de la sustitucin por neohesperidsido es necesaria pero no suficiente. La presencia de otros disacridos e incluso algunos monosacridos mostraron compatibilidad con el sabor dulce de DHCh. En la naturaleza, se conocen muy pocas DhCh entre las que se pueden destacar, floretina y floridzina, presentes en manzanas, cerezas y peras, Figura. 2.13.

OMe MeO O OMe MeO O

O trans-s-cis

trans-s-trans

Figura 2.12: Equilibrio conformacional para Ch VII [8].

31

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

OH HO OH

GlucO

O OH

Floretina HO OH

OH

Floridzina
Figura 2.13: Estructura qumica de DhCh.

Qumicamente, las DhCh pueden prepararse a partir de las Fl previa apertura del anillo heterocclico bajo condiciones alcalinas y posterior hidrogenacin. Un ejemplo de esto lo constituye NHDhCh que se obtiene por medio de una reaccin en un solo paso a partir de NH.[15], Figura 2.14. El material de partida para la produccin comercial de NHDhCh es su correspondiente Fl, NH, la cual se extrae de la piel de naranjas inmaduras, o bien a partir de N siendo esta sntesis ms compleja y costosa. Este ltimo proceso se basa en la conversin de N a floroacetofenona, la que se condensa con isovainillina de

donde se obtiene NH la que origina NHDhCh por posterior hidrogenacin. Por su parte, N constituye tambin una alternativa para la produccin de su DhDCh, Figura 2.15, la cual se ha reportado como equivalente a la sacarina en base molar [14]. Los procedimientos para la obtencin de dihidrochalconas son variados pero comnmente se realizan por hidrogenacin cataltica. Se han publicado trabajos donde se sintetiza, a travs de una reaccin de condensacin de Claidsen-Schmidt [16], la chalcona correspondiente la cual es posteriormente reducida. Esta reduccin tambin puede realizarse a partir de la correspondiente flavanona en medio bsico [16,17], Figura 2.15. Por otra parte Adams, Kern y col. [18] proponen la sntesis de bencilacetofenona (DhCh) a partir de una solucin de la correspondiente Ch en acetato de etilo a la cual se le adiciona oxido de platino (PtO2) como catalizador. La mezcla se agita bajo corriente de hidrgeno de 15 a 25 min. El catalizador se separa por filtracin y el disolvente se elimina destilndolo.

CH2OH OO OH OH O OH O CH3 OH OH
OH

OMe
O

OH
Hidrogenacin cataltica (1) H2; Pd/C; KOH (2) HCl

CH2OH OO OH OH O OH O CH3 OH OH
OH

OMe
OH

OH

Figura 2.14: Reaccin de sntesis de NHDhCh [15].

32

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

OH RO O OHH+ OH O OH O RO OH

OH RO H2
catalizador

OH OH

OH

Figura 2. 15: Reaccin de obtencin de NDhCh

Y RO OH X z

+
OH O O

OHY X RO OH z

OH H2 / Pd

O calor

Y X RO OH OHH2/Pd OH O OH O z RO O X

Y z

Figura 2.16: Esquema general para la sntesis de DhCh a travs de la reaccin de arilacin catalizada por Paladio [16].

R
X + OH OH

[Pd]

R
OH O

Figura 2.17: Esquema general para la sntesis de DhCh a travs de la reaccin de arilacin catalizada por Paladio [19].

33

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

La bencilacetofenona se recristaliza en EtOH con un rendimiento de aproximadamente 81 a 95%. Briot y col [19], desarrollaron un mtodo alternativo a partir de un ohalofenol y 1-aril-2-propen-1-ol, catalizada por Paladio, Figura 2.16. Periasamy y Thirumalaikumar informan la obtencin de DhCh por reduccin de Ch con NiCl2NaBH4.[20]

Otros procedimientos para obtener DhCh implican la utilizacin de microorganismos los cuales actan sobre las correspondientes Fl glicosiladas.[21] Dado el inters de la industria en estos compuestos, la extraccin de flavonoides a partir de residuos ctricos y su conversin a DhCh ha sido, desde hace tiempo, motivo de numerosas patentes.[2, 22].

34

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

Bibliografa
[1]

[2] [3]

[4] [5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

Dhar, D. N. The chemistry of chalcones and related compounds, Ed. Wiley-Interscience Publication. 1981 y bibliografa all citada. Horowitz, R.M.; Gentili, B. U.S. Patent. 3.087.821 1963. 3.890.298. 1975. Shimokoriyama, M. Interconversion of chalcones and flavanones of a phloroglucinol-type. Structure. J. Am. Chem. Soc. 79. 4199 4202. 1957 Harborne, J. B; Mabry, T.J.; Mabry, H. The Flavonoids. Academic press. Captulo 4. 1975. Matsushima, R.; Hirao, I. Photociclization of 2hidroxichalcones to 4- flavanones. Bull. Chem. Soc. Jpn. 53. 518-522. 1980. Miles, C.O.; Main, L. The kinetics and mechanism, and the equilibrium position as a function of pH, of the isomerization of Naringin and the 4rhamnoglucoside of 2,4,4,6tetrahydroxychalcone. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II.195 198. 1988. Old, K.B.; Main, L. The kinetics and mechanism of the cyclisation of some 2-hydroxychalcones to flavanones in basic aqueous solution. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 1309 1312. 1982. Miles, C.O.; Main, L. Kinetics and mechanism of the cyclisation of the 2,6-dihydroxy-4,4dimethoxychalcone; influence of the 6-hydroxy group on the rate of cyclisation under neutral conditions. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 1639 1642. 1985. Furlong, J.J.P.; Sbarbati Nudelman, N. Mechanism of cyclization of substituted 2-hydroxychalcones to flavanones. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 633 639. 1985. Furlong, J.J.P.; Ferretti, F.H., Pappano, N.B., Debattista, N.B.; Borkowski, E.J.; Kavka, J. Cintica de la isomerizacion de ChalconasFlavanonas. I. Sistema 2,4dihidroxiCh-7-hidroxiFl. An. Asoc. Qum Argent. 81, 199 204. 1985.

[11]

Furlong, J.J.P.; Sbarbati Nudelman, N. Cyclization of substituted 2hydroxychalcones to flavanones. Solvent and isotope effects. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 1213 1217. 1988. Cisak, A..; Mielczarek, C. Practical and theoretical aspects of flavanonechalcone isomerisations. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2.1603 1607. 1992. Andjar, S.; A.; Filippa, M.A.; Ferretti, F.H., Blanco, S.E. Isomerization of 4methoxy-flavanone in alkaline mdium. Determination of the enolate formation constant. J. Mol. Struct (Theochem) 636. 157-166. 2003. Horowitz, R. Taste Effects of flavonoids. Plant Flavonoids in Biology and Medicine: Biochemical, Pharmacological and StructureActivity Relationships. 163-175. Alan R. Liss. Inc. 1986. Br, A:; Borrego, F.; Benavente, O.; Castillo, J.; Del Rio, J. A. Neohesperidin dihydrochalcone: Properties and Applications. Review Article. Lebensm.-Wiss. U.-Technnol, 23, 371-376. 1990. Krbechek, L.; Inglett, G.; Holik, M.; Dowling, B.; Wagner, R.; Riter, R. Dihydrochalcones. Synthesis of Potential sweetening agents. J. Agric. Food. Chem. 16. 1. 108-112. 1968. Br, A.; Borrego, F.; Benavente, O.; Castillo, J.; Del Rio, J. A. Neohesperidin dihydrochalcone: properties and applications. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 23.371376. 1990. Gilman-Blatt. Sntesis Organica. Tomo I. Editorial Gustavo Gili. Pag 98. 1959. Briot, A.; Baher, C.; Brouillard, R.; Wagner, A.; Mioskoswki, Ch. Concise Synthesis of Dihydrochalcones via Palladium-Catalyzed Coupling of Aryl Halides and 1-Aryl-2-propen-1-ols. J. Org. Chem. 69. 1374- 1377. 2004. Periasamy, M.; Thirumalaikumar, M. Methods of enhancement of reactivity and selectivity of sodium borohydride for applications in organic

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18] [19]

[20]

35

Captulo 2

Equilibrio de isomerizacin Chalcona-Flavanona

[21]

[22]

synthesis..J Organomet. Chem. 609. Issue 1-2. 137-151. 2000. Linke, A.H.B.; Natarajan, S.; Eveleigh, D.E. A new screening agent to detect the formation of dihydrochalcone sweeteners by microorganisms. Abstracts of the Annual Meeting of the American Society of Microbiology, 171. Abstracts N 184. 1973. Baier, W.E. U.S. Patent. 2.421.063. 1974.

36

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

3.1- INTRODUCCIN Tanto los aceites, las grasas, como los alimentos que los contienen, estn sujetos, durante su procesamiento y almacenamiento, a reacciones qumicas que pueden alterar de modo indeseable las caractersticas del producto final. Hidrlisis y oxidaciones de cidos grasos insaturados pueden ser responsables de estos procesos. La oxidacin es una reaccin compleja catalizada por diversos factores extrnsecos que se inicia con la formacin de radicales libres y tiene como productos primarios hidroperxidos que afectan profundamente las caractersticas sensoriales y nutricionales de los alimentos reduciendo su tiempo de vida til y tornndolos inaceptables para el consumidor. 3.2 - OXIDACIN DE LPIDOS EN ALIMENTOS Los lpidos constituyen uno de los principales componentes de los alimentos y de otros sistemas biolgicos. Este grupo de biomolculas orgnicas pueden clasificarse en dos clases principales: lpidos simples y lpidos compuestos. Los lpidos simples son aquellos que no se separan en porciones menores por hidrlisis. Dentro de este grupo se encuentran esteroides, prostaglandinas y terpenos. Los lpidos compuestos son aquellos que se hidrolizan con facilidad para formar los lpidos simples. La mayor parte de estos compuestos son steres de cidos carboxlicos de cadena larga, llamados cidos grasos. Los dos grupos principales de steres son las ceras y los glicridos. Los lpidos existen tanto en animales como en plantas constituyendo una fuente potencial de energa por beta oxidacin o, como lpidos constituyentes de membrana. En el almacenaje, los lpidos existen como triglicridos, mientras que en las membranas se encuentran como fosfolpidos, esteroles, 37

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

esfingolpidos y glicolpidos. Muchos alimentos de origen vegetal contienen lpidos altamente insaturados. Los lpidos de origen animal presentan bajos contenidos de lpidos insaturados pero contienen ciertas cantidades de cidos grados altamente insaturados. La presencia de dobles enlaces en la molcula de los cidos grasos los hace susceptibles del ataque por el oxgeno provocando cambios qumicos complejos que, eventualmente se manifiestan por el desarrollo de olores y sabores indeseables. Este proceso, denominado autooxidacin es un proceso de radicales libres. La extensin del perodo de induccin de la autooxidacin es sensible a la presencia de componentes minoritarios que pueden extender dicho perodo, conocidos como AO, o aquellos que lo acorten, denominados prooxidantes. Los productos de oxidacin lipdica pueden, si son ingeridos a travs de los alimentos, desencadenar la peroxidacin in vivo, ocasionando problemas para la salud. [1] El uso de sustancias que retarden o inhiban la velocidad de la reaccin de oxidacin en alimentos que contienen lpidos minimiza la rancidez y consecuentemente retardan la formacin de productos de oxidacin txicos para quienes los consumen permitiendo mantener la calidad nutricional y los caracteres organolpticos del mismo. 3.3- MECANISMO DE LA OXIDACIN DE LPIDOS La oxidacin de los lpidos es una reaccin compleja catalizada por factores extrnsecos tales como metales u

oxgeno, que puede suceder por ejemplo durante el procesamiento de un alimento a altas temperaturas. Dicha reaccin se inicia por la formacin de radicales libres, teniendo como productos resultantes perxidos, hidroperxidos, aldehdos, cetonas, cidos y polmeros que generan modificaciones de las caractersticas organolpticas del alimento, trastornos gastrointestinales por su ingestin, destruccin de las vitaminas liposolubles: A, D, E, carotenoides y cidos grasos esenciales originando una disminucin de la calidad nutricional del alimento.[1] El mecanismo bsico de la peroxidacin lipdica consta de tres etapas: iniciacin, propagacin y terminacin. INICIACIN La oxidacin de un lpido comienza con la formacin de radicales libres. La reaccin de iniciacin se refiere al ataque de alguna especie lo suficientemente reactiva, denominada . iniciador L , capaz de abstraer un tomo de hidrgeno del grupo metileno alilco de un cido graso insaturado o por adicin de un radical a un doble enlace:
L RH R + H

3.1

ROOH RO + HO

3.2

2ROOH RO + ROO + H2O

. .

3.3
.

Donde RH, R , ROOH, RO , ROO . y L corresponden al lpido, radical lipdico, hidroperxido, radical alcoxilo, radical peroxilo e iniciador respectivamente.

38

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

La formacin del radical lipdico R , es usualmente mediada por trazas de metales, irradiacin o calor. Tambin, los hidroperxidos lipdicos, los cuales existen en cantidades de trazas an antes de la oxidacin, pueden romperse dando radicales como se indican en las ecuaciones 3.2 y 3.3. Esto es, los hidroperxidos, bajo ruptura homoltica o bajo descomposicin bimolecular pueden . formar el radical alcoxilo (RO .). Los hidroperxidos pueden formarse de varias maneras que incluyen, reaccin de lpidos insaturados con oxgeno singulete o por oxidacin de cidos grasos poliinsaturados catalizada por la enzima lipoxigenasa.
..

ROO + RH ROOH + R

3.5

PROPAGACIN Una caracterstica de los radicales libres es su tendencia a proceder en reacciones en cadena. La formacin inicial de un radical es responsable de la subsecuente transformacin qumica de innumerables molculas a travs de una cadena de eventos. De hecho, la propagacin de la oxidacin de los lpidos es una reaccin en cadena que consume oxgeno y genera una nueva especie radicalaria . denominada radical peroxlo, ROO , el cual puede abstraer otro tomo de hidrgeno de un cido graso vecino produciendo hidroperxidos y radicales lipdicos que retroalimentan la reaccin, ecuaciones 3.4 y 3.5. De esta forma, la degradacin oxidativa de lpidos, frecuentemente es descripta como un proceso autocataltico o autooxidativo. R + O2 ROO

Una vez formado el radical . lipdico, R , ste tiende a estabilizarse mediante un arreglo por deslocalizacion formando dienos conjugados, Figura 3.1 los cuales pueden reaccionar de diferentes maneras, sin embargo, en condiciones aerbicas, se combinan principalmente con oxgeno molecular originando radicales peroxilos tal como se describe en la ecuacin 3.4. El oxgeno molecular es particularmente susceptible al ataque del radical, como lo indica el valor de la constante de velocidad (k 3 x 108 M-1s-1) de la reaccin 3.4 [2], adems presenta una energa de activacin cercana a cero y por lo tanto es prcticamente controlada por difusin. Es por esto que en muchos sistemas conteniendo oxgeno la reaccin (3.4) conduce a una acumulacin de radicales peroxilo (ROO.) los que, de acuerdo a lo descrito anteriormente y tal como se indica en la ecuacin 3.5, son los principales responsables de la propagacin de la oxidacin. El paso de propagacin tambin puede ser inducido por una reaccin de adicin de radicales a compuestos con cadenas insaturadas generando radicales centrados en carbono. TERMINACIN Un radical libre se define como una entidad que posee electrones desapareados y es estructuralmente inestable lo cual significa que es altamente reactivo.

3.4

39

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

A medida que transcurre la reaccin, los radicales libres que se acumulan en el sistema, pueden reaccionar unos con otros apareando los electrones y formando especies no radicalarias estables. De esta manera, las reacciones de terminacin conducen a una interrupcin de la etapa de propagacin de la reaccin en cadena. Aunque el acoplamiento de los radicales est asociado con una muy baja entalpa de activacin, las reacciones de terminacin estn controladas por la concentracin del radical, la cual es responsable de la frecuencia de encuentros efectivos, por la orientacin correcta, y por la difusin a travs del medio de reaccin. En las ecuaciones 3.6, 3.7 y 3.8 se enumeran las reacciones de terminacin:

En la Figura 3.1 se muestra, a modo de ejemplo, la peroxidacin lipdica del cido araquidnico.
3.4- FACTORES QUE INDUCEN ESTADOS PROOXIDANTES 3.4.1-Oxgeno

El oxgeno en su estado fundamental no es reactivo y puede coexistir perfectamente con la materia orgnica. Este hecho se explica en funcin de la denominada restriccin por spin. Es un hecho conocido que las transiciones permitidas son aquellas que ocurren entre molculas con estados de igual multiplicidad de spin, tal como lo indican las ecuaciones 3.9, 3.10 y 3.11.
S + T prohibido S + S permitido

3.9 3.10

R + R R R R + ROO ROOR
ROO + ROO ROOR + O2

3.6 3.7 3.8

Los productos finales de la oxidacin lipdica son derivados de descomposicin de hidroperxidos tales como alcoholes, aldehdos, cetonas, steres y productos de elevado peso molecular resultantes de reacciones de dimerizacin y polimerizacin. La formacin de aldehdos y otros compuestos voltiles confieren sabor y olor desagradables al alimento, afectando las propiedades organolpticas del producto.

3.11 Donde S y T representan los estados singulete y triplete respectivamente La molcula de oxgeno en su estado fundamental posee dos electrones desapareados con spin paralelos correspondiendo esto a un estado de multiplicidad triplete, mientras que las molculas orgnicas presentan estado fundamental singulete. De esta manera la interaccin entre ambas est prohibida por spin. Sin embargo, las especies ms reactivas en los procesos de oxidacin son las formas activas de oxgeno. Estas formas reactivas pueden obtenerse mediante la activacin fsica o qumica de oxgeno, tal como se indica en la Tabla 3.1.

T + T permitido

40

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

14

11

COOH

Acido Araquidnico

- H.

COOH

13

11

COOH

Dieno Conjugado

O2

O O

COOH
Radical Peroxilo RH R.

H O O

COOH
Perxido Cclico Hidroperxido

COOH

O O
11

COOH

O2
Hidrolisis calor

. Endoperxido Cclico

Malonaldehdo (MDA)

Figura 3.1: Mecanismo para la peroxidacin lipdica del cido araquidnico. Se indica la abstraccin de H del C-13. El H tambin puede ser abstrado del C-10 o C-7, originando otros perxidos como productos finales [11].

La activacin fsica sucede principalmente por transferencia de energa de excitacin desde un pigmento o sustancia fotoactivada (fotosensibilizador) hacia el oxgeno. Esta energa es suficiente para invertir el spin de uno de sus dos electrones, originando el estado excitado singulete de oxgeno, 1O2, el cual presenta una alta difusibilidad y reactividad hacia molculas orgnicas (cuyos electrones estn generalmente

apareados) y como consecuencia se observan daos, por ejemplo en las membranas fotosintticas. La activacin qumica ocurre por reduccin del oxgeno molecular en su estado basal. Para la reduccin de oxgeno a agua se requiere un total de cuatro electrones y cuatro protones. La ganancia de cada electrn por parte del oxgeno genera una especie activa del mismo, Tabla 3.1.

41

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Especie Reactiva Activacin Fsica Oxgeno Singulete Radical Anin Superxido Perxido de Hidrgeno Radical Hidroxilo

Reaccin Clorofila* + O2 Clorofila + 1O2 Activacin Qumica

.-

O 2 + e O2

..

O2 + e + 2H+ H2O2 H2O2 + e- + H+ HO + H2O

Tabla 3. 1: Formacin de las principales especies reactivas de oxgeno.

Algunas de las caractersticas de las principales formas activas de oxgeno son: Anin Superxido: O2.-, es una especie que en solucin acuosa puede actuar como una base aceptando un protn para formar el radical . hidroperoxilo (HO2 ), en un equilibrio como se indica en la ecuacin 3.12:
HO 2 H + O 2

3.12

La ecuacin 3.12 es la reaccin cido-base del anin superxido cuyo pK es aproximadamente igual a 4.8, lo cual indica que en soluciones cidas predomina el radical hidroperoxilo, mientras que a pH por encima del pK prevalece el anin superxido. Por su parte, el anin superxido en solucin acuosa puede dismutar espontnea o enzimticamente originando H2O2, segn se indica en las ecuaciones 3.13a, b, c,
O + O + 2H+ H2O2 + O2 2 2 HO + O + H+ H2O2 + O2 2 2 HO + HO H2O2 + O2 2 2

como un oxidante o reductor en muchas reacciones celulares. A diferencia del anin superxido, el perxido de hidrgeno es altamente difusible a travs de las membranas y compartimentos acuosos y puede inactivar enzimas a bajas concentraciones. Al ser ms estable que las otras especies, es menos txico, sin embargo es peligroso dada su capacidad de generar el altamente reactivo radical hidroxilo por reaccin con metales tales como Fe2+ y posiblemente con iones Cu+, como se explicar ms adelante, o bien por ruptura homoltica por radiacin UV-Vis
Radical Hidroxilo: HO., es el ms poderoso agente oxidante en sistemas biolgicos. Es altamente reactivo frente a cualquier molcula biolgica y la velocidad con la que reacciona est controlada por difusin. Las diferentes especies reactivas pueden causar, en diferentes medida, inhibicin de enzimas especficas, degradacin o blanqueamiento de clorofilas, peroxidacin lipdica, como por ejemplo el perxido de hidrgeno y el oxgeno singulete pueden atacar cidos grasos insaturados formando hidroperxidos,

3.13a 3.13b 3.13c

Perxido de Hidrgeno: si bien el H2O2, no es un radical libre, participa

42

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Especie HO
1 .

Nombre Comn Radical Hidroxilo Radical Anin Superxido Oxgeno singulete Radical alcoxilo Radical peroxilo Radical xido ntrico Perxido de Hidrgeno cido Hipocloroso

Tiempo Vida (37C) 1x10-9 seg 1x10-6 seg 1x10-6 seg 1x10-6 seg 7 seg 1-10 seg Estable Estable

O2.O2 RO. ROO. NO

.

H2O2 HOCl

Tabla 3. 2: Especies reactivas de oxgeno [3].

La toxicidad de las diferentes especies activas de oxgeno est relacionada con su corto tiempo de vida antes de reaccionar con componentes celulares. En la Tabla 3.2 se muestran los tiempos de vida de las principales especies reactivas de oxgeno. La estructura electrnica de estas formas activadas de oxgeno determina . su reactividad. El radical HO y 1O2 son las formas ms reactivas seguida por el radical anin superxido y el perxido de hidrgeno. Algunas formas activas pueden interconvertirse en presencia de catalizadores especficos.
3.4.2- Calor

simultneamente. Si bien los cidos grasos saturados son relativamente estables a las temperaturas usadas en la industria de los alimentos, los cidos insaturados se deterioran en presencia de oxgeno y calor formando compuestos voltiles de olor desagradable [4]. Es importante recalcar que la extensin de la oxidacin de un alimento presenta una gran variabilidad muy difcil de prever y se encuentra influenciada por algunos factores tales como la presencia de sustancias prooxidantes y AO presentes en la matriz alimentara.
3.4.3- Fotosensibilizacin

La velocidad de oxidacin de un lpido se incrementa con el aumento de la temperatura, esto es, con el tratamiento por calor al cual se somete un alimento. Durante el calentamiento del producto se producen numerosos cambios qumicos, algunos de los cuales son importantes para el flavor, la apariencia, el valor nutritivo y la toxicidad. La qumica de la peroxidacin lipdica a altas temperaturas es complicada dado que ocurren reacciones termolticas y oxidativas

Parecera imposible que la reaccin directa de una molcula de lpido (R-H) con una molcula de oxgeno conduzca a la formacin de hidroperxidos con facilidad. De hecho, sobre la base del concepto de conservacin del momento angular de spin, es improbable que una molcula de lpido, la cual posee un estado electrnico singulete, reaccione con la molcula de oxgeno con un estado fundamental triplete. Aunque los hidroperxidos se producen durante la etapa de propagacin, el rol de un

43

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Fuente Soja L-1 Soja L-2 Arvejas L-2 Man Papa Tomate Trigo Pepinos

pH ptimo 9.0 6.5 6.5 6.0 5.5 5.5 6.0 5.5

Especificidad a Peroxidacin (%) 9-LOOH 13-LOOH 5 95 50 50 50 50 0 100 95 5 95 5 90 10 75 25

Tabla 3. 3: Fuentes y caractersticas de lipoxigenasas de origen vegetal.

iniciador, tal como la enzima lipoxigenasa o fotosensibilizadores, es muy importante desde el punto de vista de la formacin de hidroperxido inicial. Es bien conocido que sensibilizadores naturales y artificiales tales como clorofilas, hematoporfirinas o flavinas (incluyendo riboflavina, vitamina B2) son capaces de convertir oxgeno triplete a singulete. El mecanismo de formacin de 1 O2 por fotosensibilizacin o activacin fsica, Tabla 3.1, implica una transferencia de energa, desde una molcula denominada sensibilizador hacia una molcula de oxgeno en su estado fundamental. El proceso implica la absorcin de radiacin por parte del sensibilizador el cual pasa primero al estado excitado singulete y luego por cruce entre sistemas (ISC) al estado triplete, ecuacin 3.1. Desde este estado es capaz de transferir ese exceso energtico a una molcula de oxgeno en su estado fundamental, originando la especie singulete, ecuacin 3.15. Esta especie de oxgeno puede reaccionar con una molcula de lpido formando hidroperxidos. La secuencia se indica a continuacin:

h S * S S * 1 3

3.14

S *+ O2 O2 * +S
3 1

3.15

O*2 + RH ROOH

3.16

Donde 1S, corresponde al estado singulete del sensibilizador, 1S* es el estado excitado singulete, 3S* es el estado excitado triplete del 3 sensibilizador, O2 es el triplete normal de oxgeno, 1O2* estado excitado singulete del oxgeno y h es la energa de la luz en fotones. El oxgeno singulete reacciona 1000 a 10000 veces ms rpido que el oxgeno normal con linoleato de metilo, ya que ahora la reaccin est permitida por spin.

3.4.3- Lipoxigenasas

Junto a los metales, las lipoxigenasas, (LOX), son unos de los principales factores prooxidantes. Las lipoxigenasas son enzimas que existen tanto en plantas como en animales. La Tabla 3.3 muestra algunas caractersticas y fuentes vegetales de la LOX. 44

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

COOH O2
LOX-1 de soja LOX de tomate

OOH COOH OOH

Figura 3. 2: Especificidad de LOX frente a la oxidacin de cido linoleico.

COOH

Estas enzimas catalizan la oxidacin de algunos cidos grasos insaturados a sus correspondientes hidroperxidos. Estos hidroperxidos tienen la misma estructura que los obtenidos por autooxidacin, sin embargo las reacciones catalizadas por esta enzima estn caracterizadas por su especificidad de sustrato, selectividad de peroxidacin, rango de pH ptimo para la actividad de la enzima, susceptibilidad al calor, y una alta velocidad de reaccin en el rango de 0-20C. Las LOX oxidan slo cidos grasos conteniendo un sistema 1-cis,4cis-pentadieno. Los sustratos preferidos y su especificidad varan de acuerdo al origen, Figura 3.2. Las enzimas de origen vegetal reaccionan con los cidos linoleico y linolnico, mientras que las de origen animal reaccionan con el cido araquidnico.
3.4.4- Metales: Hierro y Cobre

Los metales de transicin son buenos promotores de las reacciones radicalarias debido a la transferencia de un electrn durante el cambio de su estado de oxidacin. Entre las posibles reacciones, la descomposicin de 45

hidroperxidos parece ser el principal proceso de iniciacin. Una simple ruptura del enlace O-O (energa de activacin de 184 kJ/mol) origina la formacin de radicales libres, ecuacin 3.2, los cuales son responsables de la iniciacin de la reaccin radicalaria. Dicha ruptura es insignificante en alimentos excepto cuando son sometidos al calor durante su coccin. El proceso bimolecular descrito en ecuacin 3. 3 es ms importante para la generacin de radicales libres en alimentos En presencia de iones metlicos, tales como hierro y cobre, la descomposicin cataltica de hidroperxidos es la principal fuente de radicales libres siendo este proceso conocido como reaccin de Fenton. Los iones metlicos aceleran la peroxidacin por descomposicin de hidroperxidos en bajos (ecuacin 3.17) y altos (ecuacin 3.18) estados de oxidacin. Los radicales alcoxilos y peroxilos producidos durante estas reacciones pueden abstraer hidrgeno de una molcula de lpido vecina y continuar la cadena de reaccin de la peroxidacin lipdica, ecuacin 3.19 a y b.

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

rpida ROOH + Fe (Cu ) RO + Fe (Cu ) + HO 2+ + 3+ 2+

3.17 3.18 3.19. a 3.19. b

Fe 3 + + O -2

lento ROOH + Fe3 +(Cu2 + ) ROO + Fe2+(Cu+ ) + H+

RO + RH R + ROH ROO + RH R + ROOR

Fe 2 + + O 2

(Fe 2 + O 2 Fe 3 + O -2 )

3.20 3.21.a 3.21. b

2O 2 + 2H+ H2O2 +O2

Fe2+ + H2O2 Fe3 + + HO + HO

Estos procesos pueden proceder en un ciclo de reacciones en cadena, siempre que las cantidades de iones metlicos sea adecuada para generar efectivamente radicales libres. Agentes reductores tales como cido ascrbico o radical anin superxido pueden acelerar estas reacciones dependientes de iones metlicos. Para el caso particular del hierro, el in Fe2+ puede tomar parte de las reacciones de transferencia de electrones con el oxgeno molecular, ecuacin 3.20. El anin superxido puede dismutar para formar perxido de hidrgeno, ecuacin 3.21.a, el principal componente para la reaccin de Fenton, ecuacin 3.20.b, y conducir a la formacin del altamente agresivo radical hidroxilo. La adicin de una sal de hierro a un lpido insaturado libre de perxidos provoca el comienzo de la etapa de iniciacin de la peroxidacin lipdica (abstraccin de un H por el radical HO.). Esta reaccin puede ser inhibida por enzimas que remueven perxido de hidrgeno, tales como las enzimas

catalasas o selenio glutation peroxidasa, sustancias secuestrantes de radical hidroxilo y agentes quelantes que acomplejen hierro y prevengan su participacin en la reaccin radicalaria. Sin embargo, es necesario resaltar que estos iones metlicos son esenciales para muchas funciones fisiolgicas, tales como participar como constituyentes de protenas y cofactores de diferentes enzimas, por ejemplo hierro para catalasas, cobre para ceruloplasminas y Cu, Zn para perxido dismutasa, implicadas en el sistema de defensa antioxidante [32]. Por estas razones su presencia en alimentos es de gran importancia para cubrir de esa manera la demanda del organismo.
3.5- ANTIOXIDANTES

En sistemas biolgicos existen varios mecanismos de defensa que implican enzimas, vitaminas y otras sustancias naturales que protegen a los componentes celulares del dao oxidativo. En los alimentos, existen naturalmente compuestos que imparten

46

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

cierta proteccin pero que, en muchos casos son degradados durante el procesamiento o almacenamiento de los mismos, necesitndose la adicin de sustancias exgenas que detengan o inhiban el proceso oxidativo. Es por eso que, para evitar los daos de carcter tanto sanitario como econmico que causa la rancidez, se recurre a la adicin de sustancias capaces de proteger los lpidos, al captar el oxgeno, inactivar los radicales libres que se forman o complejar metales, etc. Los AO son un grupo de sustancias que, estando presentes en bajas concentraciones, comparadas con el sustrato oxidable, retardan o previenen significativamente la oxidacin de los mismos [5]. Por las razones expuestas anteriormente, los AO son un grupo indispensable de aditivos alimentarios que prolongan el tiempo de vida til de un alimento sin alterar su calidad sensorial o nutricional.
3.5.1 CLASIFICACION ANTIOXIDANTES DE LOS

de la donacin de electrones o de tomos de hidrgeno a los radicales libres generados en la reaccin de oxidacin, transformndolos en especies termodinmicamente estables y generando radicales estabilizados que no contribuyen a la reaccin en cadena, ecuaciones 3.22, 3.23, 3.24.

AH + R A + RH AH + ROO A + RH AH + RO A + ROH
.

3.22 3.23 3.24

donde; AH y A denotan al antioxidante y . . . su radical y R , ROO , RO representan al radical del lpido, radical peroxilo y radical alcoxilo, respectivamente Durante las reacciones descritas en las ecuaciones 3.22, 3.23, 3.24, los AO se transforman en especies radicalarias de baja reactividad, muy estables que pueden interferir con la etapa de propagacin al reaccionar con otros intermediarios radicalarios, eliminndolos del medio y formando compuestos AO peroxilos, como se indica en las ecuaciones 3.25 y 3.26:

Existen numerosas maneras de clasificar a los AO, de acuerdo al origen se clasifican en naturales o sintticos; teniendo en cuenta su solubilidad son AO hidrosolubles o liposolubles, etc. La principal clasificacin tiene en cuenta el modo de accin de estas sustancias durante el proceso de oxidacin. De acuerdo a esta clasificacin los AO se dividen principalmente en dos grupos:
AO Tipo I: actan interrumpiendo la cadena de reaccin, ya sea a travs

A + ROO ROOA A + RO ROA

3.25 3.26

Los AO tipo I ms empleados en la industria de los alimentos son las sustancias polifenlicas que responden a la estructura general mostrada en la Figura 3.3. Los AO fenlicos presentan sustituyentes alqulicos o grupos donores de electrones en posicin orto y/o para en el anillo aromtico.

47

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

OH R1 R2 R4 R3

por deslocalizacin del electrn desapareado en el anillo aromtico, Figura 3.5. El radical libre fenoxilo ser tanto ms estable cuando ms grande sea el grupo sustituyente, o bien, ser menos reactivo por impedimento estrico
AO Tipo II: tambin denominados preventivos, actan por diferentes mecanismos que incluyen complejacin con metales, secuestro de oxgeno, descomposicin de hidroperxidos, absorcin de radiacin UV o desactivacin de oxgeno. Los ms utilizados son los agentes complejantes entre los que se destacan cido ctrico especialmente para complejar trazas de Fe en aceites vegetales [6], cido Tartrico, Lecitina y cido Etilendiaminotetraacetico (EDTA).

Figura 3.3: Estructura general de los AO del tipo I.

Los grupos donores de electrones incrementan la densidad electrnica sobre el grupo hidroxilo por un efecto inductivo y aumentan la reactividad hacia los radicales lipdicos. La Figura 3.4 muestra las estructuras de los AO sintticos y naturales pertenecientes a esta categora. La reaccin de estos AO con los radicales libres resulta en la formacin de un radical libre fenoxilo estabilizado
OH HO OH OH

C(CH3)3

C(CH3)3

C(CH3)3

COOC3H7 Galato de Propilo CH3 HO

OMe Butilhidroxianisol (BHA)

CH3 Butilhidroxitolueno (BHT)

CH3 H3C CH3 O CH3 CH3 CH3 CH3 OH OH CH2OH O HO HO HO O OH OH OH O Quercetina O

tocoferol (TOH)

Acido Ascrbico (AA)

Figura 3.4: Estructura de AO del tipo I frecuentemente utilizado en alimentos.

48

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

.
R R
Figura 3.5: Estabilizacin del radical fenoxlo.

.R

Secuestrantes de oxgeno, tales como cido ascrbico, palmitato de ascorbilo para matrices lipdicas y sulfitos, reaccionan con oxgeno libre y lo remueven de los sistemas cerrados. El cido ascrbico (AA) y el palmitato de ascorbilo pueden actuar regenerando AO del tipo I, denominndose Coantioxidantes (CoAO). Los carotenoides, especialmente - caroteno, son efectivos para desactivar oxgeno singulete previniendo as la formacin de hidroperxidos, [7]. Su accin est limitada por la presin de oxgeno, ya que para presiones por encima de 150 mm Hg pueden actuar como prooxidantes. Tambin pueden actuar como AO del tipo I a bajas presiones de oxgeno. En cuanto a la descomposicin de perxidos en sustancias no radicalarias; los compuestos que ejercen este efecto incluyen principalmente aminas terciarias y cidos fuertes y por eso no son utilizables en los alimentos [6]. La clasificacin de los AO es en realidad algo limitada, algunos AO pueden actuar por diversos mecanismos y por lo tanto pertenecer a los dos tipos AO descritos anteriormente, es decir, actan tanto como AO primarios, secundarios y CoAO Los polifenoles, especialmente los que presentan estructura catecol, (o-

OH) pueden actuar como AO de Tipo I y tambin como complejante de metales.

3.5.2. SINERGISMO ENTRE AO: COANTIOXIDANTES (CoAO)

El sinergismo entre AO se define como el efecto de dos o ms AO, los cuales son menos efectivos individualmente que combinados. La funcin sinrgica puede ocurrir por varios mecanismos. Algunos AO pueden actuar, por ejemplo, como donores de hidrgeno al radical fenoxilo, regenerando el AO primario, situacin que permite utilizar cantidades menores de sustancias AO, si se adiciona simultneamente un CoAO [12]. Secuestrantes de oxgeno, tales como AA, palmitato de ascorbilo reaccionan con oxgeno y lo remueven. El AA acta tambin como co-AO de los AO del tipo I, especialmente con tocoferoles. Buettner y col [2], sugieren que en una mezcla de ambos compuestos el AA puede reducir a la forma oxidada del tocoferol, ecuacin 3.26 y 3.27. Esto puede explicarse en funcin de los potenciales de reduccin, (TO, H+/ TOH, E0= 480 mV: A-, H+/AH- E= 282 mV). . El radical TO es ms oxidante que el Asc- por lo tanto se reduce, regenerndose [2]. Este efecto sinrgico es mximo para peroxidaciones iniciadas en fase lipdica. 49

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

ROO + TOH ROOH + TO TO + AscH TOH + Asc

3.27 3.28

3.6-METODOS DE DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (AAO) Y ANTIRRADICALARIA (AAR).

Muchos modelos in vitro e in vivo han sido desarrollados para la evaluacin de la AAO. Sin embargo, la interpretacin de los resultados obtenidos a partir de estos sistemas modelos deben tomarse con precaucin debido a que mtodos diferentes se basan en mecanismos diferentes, resultando en valores aparentemente contradictorios. Lamentablemente no existe el sistema perfecto que permita determinar el verdadero poder AO de un compuesto o de una mezcla compleja de AO [8]. La eleccin de una metodologa apropiada depende fundamentalmente de las caractersticas del compuesto o extracto a analizar. En general, la efectividad de un AO se determina monitoreando su poder

de inhibicin en un proceso de oxidacin, Actividad Antioxidante (AAO) o bien midiendo la capacidad de una sustancia para atrapar radicales libres, en cuyo caso se determina como Actividad Antirradicalaria (AAR). Las estrategias para la determinacin de la AAO de una sustancia consisten bsicamente en comparar la extensin o velocidad de un proceso oxidativo en ausencia y presencia del AO. Para la AAR la metodologa implica el monitoreo del cambio de alguna propiedad relacionada con la captura de los radicales libres, por ejemplo la disminucin de la absorbancia UV-Vis de una solucin de DPPH. ante la adicin de un AO. El monitoreo de las reacciones puede ser realizado utilizando mtodos qumicos, instrumentales o sensoriales. En general, cualquier ensayo para la determinacin de la capacidad AO est caracterizado por tres parmetros: el sustrato a oxidar, el iniciador de la oxidacin y una tcnica apropiada para medir el punto final u otro

Determinacin de la AAO

1- Ensayos de inhibicin

2- Medidas del tiempo de induccin

3- Ensayos de decoloracin

a- Medidas a tiempo fijo

b- Anlisis cinticos

Figura 3. 6: Clasificacin de las distintas estrategias para la determinacin de la AAO.

50

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

parmetro que sirva para evaluar el progreso de la oxidacin. (Tabla 3.2). Debido a la gran variedad tanto de sustratos, de fuentes radicalarias y de tcnicas analiticas y adems de las diferentes combinaciones posibles es que han surgido en la literatura numerosas estrategias para la determinacin de la capacidad AO de un compuesto, o extracto. Robards y col, clasifican a las diferentes estrategias en tres categoras, Figura 3.6 [9]. En el sistema 1, los reactivos se mezclan y se determina el punto final a un intervalo de tiempo predeterminado, tipo a, o la velocidad de la reaccin, tipo b. En ambos casos, la adicin de una sustancia AO modifica tanto el parmetro punto final como la velocidad de la reaccin. En los ensayos pertenecientes al grupo 2, se determina la duracin del perodo de induccin y los cambios en el punto final. Muestras con alta actividad AO suprimen los cambios mucho ms que aquellas con menor actividad. En los ensayos incluidos en el punto 3 se utiliza una sustancia coloreada. Esta sustancia presenta generalmente una absorbancia UV-Vis estable la cual desaparece ante la adicin de un AO En la Tabla 3.4 se indican algunos de los mtodos ms utilizados en la determinacin de la AAO. De manera similar a la gran variedad de mtodos para determinar la actividad AO las formas de expresar los resultados son numerosas y en muchos casos depende incluso de cada autor.

A modo de sntesis se detallan a continuacin algunos de los parmetros ms utilizados: Concentracin Eficiente (Efficient Concentration) (EC50), utilizado en el ensayo de decoloracin del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH), Figura 3.7, el cual presenta una intensa banda de absorcin a 515 nm cuya absorbancia disminuye en presencia de una sustancia AO.

NO2 O2N N N NO2

Figura 3.7: Estructura qumica del radical libre . estable DPPH .

El valor de EC50 expresa la concentracin, o, para el caso de extractos, los l de AO necesarios para reducir el 50% de la concentracin inicial del radical. En la bibliografa se utilizan indistintamente tanto EC50, como las siglas IC50, (Inhibition Concentration), SC50, (Scavenging Concentration) [23]. Otros parmetros relacionados con la AAR son el Poder Antirradicalario (ARP), definido como la inversa del valor [23] y el Factor de EC50, Estequiomtrico, (n), [21] el cual expresa el nmero de moles de radical consumido por mol de AO adicionado. Cuando el valor de EC50 se expresa en concentracin molar es posible determinar el factor estequiomtrico por medio de la ecuacin 3.29:

n=
51

1 EC50 x 2

3.29

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Mtodo Ensayo perxidos lipdicos Mtodo de absorcin de oxgeno

Fundamento de la Tcnica de Deteccin de perxidos por iodometra o colorimetra por reaccin con tiocianato frrico Deteccin de consumo de oxgeno (manmetro Warburg) o deteccin de incremento de masa Deteccin espectrofotomtrica de dienos conjugados formados por oxidacin iniciada trmica o enzimticamente, en presencia de metales de transicin (ej. lipoxigenasas, sulfato de Cobre, cloruro frrico) Deteccin espectrofotomtrica de aldehdos formados durante la oxidacin lipdica mediante reaccin con cido tiobarbitrico. Deteccin espectrofotomtrica de productos formados por reaccin entre aldehdos, 2alquenales y productos de descomposicin voltiles con p-anisidina. Medidas de conductividad de cidos de cadena corta producidos en condiciones de oxidacin acelerada (altas T y aireacin)

ndice Valor de perxidos (PV) Absorcin de Oxgeno

Tipo Sist. 1

Ref. 9,10

Sist 2

11

Ensayo de dienos conjugados Test del cido Tiobarbitrico (TBARS) Test anisidina (valor de Anisidina) Mtodo Rancimat Mtodo del AAPH 2,2azobis-(2amidinopropano) dihidrocloruro

12, % Inhibicin Sist. 1, 2 13, 14

Sist. 1

15

Valor de anisidina

Sist. 1,2

16

Sist. 2

17

Deteccin espectrofotomtrica de la desactivacin de fluorescencia de 2,7diclorofluorescena o ficoeritrina por reaccin con TRAP, ORAC los radicales peroxilos originados por descomposicin de AAPH.

Sist. 3

18, 19

Deteccin espectrofotomtrica de la decoloracin del radical catin preformado Decoloracin del ABTS+ originado por oxidacin de 2,2-azinoradical catin bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) ABTS ABTS.+ con: a-metamioglobina b-MnO2 c-Persulfato de Potasio Ensayo de decoloracin del radical libre DPPH Sistema Acido Linoleico/caroteno Monitoreo espectrofotomtrico de la decoloracin del radical libre estable 2,2-difenil1-picrilhidracilo. (DPPH) Deteccin espectrofotomtrica de la decoloracin de una emulsin acuosa de caroteno durante la oxidacin cido linoleico.

a-TEAC I b- TEACII c- TEACIII

Sist 1,2.

20, 21, 22

EC50, ARP

Sist. 1,2. 23

% Inhibicin Sist 1,2.

24

Tabla 3. 4: Metodologas frecuentemente utilizadas para la determinacin de la AAO

52

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

CH3 H3C
-

CH3 COOH

ClH2N

CH3 C C N N NH2CH3 AAPH

CH3 C C CH3NH2

NH2Cl

HO CH3 Trolox -C

Figura 3. 8: Estructura qumica del azo iniciador AAPH y el equivalente hidrosoluble de la vitamina E, Trolox-C.

Parmetro Antioxidante de captura de radicales total: (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter) (TRAP), basado en las medidas de consumo de oxgeno durante una reaccin de peroxidacin lipdica inducida por descomposicin trmica del hidrocloruro de 2,2-azobis(2amidinopropano) (AAPH), [25] El parmetro TRAP se utiliza generalmente referido a una sustancia patrn, [21] por ejemplo Trolox C, Acido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2carboxlico, (un anlogo a la vitamina E soluble en agua) y se define como la relacin entre el periodo de induccin de la muestra con respecto al tiempo de induccin de Trolox, Figura 3.8. Actividad Antioxidante Equivalente de Trolox (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (TEAC) [26] El TEAC refleja la capacidad de un antioxidante de donar un tomo de hidrgeno o electrn comparada con Trolox. Capacidad de Absorcin de Radical Oxgeno (Oxygen Radical Absorbance Capacity) (ORAC) donde se combinan tanto el tiempo como el grado de inhibicin dentro de un mismo valor.

Los valores se reportan como moles equivalentes de Trolox

3.7- ANTIOXIDANTES EN ALIMENTOS

El uso de AO en alimentos data desde antes de la dcada del 40. Sustancias naturales, como la goma guaiaca, se usaron inicialmente para preservar grasas y aceites. En la actualidad estas sustancias fueron reemplazadas por compuestos sintticos con AAO mejores y de mayor disponibilidad. El uso de AO en alimentos est regulado por las leyes de cada pas y por estndares internacionales. A pesar de que muchos compuestos naturales o sintticos presentan AAO, solamente algunos de ellos son aceptados como seguros. Para que una sustancia sea empleada en alimentos debe cumplir con los siguientes requisitos a) Carecer de accin txica o interferente b) Ser soluble en la matriz alimenticia (distribucin homognea, con emulsionante y sinergista) c) No modificar los caracteres organolpticos del alimento d) Actuar en pequeas cantidades (0.1 a 0.5 g/kg)

53

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

e) Conservar su accin, an a altas temperaturas [27].

3.7.1- ANTIOXIDANTES PERMITIDOS POR EL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO

3.8- ANTIOXIDANTES NATURALES

En la Repblica Argentina, el Cdigo Alimentario Argentino, CAA, dentro del grupo de Aditivos Alimentarios, Captulo XVIII, Articulo 1391, enumera las sustancias AO permitidas para su uso en alimentos, especialmente para aquellos que contengan ciertos aceites esenciales, terpenos, as como otras sustancias aromticas. Segn el CAA para que una sustancia pueda se utilizada como AO debe cumplir con los siguientes requisitos: a) Ser inocuos por s mismos o a travs de su accin como aditivos en las condiciones de uso. b) Formar parte de la lista positiva de aditivos alimentarios del presente Cdigo c) Ser empleados exclusivamente en los alimentos especficamente mencionados en este Cdigo. d) Responder a las exigencias de designacin, composicin, identificacin y pureza que este Cdigo establece. Segn el CAA los AO son indispensables para la proteccin de ciertos aceites esenciales, especialmente los que contienen terpenos, as como de otras sustancias aromticas. En la Tabla 3.5 se indican los AO permitidos para su utilizacin en alimentos.

Dada la importancia de la peroxidacin lipdica en el deterioro de los alimentos, la industria, con el fin de preservarlos, ha recurrido a la adicin de sustancias que de acuerdo a lo mencionado, son en su gran mayora de origen sinttico. Sin embargo en la actualidad existe una gran controversia acerca de la seguridad de su empleo, por ejemplo se han publicado trabajos sobre los efectos perjudiciales para la salud que presenta el uso de BHT y BHA [28]. Esto ha motivado a los investigadores a buscar sustancias naturales con AAO, que puedan actuar solas o sinrgicamente con otros aditivos [1]. En el reino vegetal, existen numerosas sustancias con propiedades AO, entre las que se pueden citar los tocoferoles, los cidos ascrbico, ctrico, los carotenoides y por supuesto los F. En la Tabla 3.6 se muestran algunas fuentes de AO naturales. A pesar de la variedad es importante tener en cuenta que su uso est limitado a productos que sean compatibles con sus texturas, color, flavor y por supuesto con su naturaleza hidro o liposoluble.
3.9FLAVONOIDES COMO ANTIOXIDANTES ALIMENTARIOS NATURALES

La bsqueda de nuevos AO llev a identificar y aislar sustancias entre las cuales se encuentran los F. Estos polifenoles ejercen propiedades AO va varios mecanismos tales como secuestro de especies ROS y entre ellos radicales

54

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Sustancia -tocoferol y mezclas de tocoferoles naturales cido Ascrbico (AA), Ascorbatos de Sodio y Calcio cido Ctrico, Fosfrico cido Eritrbico
HO
CH3 HO

Estructura Qumica

CH3 H3C CH3 O CH3 CH3 CH3 CH3

Usos y Dosis Mxima Permitida Se utilizan en grasas de origen animal, especialmente combinado con AA. No se especifica

OH O HO HO O OH

COOH COOH COOH

OH OH

H3PO4,

No se especifica

No se especifica
O O OH

HO
COOR

Galatos de propilo, octilo y dodecilo Hidroxianisol butilado(BHA); Hidroxitolueno butilado (BHT); Palmitato y estearato de ascorbilo Ter-butil hidroquinona (TBHQ)

HO OH
OH

OH

R: C3H7 galato de propilo C8H17 galato de octilo C12H25 galato de dodecilo

Utilizados en grasas y aceites. Mximo 1g/kg

OH C(CH3)3 (CH3)3C C(CH3)3

Utilizados en grasas, aceites y alimentos que los contengan. Mximo 1g/kg

OMe

CH3

OOC(CH2)14CH3 O HO HO
OH C(CH3)3

Mximo 1g / kg

O OH

Mximo 1 g/ kg o en mezclas con BHT y BHA

OH

Tabla 3. 5: Estructura qumica y caractersticas de algunos AO alimentarios permitidos por el CAA

hidroxilos, alcoxilos y peroxilos, la inhibicin de enzimas implicadas en su formacin, la complejacin de metales y la regeneracin de AO endgenos ligados a la membrana tales como tocoferol (vitamina E) [29]. Si bien en la actualidad no son empleados industrialmente como AO, existen estudios acerca de su utilizacin por 55

ejemplo extractos conteniendo flavonoles, flavanoles de uva en la conservacin de pescado [30]. Rey y col [31] estudiaron el efecto de adicionar F puros (Q y R) y extractos de hierbas conteniendo polifenoles a carne de cerdo, indicando que los mejores resultados se lograron con Q.

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Fuentes Aceites y semillas Avena y ciertos tipos de arroz Frutas y vegetales Especias, hierbas, t, cacao Protenas e hidrolizados de protenas

Sustancia Antioxidante Tocoferoles y Tocotrienoles; Sesamol y sustancias relacionadas; aceite de oliva; Fosfolpidos. Varios compuestos derivados de lignina. Acido Ascrbico, Acidos hidroxicarboxlicos, Flavonoides y Carotenoides. Compuestos Fenlicos. Aminocidos, productos de reaccin de Maillard.

Tabla 3. 6: AO naturales en algunos ingredientes alimentarios

Butena (3,4-dihidroxiCh) es un potente AO utilizado en grasas de cerdo. A una concentracin de 0.02% es dos veces ms activa que Q o TOH y seis veces ms reactiva que BHT [11]. Las isoflavonas de soja combinadas con tocoferoles y fosfolpidos, son efectivas para preservar pescados [11].
3.9.1- ACCIN VITRO ANTIOXIDANTE IN

anillo B, el grupo 3-OH, 4-oxo en el anillo heterocclico C y el anillo B y el 4-oxo, 5OH entre el heterociclo C y el anillo A, Figura 3.9.
O Me O O O O Me O Me

F actan como AO Los principalmente de dos maneras: 1- Inhiben enzimas responsables de la produccin de anin superxido, tales como xantina oxidasa y proteinquinasa C. Los F han mostrado tambin inhibicin hacia ciclooxigenasa, lipoxigenasa, monooxigenasa, glutation S-transferasa, succinoxidasa mitocondrial y NADH oxidasa, todas implicadas en la generacin de ROS [32,37]. Por otra parte, ciertos F complejan eficientemente trazas de metales Fe y Cu, los cuales juegan un rol importante en el metabolismo de oxgeno [32]. Los sitios propuestos de unin con metales son el ncleo catecol en el

Figura 3.9: Sitios de unin de F con metales.

2Debido a sus bajos potenciales de reduccin, (0.23 < E7 < 0.75V) [33], donde E7 representa el potencial de reduccin a pH 7, los F son termodinmicamente capaces de reducir los radicales libres oxidados con potenciales redox en el rango de 2.131.00 V, tales como los radicales superxido, peroxilos, alcoxilos e hidroxilos por cesin de un tomo de hidrgeno, ecuacin 3.30, Tabla 3.7:

FlOH + ROS FlO + ROS H

3.30

donde ROS. representa a las especies reactivas de oxgeno, anin superxido, etc. 56

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Radical HO , H / HO . + RO , H / ROH (alcoxilo) . + ROO , H / ROOH (peroxilo) . + PUFA , H /PUFA-H . + TO , H / TOH .+ In ascorbato , H / in ascorbato
. + -

E7 (V) 2.310 1.600 1.000 0.600 0.480 0.282

Tabla 3. 7: Potenciales de reduccin a pH 7 para cuplas de radicales seleccionados [32].

3.9.2INFLUENCIA DE LA ESTRUCTURA SOBRE LA ACTIVIDAD AO DE FLAVONOIDES

La Tabla 3.8 muestra los datos de potenciales de reduccin, los potenciales de oxidacin a medio pico a pH = 7 y la AAO de algunos F expresada como TEAC (Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox) [34,35]. Jovanovic y col [33], sobre la base de que tanto la oxidacin electroqumica como la cesin de un tomo de hidrgeno implican la ruptura del mismo enlace [32], proponen que el potencial de oxidacin a medio pico, Ep/2, es un parmetro recomendable para evaluar la AAO de F. De acuerdo con esta hiptesis, F con Ep/2 < 0.2 son definidos como fcilmente oxidables y por lo tanto buenos AO. Por otra parte, y teniendo en cuenta que los compuestos con mayor AAO son los que presentan el mayor valor de TEAC y Ep/2 < 0.2, de la Tabla 3.8 puede observarse que la catequina Epigallocatequina, el flavonol Quercetina y la antocianidina Cianidina son los mejores AO, mientras que la flavanonas Naringina y Hesperidina se encuentran entre las sustancias de menor capacidad para actuar como AO.

De la Tabla 3.8 puede concluirse por lo tanto que la AAO de los F depende tanto de su estructura como del arreglo de los grupos funcionales que presenta. En los ltimos 15 aos investigadores abocados al estudio de la Relacin Estructura- Actividad (REA), han generado varias lneas consistentes que evidencian el rol especfico de los componentes estructurales como requisitos para la capacidad de atrapar radicales libres, capacidad de complejar metales y AAO de los F. La aplicacin nutricional de esta informacin requiere una investigacin exhaustiva del metabolismo de las sustancias, el anlisis sistemtico de los alimentos en cunto a la composicin de F y la comparacin de la AAO in vivo.
[Link]- RELACION ESTRUCTURAACTIVIDAD DE FLAVONOIDES

Los criterios estructurales para establecer la AAO estn definidos principalmente por: la presencia de un grupo catecol en el anillo B o anillo B ohidroxilado, capaz de donar tomos de hidrgeno o electrones para estabilizar especies radicalarias [ 34 , 35 , 36 ], y un doble enlace en posicin C-2,C-3 en conjuncin con un grupo oxo en posicin 4, responsables de la deslocalizacin electrnica 57

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

58

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

OH OH R.
RH

OH O R.
RH

O O

Fl-OH

Semiquinona

Quinona

Figura 3.10: Captura de especies reactivas de oxgeno por F [32].

La oxidacin de un F, con este patrn de sustitucin, ocurre sobre el anillo B formando o-semiquinonas, relativamente estables, Figura 3.10. A continuacin se detalla el efecto de cada uno de los parmetros estructurales: Grupos hidroxilos: El arreglo espacial de los sustituyentes es un factor determinante en la AAO. De acuerdo con lo observado para muchos AO fenlicos, tanto la posicin como el nmero total de grupos hidroxilos influyen sustancialmente sobre el mecanismo de la AAO. La presencia de grupos hidroxilos en el anillo B es ms efectiva que en el anillo A. Estos grupos hidroxilos donan hidrgeno y un electrn a radicales hidroxilos, peroxilos y peroxinitritos estabilizndolos y transformndose en radicales fenoxilos relativamente estables. En cuanto al nmero de hidroxilos presentes, Cao y col [37] indican, que a mayor sustitucin por grupos hidroxilos, mayor AAO expresada en ORAC.
OH OH HO O

Ciertas flavonas y flavanonas estructuralmente homlogas muestran un incremento lineal y exponencial respectivamente de la capacidad de atrapar radicales peroxilos e hidroxilos, con el nmero total de grupos OH, por ejemplo. Kaempferol (5,7,4trihidroxiflavonol), Quercetina (5,7,3,4tetrahidroxiflavonol) y Miricetina (5,7,3,4,5-pentahidroxiflavonol) tienen actividad en ORAC de 2,7; 3,3 y 4,3 respectivamente. Una estructura 3,4- catecol en el anillo B mejora fuertemente la inhibicin hacia la peroxidacin lipdica. Este arreglo estructural es una caracterstica importante de los ms potentes AO para atrapar radicales peroxilo, superxido, etc. Por ejemplo, la capacidad de capturar radicales peroxilo de Luteolina excede substancialmente a Kaempferol. Figura 3.11, a pesar de presentar el mismo nmero de grupos hidroxilos Se ha reportado que el principal factor que controla la actividad de los F con un sistema catecol en el anillo B es la estabilizacin por enlace puente

OH HO O OH

OH

OH

Figura 3.11: Estructura de Luteolina y Kaempferol respectivamente.

59

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

hidrgeno intramolecular del radical fenoxilo formado, Figura 3.12 [38]. El efecto de otros patrones de sustitucin no es claro, sin embargo las evidencias indican que el incremento del nmero total de grupos hidroxilos incrementa la AAO. Al respecto, F conteniendo solamente un grupo hidroxilo en el anillo B, especficamente en posicin 4, son pobres AO. El mecanismo de accin es va la formacin de un radical fenoxilo. Este es el caso particular de F sin la presencia del doble enlace en el anillo C, lo cual interrumpe la conjugacin. Dos ejemplos tpicos lo constituyen Apigenina (5,7,4-trihidroxiflavona) y Naringenina (5,7,4-trihidroxiflavanona) las cuales presentan la mnima reactividad posible debido a la relativamente lenta formacin del radical fenoxilo [29]. Los hidroxilos en posicin 3 y 5 potencian la accin antioxidante. Este patrn de sustitucin tambin les confiere la accin complejante de metales, como se vio en la Figura 3.9. Adems del nmero de grupos hidroxilos, un factor determinante para la AAO es su localizacin con respecto a los anillos. Que el anillo C est cerrado o no es indistinto para la efectividad, sin embargo son de fundamental importancia la presencia de un grupo hidroxilo en posicin 3 y un doble enlace en posicin C2-C3 que permite la conjugacin entre los anillos aromticos [39].
OH R OH
ROO.

Burda y Oleszek [40], analizaron la AAO y AAR de diferentes F a fin de elucidar la relacin entre la estructura qumica y su AAO informando que, comparado con BHT y -tocoferol, los compuestos con un grupo hidroxilo libre en posicin C3 muestran una capacidad antioxidante similar, indicando que dicho grupo hidroxilo es el responsable de la alta inhibicin de la oxidacin del caroteno en un sistema heterogneo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta la capacidad de acceso a la fase lipidica, la cual se modifica al bloquearse dicho grupo [29]. La glicosilacin o metilacin de otros hidroxilos no produce tal efecto. El ngulo de torsin del anillo B con respecto al resto de la molcula influencia fuertemente la capacidad de atrapar radicales. Flavonoles con 3-OH son planares, dado que se ha postulado que los grupos hidroxilos del anillo B forman enlace hidrgeno con el 3-OH alinendolo con el heterociclo C y el anillo A, mientras que flavanonas y flavonas carecen de coplanaridad y por lo tanto son dbiles AO. Remover el 3OH disminuye la coplanaridad y la conjugacin, por lo tanto compromete la capacidad antioxidante [41]. Ejemplo de esto lo constituyen Quercetina (5,7,3,4-tetrahidroxiflavonol), Figura 3.13, la cual exhibe un valor de TEAC de aproximadamente 4.7, mientras que Luteolina, sin el grupo 3-OH presenta un valor de 2.1, o sea una
O OH R O

OH

Figura 3.12: Estabilizacin del radical fenoxilo en el anillo B de los F por enlace puente hidrgeno intramolecular [38].

60

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

disminucin del 50% en la AAO. La sustitucin del 3-OH por un grupo metilo o por un glicsido suprime la actividad de Quercetina y Kaempferol.

OH OH HO O OH OH O

Figura 3. 13: Estructura del flavonol Quercetina. El sombreado indica las caractersticas estructurales importantes para la AAO de F.

por sulfato ferroso desde un 98.0% a 2.6% [42]. En conclusin la mayora de los investigadores acepta que la sustitucin de un grupo hidroxilo por un metilo compromete la AAO, sin embargo, la influencia de los grupos metilos no es clara ya que en la bibliografa existen datos aparentemente contradictorios. Dicha controversia puede deberse a que los resultados dependen del mtodo utilizado para su evaluacin, el tipo de radical usado y las propiedades fisicoqumicas de los AO, ya que, por ejemplo en un sistema lipdico, la lipofilicidad es un factor crucial para accin antioxidante.
El doble enlace C-2,3 y la funcin 4-oxo:

La o- metilacin.

Aunque la relacin de los sustituyentes metoxilo a hidroxilo no necesariamente condiciona la capacidad para atrapar radicales de los F, el anillo B es particularmente sensible a la posicin de los grupos metilos. Una configuracin 6-OH/4-OMe a una 6OMe/4-OH reduce completamente la capacidad de atrapar radicales DPPH por reducir la coplanaridad [39]. La diferencia observada en cuanto a la AAO entre F polihidroxilados y polimetoxilados radica principalmente en los efectos estricos que perturban la coplanaridad. La obstruccin estrica de la estructura 3,4-catecol por un OMe en posicin 4, compromete significativamente la capacidad AO. Por ejemplo, la sustitucin del grupo hidroxilo en posicin 4 de Quercetina por un grupo metilo (Tamarixentina) disminuye la inhibicin de la peroxidacin inducida

F con un doble enlace en posicin C2-C3 en conjugacin con un grupo carbonilo en posicin C4 presentan valores menores de EC50 (indicativo de una fuerte AAO) comparado con F cuyos heterociclos estn saturados. La mayora de los investigadores concuerdan que aquellos F que presentan ambas caractersticas estructurales son potentes AO. La conjugacin entre el anillo A y el B permite un efecto de resonancia que estabiliza al radical fenoxilo, optimizando el efecto de la estructura catecol del anillo B. Glicosilacin

En general, la glicosilacin reduce la capacidad de atrapar tanto

61

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

radicales libres como de inhibir la oxidacin [32]. Las agliconas son ms potentes AO que sus correspondientes glicsidos. Daidzena y Genistena aglicona exhiben mayores valores de TEAC (1,25 y 2,9) que sus 7-glicsidos (1,15 y 1,24 respectivamente) [ 43 ]. Adems de la presencia; la posicin y la estructura del azcar juegan un rol importante. Ioku y col. evaluaron el efecto de Quercetina y varios de sus glicsidos en una suspensin fosfolipdica liposomal expuesta a ROS en medio acuoso, Luteolin y quercetina exceden significativamente sus 3-4- y 7-Oglicsidos en la accin de retardar la acumulacin de hidroperxidos en bicapas de membranas, pero un azcar en posicin 4 presenta mayor efecto supresor que la sustitucin en posicin 3 7. Cuando la C-glicosilacin se da en el anillo A tambin disminuye la actividad y el efecto negativo puede ser una consecuencia del azcar en s mismo, ms que por la sustitucin de grupo hidroxilo original. Rice Evans y col [34] compararon los valores obtenidos para Naringenina (TEAC 1.5 0.05 mM) con Narirutina (5,4-dihidroxi-7-rutinsido (TEAC 0.76 0.05 mM mostrando que la glicosilacin en posicin 7 en una estructura con un heterociclo saturado y solamente un grupo OH en el anillo B reduce fuertemente la actividad antioxidante. Un efecto similar se observa con Hesperetina (TEAC 1.4 0.08 mM), comparado con su glicsido Hesperidina (TEAC 1.08 0.03 mM), lo cual es una evidencia de lo descrito anteriormente.

3.10-INTERACCION FLAVONOIDES Y ACIDO ASCORBICO

Existen innumerables evidencias acerca de que el consumo de frutas y vegetales es benfico para la salud y contribuye a la prevencin de procesos degenerativos tales como cncer y enfermedades cardiovasculares. Estas propiedades benficas han sido atribuidas a varios fitonutrientes entre los que se destacan el cido ascrbico (AA), y los F. La interaccin AA-F ha recibido una gran atencin por parte de los investigadores reportndose resultados aparentemente contradictorios, por un lado se postula que varios F sirven como CoAO para el AA mientras que otros autores indican lo contrario, es decir que el AA protege a ciertos F. Miller y Rice-Evans [ 44 ] determinaron la AAO, asociada fundamentalmente al AA, de jugos de naranjas, manzanas y grosellas negras comerciales y la estabilidad de Vitamina C en los mismos, concluyendo que las sustancias fenlicas presentes en los jugos (Hesperidina, Narirutina, Antocianidinas, etc) protegen a la Vitamina C, Figura 3.14. Los F retardan la degradacin de in ascorbato a cido dehidroascrbico (DHA). El mecanismo para esta proteccin implica el complejamiento de cobre y otras trazas de metales F, resultando en una disminucin de la oxidacin de AA catalizada por metales. Otro efecto implica la capacidad de los F para atrapar radicales libres. La formacin de los mismos est considerada como una etapa muy

62

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

100

% Remanente de Vit. C

80

60

40

los potenciales de reduccin de algunos F y combinaciones con AA en un sistema radical azida/ in ascorbato/ F a pH 8.5, empleando la tcnica de radiolisis pulsada. Las reacciones bsicas planteadas para ese sistema son:

20

FlO- + AH.
0 5 10 15 20 25

FlO. + AH-

3.31.a,b 3.32

tiempo (h)
Figura 3.14: Estabilidad de Vit. C proveniente de jugos comerciales de: grosellas negras (25%); grosellas negras (17%); naranjas con adicin de Vit. C; manzanas y Redoxn disuelto en agua mineral [44].

FlO. + FlO.
Fl = O + AH.

Fl = O + FlOH

FlO. + DHA 3.33.a,b

FlO. + AH.
FlO. + AH.

FlOH + DHA
Fl = O + AA

3.34 3.35 3.36

importante en la oxidacin del in ascorbato. En cuanto a lo fisiolgico [45], se han considerado varias interacciones tales como: a) Incremento de la absorcin del cido ascrbico b) Estabilizacin del cido ascrbico c) Reduccin de DHA a in ascorbato
Bors y col [ 46 ] estudiaron la interaccin F-AA sobre la hiptesis de la existencia de una analoga con el sinergismo observado entre in ascorbato y -tocoferol, ecuaciones 3.26 y 3.27. El trabajo consisti en determinar
Flavonoide K2 K1 k30a/ k30b k32a/ k32b 74.4 0.54 1.6x10-2 0.44 3.3x10-4 4.1x10-2 0.10 18.43 10.10 4.22 ln K1 4.31 -0.62 -4.15 -0.81 -8.02 -3.19

AH. + AH.

AA + DHA

Donde FlOH, FlO-, FlO. y Fl=O corresponden a F reducido, disociado, univalentemente oxidado (semiquinona o radical fenoxilo) y el totalmente oxidados (quinona) respectivamente, y AA, AH,AH y DHA denotan, cido Ascrbico, ion ascorbato, radical ascorbilo, y cido Dehidroascrbico. Los potenciales de reduccin de la Tabla 3.7 fueron obtenidos mediante los parmetros cinticos de las reacciones resaltadas 3.31 y 3.33. La reaccin descrita por la ecuacin 3.33 se plantea especficamente para aquellos F que forman o-quinonas en el anillo B.
Parmetros ln K2 E10 (mV) -2.29 2.91 2.30 1.44 -110 16 106 21 205 82 E20 (mV) 59 -75 -59 -37 E10 (mV) 83 209 299 214 398 275 E20 (mV) -115 -249 -233 -211

Dihidroquercetina Kaempferol Luteolina Fisetina Quercetina Rutina

Tabla 3.9. Parmetros termodinmicos de cuplas flavonoides/in ascorbato a pH 8.5 [46].

63

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

A partir de los parmetros termodinmicos y los potenciales de reduccin obtenidos, concluyen la existencia de dos comportamientos. Aquellos F que poseen una estructura catecol en el anillo B, presentan potenciales de reduccin mayores que los de la cupla del Ascorbato, por lo que en estos casos predomina la regeneracin del F, o sea la ecuacin 3.30b. Los F que no presentan las caractersticas estructurales mencionadas en el punto anterior tienen potenciales de reduccin menores que ascorbato, por lo que la reaccin predominante es la descrita en la ecuacin 3.30a, o sea la regeneracin de ascorbato a partir del radical ascorbilo. De considerable inters es el hecho de que el flavonol Quercetina, frecuentemente encontrado en alimentos, as como tambin su glicsido Rutina, son regenerados por in ascorbato a partir del correspondiente radical fenoxilo. Tal interaccin, anloga a la reaccin de AA con - tocoferol podra ser una evidencia de un efecto sinrgico entre un F y el in ascorbato. Galatti y col [47] compararon la actividad prooxidante de F y su capacidad de cooxidar in ascorbato. La reaccin consisti en oxidar in ascorbato en un sistema H2O2/peroxidasa en presencia de F. Se compararon las velocidades de cooxidacin de in ascorbato ante F conteniendo un slo grupo hidroxilo con sus equivalentes catecoles para tres clases de F: las flavonas Apigenina versus Luteolina, las flavanonas Naringenina versus Eriodictiol y los flavonoles Kaempferol versus

Quercetina. Los resultados indican que los radicales semiquinonas de polifenoles conteniendo estructura catecol en el anillo B son los responsables de oxidar in ascorbato ms rpidamente que las o-quinonas.
3.11-ACTIVIDAD PROOXIDANTE DE FLAVONOIDES

La presencia de algunas caractersticas estructurales que optimizan la AAO de los F, tales como la presencia de un sistema catecol en el anillo B, pueden tambin exacerbar su actividad prooxidante. Los radicales fenoxilos producidos durante la oxidacin de los F pueden actuar como prooxidantes en sistemas conteniendo metales activos. La presencia de oxgeno y metales de transicin tales como cobre y hierro, catalizan reacciones que forman ROS y otros radicales que pueden daar ADN, lpidos y otras molculas biolgicas [48]. El radical fenoxilo interacta con oxgeno molecular, generando quinonas y anin superxido. Esta ltima reaccin puede tener lugar en presencia de altos niveles de iones metlicos y es la responsable del efecto prooxidante indeseado de los F [49]. Esto es, la capacidad de actuar como AO de los F depende no slo del potencial redox de la cupla Fl-O./ FlOH sino tambin de las posibles reacciones del radical fenoxilo. La captura del radical superxido es particularmente importante, porque si bien este radical es de reactividad intermedia, es el precursor del radical hidroxilo, altamente reactivo.

64

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

OH + Cu(II) OH

O + Cu(I) + 2 H+ O

3.37

O + O2 O

O + O2-. O

3.38

OH + O2-. OH

O + H2O2 O

3.39

2 O2-. + 2 H+

H 2O 2 + O 2

3.40 3.41

Cu(I) + H2O 2

Cu(II) + HO. + HO -

La oxidacin inicial de catecoles por Cu (II) genera semiquinonas, ecuacin 3.37, que pueden reaccionar con oxgeno para formar el radical anin superxido, ecuacin 3.38. Esta reaccin tiene un carcter autocataltico dado que el anin superxido es capaz de oxidar a un nuevo F regenerando la semiquinona y perxido de hidrgeno el cual tambin se origina por desproporcin del radical superxido, ecuaciones 3.39 y 3.40. En presencia de trazas de Cu (I), el H2O2 es rpidamente convertido a radical . hidroxilo OH, en una reaccin tipo Fenton, ecuacin 3.41. La actividad prooxidante es directamente proporcional al nmero total de grupos hidroxilos. La presencia de grupos hidroxilos mltiples, como el caso de Miricetina (5,7,3,4,5pentahidroxi flavonol) especialmente en el anillo B, la incrementan [50]. La o- metilacin y probablemente otras modificaciones atenan tanto la conducta AO como la prooxidante [37]. En presencia de RNS, F con configuracin pirogallol (3 grupos

hidroxilos adyacentes) en el anillo A o B inducen daos al ADN. Existen evidencias que el doble enlace 2,3 y la funcin 4-oxo, adems de una estructura catecol en el anillo B, promueven la formacin de ROS inducidas por la presencia de Cu(II) y oxgeno [42]. Montenegro [7] en su trabajo postula que algunos F bajo irradiacin pueden presentar efectos prooxidantes por generacin de O2 (1g) mediante un mecanismo de transferencia de energa entre el F y el oxgeno molecular, ecuacin 3.39, pudiendo tambin actuar como AO por desactivacin del O2 (1g) tanto por va fsica como qumica, ecuaciones 3.44 y 3.45.

Fl
3Fl

1Fl

ISC

3Fl

3.42

+ O2(3g-)

Fl + O2(1g) 3.43

Desactivacin Fsica

Fl + O2(1g)

3Fl

+ O2(3g-)

3.44 3.45

Desactivacin Qumica

Fl + O2(1g)

FO2

65

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Los resultados indican que las formas Ch y Fl de N, con rendimientos cunticos de 0.03 y 0.04 respectivamente, son generadores dbiles de oxgeno singulete. Estos efectos prooxidantes son los responsables de la toxicidad de algunos F aislados a partir de hierbas medicinales. Al respecto, es importante destacar que el nivel de ingesta de F requerido para inducir mutaciones y citotoxicidad en humanos no es fisiolgicamente alcanzable a travs de una dieta rica en vegetales, sin embargo, el uso de suplementos, particularmente frmulas comercializadas como Antioxidantes y mezclas de hierbas, recomendadas en trminos de gramos por da, puede resultar en niveles potencialmente txicos. Por ejemplo, algunos fabricantes de suplementos recomiendan dosis de Quercetina, en un rango entre 500 a 1000 mg por da, el cual es 10 a 20 veces mayor que lo que puede consumirse a partir de una tpica dieta vegetariana. Esto sugiere que la comercializacin no regulada de estos suplementos pueden presentar efectos adversos a la salud humana [51].
3.12-ACCION ANTIOXIDANTE IN VIVO DE FLAVONOIDES

A pesar de las evidencias acerca de la actividad antioxidante in vitro de los F, es poca la informacin de su eficacia in vivo. Es importante destacar que la funcin antioxidante en sistemas biolgicos es mucho ms complicada que un simple proceso de captura de

radicales libres. Un AO puede afectar a un sistema biolgico por inhibicin de especies reactivas ROS y RNS, alterando la actividad de ciertas enzimas, afectando otros AO endgenos, secuestrando metales de transicin, etc. Existen evidencias de que algunos AO actan por uno o ms mecanismos en dichos sistemas. Los factores que influencian la eficiencia de un antioxidante in vivo son complejos y requieren consideracin acerca de su biodisponibilidad, lugar de accin, tipo de especie reactiva con la cual reaccionar, su estabilidad, toxicidad y los posibles efectos sinrgicos con otros compuestos. Todo esto hace que los resultados obtenidos in vitro no puedan ser extrapolados a sistemas in vivo. La actividad antioxidante in vivo de un compuesto depende fuertemente de su biodisponibilidad. Esta depende de varios factores, entre los que se incluyen su liberacin de la matriz alimentaria, su estabilidad frente a la flora intestinal, las modificaciones que experimente en el intestino, la absorcin a travs de la pared intestinal hacia el torrente sanguneo, la estabilidad en el hgado y su accesibilidad. La absorcin de estos polifenoles depende primariamente de factores relacionados con su estructura bsica, incluyendo el grado de glicosilacin, su tamao molecular y el nivel de conjugacin con otros polifenoles. Los F glicosilados son susceptibles de degradacin por microorganismos presentes en el intestino. Por esto, slo una pequea proporcin de los F digeridos alcanza el torrente sanguneo.

66

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

De acuerdo a muchos autores, flavonoles, flavonas e isoflavonas glicsidos son, en principio, hidrolizados a sus respectivas agliconas.[52,53] Sin embargo se ha demostrado, utilizando la tcnica de Cromatografa Liquida acoplada con Espectrometra de Masa LC-MS, la existencia de Rutina en sangre de voluntarios despus del consumo de pur de tomate. La cantidad absorbida de F normalmente no excede un pequeo porcentaje de la dosis ingerida. La composicin del alimento representa un factor importante para su disponibilidad. Protenas unidas a polifenoles reducen la biodisponibilidad, por el contrario el alcohol lo mejora, como ha sido demostrado en vino tinto, comparado con los niveles detectados luego de la ingesta de vino tinto sin alcohol. Adems, datos recientes informan tambin que las grasas mejoran la absorcin de ciertos F especficos, catequinas de t verde, proantocianidinas oligomricas de semillas de uva y silibinina de leche de cardo son absorbidas en un porcentaje mayor cuando son administrados con fosfolpidos. Durante la absorcin a travs de la membrana intestinal, flavonoles, flavonas, isoflavonas y catequinas son parcialmente transformadas a sus glucurnidos y sulfatos, Figura 1.7 Subsecuentemente, una pequea fraccin de los F absorbidos son metabolizados por enzimas del hgado, resultando en conjugados polares que pueden ser excretados en la orina. Sin embargo, la mayor parte son degradados por la microflora intestinal. Las enzimas bacterianas catalizan varias reacciones,

incluyendo hidrlisis, cortes del anillo heterocclico, dehidroxilacin y descarboxilacin. Durante estas reacciones se producen varios cidos fenlicos. Estos cidos fenlicos s pueden reabsorberse. Este aspecto es relevante por dos razones: la primera es debido a que estos cidos pueden representar una gran fraccin de los F ingeridos (30-60%) y la segunda razn es que algunos de esos cidos poseen una capacidad AO comparable con sus precursores. Esto sugiere que esos metabolitos pueden tomar parte en la proteccin AO. Se asume que los F dietarios pueden tomar parte de un sistema primario de defensa en el tracto digestivo, por limitar la formacin de ROS y por capturarlos. Una vez absorbidos, tanto glicsidos y agliconas, intactos y sus cidos fenlicos, continan ejerciendo un efecto AO. Este efecto in vivo se evidencia por mediciones del incremento total del potencial antioxidante de plasma despus de la ingesta de F contenidos en alimentos, bebidas o hierbas. Sin embargo existe una controversia acerca de esto, ya que por otra parte se ha informado que, comparado con otros AO potentes tales como AA y -tocoferol, las concentraciones de los F en el plasma son muy bajas y sin embargo otra hiptesis planteada indica que en realidad la actividad de los F est mediada por sus interacciones con protenas especficas, actuando como molculas seales, es decir presentan actividad farmacolgica en receptores, enzimas y factores de transcripcin [54]

67

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Bibliografa
[1] Melo, Enayde de Almeida; Guerra, Nonete Barbosa. Aao antioxidante de compostos fenlicos naturalmente presentes em alimentos. Bol SBCTA, Campinas, 36(1): 1-11, [Link]. 2002. Buettner, G. Oxygen Society Annual Meeting, RTP. NC. Nov 16-19, 2001. Jacob, R. A. The Integrated antioxidant system. Nutrition Research. 15. 5. 755-766. 1995. Fennema, O. Food Chemistry. Third Edition. Marcel Dekker Inc. Cap. 6. 1996. Vaya, Jacob: Aviram, Michael. Nutritional Antioxidant: Mechanisms of Action, Analyses of Activities and Medical Applications y bibliografa citada all. Cheftel, J.C.; Cheftel H. Introduccin a la bioqumica y tecnologa de los alimentos. Volumen 1. Editorial Acribia. Captulo III-2. 1976. Montenegro, M. Reactividad de Oxgeno Singulete frente a Sustancias Naturales presentes en Alimentos. Tesis Doctoral. Universidad Nacional de Santiago del Estero. 2004. Rong,T.; Zeyuan, D. Separation procedures for naturally occurring antioxidant phytochemicals Review J. Chromatogr. B. 812. Issue 1-2. 8589. 2004. Robards, K.; Prenzler, P.D.; Tucker, G.; Swatsitang, P.; Glover, W. Phenolic Compounds and their role in oxidative processes in fruits. Food Chemistry. 66. 401-436. 1999. Marinova, E. M.; & Yanishlieva, N. Antioxidative activity of phenolic acids on triacylglicerols and fatty acid methyl esters from olive oil. Food Chemistry. 56. 139-145. 1996. Madhavi, D. L.; Deshpande, S. S.; Salunkhe, D. K. Food Antioxidants: Technological, Toxicological and Health Perspectives. Marcel Dekker, Inc, 1995 y bibliografa all citada. Larson, A. R. Naturally ocurring antioxidants. Ed. Lewis Publishers. Pag 19. 1997. Heinonen, I. M.; Lehtonen, P. J:; Horpia, A. L. Antioxidant Activity of [14] berry and fruit wines and liquors. J. Agric. Food Chem. 46. 25-31. 1998. Ohnishi, M., Morishita, H.; Iwahashi, H.; Toda, S.; Shirataki, Y.; Kimura, M.; Kido, R. Inhibitory effects of cholorgenic acids on linoleic acid peroxidation and haemolysis. Phytochemistry. 36. 579-583. Gray, J. I. Measurement of lipid oxidation: a review. J. Am. Oil Chem. Soc.. 55. 539-546. 1978. Sheabar, F. Z: ; Neeman, I. Separation and concentration of natural antioxidants from rapes of olives. J. Am. Oil Chem. Soc. .65. 990-993. 1988. Hudson, B. J. F.; Lewis, J. L. Polyhydroxy flavonoids antioxidantss for edible oils. Structural criteria for activity. Food Chemistry 10. 47-55. 1983. Valkonen, M.; Kuusi, T. Spectrophotometric assay for total peroxyl radical-trapping antioxidant potential in human serum. J. Lipid Res. 38. 823-833. 1997. De Lange, R. J.; Glaze, A. N: Phycoerythrin fluorescence-base assay for peroxy radicals: a screen for biologically relevant protective agents. Anal. Biochem. 177. 300306.1989.[20] Miller, N.; RiceEvans, C.; Davies, M.; Gopinathan, V.; Milner, A: A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidants status in premature nenonates. Clin. Sci. 84. 407-412. 1993. Perez, D. D.; Leigthon, F.; Aspee, A.; Aliaga, C.; Lissi, E. A comparison of methods employed to evaluate antioxidant capabilities. Biol. Res. 33. 71-77. 2000. Re,R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M. Rice-Evans, C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Rad. Biol. Med. 26.9-10.1231-1237.1999. Brand-Williams, W.; Cuvelier, M. E:; Berset, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft

[2] [3] [4] [5]

[15] [16]

[17]

[6]

[18]

[7]

[19]

[8]

[9]

[10]

[21]

[11]

[22]

[12] [13]

[23]

68

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

[24]

[25]

[26]

[27]

[28]

[29]

[30]

[31]

[32] [33]

and Technologie. 28. 25-30. 1995. Taga, M. S.; Miller, E. E.; Pratt, D. E. Chia seeds as a source of natural lipid antioxidants. J. Am. Oil Chem. Soc. 61. 928-931. 1984. Wayner, D. D. M.; Burton, G. W.; Ingold, K. U.; Locke, S. Quantitative measurement of the total peroxyl radical-trapping antioxidants capability of human blood plasma by controlled peroxidation. FEBS Lett. 187. 33-37. 1985. Rice Evans, C.; Miller, N. J. Total antioxidant status in plasma and body fluids. Methods in Enzymol.. 234. 279-293.1994. Schimdt-Hebbel, H. Avances en Aditivos alimentarios y la reglamentacin de los alimentos. Aplicaciones y comentarios de orden qumico y tecnolgico. Ed Fundacin Chile, pp39. 1990 McCarthy, T. L.; Kerry, J. P.; Kerry, J. F.; Lynch, P.B.; Buckley, D. J. Evaluation of the antioxidant potential of natural food/plant extracts as compared with synthetic antioxidants and vitamin E in raw and cooked pork patties. Meat Science. 57. 45-52. 2001 Dangles, O.; Fargeix, G.; Dufour, C. Antioxidant properties of anthocyanins and tannins: a mechanistic investigation with catechin 3, 4, 7- trihydroxyflavylium ion. J. Chem. Soc. Perkin Trans 2, , 1653-1663. 2000 Pazos, M.; Gallardo, J. M.; Torres, J. L. Medina, I. Activity of grape polyphenols as inhibitors of the oxidation of fish lipids and frozen fish muscle. Food Chemistry. 92. 3. 547557. 2005. Rey, A. I.; Hopia, A.; Kivikari, R.; Kahkonen, M. Use of natural food/plant extracts: cloudberry (rubus chamaemorus), beetroot (beta vulgaris vulgaris) or willow herb (Epilobium angustifolium) to reduce lipid oxidation of cooked pork patties. Food Science and Technnology. 363370. 2004 Pietta, P.G. Flavonoids as Antioxidants. J. Nat. Prod. 63. 10351042. 2000 Jovanovic, S. V.; Steenken,S.; Tosic, M.; Marjanovic, B.; Simic, M. G.

[34]

[35]

[36]

[37]

[38]

[39]

[40]

[41]

[42]

[43]

Flavonoids as Antioxidants. J. Am. Chem. Soc. 116. 4846-4851 1994. Rice-Evans, C. A.; Miller, N. J.; Paganga, G. Structureantioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Rad. Biol. Med. 20:933 956; 1996. Bors, W.; Michel, C.; Stettmaier, K. Structure activity relationships governing antioxidant capacities of plant polyphenols. Methods Enzymol. 335:166 180; 2001. Bors, W.; Michel, C. Antioxidant capacity of flavanols and gallate esters: pulse radiolysis studies. Free Rad. Biol. Med. 27:14131426; 1999. Cao, G.; Sofic. E.; Prior, R.L. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: structure-activity relationships. Free. Rad. Biol. Med. 22. 5. 749-760. 1997. Barclay, L. R. C.; Edwards, C. E.; Vinqvist, M. K.; Dragster, L. O.: Skibsted, L. H. Regeneration of phenolic antioxidants activities of phenols and cathecols. J. Am. Chem. Soc. 121, 6226-6231. 1999. Matthiesen, L.; Malterud, K. E.; Sund, R.B. Hydrogen bond formation as basis for radical scavenging activity: a structure-activity study of Cmethylated dihydrochalcones from Myrica gale and structurally related acetophenones. Free. Rad. Biol. Med 22-2. 307-311. 1997 Burda, S.; Oleszek, W. Antioxidant and Antiradical Activities of Flavonoids. J. Agric. Food Chem. 49. 2774-2779. 2001 Bors, W.; Sller, W.; Michel, C.; Saran, M. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavening efficiencies. Methods Enzimol. 186. 343-355. 1990. Dugas Jr, A.J.; Castaneda-Acosta, J.; Bonina, G.C.; Price, K.L.: Fisher, N.H.; Winston, G.W. Evaluation of the total peroxyl radical scavenging capacity of flavonoids: structureactivity relationships. J. Nat. Products, 63. 327-331. 2000. Lai, H.H.; Yen, G.C. Inhibitory effects of isoflavones on peroxinitritemediated low-density lipoprotein oxidation. Biosc. Biotechnol, Biochem. 66. 22-28. 1990.

69

Captulo 3

Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

[44]

[45]

[46]

[47]

[48]

[49] [50]

[51]

[52]

[53]

[54]

Miller, N.; Rice-Evans, C. The relative contributions of ascorbic acid and phenolic antioxidants to the total antioxidant activity of orange and apple fruit juices and blackcurrant drink. Food Chemistry. 60 (3) 331337. 1997. Hughes, R.E.; Wilson, H.K. (1977) en Progress in Medicinal Chemistry (Ellis, G. P. and West, G. B. ed.) Vol 14, Elsevier, Amsterdam, pag 185 Bors, W.; Michel, C.; Schikora, S. Interaction of flavonoids with ascorbate and determination of their univalent redox potentials: a pulse radiolysis study. Free Rad. Biol Med. 19. 1. 48-52. 1995. Galatti, G.: Sabzevari, O.; Wilson, J.X.; OBrien, P.J. Prooxidant activities and cellular effects of the phenoxyl radicals of dietary flavonoids and other polyphenolics. Toxicology. 177. 91-104. 2002. Sakihama, Y.; Cohen, M.F.; Grace, S.C.; Yamasaki, H. Plant phenolic antioxidant and prooxidant activities: phenolic-induced oxidative damage medated by metals in plants. Toxicology. 177. 67-80. 2002 McCord, J. M. Proc. Exp. Biol. Med 202. 112-118. 1995 Hodnick, W.F.; Kung, F.S.; Roettger, W.J.; Bohmont, C.W.; Pardini, R.S. Inhibition of mitochondrial respiration and production of toxic oxygen radicals by flavonoids: structureactivity study. Biochem. Pharmacol. 35. 2345-2357. 1986. Skibola, C.F.; Smith, M.T. Potential health impacts of excessive flavonoid intake. Free Rad. Biol. Med.. 29. N3/4. 375-383. 2000 Manach, C.; Regerat, T.; Texier, O.; Agullo, G.; Demigne, C.; Remesy, C. Bioavailability, metabolism and physiological impact of 4-oxoflavonoids Nutr. Res. 16. 517-544. 1996. Nielsen, S. A.; Kall, M.; Justesen, U.; Schon, A.; Dragsted, L. O. Human absorption and excretion of flavonoids after broccoli consumption Cancer Lett. 114. 173-174. 1997. Willams, R.; Spencer, J.; Rice-Evans, C. Flavonoids: antioxidants or signaling molecules? Free Radic. Biol. 36.7. 838-849. 2004

70

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

4.1-INTRODUCCIN La ciclizacin de Ch a Fl es una reaccin crucial en la biosntesis de F en las plantas y est catalizada por una enzima especfica: la Ch-Fl isomerasa. La mayora de las Fl son estables en soluciones cidas y neutras. Sin embargo en soluciones bsicas experimentan la apertura del anillo C para dar la correspondientes Ch [1]. Esta transformacin no es completa debido a la tendencia de las 2-OHCh en volver a ciclar establecindose un equilibrio cuya posicin depende del los sustituyentes, la composicin del solvente y el pH, Figura 4.1. Como se mencion en el Captulo 1, tanto las Fl como las Ch son el material de partida para el resto de los flavonoides, Figura 1.5, y es precisamente este hecho el que ha motivado a numerosos investigadores a estudiar el equilibrio y el efecto de diferentes factores que afectan la posicin del mismo, tales como grupos sustituyentes en el ncleo flavonoide [2], efecto del solvente [3, 4], pH [1] y la temperatura [2],entre otros. Para el caso particular de. Naringina (N), el estudio del equilibrio y las condiciones que lo controlan son de

OH R R O Chalcona R

O R O Flavanona

Figura 4.1: Equilibrio de isomerizacin Ch-Fl.

71

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

R''
RO
7 6 8

R'
RO
4' 5' 6' 3' 2' 4

C
2 3 2'

4' 3'

A
5

R'

OH
2

R''

OH O Flavanona

OH O Chalcona

Compuesto Flavanonas Naringina (N) Hesperidina (H) Chalconas Naringina Chalcona (NCh) Hesperidina Chalcona (HCh)

Patrn de sustitucin R -O-neohesperidsido -O- rutinsido -O-neohesperidsido -O- rutinsido R -H -OH -H -OH R -OH -OCH3 -OH -OCH3

Figura 4.2: Estructura qumica de las flavanonas de N y H y sus correspondientes Ch.

gran inters dado que su forma Ch, por una simple reaccin de hidrogenacin origina la correspondiente dihidrochalcona con propiedades edulcorantes equivalente en base molar a la sacarina. Por otra parte, tanto Hesperidina (H) y su chalcona derivada, hesperidinmetilchalcona (HCh) son ampliamente utilizadas en el tratamiento de enfermedades tales como insuficiencia venosa crnica [5], entre otras. En este captulo se presenta un estudio cintico del efecto del solvente, (H2O, EtOH y mezclas de ambos) sobre el equilibrio Fl-Ch de N y H, Figura 4.2, en condiciones donde el mecanismo de isomerizacin es controlado por la formacin de un carbanin intermediario. Se determinaron los parmetros cinticos y termodinmicos asociados a la reaccin de isomerizacin mediante la utilizacin de espectroscopa

de absorcin UV-Vis y cromatografa lquida de Alta Resolucin (HPLC). 4.2- ESPECTROSCOPIA UV-VIS DE FLAVANONAS Y CHALCONAS. El espectro de absorcin UV- Vis de las Fl exhiben dos mximos de absorcin: una banda intensa en la regin de 270-295 nm, asociada al anillo A, denominada Banda II y un hombro o pico de menor intensidad en la regin de 300-390 nm, denominado Banda I, originada por el anillo B. El espectro de estos compuestos no es afectado por cambios en la oxigenacin del anillo B, sin embargo el incremento de oxigenacin en el anillo A provoca corrimientos batocrmicos de la Banda II. Para las Ch, debido a la presencia del doble enlace C2-C3 que extiende la conjugacin desde el anillo B, la situacin es diferente ya que la banda dominante corresponde a la Banda I,

72

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

30000

Naringina
Flavanona Chalcona
14000

Hesperidina
Flavanona Chalcona

(M cm )

-1

(M cm )

-1

-1

-1

20000

7000

10000

0 300 400 500 600

0 300 400 500 600

(nm)

(nm)

Figura 4.3: Espectros de las formas Fl y Ch de N y H en soluciones etanlicas neutras.

localizada en la regin de 340-390 nm, mientras que la Banda II de menor intensidad y se encuentra en la regin 220-270 nm. La presencia de un grupo hidroxilo en posicin C-2 tiene un marcado efecto sobre el mximo de absorcin, por ejemplo 4,4dihidroxichalcona (= 348 nm) y 2,4,4trihidroxichalcona (= 370 nm). En la Figura 4.3 se muestra el espectro de la flavanona N y su Ch en EtOH. Para N se observa un mximo principal a 284 nm (Banda II, log = 4.28) y una banda minoritaria a 330 nm (Banda I). Para NCh se observa un mximo principal a 366 nm (Banda I, log = 4.51). Para H el espectro UV- Vis presenta dos mximos de absorcin, uno a 285 nm (Banda II, log = 4.27), un hombro a 330 nm (Banda I) [6], mientras que para HCh la banda principal est centrada a 371 nm (Banda I, log = 4.3) [7]. En la Figura 4.3 se observa que si bien tanto las Fl como las Ch de ambas sustancias presentan mximos de absorcin similares, el coeficiente de

absortividad molar de las Ch con respecto a sus correspondientes flavanonas son diferentes. Para NCh el valor de experimenta un importante incremento, casi un 50%, con respecto a su Fl; mientras que HCh presenta un coeficiente de absortividad menor que H. Las principales caractersticas de una banda de absorcin son su posicin e intensidad. Esta ltima depende de dos factores, el primero implica la probabilidad de la interaccin entre la energa de radiacin y el sistema electrnico lo que ocasiona la transicin desde el estado fundamental al estado excitado, y el segundo factor depende de la polaridad del estado excitado. Sobre la base de estos hechos las diferencias observadas pueden explicarse en funcin de las diferencias estructurales de ambos compuestos. Para H, la sustitucin en C-4 y C3 modificara la coplanaridad del anillo B, provocando una disminucin en el coeficiente de extincin de H con respecto a N, este efecto sera mayor para las formas Ch.

73

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

1.0
0.4 0.3

1.5

0.8

Abs

Abs

288 nm 430 nm

0.2 0.1 0 40

288 nm 430 nm

0.4

1.0

Abs

Abs

0.5

tiempo (min)

80

tiempo (min)

30

60

90

0.5

t =10 s
0.0
0.0

t = 10 s

300

(nm)

400

500

300

400

500

(nm)

Figura 4. 4: cambios espectrales de A) N y B) NCh producidos por el agregado de NaOH 1.25 mM en soluciones EtOH-H2O (XW = 0.03).

4.3- EFECTO DEL AGREGADO DE NaOH SOBRE LOS ESPECTROS UVVIS DE NARINGINA Y HESPERIDINA. La Figura 4.4 muestra los cambios espectrales, producidos por el agregado de NaOH 1.25 mM, en soluciones EtOH-H2O, XW = 0.03, de N y NCh. En todos los casos el agregado de base provoca cambios espectrales instantneos, seguido de cambios dependientes del tiempo. Para N, la Figura 4.4.A muestra que inmediatamente despus del agregado de base (t <10 s), se produce un ligero corrimiento batocrmico de la Banda II desde 284 nm a 288 nm y la aparicin de una banda a 245 nm, cambios asociados con la deprotonacin del grupo hidroxilo en posicin C-5 del anillo A [1,6]. Simultneamente, para la Banda I, se observa un importante desplazamiento batocrmico de 35 nm, el cual est asociado a la presencia de una especie carbaninica intermediaria 74

formada, luego de la deprotonacin del grupo hidroxilo en posicin C-4, por abstraccin de un tomo de hidrgeno en posicin C, cuyo mecanismo de formacin se detallar ms adelante. Esto fue corroborado utilizando el ensayo del NaOAc, descrito en la seccin 1.3, el cual al ser una base dbil deprotona el grupo hidroxilo ms cido de la molcula. Los espectros de la Figura 4.5 muestran que la adicin de dicha sal no provoca cambios en la Banda II, sin embargo, la Banda I muestra un corrimiento batocrmico de 8 nm, indicado en el inserto de la Figura 4.5, el cual corresponde a la deprotonacin del grupo fenlico en posicin C-4 del anillo B. De esta manera se confirma la hiptesis de que el corrimiento de 35 nm de la Banda I, observado en la Figura 4.4.A, no corresponde a la deprotonacin de los grupos fenlicos de la molcula sino a la formacin de la especie carbaninica de N.

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

1.20

8 nm

0.6

1.16

1.12 315 330 345

0.4

Abs

(nm)

0.2

0.0 250

N N +NaOAc (30 min)

300 350 400 450

(nm)
Figura 4. 5: Cambios espectrales de soluciones metanlicas de N ante el agregado de NaOAc

Luego de los cambios instantneos se observa el crecimiento de una banda centrada a 430 nm, y la disminucin simultnea de las bandas formadas a 245 nm y a 288 nm, tornando a la solucin de incolora a amarilla. A medida que transcurri la reaccin, (10 s < t < 2500 s), se observ la aparicin de puntos isosbsticos a 256, 267 y 304 nm los cuales indican la existencia de un equilibrio o de la transformacin directa

al producto final, por ej., RP. Por otra parte, los perfiles cinticos para los cambios de absorcin observados a la desaparicin de la banda de 288 nm y la formacin de la banda a 430 nm presentan las mismas constantes de velocidad de primer orden, indicando que la especie formada instantneamente por el agregado de HO- se transforma ms lentamente en la especie de color amarillo. La comprobacin de dicho equilibrio se produce cuando se realiza el mismo experimento partiendo de una solucin de NCh, Fig. 4.4B. En este caso el agregado de base provoca de manera instantnea el corrimiento de la Banda I desde 367 nm a 430 nm, asociado a la deprotonacin de los grupos 2-OH y 4OH principalmente, dado que se ha informado que los valores de pKa son 6.9 y 8.5, respectivamente, mientras que el grupo 6-OH tiene un pKa= 12 [1]. As es claro que la banda visible a 430 nm corresponde a la forma deprotonada de la chalcona de N, NCh.

Abs (x1x10 )

-1

0.24

t = 0 min t = 90 min
0.18

NCh

0.12

0.06

0.00 0 4 8 12 16

tiempo (min)

Figura 4. 6: Cromatogramas inicial (negro) y final (trazos) obtenidos para la reaccin N en medio etanlico bsico [NaOH] =1.25 mM. Condiciones: columna ODS-2 (250x46 mm i.d., 5 m), T: 25 C. Fase mvil H2O-ACN-HAc (79.5: 20: 0.5). Flujo 1.2 ml/min. Deteccin 330 nm.

75

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

Naringina Xw 0.03 0.15 0.24 0.36 0.52 0.52 0.52 0.52 0.52 0.64 0.76 0.76 0.76 0.91 0.97 1.00 1.00 1.00 1.00 NaOH (mM) 1.25 1.25 1.25 1.25 0.13 0.25 0.40 1.25 4.00 1.25 1.25 3.72 9.80 1.25 1.25 0.32 0.89 1.25 3.16 kobs /10 (s-1) Fl + HOCh + HO1.4 0.5 1.3 0.2 1.9 0.5 1.8 0.3 2.3 0.5 2.6 0.5 2.5 0.1 2.5 0.1 2.2 0.2 2.2 0.2 1.8 0.2 1.5 0.1
3

KFlCh (ka/kc) 1.7 0.2 2.4 0.2 3.0 0.2 0.07 0.02 0.09 0.02 0.8 0.1 3.4 0.3 3.3 0.2 2.7 0.3 1.5 0.2

Hesperidina kobs /103 KFlCh (s-1) (ka/kc) Fl + HO0.80 0.04 0.37 0.04 1.25 0.01 0.48 0.03

2.5 0.5

2.3 0.1

1.57 0.03

0.31 0.02

1.5 0.2

0.8 0.1 0.5 0.1 1.3 0.1 0.56 0.04 0.49 0.02 0.49 0.05

0.8 0.1

0.48 0.01

0.57 0.05 0.29 0.08 0.04 0.01 0.18 0.02 0.23 0.04 0.24 0.10

1.90 0.05 2.03 0.05 2.24 0.05 1.70 0.09

0.33 0.03 0.45 0.05 0.37 0.02 0.18 0.01

1.48 0.08

0.19 0.02

XW = fraccin molar de H2O

Tabla 4. 1: Constantes de primer-orden observadas, kobs, y constantes de equilibrio K para isomerizacin Fl- Ch en mezclas EtOH-H2O en presencia de NaOH a 25 C, usando tanto la Fl como Ch como reactivo inicial.

-2.0

-4.00

-4.0

A
-2.5 -3.0

-4.05 0.12

B
-4.1

-4.10

Abs (358 nm)

log k

-4.15

0.08 -4.2

log ka

-3.5

-4.20

-4.0

-4.25

0.04
-4.30

-4.3
-6 -6 -5 -4 -4 -3 -2 -2 -1 0 0

-4.5 -4.0

-3.5

-3.0

-2.5

log [NaOH]

- log [NaOH]

Figura 4.8.A) Efecto de la concentracin de NaOH sobre ka (crculos) y kc (cuadrados) en mezclas EtOHH2O (XW = 0.52) (smbolos negros) y en H2O (smbolos grises) de N. B) smbolos llenos: Curva de titulacin para N en buffer Na2HPO4- NaH2PO4, smbolos abiertos: variacin de ka con la concentracin de base.

79

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

O
RO

O H H O Fl2O rpido
-OH

RO

O ka

RO

H O O Fl3Carbanin

kc lento

OH O Ch2-

Figura 4.9: Mecanismo de reaccin propuesto para el equilibrio Fl ! Ch

Las reacciones que operan bajo este mecanismo implican primero la abstraccin de un tomo de hidrgeno por parte de una base, originando un carbanin o base conjugada del sustrato a partir de la cual, en una segunda etapa, parte el grupo saliente. Existen algunas evidencias que apoyan la hiptesis de que el equilibrio Fl-Ch opera bajo el mecanismo E1cB, Figura 4.9. Este mecanismo se presenta particularmente en sustratos conteniendo hidrgenos cidos y pobres grupos salientes, tal como fenoxilos, presentes en las flavanonas. Por otra parte, se ha sugerido tambin que, todas las eliminaciones iniciadas por bases, donde el tomo de hidrgeno est activado por un grupo tomador de electrones, tal como el grupo carbonilo en las flavanonas, operan bajo el mecanismo E1cB [9] De acuerdo con este mecanismo, la reaccin de apertura sucede va un preequilibrio rpido en el cual, por abstraccin del tomo de hidrgeno en posicin C-3, el ms cido de la molcula de la flavanona ionizada, se forma el carbanin Fl3-. Este carbanin puede retornar al compuesto de partida Fl2-, o bien continuar hasta la chalcona ionizada Ch2-, siendo ste el paso

determinante de la reaccin con una constante de velocidad ka. Este preequilibrio explica la variacin de las constantes de velocidad con la concentracin de la base. A medida que aumenta la concentracin de la base, la reaccin se desplaza hacia la formacin de Fl3-. Cuando log [NaOH] > -3 la formacin del carbanin es prcticamente completa, y la velocidad de la reaccin se torna independiente de la concentracin de la base. De acuerdo con lo anterior, la grfica sigmoidal de la Figura 4.8.A puede considerarse como la curva de titulacin para el pre-equilibrio cido de formacin del carbanin, con un valor de protonacin media (50% de carbanin), (log[NaOH])1/2 -3.4 (0.3), considerando los datos en H2O y al 25% v/v H2O en EtOH. Estos resultados son comparables a lo informado en la bibliografa para el equilibrio entre la flavanona base, y su 2-OHCh, (log[NaOH]1/2) -2.2 medidos en H2O [10]. La Figura 4.10 muestra el efecto de la composicin del solvente sobre los valores de las constantes de velocidad de reaccin para N y H. Se observa que para N, ka alcanza un mximo en mezclas con XW 0.5, mientras que para la constante de cierre kc prcticamente no se observan mayores cambios con la composicin de la 80

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

Xw 0.03 0.52 0.76 0.91 1.00

Naringina Ha 60 3 54 3 66 3 77 2 85 2
-1

Hesperidina Sc -65 1 -10 3 -69 1 -59 2 -69 5

-1

Sa -100 7 -116 5 -86 5 -56 5 -36 5

Hc 72 5 89 3 72 4 74 1 72 3
-1

Ha 75 2 79 3 65 2 73 3 62 9

Sa -65 7 -45 11 -93 6 -70 9 -108 30

Hc 68 6 72 1 62 3 72 2 5910

Sc -7620 -594 -8911 -56 7 -103 34

H = [ kJ mol ]; S = [J K mol ]
Tabla 4. 2: parmetros de activacin para las reacciones de apertura (a) y cierre (c) de N y H en funcin de la composicin de la mezcla EtOH-H2O. ([NaOH] = 1.25 mM).

Flavanona

HO rpido

Carbanin
lento

Chalcona Anin
OMe

H+
rpido

Chalcona

RO

HESPERIDINA
O O

HO OMe RO O O O O O O RO O O O O RO O O OMe

OMe

O RO O

NARINGINA
O O

HO RO O O O O O O RO O O O O RO O O

Figura 4. 12: Estructura de resonancia de los carbaniones de N y H

82

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

Componente 1 A (1-); B () T; =eq (T) Equilibrio

Componente 1 A (1-); B () T; =eq (T) Equilibrio

Proceso Isodlfico Cambio de T H01 TS01

Componente 1 A (1-); B () T; =eq (T) No equilibrio

Proceso Liodlfico Isotrmico H01 = TS01 G01= 0

Figura 4. 14: Descripcin de las etapas isodlfica y liodlfica para una perturbacin de un sistema en equilibrio.

las especies moleculares son derivadas de los componentes formales tales como ismeros, dmeros, etc, los cuales se encuentran en un equilibrio dinmico. Este equilibrio dinmico es sensible a la adicin de cualquier componente, ya sea soluto o solvente ya que por ejemplo, la adicin de solutos polares favorece la formacin de subespecies polares del solvente como as tambin la adicin de solutos no polares favorece la formacin de especies no polares. De la misma manera si al sistema se adicionan solutos capaces de formar puente hidrgeno, stos interferirn en el equilibrio existente entre las especies de solvente. El modelo postula que cualquier cambio finito en una variable de estado puede ser representado como la suma de cambios infinitesimales, de tal manera que el sistema est inicial y finalmente en un equilibrio molar. Bajo este mecanismo cada paso infinitesimal puede ser dividido en un

paso isomolar o isodlfico , en el cual el sistema parte de un equilibrio molar seguido de un segundo paso denominado de variacin, cambio molar, o componente liodlfica en el cual el sistema resultante retorna al equilibrio bajo las nuevas condiciones, Figura 4.14 Cualquier cambio finito en una variable de estado, en principio, incluye una contribucin con una compensacin entalpa-entropa exacta. El CEE postula que todas las subespecies de una misma especie que estn en un equilibrio antes de cualquier cambio se reorganizan o redistribuyen de manera tal que la energa libre de este proceso es cero. Dentro de esta teora, el CEE para soluciones lquidas puede explicarse mediante un mecanismo termodinmico denominado mecanismo de solvatacin. En fases lquidas se pueden generar diferentes ismeros ambientales. En la Figura 4.15 se muestra un ejemplo de solucin diluida

85

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

A A A A/a

A A A

A A A A/u A/u

A/u U/a

Figura 4. 15: Ejemplo de ismeros ambientales en soluciones diluidas. A= molculas de solvente. U = molculas de soluto. Ambientes: /a: adyacente nicamente a molculas de solvente, /u: adyacentes a una molcula de soluto.

formada por molculas de solvente (A) y molculas de soluto (U). En este sistema la especie molecular del solvente consiste en dos subespecies A/a y A/u definidas en la Figura 4.15, mientras que el soluto, por ser una solucin diluida, slo contiene la subespecie U/a. De manera general, la expresiones matemticas para los parmetros termodinmicos de una solucin implican;

G G = + y n2 y , n1 n2 , n1 n2

4.25

Donde la primera diferencial corresponde al proceso isodlfico y la segunda al liodlficoEn el equilibrio, por definicin y = 0 , por lo tanto la ecuacin se reduce a:

G G = G2 = n2 y=0 ,n1 n 2 eq ,n1

4.26

(dG )n

G G = dn2 + d n2 ,n1 n2 ,n1

4.24

Donde n1, n2 corresponden al peso frmula del solvente y soluto respectivamente y es la fraccin molar de las subespecies e indica el progreso de la reaccin. Durante la perturbacin del equilibrio, se ajusta a s mismo cuando se adiciona el soluto mantenindose la energa libre en un mnimo, siendo (G / ) n1,n 2 = 0 . Para ser capaz de especificar esta restriccin se introduce una nueva variable, y = (G / )n1 , n2 . Por definicin, y=0 cuando =eq. La transformacin matemtica de G(n2, ) a G(n2, y) es decir cuando el sistema es perturbado, se describe en la ecuacin 4.25. 86

En la ecuacion 4.23 la variacin de energa libre corresponde a la suma de los trminos asociados a los procesos isomolar y al de variacin molar. El (G / n2 ) expresa trmino isomolar el cambio de energa libre molar parcial cuando se introduce el soluto sin variacin en . El trmino de variacin o corrimiento molar expresa el efecto de la variacin en : ( / n2 ) y por mol de y = (G / ) soluto adicionado y expresa la respuesta de G al corrimiento de . La ecuacin 4.24 indica que la energa parcial molar del soluto no es afectada por la perturbacin del solvente. De manera similar, la entropa y entalpa molar parcial se expresan de acuerdo a las ecuaciones 4.27 y 4.28
4.27 2 G S 2 = (S 2 ) + 2 T ,n 2 T n 2,eq n2 T ,eq

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

4.28 2 G H 2 = (H 2 ) + 2 T ,n 2 T n 2,eq n2 T ,eq

Isodlfico Isodlfico

Donde Si y Hi representan la entropa y entalpa molar parcial del isimo componente bajo condiciones de equilibrio qumico a T y P constante, (Si) representa a la entropa y entalpa del isimo componente adicionado, a T y P constantes, bajo condiciones de no equilibrio es decir bajo el proceso isodlfico. Como se muestran en las ecuaciones 4.26, 4.27 y 4.28, para G la contribucin liodlfica es cero dado que G2 es rigurosamente una propiedad isomolar, pero para H y S la dicha contribucin es diferente de cero. La ley de compensacin puede derivarse entonces como un caso especial donde la contribucin liodlfica es mayor que la isodlfica:

H = G + TS
H + H liodlfica = G + T S + T S liodlfica

4.27

4.28

H = G + TS
H liodlfico = T S liodlfico

4.29 4.30

De las ecuaciones 4.29 y 4.30 se observa que el trmino isodlfico compensa exactamente, por lo cual el CEE emerge cuando la componente liodfica de la entalpa es mucho mayor que la contribucin isodlfica. Este modelo, aplicado a nuestro caso implicara que la adicin del segundo solvente, EtOH o H2O, perturba 87

al equilibrio existente entre el soluto, o sea el carbanin, y el solvente. A medida que se adiciona el segundo solvente el equilibrio es pertubado y con ello por ejemplo, la capacidad donora de puente hidrgeno del solvente en su conjunto. De acuerdo a esta teoria, la reorganizacin del sistema involucra las dos etapas antes mencionadas, el corrimiento isodlfico, sin compensacin, y el paso de liodelfico, donde el sistema retorna al equilibrio. De esta manera las propiedades termodinmicas del sistema se modifican de manera tal de alcanzar el equilibrio bajo las nuevas condiciones. Particularmente para la reaccin de isomerizacin de las flavanonas, el efecto de compensacin implica el desplazamiento del equilibrio dinmico de interacciones unin hidrgeno entre el carbanin Fl3- y su esfera de solvatacin, compuesta por molculas de EtOH y H2O. Puesto que tanto las molculas de H2O como de EtOH presentan una gran tendencia a participar como donoras y aceptoras de puentes hidrgeno, la formacin de los mismos entre ambos solventes se ve favorecida y la entalpa disminuye. Como estos enlaces requieren de la participacin de molculas en posiciones relativamente fijas tambin disminuye la entropa [13]. Por otro lado hay que tener en cuenta que las mezclas EtOH-H2O no se comportan idealmente, y que las interacciones unin hidrgeno solventesolvente son mximas a Xw 0.6, como se concluye a partir de la disminucin observada en el valor de volumen molar de exceso para la mezcla a dicha composicin, Figura 4.16 [14]. Esto implica que a dicha composicin las

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

interacciones soluto-solvente son altamente reducidas. Por otra parte, para caracterizar la polaridad de un solvente, Taft y col. [1] idearon y determinaron el conocido parmetro emprico . Este parmetro es sumamente til para cuantificar la capacidad donora de unin hidrgeno (HBD) de un solvente. En la Figura 4.16 se muestra que dicho factor es mnimo a Xw 0.8 indicando que a esa composicin la capacidad de interaccin soluto solvente es mnima.
1.3 0.0 1.2 -0.2

alfa Volumen exceso

1.3

reaccionan bajo el mismo mecanismo E1cB o mecanismo carbaninico. En cuanto al comportamiento cintico, las diferencias observadas en las velocidades de apertura y cierre entre N y H pueden explicarse sobre la base del efecto de los sustituyentes en el anillo B de ambas flavanonas. En cuanto a la optimizacin de las condiciones para la obtencin de Ch, los valores de Keq, Tabla 4.2, indican que la reaccin se encuentra desplazada hacia la forma Ch a Xw =0.52 para N y Xw=0.24 para H ambas a pHap= 11, coincidentes con los parmetros cinticos de la Figura 4.11.

1.2

Volumen exceso

parametro alfa

-0.4 1.1 -0.6 1.0 -0.8 0.9 -1.0

1.1

1.0

0.9

-1.2 0.8

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.8

Xw
Figura 4. 16: Parmetros (capacidad donora de puente hidrgeno) y volumen de exceso en funcin de la composicin del solvente para mezclas EtOH: H2O [12,13,14].

4.5- CONCLUSIONES Tanto para N como para H existe un equilibrio entre sus formas flavanonas y chalconas. En medio bsico, pH aproximado de 11, N se encuentra desplazada hacia su forma Ch ocurriendo lo contrario para H, como lo indican los valores de K, Tabla 4.2. La existencia de un CEE para los parmetros termodinmicos es una evidencia de que ambas flavanonas

88

Captulo 4

Estudio cintico del efecto del solvente sobre el equilibrio Flavanona-Chalcona

Bibliografa
[1] C.O. Miles, and L. Main, The kinetics and mechanism, and the equilibrium position as a function of pH, of the isomerization of naringin and the 4rhamnoglucoside of 2,4,4,6tetrahydroxychalcone. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 195 198. 1988. Furlong, J.J.P.; Ferretti, F. H.; Pappano, N. B.; Debattista, N. B.; Borkowsky, E.J.; Kavka, J. Cinetica de la isomerizacion de chalconasflavanonas. I. Sistema 2,4dihidroxichalcona a 7hidroxiflavanona. An. Asoc. Quim. Arg. 81. 199-204.1985. Furlong, J.J.P.; Sbarbati Nudelman. Ciclization of substituted 2hydroxychalcones to flavanonas. Solvent ans Isotpe effects. J. Chem. Soc. Perkin Trans II. 12131217.1988. Gonzlez, E.A.; Nazareno, M. A.; Borsarelli,C.D. Enthalpyentropy compensation effect in the chalcone formation from naringin in water ethanol mixtures J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2. 20522056. 2002. Garg, A.; Garg, S.; zaneveld, L.J.D.; Singla, A.K. Chemistry and Pharmacology of the citrus bioflavonoid Hesperidin. Phytother. Res. 15. 655-669. 2001. Mabry, T.; Markham, K.; Thomas, M. The Systematic Identification of flavonoids, Springer- Verlag, New York. Capitulo VI. 1970. Shimokoriyama, M. Interconversion of Charcones and Flavanones of a Phloroglucinol-type structure. Journal Am. Chem. Soc. 79, 4191-4202. 1957. Espenson, J.H. Chemical kinetics and reaction mechanisms 2nd edition, Mac Graw-Hill, New York, 1995. March, J. Advanced Organic Chemistry. John Wiley & Son Inc. 3rd Ed. Edition November 1986. Cisak, A.; Mielczarek, C. Practical and theoretical aspects of flavanonechalcone isomerisations. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1603 1607. 1992. [11] Liu, L.; Guo, Q. Isokinetic relationship, isoequilibrium relationships and Enthalphy- Entropy compensation. Chem. Rev. 101. 676695. 2001. Grunwald, E. Thermodynamic properties, propensity laws and solvent models in solutions in selfassociating solvents. Application to aqueous alcohol solutions. J. Am. Chem. Soc. 106, 5414- 5420. 1984. Grunwald, E. Thermodynamics of molecular species. Ed. Wiley; New York, 1996. Ogawa, H.; Murase, N.; Murakami. S. Behavior of solutes in water + ethanol mixed solvent. Part 1. Partial molar volumes, enthalpies of solution and chemical shift of 1H NMR for sucrose, urea and 1-phenyl-2thiourea solutes. Thermochim. Acta. 253, 41 49. 1995. J.L. Abboud, M.J. Kamlet, R.W. Taft, Prog. Phys. Org. Chem. 13 485. 1981

[12]

[2]

[13] [14]

[3]

[4]

[15]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9] [10]

89

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Flavanona- Chalcona de Naringina

5.1-INTRODUCCIN Como se mencion en el Captulo 2, las chalconas son un importante grupo de sustancias precursoras biosintticas del resto de la familia de los flavonoides. La relacin entre estos compuestos y la luz ha sido motivo de numerosas investigaciones. La utilizacin de chalconas como fotoestabilizadores de polmeros, en lociones de proteccin solar y en fotografa [ 1 ], indican lo interesante de su fotoqumica. El efecto de la luz sobre las reacciones de los F se ve reflejado desde la biosntesis, ya que ha sido demostrado que la irradiacin directa de 2OH-Ch contenida en cultivos celulares de Petrollinum hortense [2], incrementa la produccin de F. Las reacciones que experimentan las Ch en presencia de luz son muy diversas e implican fotociclizacin a flavanonas [3,4], sntesis de flavonas [5], fotodimerizacin [1], fotoisomerizacin cis-trans [6], entre otras. Por otra parte, se ha informado tambin acerca de la irradiacin de flavanonas la cuales conducen a la formacin de 2-OH-Ch, 4fenildihidrocumarina y cido saliclico [7]. Sobre la base de estos antecedentes se presenta un estudio acerca del efecto que produce la luz tanto sobre las velocidades de reaccin del equilibrio Fl-Ch, como las posibles reacciones secundarias que pudieran tener lugar en presencia de irradiacin. Es importante aclarar que nuestros estudios preliminares indicaron que no existe efecto de la luz sobre Hesperidina, H, ni sobre su chalcona; por lo que el presente trabajo se refiere exclusivamente al efecto de la luz sobre el equilibrio Naringina, N, Naringina Chalcona, NCh.

91

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

5.2- EFECTO DE LA LUZ SOBRE SOLUCIONES ACIDAS Y NEUTRAS. 5.2.1- SOLUCIONES ACUOSAS CIDAS. La Figura 5.1 muestra los cambios espectrales que se producen en soluciones de NCh en buffer de citratofosfato (1 mM) de pH 3.6 irradiada con luz de 360 5 nm, correspondiente a la regin de mxima absorcin de NCh en medio cido y neutro.

isosbstico a 300 nm y a los cromatogramas obtenidos por HPLC, muestran que la reaccin se encuentra desplazada hacia N, concluyndose que la reaccin en cuestin se trata simplemente de la reaccin de isomerizacin Ch F en medio cido, la cual debe ser considerada irreversible ya que en estas condiciones de pH la forma flavanona es estable. Por lo tanto los valores de kobs son directamente los correspondientes a la constante de velocidad unimolecular para el cierre de la chalcona, kc. 5.2.2- SOLUCIONES NEUTRAS ETANLICAS

0.9

0.9
0.6

285 nm,
= 4.5 0.2 h

Abs
0.3 365 nm,

0.6
0.0 0 2

= 4.2 0.1 h

Abs

tiempo (horas)

0.3

0.0

300

400

/ nm

500

600

Figura 5.1: Cambios espectrales y perfiles cinticos (insertos) de NCh en buffer citratofosfato a pH 3.6 y T=42.6 C en soluciones irradiadas a 360 nm

La reaccin fue estudiada a diferentes T entre 16 y 45 oC, tanto en presencia de radiacin UV como en ausencia de la misma. En todas las condiciones se observaron cambios espectrales similares: disminucin de la banda caracterstica de NCh a 366 nm y crecimiento simultneo de la banda a 285 nm asociada con la formacin de la flavanona N. Las constantes de velocidad observadas de primer orden, kobs, monitoreadas en ambas longitudes de onda, fueron similares. Este resultado sumado a la presencia de un claro punto 92

Las Figura 5.2 muestra los cambios espectrales producidos en soluciones etanlicas de NCh en ausencia (A) y presencia (B) de irradiacin UV (360 nm). Al igual a lo observado en soluciones acuosas a pH 3.6, en ambas reacciones se observa la disminucin con el tiempo de la banda de la chalcona a 366 nm y la aparicin simultnea de la banda a 285 nm correspondiente a la forma flavanona de N. En general se observa que, tanto para las reacciones en medio acuoso, como para las soluciones etanlicas las velocidades de las reacciones sin irradiar son menores que las irradiadas al mximo de absorcin de NCh. Las reacciones tambin fueron simultneamente monitoreadas por HPLC confirmndose la existencia slo de la forma flavanona y chalcona de N, Figura 5.3.

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

1.5
0.9

A
Abs
0.5 0.0 0 4

368 nm 284 nm

B
1.0

1.0

285 nm 365 nm

0.6

= 7.7 0.5 h

Abs

0.5 0.0 0
= 4.2 0.2 h

Abs

tiempo (horas)

Abs

tiempo (horas)
0.5

0.3

0.0

0.0
400

(nm)

600

300

400

(nm)

500

600

Figura 5.2: Cambios espectrales y perfiles cinticos (insertos) de chalcona en EtOH. T: 25 C. A) sin fotolizar. B) fotolizada con luz de 360 nm.

0.006

N Ch Ch fotolizada

0.003

0.000

10

tiempo (min)
Figura 5.3: Cromatograma para la reaccin de NCh en EtOH neutro, irradiada con luz de 360 nm. Deteccin 298 nm.

5.2.3- EFECTO DE LA TEMPERATURA PARA LAS REACCIONES EN MEDIO CIDO Y NEUTRO La Tabla 5.1 muestra las constantes de primer orden observadas, kobs, en funcin de la temperatura para soluciones acuosas de chalcona a pH 3.6 y etanlicas neutras, tanto en condiciones de oscuridad como irradiadas con luz de 360 nm. La Figura 5.4 muestra el efecto de la temperatura sobre los valores de la Tabla 5.1,

analizados segn la Teora del Estado de Transicin, ecuacin 4.16. En la Figura 5.4 se observa que la luz UV no ejerce efecto cataltico sobre la reaccin de ciclizacin NNCh en cada solvente, pero s existe una diferencia entre los parmetros termodinmicos de activacin de las soluciones acuosas cidas y las etanlicas. Los valores de H obtenidos son entre 10 y 40 kJ/mol mayores que los observados para el cierre de NCh en

93

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

-14 -12

-16

ln(kobs/T)

-14

-18

-20

pH 3.6 Oscuro Luz S = -66 7 J/[Link]

H = 82 5 kJ/mol
3.2 3.4

-16

Etanol Oscuro Luz

S = 58 5 J/[Link] H = 113 7 kJ/mol
3.2 3.4

-18

10 /T (K )
Figura 5.4: Grficas de Eyring para NCh en soluciones acuosas cidas y etanlicas neutras.

-3

-1

condiciones bsicas al oscuro en agua y etanol respectivamente, Tabla 4.2.

Solucin acuosa pH 3.6 Oscuro Irradiado (360 nm) kc/105 kc/105 T -1 (C) (s ) (s-1) 0.27 20.6 0.68 1.24 29.2 1.66 2.51 34.7 2.71 8.34 42.6 6.57 Soluciones etanlicas neutras Oscuro T (C) 16.8 25.9 34.8 43.7 kc/10 (s-1) 3.58 4.29 54.1 208
5

T (C) 16.2 25.4 35.7 44.7

Irradiado (360 nm) kc/105 T (C) (s-1) 20.6 4.53 29.2 6.68 34.7 78.1 42.6 204

Tabla 5. 1: Constantes de velocidad para la reaccin de chalcona a flavanona en soluciones acuosas a pH 3.6 y etanlicas en funcin de la temperatura

Este resultado concuerda con los mecanismos previstos para el cierre de NCh. En medio bsico, la reaccin involucra un nuclefilo fuerte, el grupo C2-O-, el cual se adiciona al C del doble enlace, condiciones ptimas para

que se produzca la reaccin de Michael [9]. Sin embargo en medio cido el nuclefilo es dbil, C2-OH y, aunque el sistema se encuentra activado para la adicin ya que el C es altamente electroflico debido a que, por resonancia, comparte la carga positiva parcial del carbono carbonlico, los valores de entalpa indican que bajo estas condiciones la reaccin es menos favorable que en medio bsico. Por otra parte, es interesante notar que si bien la Hc, EtOH > Hc,H2O las kobs en EtOH son mayores que en H2O cida. Este comportamiento puede entenderse en funcin del cambio entrpico que se produce en cada solvente, ya que Sc,EtOH = 58 J/[Link] mientras que S c,H2O = -66 J/[Link]. En EtOH el aumento entrpico compensa el aumento de entalpa de activacin, mientras que el segundo caso no favorece la espontaneidad de la reaccin por incrementar el valor de la energa libre, Figura 5.5.

94

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

110

G c = H c- S cT

asociarse a los cambios de organizacin de las esferas de solvatacin en cada solvente. 5.2.4-. MECANISMO DE CIERRE PARA NCh Fl EN MEDIO ACIDO Y NEUTRO Los resultados obtenidos tanto para las soluciones acuosas pH= 3, como para las soluciones etanlicas neutras, con o sin irradiacin, indican que la reaccin implica nicamente el cierre de la forma NCh a N. Estos resultados estn de acuerdo con los datos existentes en la bibliografa en los cuales se informa acerca de reacciones de ciclizacin de chalconas en medio cido [ 8 ]. Para soluciones en medio cido puede explicarse en funcin del mecanismo que se describe en la Figura 5.6, el cual implica en un primer paso la
OH HO +H+ OH

G c (kJ/mol)

100

Agua pH 3 Etanol

90

280

300

320

340

360

T (K)
Figura 5.5: Simulacin de la variacin de la energa libre de activacin Gc con la temperatura para la reaccin de cierre de NCh N en medio acuoso pH 3 y en EtOH.

Teniendo en cuenta que las coordenadas nucleares internas para la formacin del enlace C2OC son las mismas en ambos solventes, la marcada diferencia de entropa de activacin debe
OH HO OH

OH

O OH

OH

OH
+

OH HO OH
+

HO

OH
+

OH

OH

OH

OH

H HO O+

OH HO -H+ O

OH

OH

OH

OH

Figura 5.6: Mecanismo propuesto para la reaccin de ciclizacin de NCh en medio acuoso cido.

95

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

protonacin del grupo carbonilo [9]. Esto provoca, por el efecto de conjugacin con el doble enlace, un aumento en la electrofilicidad del C activndolo para el ataque de nuclefilos dbiles, tales como el grupo hidroxilo ubicado en posicin C-2 originando la flavanona. Este mecanismo implica por lo tanto una enolizacin catalizada por cido. En cuanto a la reaccin en EtOH neutro, existen datos en la bibliografa [3] en los que se informa que en solventes polares, tales como alcoholes, el grupo hidroxilo en posicin C-2 y el solvente interactan, ya sea por solvatacin o algn efecto similar, que debilita o rompe el enlace hidrgeno del dicho grupo hidroxilo, transformndolo en fenolato, un nuclefilo fuerte capaz de atacar el doble enlace con la consecuentemente formacin de Fl. Esta hiptesis concuerda con los datos de entropa de activacin obtenidos en cada medio. En el caso de EtOH, el ataque del ion fenolato del C-2 sobre el C libera

molculas de solvatacin aumentando la entropa total del sistema. 5.3-EFECTO DE LA LUZ SOBRE SOLUCIONES BASICAS 5.3.1-SOLUCIONES ACUOSAS BSICAS La Figura 5.7 muestra los cambios espectrales observados para la reaccin de NCh en soluciones acuosas pH 11, sin irradiar e irradiada con luz de 420 5 nm a 25.1 C. En ambos casos los espectros muestran la desaparicin de la Banda I de NCh deprotonada, centrada a 430 nm, y la aparicin de la banda a 285 nm asociada a la forma N deprotonada. Sin embargo, a diferencia de lo observado en soluciones no irradiadas y en soluciones cidas, la iluminacin de la banda I de NCh produce la aparicin de dos nuevas bandas centradas a 310 nm y a 400 nm, respectivamente.

0.9

A
Abs

0.9

B
HCl exceso

0.6

0.6

Abs

0.3

0.3

0.0

300

(nm)

400

500

0.0

300

(nm)

400

500

Figura 5.7: Cambios espectrales de soluciones acuosas de NCh en medio bsico. A) Sin irradiar, B) irradiado con luz de 420 nm. En lneas de puntos se indica el espectro obtenido por agregado de HCl.

96

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

0.012

A
N

t=0 t=5h

0.012

t=0h t=5h

0.008

0.008

0.004

Ch NCh

NCh
0.004

P
0.000 0 4 8 12

N
0.000 0 5 10 15

tiempo (min)

tiempo (min)

Figura 5.8: Cromatogramas para soluciones acuosas de chalcona en medio bsico. A) sin irradiacin, B) irradiado con luz de 420 nm. Deteccin 330 nm. Condiciones experimentales descritas en el Captulo 8.

Estas bandas no estn asociadas con la forma N, ya que el agregado de H+ en exceso produce un corrimiento hipsocrmico de 25 nm de la Banda a 401 nm y el espectro obtenido es totalmente diferente al de N, Figura 5.7.B. Por lo tanto, en soluciones irradiadas la reaccin de cierre para la formacin de flavanona es acompaada por la formacin de un nuevo producto P. Es importante destacar que independientemente del reactivo inicial se obtuvieron resultados similares, es decir partiendo tanto de NCh como de N, en un rango de pH comprendido entre 10 y 12. La Figura 5.8.A y B muestra el anlisis por HPLC de las distintas fracciones irradiadas, las cuales confirman la formacin progresiva de un nuevo producto con tiempos de retencin menor (tR = 4.10 min) que los picos para N (tR= 5.7 min) y NCh (tR= 12.0 min). Aunque el anlisis espectral de las soluciones a oscuras no permite la deteccin de un producto diferente a la flavanona, el anlisis por HPLC, luego de ms de 5 horas de reaccin, confirma la

existencia de trazas de un producto con el mismo tiempo de retencin que el producto observado en soluciones irradiadas. Mediante la utilizacin de curvas de calibracin de N y Ch, bajo las mismas condiciones del anlisis, se determin la composicin del sistema al final de cada experimento. A las 5 h de reaccin a oscuras se obtiene un 4.4% de P, expresado en funcin de la concentracin inicial de NCh, mientras que para la reaccin irradiada ese porcentaje aumenta a 88.40%. En principio, puede establecerse que la formacin de P en oscuridad posee una barrera de activacin bastante elevada y por lo tanto, este proceso puede descartarse a temperatura ambiente. Con el objeto de identificar el producto P, se procedi a aislarlo mediante la tcnica de HPLC. La Figura 5.9.A muestra el espectro UV-Vis de P en solucin acuosa cida (pH:4) junto con los espectros N y NCh al mismo pH. El producto P presenta dos bandas de absorcin bien definidas a 309 nm y a 363 nm, respectivamente.

97

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

1.0

P Fl Ch

0.6

0 das 2 das 8 das

Abs

0.5

Abs
0.3

0.0 250

A
300

0.0

B
250 300

(nm)

350

400

450

(nm)

350

400

450

Figura 5. 9: A) Espectro del producto P (normalizado) en solucin cida (pH 4). B) Evolucin Figura 5.9:espectral del del producto P solucin acuosa cida, pH cida (pH 4). A) Espectro producto P en (normalizado) en solucin 4. B) Evolucin espectral del producto P en solucin acuosa cida, pH 4.

0.03

Coinyeccin P + N P (3 das) P
0.02

0.01

0.00 0 5

tiempo (min)

10

15

Figura 5.10: Cromatograma de la evolucin de P en medio acuoso cido. Deteccin 330 nm.

Es interesante notar que en medio cido, el espectro de absorcin UV-Vis del producto P se modifica muy lentamente, en trminos de das, con una clara aparicin de la banda a 285 nm caracterstica de la forma N, Figura 5.9.B. Para confirmar si la aparicin de esta banda corresponde a la formacin

de N a partir de P, se realiz el anlisis por HPLC de una solucin de P en medio cido dejada reaccionar por 3 das y se la coinyect con una solucin de N, Figura 5.10. El aumento del rea del pico de mayor tiempo de retencin confirma que el producto P se transforma lentamente en N.

98

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

La Figura 5.9.A muestra que el espectro del producto P presenta un corrimiento hipsocrmico con respecto al espectro de NCh, indicando la prdida del cromforo caracterstico que involucra la conjugacin extendida de los anillos aromticos a travs del sistema del doble enlace conjugado con el grupo carbonilo. El anlisis del comportamiento cromatogrfico sugiere que P es una molcula ms polar y de menor tamao que N y NCh. Por otra parte, la transformacin de P hacia N es un indicio de que la molcula carece del heterociclo C, es decir se encuentra en forma abierta con una tendencia a cerrar en medio cido. Finalmente, y dado que las chalconas son susceptibles a la hidrogenacin cataltica del doble enlace en posicin C2-C3 originando las correspondientes dihidrochalconas [ 10 ],

se utiliz esta reaccin para comprobar la existencia de un doble enlace en el anillo C de P. El procedimiento bsicamente consisti en comparar los resultados de la hidrogenacin de NCh y P en soluciones metanlicas cidas y neutras utilizando como catalizador PtO (IV) y bajo una presin de hidrgeno de 2-3 atm. A diferencia de NCh, la reaccin fue negativa para P, sugiriendo esto la ausencia del doble enlace en la molcula. Los resultados experimentales sugieren que P corresponde a la familia de compuestos denominados hidroxidihidrochalconas [11], Figura 5.11, -hidroxi-4,2`,4`denominandose trihidroxi dihidrochalcona.
RO OH OH

OH

OH

Figura 5.11: Estructura del producto P.

HO

OH

OH

HO

OH

OH

OH

OH
H+

OH -H2O OH HO

OH2 +

H HO O+

OH

OH

+ OH OH O -H+ OH HO O O

OH

Figura 5.12: Mecanismo para la reaccin de cierre del producto P en medio cido.

99

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

3
Oscuridad 0h 6h das

3
Luz (420 nm) 0h 6h das

Abs
1

A
0 300

B
(nm)
400 500 600 0 300

(nm)

400

500

600

Figura 5.13: Espectros de absorcin de soluciones etanlicas bsicas de NCh ([NaOH] 1.25 mM). A) Reaccin a oscuras. B) Reaccin irradiada con luz de 420 nm.

Basado en esta estructura para P, la reaccin de cierre a N en medio cido puede explicarse mediante una reaccin de sustitucin nucleoflica unimolecular, SN1 que implica simplemente la protonacin del hidroxilo en posicin C- (hidroxilo benclico) facilitando su salida como H2O y cerrando a la forma flavanona, Figura 5.12.

5.3.2-SOLUCIONES ETANLICAS BSICAS. La Figura 5.13 muestra los cambios espectrales observados para soluciones etanlicas bsicas de NCh ([NaOH] = 1.25 mM), tanto en condiciones de oscuridad como de irradiacin de la banda visible de la chalcona deprotonada a 420 nm. Los cambios espectrales para la reaccin

0.06

P
0.04

NCh

0.02

N
0.00

-0.02

t=6h Sin irradiacin Irradiado con luz = 420 nm

0 3 6 9 12 15 18

tiempo (min)
Figura 5.14: Cromatogramas para soluciones etanlicas de NCh en medio bsico ([NaOH] 1.25 mM). Deteccin 330 nm.

100

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

irradiada son similares a los observados en medio acuoso bsico, segn lo indica la forma del espectro final luego que se dej a las soluciones durante un perodo de 2 das. A fin de corroborar si en soluciones etanlicas bsicas tambin tena lugar la reaccin de formacin de P observada en soluciones acuosas, se realiz tambin el anlisis por HPLC de las soluciones irradiadas y no irradiadas, Figura 5.14. Tanto los experimentos de absorcin UV-Vis como los realizados por HPLC demuestran que la irradiacin de soluciones etanlicas bsicas de NCh originan el producto P. Adems, este producto formado regenera N luego de dos das de almacenado en oscuridad en medio cido. En cambio en ausencia de luz despus de 6 horas aproximadamente, solo se observa una mezcla de N y Ch. Estos resultados sugieren la formacin del mismo producto P que en medio acuoso, Figura 5.11.

5.3.3- MECANISMO DE REACCIN DE NCh EN MEDIO BSICO CON IRRADIACIN Segn la estructura propuesta, el producto P se formara mediante la adicin nucleoflica intermolecular del anin HO- al C- [9]. Bajo las condiciones experimentales estudiadas puede considerarse que P slo se forma en presencia de luz. Esto sugiere que el proceso de adicin nucleoflica intermolecular est activado fotoqumicamente, involucrando al estado excitado del cromforo asociado con la banda de absorcin visible de la chalcona deprotonada, *NCh2-, Figura 5.15. La mayora de la reacciones fotoqumicas orgnicas ocurren mediante procesos diabticos, en donde la superficie potencial del estado excitado del reactivo se aproxima a la superficie potencial del estado fundamental en alguna geometra molecular intermedia entre el reactivo y el producto, Figura 5.16.

O
RO O
+

*
RO O
+

*
O

OH

OH

- OH

kc*
ADICION NUCLEOFILICA INTRAMOLECULAR

* NCh2h
O

kP
ADICION NUCLEOFILICA INTERMOLECULAR

RO

RO

RO

ka kc
O O OH O OH O

OH

N 2-

NCh 2-

Figura 5.15: Mecanismo para la reaccin de NCh en medio bsico a oscuras e irradiada.

101

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

R*

Estado excitado

Transicin radiativa

Transicin no radiativa Movimiento en la superficie

R
Estado fundamental h

Figura 5. 16: Representacin de reacciones fotoqumicas diabticas en trminos de superficies de energa.

La diferencia de estos procesos con los denominados adiabticos radica en el hecho que para los ltimos la transformacin del reactivo en producto ocurre en la misma superficie de energa potencial del estado excitado [12].
1.35 A 1.44 A

S0 ( ,) planar

S1 ( ,*) torsionado

Estado Fundamental

Estado excitado singulete

Figura 5. 17: Formacin de un zwitterin por absorcin de energa.

En la Figura 5.16, R* representa el estado singulete excitado de NCh2cuya configuracin geomtrica en el mnimo de energa es ptima para el acoplamiento de las superficies de energa potencial entre el estado excitado y el fundamental. En el caso de sistemas de dobles enlaces es conocido que los estados singuletes excitados poseen carcter zwitterinico [12], Figura 5.17.

Es importante notar que el estado excitado con estructura zwitterinica posee un momento dipolar mayor que el estado fundamental, favoreciendo el ataque nucleoflico. En esta situacin, en principio, el estado excitado zwitterinico tambin favorecera la competencia con la adicin nucleoflica intramolecular del grupo fenolato en posicin C-2 al mismo C- originando la flavanona. El mecanismo de reaccin en medio bsico que se describe en la Figura 5.15 implica bsicamente una reaccin a travs de la cual la especie NCh anin puede, tanto en el estado fundamental como en el estado excitado, ciclizar a la forma N en un ataque intramolecular del grupo fenolato en posicin C-2 de acuerdo al mecanismo planteado en el Captulo 4, Figura 4.10, y simultneamente en el estado excitado puede adicionar HO- originando el producto P. La Figura 5.18 muestra los perfiles cinticos obtenidos por anlisis de HPLC de la reaccin de NCh2- en ausencia y presencia de irradiacin a 430 nm. 102

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

HPLC Area/10

Reaccin en oscuro NCh ; = 33 min N ; = 34 min

2 2
22-

Reaccin con luz (430 nm) NCh ; = 13.5 min P; = 14.0 min N ; 1 = 13.8 min 2 = 171 min
22-

100

200

300

100

200

300

tiempo (min)

tiempo (min)

Figura 5.18: Perfiles cinticos obtenidos por HPLC, deteccin 298 nm, para la reaccin de NCh2- en soluciones acuosas pH 11, en ausencia y presencia de radiacin visible a 430 nm

Efectivamente, puede observarse que en ausencia de luz tanto los perfiles cinticos para el consumo de NCh2como la formacin de N2- son idnticos, con una constante de velocidad de primer orden kobs = 4.9x10-4 s-1. Adems es claro que tanto Ch2- y N2- alcanzan un valor de equilibrio. Tal como se discutiera en el Captulo 4, kobs = ka + kc para el equilibrio de isomerizacin flavanona-chalcona en el estado fundamental. A pH 11 la constante de equilibrio para la formacin de flavanona es 4.35 (Tabla 4.1). Teniendo en cuenta la ecuacin. 4.9 se obtiene que kc = 4.07x10-4 s-1 y ka = 9.04x10-5 s-1. En presencia de radiacin, el decaimiento de primer orden de NCh2- es ms rpido (kobs = 1.23x10-3 s-1) mientras que su consumo es prcticamente total luego de 150 min de reaccin. A su vez, se observa la formacin eficiente tanto de P como de N2- con la misma velocidad que el decaimiento de NCh2- (kobs = 1.23x10-3 s-1). Para el caso de N2,- y luego del crecimiento mencionado, se

observa un consumo ms lento con una kobs = 9.75x10-5 s-1. Este valor coincide con la constante de velocidad para la reaccin de apertura de N2- en oscuridad (ka = 9.04x10-5 s-1), indicando que en estas condiciones el equilibrio de isomerizacin chalcona-flavanona es desplazado hacia el consumo total de chalcona ya que la formacin fotoinducida de P es un proceso irreversible en medio bsico. Bajo condiciones de iluminacin continua, y slo considerando la formacin de N2- y P, las velocidades de consumo y formacin de las distintas especies estn descriptas por las siguientes ecuaciones diferenciales:
d [ NCh 2 ] dt = ( k c + k a ) [ NCh] k e [* NCh 2 ]5.1

d [ P] dt

= k P [ * NCh
*

5.2

d [ N2 - ] dt

= k c [ NCh

] + k [ * NCh ]
* 2 c

5.3

103

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

En condiciones de iluminacin continua, la formacin de los estados excitados de NCh2- pueden considerarse en rgimen de estado estacionario [13], y por tanto la concentracin de los mismos en esas condiciones est dado por:

[*Ch ]ee =
2

2 k e[Ch ]

( k c + kP + k e )
* *

= k ee[ Ch2 ]

5.4

Estas ecuaciones explican por qu la constante de velocidad observada, kobs, para el consumo de NCh2- es coincidente con los valores para la formacin de N2- y de P, validando el mecanismo propuesto. Los valores de kP y kc pueden obtenerse considerando las ecuaciones 5.9 y 5.10 en condiciones de tiempo infinito.

Donde ke y k-e corresponden a la velocidad de formacin y desactivacin de los estados excitados *NCh2-, mientras que kc*, y kP*, son las constantes de velocidad de formacin de N2- y P desde el estado excitado. El cociente de estas constantes se denomina constante de velocidad observada de estado estacionario kee. En estas condiciones y teniendo en cuenta la [*NCh2-]ee las ecuaciones anteriores pueden reescribirse como:

kP' = k obs

[ P ] [ NCh ]0
2

5.11
[ N2 ]

( k c + k c ' ) = k obs

5.12

[ NCh ]0

d [ NCh dt

= (kc + ke k e kee [ NCh2 ] 5.5 = kobs[ NCh

2

d [P ] dt

= ( k P* + k e e ) [ NCh2

] ] = k ' [ NCh ] 5.6

2

d [ N2 ] dt

= ( k c + k c* k e e ) [ NCh2 ]
2

= ( k c + k c ' ) [ NCh ] La forma integrada de estas ecuaciones son:

5.7

[ NCh ] = [ NCh ] exp(k

2 2 t 0

obs

t)

5.8 5.9

[ P] =
t

kP ' k obs

[NCh ] [1 exp(k t)]

2 0 obs
2 0 obs

[N ] =
2 t

(kc + k c ' ) k obs

[ NCh ] [1 exp(k t)]5.10

104

Donde [P] representa la concentracin final de producto formado, mientras que la [N2-] representa la concentracin mxima de Naringina formada bajo iluminacin (aproximadamente a 30 min de iniciada la reaccin), es decir sin considerar su consumo lento por el desplazamiento del equilibrio de isomerizacin ChF a causa de la formacin irreversible de P. Ambas cantidades fueron obtenidas por HPLC mediante la realizacin de curvas de calibracin. Los valores obtenidos fueron [P]= 5.2x10-5 M, [N2-] = 1.8x10-5 M y [NCh2-]0 = 5.9x10-5 M. Teniendo en cuenta que kobs = 1.23x10-3 s-1, se obtiene kP = 1.1x10-3 s-1 y (kc + kc) = 3.8x10-4 s-1. Sin embargo, el valor de la constante de cierre en la oscuridad a pH 11 es kc = 4x10-4 M (ver arriba), por lo tanto este resultado implica que no se produce la formacin de flavanona desde el estado excitado *NCh2- y que la nica reaccin que ocurre desde dicho estado en forma eficiente es la formacin de P.

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

En el estado fundamental la conformacin de NCh2- es trans-s-cis respecto al doble enlace, Figura 2.9 [4, 5, 6, 14,15]. Esta conformacin geomtrica no es la apropiada para la adicin nucleoflica intramolecular y por tanto la molcula debe rotar sobre el enlace CCO para alcanzar la conformacin reactiva trans-s-trans [8]. Sobre la base de los hechos observados, es posible plantear que la rotacin hacia la forma trans-s-trans N, mientras que la originara conformacin trans-s-cis favorecera la formacin de P. La rotacin alrededor del enlace simple tiene una barrera energtica baja, tal como lo indica el hecho de que la reaccin de ciclizacin ocurra en el estado fundamental, por lo tanto, que en el estado excitado el proceso predominante sea la formacin de P implica que cuando la molcula de NCh2- absorbe radiacin, se forma el estado excitado zwitterinico con un exceso de carga positiva sobre el C y, antes de rotar hacia la forma reactiva para el cierre, ocurre la reaccin de adicin nucleoflica intermolecular del anin hidrxido, HO-. Esto resulta lgico si se tiene en cuenta que la [HO-]>>[NCh2-]. Dicho proceso bimolecular se comporta como de pseudoprimer orden, tal como se observa en Figura 5.18. Finalmente, y teniendo en cuenta los resultados obtenidos se plantea, en la Figura 5.19, el esquema de reaccin para las soluciones bsicas de NCh2-.
5.4-CONCLUSIONES

NCh 2h ke k-e
ka kP

N 2-

kc

NCh 2-

Figura 5.19: esquema para la reaccin de NCh en medio bsico

Los experimentos realizados indican que tanto en medio cido como

en soluciones etanlicas neutras, el equilibrio se encuentra desplazado hacia la forma N, no existiendo efecto de la luz sobre las velocidades de reaccin ni en los parmetros termodinmicos. El mecanismo involucrado en la reaccin de ciclizacin de NCh es va enolizacin catalizada por cido. Los parmetros cinticos indican que la reaccin de ciclizacin es ms rpida en EtOH que en las soluciones cidas, a pesar que los valores de entalpa de activacin son mayores en EtOH que en medio acuoso. Como consecuencia se observa que en EtOH la reaccin est controlada por entropa debido al relajamiento de molculas de solvente en el estado de transicin, el cual sera menos polar que NCh2-. En medio bsico (10 < pH < 12), los resultados indican que en presencia de radiacin visible adems de la reaccin de ciclizacin existe la formacin de un producto P, el cual se origina prcticamente desde el estado excitado de la NCh2- por una reaccin de adicin nucleoflica intermolecular del anin hidrxido HO-. Sobre la base de estos resultados se concluye que si bien es posible obtener chalcona a partir de flavanona en medio alcalino, deben tenerse en cuenta las posibles reacciones secundarias como las descritas en este 105

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

captulo, las que disminuiran el rendimiento de la reaccin, teniendo especial precaucin en el efecto de la luz. Por lo expuesto, el manejo de condiciones experimentales como pH,

luz, composicin del solvente, son de fundamental importancia para desplazar este equilibrio a una u otra forma isomrica de Naringina.

106

Captulo 5

Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch de Naringina

Bibliografa
[1] Nicodem, D.; Augusto, J.; Matos, M.G. Photoisomerization of chalcone: wavelength dependence. J. Photochem. 15. 193-202. 1981. Halhbrock, K.; Ebel, [Link], R.; Sutter, A.; Wellman, E.; Griesbach, H. Biochim. Biophys. Acta. 244. 7. 1971. Matsushima, R.; Hirao, I. Photocyclization of 2hydroxychalcones to 4-flavanones. Bull. Chem. Soc. Jpn., 53. 518-5221980. Tokumura, K.; Nagaosa, K.; Ohta, Y.; Matsushima, R. Temperaturedependent tautomer fluorescence spectra of 3,4-benzo-2hydroxychalcone: direct evidence for fotoenolization followed by Z E isomerization in the singlet manifold. Chem. Phys. Lett. 295. 516-524. 1998. Stermitz, F. R.; Adamovics, J. A.; Geigert, J. Snthesis and photoreactions of sorbofenones: A photochemical sntesis of flavone. Tetrahedron. 11. 1593-1595. 1975. Norikane, Y.; Itoh,H.; Arai, T. Photochemistry of 2hydroxychalcone. One-Way cis-trans photoisomerization induced by adiabatic intramolecular hydrogen atom transfer. J. Phys. Chem. A. 106. 2766 - 2776. 2002. Dhar, D. N. The chemistry of chalcones and related compounds, Ed. Wiley-Interscience Publication. 1981 y bibliografa all citada. Miles, C. O.;. Main, L.. Kinetics and mechanism of the cyclisation of the 2,6-dihydroxy-4,4dimethoxychalcone; influence of the 6-hydroxy group on the rate of cyclisation under neutral conditions. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II.1639 1642. 1985. Wade, Jr; L.G: Quimica Organica. Segunda Edicin. Ed. Prentice-Hall. 1993. Horowitz, R.M.; Gentili, B. U.S. Patent. 3.087.821 (1963). 3.890.298. 1975. [11] Nel, R. N. J. J.; Van Rensburg, H.; Van Heerden, P. S.; Cohetes, J.; Ferreira, D. Stereoselective synthesis of Flavonoids. Part 7. Polyoxygenated Hydroxydihidrochalcones derivatives. Tetrahedron 55. 9727 - 9736. 1999. Turro, N.J., Modern Molecular Photochemistry. University Science Books, Sausalito, USA. 1991. Espenson, J.H. Chemical kinetics and reaction mechanisms 2nd edition, Mac Graw-Hill, New York, 1995. Stermitz, F. R.; Adamovics, J. A.; Geigert, J. Synthesis and photoreactions of sorbofenones: A photochemical synthesis of flavone. Tetrahedron. 11. 1593-1595. 1975. J.J.P. Furlong, and N. Sbarbati Nudelman. Mechanism of cyclization of substituted 2-hydroxychalcones to flavanones. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II.633 639. 1985

[2]

[12] [13]

[3]

[4]

[14]

[15]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9] [10]

107

Captulo6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Determinacin de las propiedades antioxidantes de flavanonas y sus derivados

6.1-INTRODUCCIN En los ltimos tiempos los avances cientficos han demostrado que los alimentos contienen, adems de los nutrientes esenciales, sustancias fisiolgicamente activas que son necesarias para una vida saludable. Dentro de estos alimentos benficos se ha demostrado la importancia del consumo de frutas y vegetales en la prevencin de enfermedades crnicas. Las propiedades benficas para la salud relacionadas con los ctricos son atribuidas, adems de la presencia de AA, a la actividad antioxidante de los polifenoles que contienen [1]. Entre las frutas, los ctricos se destacan como principal fuente de flavanonas dentro de las cuales se encuentran Naringina, en naranjas agrias y pomelos principalmente; Hesperidina en naranjas dulces y sus agliconas Naringenina y Hesperetina respectivamente. En este captulo se presentan los resultados obtenidos en la determinacin de las actividades antioxidantes (AAO) y antirradicalarias (AAR) de Naringina, N, Hesperidina, H, sus agliconas como as tambin la especie Naringinchalcona, NCh, su correspondiente dihidrochalcona, NDhCh y los flavonoles Rutina, R y Quercetina, Q utilizadas como sustancias de comparacin por su alto poder antioxidante, Figura 6.1. En una segunda etapa y teniendo en cuenta que en los jugos ctricos coexisten tanto F como cido ascrbico (AA), Figura 6.2, se analizaron las combinaciones de AA y F en diferentes concentraciones con el objeto de simular las condiciones existentes en los jugos ctricos 109

Captulo6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

R4
R1 O

R4
R1 OH

R3

R3

O R2 Flavanonas

O R2 Chalconas

Compuesto
Flavanonas Naringina (N) Naringenina (Ng) Hesperidina (H) Hesperetina (Ht) Chalconas Naringin Chalcona (NCh) Naringina Dihidrochalcona (NDhCh)
R4
R1 OH

Patrn de sustitucin
R1 -O-neohesp. -OH -O- rutinos. -OH R1 -O-neohesp -O-neohesp R2 -OH -OH -OH -OH R2 -OH -OH R3 -H -H -OH -OH R3 -H -H R4 -OH -OH -OCH3 -OCH3 R4 -OH -OH
R4
R1 O R5

R3

R3

R2

R2

Dihidrochalconas

Flavonoles

Flavonoles Quercetina (Q) Rutina (R)

R1 -OH -OH

R2 -OH -OH

R3 -OH -OH

R4 -OH -OH

R5 -OH -O-rutinos.

Figura 6. 1: Estructura de los compuestos estudiados.

CH2OH HO HO O O

de -caroteno por cooxidacin con cido Linoleico, cuyas fundamentos se describen a continuacin. 6.2-FUNDAMENTOS DE LAS METODOLOGIAS 6.2.1-Determinacin de la capacidad Antirradicalaria por el ensayo de decoloracin del radical libre estable 2,2-Difenil-1-Picrilhidracilo. (DPPH). En esta tcnica se utiliza el radical libre estable 2,2-difenil-1picrilhidracilo, DPPH, Figura 6.3, el cual presenta una intensa banda de absorcin a 515 nm que desaparece en presencia

OH

Figura 6.2: Estructura qumica de cido Ascrbico (AA).

Finalmente, se determinaron las AAR de jugos naturales de naranjas, pomelos y limones. Para la determinacin de las AAR y AAO se utilizaron dos metodologas: el ensayo de decoloracin del radical libre estable 2,2-difenil-1-picrilhidracilo. (DPPH) y el mtodo de blanqueamiento 110

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

de una especie capaz de donar un hidrgeno. Debido a que los F estudiados no absorben a 515 nm, las cinticas de desaparicin de DPPH en funcin de la concentracin de los F pueden ser estudiadas espectrofotomtricamente al mximo de absorcin del radical.
NO2 O2N

N N NO2

Figura 6. 3: Estructura qumica del radical DPPH

La reaccin de consumo del radical por la especie donora de hidrgeno, AH se muestra en la ecuacin 6.1:

involucra varias reacciones reversibles de difcil interpretacin en trminos de la velocidad de reaccin [4]. Los resultados obtenidos pueden expresarse en trminos del factor estequiomtrico (n) definido como el nmero de molculas de radicales libres consumidos por molcula de sustancia adicionada durante el tiempo necesario para alcanzar un estado estacionario, EE [ 4 ]. A mayor valor de n, mayor capacidad antirradicalaria. Otro parmetro utilizado es el valor EC50, el cual representa la cantidad de antioxidante adicionado necesario para reducir al 50% la concentracin inicial del radical DPPH. El valor de EC50 puede expresarse en moles de AO adicionado, concentraciones o, para el caso de extractos EC50 frecuentemente se expresa en l de extracto adicionado [5]. 6.2.2- Determinacin de la capacidad Antioxidante por el sistema caroteno- cido linoleico Este mtodo se basa en el monitoreo de la desaparicin de caroteno durante la co-oxidacin de una emulsin acuosa formada por el carotenoide y cido linoleico contenidas en micelas de Tween 20, Figura 6.4. Durante la oxidacin del cido linoleico, un tomo de hidrgeno es abstrado desde un grupo metilnico bisalilco formando el radical libre pentadienilo el cual, para readquirir un tomo de hidrgeno ataca el altamente insaturado -caroteno reduciendo su sistema de dobles enlaces conjugados y produciendo consecuentemente su decoloracin.

DPPH + AH DPPH H + A

6.1

Este tipo de metodologa brinda informacin acerca de la reactividad de los compuestos adicionados y es funcin de su concentracin. Es un mtodo rpido, sensible y sencillo que requiere poca cantidad de muestra y puede aplicarse tanto para sustancias lipoflicas e hidroflicas [2], mientras sean solubles en el medio; sin embargo presenta el inconveniente de que la cintica del proceso es usualmente compleja, especialmente para aquellas sustancias que reaccionan muy lentamente [ 3 ] lo que se atribuye a mecanismos complejos de reaccin que implican etapas secundarias. Especficamente en el caso de fenoles la reaccin es compleja e

111

Captulo6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Tween 20 Acido Linoleico + -caroteno

Flavonoides

Figura 6. 4: Esquema representativo del sistema -caroteno- cido linoleico

El proceso se monitorea por espectroscopa UV-Vis al mximo de absorcin del carotenoide. La AAO es evaluada como la capacidad de un compuesto de minimizar la prdida de color del carotenoide. Este mtodo es rpido y sensible, ampliamente utilizado en la determinacin de la AAO de diferentes sustancias, sin embargo ha sido criticado por su baja especificidad, por estar sujeto a interferencias y por no ser, el cido linoleico, un lpido representativo de los tpicos presentes en alimentos [6]. Sin embargo, al ser un mtodo aplicable especialmente a sustancias lipoflicas, considera la habilidad real de atravesar las membranas y de actuar en medios ms similares a los biolgicos [2]. 6.3- RESULTADOS Y DISCUSIN 6.3.1- DETERMINACIN DE LA AAR DE FLAVANONAS Y SUS DERIVADOS. En la Figura 6.5 se muestran los perfiles tpicos de desaparicin del

radical DPPH en funcin del tiempo para los diferentes F estudiados. Desde el punto de vista de la velocidad de reaccin y de la efectividad, se observan diferentes comportamientos, las flavanonas N y Ng presentan un comportamiento cintico muy lento, en perodos de horas y con requerimientos de altas concentraciones para consumir ms del 50% del radical (100 moles de N/mol DPPH); en el otro extremo de reactividad se encuentra el flavonol Q, con un decaimiento rpido y altos consumos del radical a bajas concentraciones, indicando su alta eficiencia y reactividad. El resto de los F analizados muestra un comportamiento intermedio entre los dos casos descritos. Para la determinacin de los factores estequiomtricos se realizaron experimentos a partir de los cuales se obtuvieron los consumos porcentuales del radical en el estado estacionario, para diferentes concentraciones de F, como se ejemplifica en la Figura 6.5.A.

112

Captulo6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

0.8

Abs. (515 nm)

0.4

Abs. (515 nm)

0.6

0.6

0.3

0.2

A
0

B
tiempo (min)
9 18

14

tiempo (min)

Figura 6. 5: Perfiles de disminucin de la concentracin del radical libre por adicin de: A) 0,0; 7,0; 10,00 y 200 moles de N / mol DPPH. B) 0,00; 0,07; 0,14; 0,29 moles de Q / mol DPPH.

Estos valores se graficaron en funcin de la concentracin de cada F, Figura 6.5.B, y a partir de all se determinaron los valores de EC50. Finalmente se calculan los factores utilizando la ecuacin 6.2:

n=

1 EC50 x 2

6.2

Una forma alternativa de determinar el factor n consisti en realizar grficas como la que se muestra en la Figura 6.6, donde se representan
100

los moles de radical consumido por mol de AO agregado. Como se muestra en la Figura 6.7, la relacin es lineal hasta una cierta concentracin de AO a partir de la cual el consumo de radical se torna independiente de la concentracin del AO adicionado. El valor de la pendiente para el sector lineal de este grfico, representa el factor estequiomtrico.

75

% DPPH remanente E. Estacionario

100

% DPPH remanente

75

50

50

25

25

A
0

B
0.0

tiempo (s)

1000

2000

mol Rutina/ mol DPPH

0.4

0.8

Figura 6. 6.A: Perfil cintico; 0,07; 0,15; 0,22; 0,37; 0,73 1,08 mol R/ mol DPPH. B: % DPPH remanente en el E.E en funcin de la concentracin para el flavonol Rutina.

113

Captulo6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Compuesto Q R Ht H NCh NDhCh Ng N

n* 3.57 4.91 0.31 0.42 1.03 0.57 0.11 0.09

n 3.11 3.90 0.31 0.38 1.06 0.78 0.13 0.02

ARP 7.14 9.81 0.62 0.80 2.08 1.14 0.22 0.18

Tabla 6. 1: Factores estequiomtricos y valor de ARP para los F estudiados

En la Tabla 6.1 muestra los valores obtenidos para los diferentes F estudiados y se comparan los valores determinados mediante grficos como el de la Figura 6.7 (n*) con los calculados a (n) segn la partir del valor EC50 ecuacin 6.2 [5].

12

0 0 7

Quercetina (1 x 10 moles)
Figura 6.7: Relacin mol DPPH consumido vs. mol Q adicionado.

14 -8

De acuerdo a los valores obtenidos se estableci el siguiente orden de eficiencia, expresado como factores estequiomtricos, R > Q > NCh > NDhCh > H > Ht > Ng > N. Los resultados pueden explicarse en funcin de las caractersticas estructurales de los compuestos. La eficiencia para atrapar radicales libres est modulada por la aptitud de transferir tomos de H a 114

DPPH, esto es por la estabilidad de la forma radicalaria del F. Flavanonas con solo un grupo hidroxilo en el anillo B y un enlace simple entre C2-C3 tienen baja reactividad debido, entre otras razones, a la lenta formacin del radical fenoxlo [ 7 ]. El aumento de la reactividad observado para H y Ht es una evidencia del efecto de un grupo metoxilo en posicin C-4 del anillo B junto al hidroxilo en C-3, o sea la disustitucin en el anillo B. La adicin del grupo metoxilo mejora las propiedades donoras de H de la posicin C-3. En cuanto a la forma NCh, el ismero estructural de N, el aumento de la reactividad se asocia fundamentalmente a la presencia del doble enlace C2-C3 que favorece la conjugacin entre los anillos aromticos, adems de la presencia de un nuevo grupo hidroxilo en posicin C-2, susceptible de donar tomos de hidrgeno. La disminucin observada para NDhCh es consecuencia de la eliminacin de dicho doble enlace. La mxima efectividad para capturar radicales corresponde al flavonol Q cuya estructuras rene las caractersticas ptimas para la captura de radicales libres; esto es un sistema odihidroxi en el anillo B, el cual estabiliza al radical fenoxilo por enlace puente hidrgeno intramolecular (Figura 3.9), un doble enlace C2-C3 que permite la

DPPH consumido (1 x 10 mol)

-8

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

1.0

1.0

0- 90 min
0.8

Abs 460 nm

0.6

Abs

0.5

0.4

0.2

0.0

A
400

(nm)

500

0.0

B
0 20

Blanco Control Adicin Quercetina

40 60 80 100

tiempo (min)

Figura 6. 8: A) Cambios espectrales de -caroteno durante la cooxidacin con cido linoleico. B) Perfil cintico para el agregado de Q. (1 mol Q/mol -caroteno) calculado en base a la solucin micelar en Tween 20. T: 50C. Procedimiento descrito en el Captulo 8.

conjugacin entre el anillo B y el carbonilo, y un grupo hidroxilo en posicin C-3 el cual aumenta la coplanaridad de la molcula por disminucin del ngulo de torsin del anillo B con respecto al resto de la molcula. La disminucin observada para NDhCh es consecuencia de la eliminacin de dicho doble enlace. 6.3.2- DETERMINACIN DE LA AAO DE FLAVANONAS Y SUS DERIVADOS. La Figura 6.8.A muestra el consumo de -caroteno durante la cooxidacin trmica (50C) de cido linoleico. En el grfico 6.8.B se comparan los perfiles cinticos para la muestra blanco la cual contiene solo el carotenoide y es una referencia de su descomposicin trmica, el control que incluye el carotenoide ms el cido linoleico y representa el proceso de cooxidacin y la muestras en donde se adiciona la sustancia a analizar, en el caso de la Figura 6.8, corresponde a Q. 115

Bajo esta metodologa, la AAO puede expresarse de diferentes maneras entre las que se incluyen medidas de la absorbancia UV-Vis del control y la muestra al comienzo y final de la reaccin [ 8 ], relacin entre las velocidades de blanqueamiento del carotenoide [9], etc. En nuestro caso consideramos conveniente monitorear el consumo del carotenoide a lo largo del tiempo del experimento, utilizando las pendientes de las grficas absorbancia vs. tiempo del control y la muestra como lo indica la ecuacin 6.3:

% AAO = PendienteCtrol PendienteM 6.3 PendienteCtrol

Dado que esta metodologa involucra un sistema microheterogneo, el conocimiento de la forma en la que las sustancias se distribuyen en las diferentes microfases es de gran importancia. Es por ello que se determinaron los coeficientes de particin utilizando n-octanol como fase orgnica debido a que este solvente

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

F Q R Ht H NCh NDhCh Ng N

Relacin molar F/-C 0.97 0.94 0.81 0.99 0.95 0.92 0.98 0.95

% Act. AO 62.50 -1.56 25.15 7.12 17.61 27.31 0.10 1.25

KO/W 18.20 1.62 8.93 2.09 2.75 3.30 39.81 1.29

fO 0.95 0.62 0.90 0.68 0.73 0.77 0.98 0.56

Tabla 6. 2: Actividad Antioxidante de los F estudiados.

presenta un valor de constante dielctrica similar al reportado para Tween 20 [10]. En la Tabla 6.2 se indican los valores de AAO junto a las constantes de particin de F entre n-octanol y agua, KO/W, y la fraccin de F en la fase orgnica, fO. de los F analizados, calculados como:
K O /W = [ F ]O [ F ]O K O /W ; fO = = [ F ]W [ F ]T 1 + K O /W

6.4

De los F analizados, el flavonol Q presenta la mayor AAO, mientras que su correspondiente glicsido, R es el menos eficiente en la proteccin del carotenoide. Este resultado est de acuerdo con lo publicado por Burda y col [11] quienes, comparando la AAO de flavonoles agliconas con sus glicsidos sugieren que el bloqueo del grupo hidroxilo en C-3 resulta en una prdida total de la AAO [11,12]. Por otra parte Heim y col [ 13 ] indican que la superioridad de Q para inhibir daos oxidativos est adscripta a la presencia de un sustituyente hidroxilo en posicin C-3 que incrementa la estabilidad del radical fenoxilo formado.

Adems de los factores estructurales, el sistema heterogneo utilizado en esta metodologa juega un rol importante ya que se trata de un sistema micelar donde los sustratos oxidables estn en el interior de la micela. Es por esto que la capacidad de atravesar la interfase para actuar en el medio lipoflico puede ser estimado considerando una particin agua-octanol. De este modo K modela la capacidad de llegar al interior de la micela. Para R, el coeficiente de particin indica que se encuentra en un 60% dentro de la micela. Sobre la base de estos hechos la baja AAO o la actividad prooxidante de R se explica en funcin de los factores estructurales antes mencionados. Dentro del grupo de las flavanonas, tanto N como Ng son prcticamente inactivas, a pesar de que los coeficientes de particin de la ltima indican una alta solubilidad en la micela, esto es un 98% de la concentracin inicial se encuentra en la fase orgnica. Tanto N como Ng poseen un enlace simple C2-C3 y slo un grupo hidroxilo en posicin C-4 del anillo B, caracterstica poco favorable para atrapar radicales libres [12]. La ausencia 116

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

de un doble enlace C2-C3 impide la conjugacin entre los anillos A y B y consecuentemente los radicales fenoxilos formados son menos estables. Por otra parte se ha informado que compuestos con grupos 4 monohidroxilados son menos potentes, debido a la relativamente lenta formacin del radical fenoxilo comparado por ejemplo, con fenoles impedidos es decir, estructura con grupos metoxilos en posicin orto. En forma general, las flavanonas, son AO dbiles, debido a la prdida de la conjugacin entre los anillos A y B. En la Figura 6.9, se comparan las estructuras de la forma flavanona y chalcona de N. En ella se observa que, para la forma flavanona, el anillo B, principal responsable de la AAO, se encuentra fuera del plano con respecto al resto de la molcula, mientras que para la forma chalcona existe coplanaridad entre el anillo B y el grupo carbonilo. Las flavanonas H y especialmente su aglicona Ht, presentan un aumento de la AAO con respecto a N y Ng. Esto concuerda con lo informado por Burda y Oleszek [11] quienes asocian este aumento en la eficiencia a

la presencia del grupo metoxilo el cual incrementara la estabilidad del radical fenoxilo traducindose como un aumento de la actividad AO. En cuanto al efecto de la glicosilacin, en general las agliconas son ms potentes que sus respectivos glicsidos, hecho que se observa puntualmente en H y Ht donde la glicosilacin reduce la AAO en un 65% aproximadamente. Dentro de los F ms efectivos se encuentran NCh y NDhCh, siendo la primera un ismero estructural de N. Para NCh la efectividad se debe fundamentalmente a la presencia del doble enlace C2-C3 que, como se ve en la Figura 6.9 aumenta la coplanaridad entre el anillo B y el resto de la molcula. De manera contraria a lo esperado, NDhCh, con un enlace simple en posicin C2-C3 interrumpiendo la conjugacin entre el anillo B y el resto de la molcula, es ms efectiva que su correspondiente chalcona. Este resultado inesperado podra justificarse teniendo en cuenta la estabilidad de NDhCh comparada con NCh la cual se encuentra en equilibrio con la forma flavanona, siendo esta

Anillo B Anillos A y C Anillo A Anillo B

Flavanona

Chalcona

Figura 6.9: Estructuras de las formas flavanona y chalcona de N.

117

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

ltima la forma predominante en agua. Con el objeto de constatar esta hiptesis se realizaron experimentos que consistieron en disolver NCh en la micela de Tween 20 monitorendose los cambios espectrales en funcin del tiempo. Los resultados indicaron que NCh se encuentra en el interior la micela, y est fuertemente estabilizada por sta ya que no se observaron cambios en el espectro de absorcin. Este mismo resultado se obtuvo en n-octanol, el solvente utilizado para modelar el medio, por lo que la hiptesis se rechaz. Tanto para NCh como para NDhCh los valores del coeficiente de particin y de fO son similares, por lo tanto, la diferencias en cuanto a la AAO pueden atribuirse a algn tipo de interaccin especfica (probablemente tipo puente hidrgeno) de NCh con el surfactante, la cual bloquea el sitio accesible para la reaccin con los radicales, disminuyendo la AAO. Finalmente puede concluirse que la AAO est sujeta principalmente a los factores estructurales de las molculas. 6.3.3- COMPARACION DE LA AAO Y AAR DE LOS FLAVONOIDES La Figura 6.10 compara los valores obtenidos para la AAO y AAR de los F bajo estudio. La principal diferencia entre las dos metodologas se observa para el caso de R la cual presenta una elevada AAR y AAO casi nula, lo cual puede adscribirse a dos efectos, por una parte el bloqueo del grupo hidroxilo en posicin C-3, presente en Q el cual es responsable de la AAO de sta con respecto al resto de los F que no lo

poseen y por otra parte, dado que se trata de un sistema microheterogneo, las diferencias en el coeficiente de particin determinado en n-octanol, solvente de caractersticas similares a Tween 20.
1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 60

A B
Q R Ht H Ch NDhCh Ng N

% AAO

fo

40 20 0 6

Factor esteq.

Ht

Ch

NDhCh

Ng

Ht

Ch NDhCh Ng

Figura 6. 10: A) Fraccin de F en la fase orgnica (f0)., B) % AAO, C) factor estequiomtrico (AAR) de los F estudiados

Sin embargo, observando la situacin para Ng, la cual presenta el mayor coeficiente de particin y AAO muy baja, se puede concluir que las diferencias observadas se deben fundamentalmente a los factores estructurales. 6.3.4-DETERMINACION DE LA AAR DE COMBINACIONES F-AA POR EL MTODO DE DECOLORACIN DEL DPPH. De acuerdo con lo descrito en el Captulo 3, en los ctricos coexisten tanto AA como F. Sobre la base de los antecedentes bibliogrficos mencionados en el Captulo 3 y, con el objeto de explorar la posibilidad de un sinergismo similar al observado entre in ascorbato 118

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

CH2OH HO HO O

DPPH.
O

DPPH-H CH2OH
HO HO O O

DPPH.

DPPH-H CH OH 2
HO O O O

OH

Acido Ascrbico (AA)

Radical Semidehidroascorbilo (HA.)

Acido Dehidroascrbico DHA

Figura 6.11: Mecanismo para la reaccin de AA con DPPH.

y el -tocoferol, ecuaciones 3.24 y 3.25, se investig el efecto sobre la AAR de combinar los F estudiados anteriormente . con AA frente al radical libre DPPH . Los experimentos se realizaron determinando primero los consumos de radical de cada compuesto por separado, luego se prepararon mezclas in situ a las cuales se les adicion solucin stock del radical y finalmente, con el objeto de determinar la posibilidad de regeneracin entre las diferentes especies oxidadas y reducidas, la reaccin se llev a cabo en etapas, esto es adicionando primero el F, y luego de alcanzar el EE se adicion el AA. El procedimiento tambin se llev a cabo de manera inversa, se permiti reaccionar primero AA y luego del EE se agreg el F.

El AA presenta una gran reactividad frente a los radicales libres, para el caso particular de DPPH la reaccin procede de manera instantnea, alcanzndose el EE en menos de 30 s con un factor estequiomtrico de 1.76, determinado experimentalmente. Como consecuencia de su reaccin con los radicales libres AA se transforma en cido Dehidroascrbico (DHA), la forma completamente oxidada de AA., Figura 6.11. En la Figura 6.12 se muestran los perfiles cinticos obtenidos para N, Q, y AA con diferentes secuencia de agregado. Las lneas de puntos representan el consumo terico del radical, obtenido

100

(AA+DPPH)+N

A
% DPPH remanente

100

(AA+DPPH)+Q

% DPPH remanente

B
valor terico

80

90

(N+DPPH)+AA

(Q+DPPH)+AA
60

valor terico
80

valor experimental
40

(Q+AA)+DPPH

70

(N+AA)+DPPH
0 40

valor experimental
80 120 360 380 400

20

tiempo (min)

(N+AA)+DPPH

50

100 150

330

360

390

420

tiempo (min)
.

Figura 6.12: Perfiles cinticos para A) N, AA y mezclas. B) Q, AA y mezclas frente a DPPH .

119

Captulo6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

DPPH .

DPPH-H DPPH .
instantneo kobs < 0.5 s-1 instantneo

DPPH-H

AscH-

[Link] kobs = 3 x10-4 s-1

DHA

muy lento

DPPH.
kobs = 3 x10-3

DPPH-H
s-1
.

Figura 6.13: Mecanismo para mezclas de N y AA con DPPH .

sumando los consumos de cada compuesto por separado. Los crculos de la Figura corresponden al comportamiento de la mezcla de los F con AA, preparada in situ mientras que los cuadrados corresponden a la reaccin en etapas donde se adiciona en primer lugar el F y los tringulos a la reaccin primera con AA. La Figura 6.12.A muestra que . para la mezcla, (N+AA)+DPPH , se observa primero un decaimiento instantneo cuyo consumo es coincidente con la suma de los perfiles para los compuestos individuales, designado como valor terico Luego de este decaimiento rpido el perfil de la mezcla muestra una lenta disminucin que no puede asociarse con N ni AA, dado que de acuerdo a los perfiles individuales de ambas sustancias la reaccin con el radical ya alcanz el EE. Este consumo extra de radical, de aproximadamente 6% sugiere que la interaccin de ambas sustancias origina

alguna especie susceptible de continuar atrapando radicales libres. Cuando se hace reaccionar N en primer lugar, smbolos cuadrados, se observa un decaimiento rpido con un consumo de aproximadamente un 10% del radical. Una vez que se alcanz el EE, se adicion una alcuota de AA observndose una segunda disminucin rpida coincidente con el consumo de AA seguida de una tercera componente lenta similar a la observada para la mezcla. Por ltimo, cuando se utiliza AA como reactivo inicial el perfil muestra, luego del consumo caracterstico del radical por parte de AA, un disminucin asociada a la adicin de N para posteriormente continuar disminuyendo lentamente con una pendiente similar a la observada en el perfil de la mezcla. Estos resultados sugieren que durante la interaccin F-AA se formara o regenerara alguna especie susceptible de continuar capturando radicales libres. Las velocidades con las que ambas sustancias reaccionan con el 120

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

radical son muy diferentes, AA reacciona instantneamente: kobs AA+DPPH > 0.5 s 1 mientras que N presenta una velocidad de reaccin de aproximadamente kobs -3 -1 N+DPPH = 3x10 s . Esto sugiere que DHA se forma aproximadamente 30 veces ms rpido que el correspondiente radical fenoxilo de N. Sobre la base de estas observaciones, se puede postular que la reaccin entre ambos compuestos ocurre, en este caso, principalmente entre la forma DHA y N. De esta manera, el posterior decaimiento en los perfiles puede atribuirse principalmente a la regeneracin del radical ascorbilo, AH por reaccin con N, de acuerdo con lo postulado por Bors y col [14] durante su estudio de la interaccin de ascorbato con F. Las reacciones posibles para N son las descritas en la Figura 6.13, . donde: AscH-, Asc -.y DHA corresponden a ascorbato, radical ascorbilo y . dehidroascorbato; N y N representan a Naringina y radical libre fenoxilo de Naringina. Para la reaccin con Q, AA y mezclas con DPPH, Figura 6.12.B se observa que tanto para la reaccin en etapas con AA en primer lugar como para la reaccin donde ambas sustancias estn juntas, los consumos del radical y las pendientes de los perfiles cinticos son idnticos, sugiriendo esto que las reacciones involucradas son las mismas para ambos casos. Sobre la base de estas observaciones se sugiere que, en estas condiciones experimentales, no existe interaccin entre el DHA formado y Q en

ninguno de sus diferentes estados de oxidacin y los consumos observados tanto para la reaccin en etapas como para la mezclas (AA+DPPH)+Q y (AA+Q)+DPPH corresponden simplemente a la suma de los compuestos por separado. Sin embargo, para el agregado de AA a la mezcla Q+DPPH la situacin es diferente, cuadrados en la Figura 6.12.B, ya que una vez adicionado AA ocurre un consumo del radical mayor al esperado, aproximadamente un 10% extra.. Esto sugiere que existe alguna interaccin entre las formas oxidadas de Q y AA, formando o regenerando alguna especie susceptible de donar tomos de H al radical. Dado que la pendiente del decaimiento es similar en los tres casos es posible plantear que se trata de una regeneracin de alguna especie ya presente en la reaccin o con la misma reactividad. La reaccin de Q con DPPH ha sido ampliamente estudiada [ 15 , 16 ], reportndose que bajo estas condiciones experimentales, la absorbancia UV- Vis. decae rpidamente, en el orden de 1-2 min como resultado de la transferencia del tomo de Hidrgeno ms lbil (paso rpido( el cual es seguido por una cada lenta asociada a la capacidad de donar tomos de Hidrgeno residuales. El mecanismo de reaccin de Q con DPPH ha sido postulado por Dangles [15], Figura 6.14 e implica: Abstraccin de un tomo de Hidrgeno en posicin 3 y/o 3 formando los respectivos radicales aroxilos, etapa muy rpida (k= 41.9 x 102 mol-1 s-1) [15].

121

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

2 DPPH .

2 DPPH-H
kobs> 9.07 x 10-2 s-1

Q rpido Q(-H).

Q(-H) .

DPPH .

DPPH-H

Q=O

2 ROH (solvente) rpido

Aducto*

Aducto=O

Figura 6 14: Mecanismo de reaccin de Q frente a DPPH.

Desproporcin de los radicales aroxilos regenerando Q y formando quinonas, etapa rpida. (k= 13.0 x 102 l mol-1s-1)[15]. Adicin rpida del solvente (por ej. MeOH) a las quinonas originando un aducto susceptible de donar otro tomo de hidrgeno en un paso posterior. Por lo expuesto anteriormente y para la reaccin en discusin, (Q+DPPH)+AA, las cinticas rpidas observadas para Q corresponden a la primera abstraccin de un tomo de hidrgeno y la formacin de quinonas con regeneracin de Q. En cuanto al AA, y dado que en la reaccin donde AA se hace reaccionar primero con DPPH no se observa este aumento en el consumo,
DPPH . DPPH-H
instantneo

se descarta que la reaccin suceda con la especie DHA. Adems de esto y puesto que las velocidades de reaccin de AA y Q en su primera etapa son comparables las reacciones posibles son las indicadas en la Figura 6.15, donde Q representa el radical aroxilo formado por la primera abstraccin de un tomo de hidrgeno, Q=O la forma quinona de Quercetina, Figura 6.16. En ambas reacciones se plantea la posibilidad de regeneracin de Q, desde su primer estado de oxidacin o desde su forma quinoidea, susceptible de formar un aducto con el solvente y continuar reaccionando con el radical. Esto estara de acuerdo con la similitud del perfil cintico observado
DPPH-H

DPPH .

instantneo

AscH-

Asc.-

DHA

Q(-H).

Q=O

2 ROH (solvente)

Aducto

Aducto=O

rpido

DPPH . DPPH-H DPPH .

DPPH-H

DPPH .

DPPH-H

Figura 6.15: Mecanismo de reaccin para mezclas de Q y AA frente a DPPH..

122

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

O HO O O OH O OH O OH HO O OH

O O

Figura 6.16: Estructuras de Resonancia para la forma quinoidea de Q.

para Q sola con el obtenido despus de la adicin de AA. Las reacciones indicadas en la Figura 6.15 fueron planteadas por Bors y col.[14], quienes reportan que la reaccin de regeneracin de Q tiene una considerable contribucin al proceso total mientras que la reaccin donde se . regenera Q a partir de la forma quinoidea de Q se encuentra favorecida termodinmicamente por los potenciales redox de las cuplas implicadas, Captulo 3, Tabla 3.7. En la Tabla 6.3 se muestran los valores obtenidos para el resto de los F. Los valores denominados tericos se determinaron sumando los consumos individuales del radical para cada F y para el AA. Los valores designados como experimentales corresponden al consumo de las mezclas de los diferentes F con AA. Los valores designados como (F+ DPPH)+AA corresponden a

experimentos en donde se hizo reaccionar en primer lugar el F adicionndose luego el AA y (AA+ DPPH)+F a las reacciones en las cuales se oxid al AA y posteriormente se adicion el F. Los valores de la Tabla 6.3, indican que slo Q y N presentan reaccin positiva frente al radical. Para la reacciones en etapas, la mayora de los F presentaron efecto positivo slo cuando la reaccin se llev a cabo en primer lugar con los F y adicionando luego AA, indicando que la interaccin es favorable entre las especies oxidadas de F con AA.. Sobre la base de los resultados obtenidos surge la posibilidad de continuar las investigaciones en este tema utilizando otras metodologas que permitan evaluar la AAO, por ejemplo un sistema heterogneo donde cada uno de los compuestos se ubiquen en fases diferentes de acuerdo con su solubilidad

Flavonoide (F) Q R Ht H Ch DhCh Ng N

(F+AA)+DPPH terico 40.3 0.3 22.8 0.2 84.2 0.6 96.1 0.3 70.3 0.3 52.4 0.5 56.7 0.1 18.0 0.1

% Consumo DPPH (F+AA)+DPPH (F+DPPH)+AA experimental 47.4 0.5 53.0 0.3 20.1 0.4 25.2 0.6 82.2 0.9 100 0.8 81.3 0.7 77.9 0.7 61.5 0.5 79.1 0.3 42.2 0.3 48.7 0.1 47.8 0.1 50.5 0.3 23.9 0.1 24.2 0.3

(AA+DPPH)+F 43.0 0.1 21.0 0.2 80.0 0.5 78.4 0.9 58.9 0.2 43.4 0.2 47.3 0.5 20.9 0.4

Tabla 6. 3: Consumos porcentuales en el EE para las mezclas F-AA. Concentraciones (mol F/mol DPPH ): Q: 0,07; R:0,05; Ht: 5,24; H: 10,16; NCh: 0,50; NDhCh; 0,43; Ng:11,24; N:10,09.

123

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

(mtodo de decoloracin de -caroteno iniciado enzimticamente, utilizar otro tipo de fuente de radicales libres para la cual la reaccin de AA y los F sean a velocidades similares, lo que permitira determinaciones ms precisas o emplear tcnicas cinticas ms rpidas por ejemplo, stop- flow, etc. 6.3.5DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD ANTIRRADICALARIA DE JUGOS CTRICOS NATURALES.

90

60

30

20 l jugo fresco 15 l jugo fresco 10 l jugo fresco 5 l jugo fresco

0

tiempo (min)

Figura 6. 17: Perfiles obtenidos para jugos fresco de naranjas.

La Figura 6.17 muestra el efecto del agregado de jugo de naranja natural frente al radical DPPH. En los perfiles se observa un rpido decaimiento de la absorbancia, alcanzndose el EE en menos de 30s, comportamiento similar al

observado para la reaccin de AA, principal componente AO de los jugos ctricos [17]. Al respecto, Rapisarda y col [18] indican que el perfil de sustancias AO de los jugos de naranjas frescos estn constituidos en un 65%, por AA, un 28% de F (principalmente Hesperidina y Narirutina) mientras que el resto incluye a Acidos Hidroxicinmicos tales como Acido ferlico, sinpico y p-cumrico La Tabla 6.4 muestra los valores de EC50 expresados como l de jugo necesario para reducir al 50% la concentracin de DPPH, la concentracin de AA en los jugos determinada por HPLC y la concentracin calculada a partir de los moles de DPPH consumidos utilizando los parmetros de la curva 6.18.A , cuyos detalles se describen ms adelante. En nuestra provincia se cultivan dos variedades de naranjas, una de cosecha temprana y una tarda todas injertadas sobre limn. En cuanto al pomelo la variedad ms comn corresponde a la denominada Marsh Sedlees. Los valores de EC50 obtenidos para los jugos de naranjas, considerando las dos especies antes mencionadas, Washington navel y Valencia son menores que los informados en la literatura para jugos de naranjas [18].

% DPPH remanente

Jugos Naranjas Pomelos Limones

EC50 (l jugo) 15.5 0.3 18.6 0.3 28.8 0.3

[AA] [AA]* (g / ml jugo) (g / ml jugo) 477 5 568 23 468 4 501 22 250 9 341 27

* Calculado a partir del consumo del radical DPPH Tabla 6.4: Valores de EC50 y concentracin de AA determinada por HPLC para jugos naturales

124

Captulo6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Estas diferencias pueden explicarse teniendo en cuenta que tanto la composicin como la concentracin de las sustancias presentes en un fruto estn sujetas a la influencia de factores tales como variedad de cultivo, condiciones ambientales del crecimiento, estado de madurez, entre otros ocasionando una gran variabilidad en los resultados. De los jugos analizados con esta tcnica, el jugo de naranja es el que presenta la mayor AAR, mientras que el jugo de limn es el menos eficiente. Los valores obtenidos muestran que existe una relacin entre la eficiencia para atrapar los radicales libres de cada jugo con la concentracin de AA presente. Durante los experimentos con soluciones patrones de AA se observ una excelente correlacin lineal entre los moles de AA presentes y los moles de radical consumido, Figura. 6.18.A, con una pendiente igual a 1.76, correspondiente al factor estequiomtrico del AA.

A partir la Figura 6.18.A es posible determinar, conocidos los moles de radicales consumidos, los moles de AA presentes en una muestra o viceversa, esto es conocidos los moles de AA de la muestra, estimar cual ser el consumo de radicales. De esta manera la grfica puede considerarse como una curva de calibracin para AA frente a DPPH. A partir de los moles de radical consumido por cada jugo y utilizando los parmetros de la curva de la Figura 6.18.A, se calcularon los moles de AA correspondientes, tal como se indica en la Tabla 6.4. Los resultados indican que los valores de concentracin de AA determinados a partir de los moles de radical consumidos son siempre mayores que los determinados por HPLC. En la Figura 6.18.B se comparan los consumos de radical de cada alcuota de jugo de naranja adicionados a soluciones metanlicas de DPPH smbolos llenos, respecto de los consumos tericos, smbolos abiertos,

12

mol DPPH consumido (x10 )

Y=A+B*X
12

A= (1.812.73) x10 B= 1.76 0.06 R= 0.99807

-9

mol DPPH consumido (x10 )

10

jugo de Naranjas Solucin Stock AA

-8

-8

0 0 3

A
mol AA (x10 )
6 -8 9

0 0 3

B
6
-8

mol AA (x10 )

Figura 6: 18: A) Relacin de mol radical consumido por mol de AA adicionado. B) Consumo de radical de jugo de naranja comparado con solucin stock de AA.

125

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

correspondientes a los moles de AA contenidos en la muestra. Nuevamente se observa que, el consumo de radical por parte del jugo es mayor que el esperado para la concentracin de AA presente en el mismo. Esto sugiere que si bien el AA es el principal componente en los jugos ctricos, en el caso del jugo de naranjas los clculos indican una contribucin mayor al 85% de la AAR total, existe un aporte asociado a la presencia del contenido fenlico total entre los que se encuentran por supuesto, los F, adems de la posibilidad de que la interaccin entre el AA con las diferentes sustancias, presenten efectos positivos en cuanto a la AAR total del sistema, tal como los observados durante los experimentos donde se combinaron soluciones patrones de AA y los F descritos en la seccin anterior.. 6.4- CONCLUSIONES En este captulo se determinaron las AAO y AAR de las flavanonas ctricas, sus agliconas, chalconas y los flavonoles Quercetina (aglicona) y Rutina, empleando dos mtodos ampliamente utilizados: el mtodo de decoloracin del radical libre DPPH y el mtodo del blanqueamiento de caroteno durante la cooxidacin con cido linoleico. Los resultados obtenidos indican que R y Q presentan la mayor AAR y AAO respectivamente, de acuerdo con lo predicho por la relacin estructuraactividad (REA) descrita en el Captulo 3, Seccin [Link]. De las flavanonas N presenta la mnima AAR, sin embargo los experimentos realizados con el objeto

de evaluar la interaccin con AA indican que la combinacin N-AA presenta efecto positivo expresado como consumo de radical, comparado con la suma de los consumos individuales. Este efecto puede explicarse en funcin de los potenciales de reduccin de las cuplas, los cuales indican que F con las caractersticas estructurales de N tienen potenciales de reduccin menores que los del AA, o sea que son capaces de regenerarlo, prolongando la capacidad de atrapar radicales libres, como lo demuestran los perfiles cinticos de la Figura 6.12.A. Adems de N, slo Q present efecto positivo al combinarse con AA. Finalmente se determinaron las AAR de jugos de naranjas, pomelos y limones, encontrndose que el ms eficiente en cuanto a la capacidad de atrapar radicales libres corresponde al jugo de naranja. Teniendo en cuenta que el AA es el componente mayoritario de los ctricos, se determinaron las concentraciones de este compuesto en cada jugo, encontrndose que existe una relacin lineal entre la cantidad de AA y la AAR. Una vez determinados los consumos porcentuales de DPPH de cada jugo, se compararon estos valores con los correspondientes a los moles de AA presente en cada muestra. Los resultados indican que el consumo de radical por parte de los jugos es mayor que el esperado para una solucin patrn de AA a la misma concentracin. Este hecho puede explicarse teniendo en cuenta que si bien AA es el componente mayoritario de los jugos, existen otras sustancias, entre las cuales

126

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

se encuentran los F, que contribuyen a la AAR total. Adems, existe la posibilidad de que las diferentes sustancias, (F, AA, cidos Hidroxicinmicos) puedan actuar sinrgicamente potenciando la AAR. Por otra parte, es importante destacar la necesidad de utilizar diferentes metodologas para la determinacin de la AAO y AAR de un compuesto o extracto ya que ha sido demostrado que el poder AO depende de la tcnica utilizada tanto como de la concentracin, naturaleza y propiedades fisicoqumicas de los compuestos estudiados. Adems de lo descrito, la gran diversidad existente en cuanto a las formas de expresar la eficiencia de una sustancia para actuar como AO es tan numerosa como la cantidad de metodologas para medirla. Esto hace difcil la comparacin entre los resultados obtenidos por diferentes investigadores, an para un mismo compuesto. Con respecto a este tema, existe un consenso generalizado entre los cientficos que trabajan en esta temtica acerca de la imperiosa necesidad de estandarizar tanto las metodologas como la forma de expresar los resultados con el objeto, fundamentalmente, de aportar datos confiables a los consumidores.

127

Captulo 6

Determinacin de las Propiedades Antioxidantes de los Flavonoides

Bibliografa
[1] Benavente-Garca, O.; Castillo, J.; Marin, F.; Ortuo, A.; Del Ro, J. A. Uses and properties of Citrus flavonoids. J. Agric. Food Chem. 45. 4505-4515. 1997. Kulisic, T.; Radonic, A.; Katalinic, V.; Milos, M. Use of different methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil. Food Chemistry. 85. 633-640. 2004. Perez, D. D.; Leigthon, F.; Aspee, A.; Aliaga, C.; Lissi, E. A comparison of methods employed to evaluate antioxidants capabilities. Biol. Res. 33. 71-77. 2000. Lissi, E.; Modak, B.; Torres, R.; Escobar, J.; Urzua, A. Total Antioxidant Potential of resinous Exudates from Heliotropium Species, and Comparison of the ABTS and DPPH methods. Free Rad. Res. Vol 30, 471-477. 1999. Brand-Williams, W.; Cuvelier, M. E:; Berset, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft and Technologie. 28. 25-30. 1995. Fukumoto. L. R.; Mazza, G. Assesing Antioxidant and Prooxidant Activities of Phenolic Compounds. J. Agric. Food Chem. 48. 3597-3604. 2000. Pannala, A. S.; Chan, T. S.; OBrien, P. J.; Rice-Evans, C. A. Flavonoid BRing Chemistry and Antioxidant Activity: Fast Reaction Kinetics. Biochem. and Biophysical Research Communications. 282. 1161-1168. 2001. Von Gadow, A.; Joubert, E.; Hansmann, C. F. Comparison of the Antioxidant Activity of Aspalanthin with that of other plant phenols of rooibos tea (Aspalathus linearis), Tocopherol, BHT and BHA. J. Agric. Food Chem. 45. 632-638. 1997. Prez, R.M.; Vargas, R.; Martnez, F. J.; Garcia, E.V.; Hernandez, B. Actividad antioxidante de los alcaloides de Boconia arborea. Estudio sobre seis mtodos de anlisis. Ars. Pharmaceutica. 44:1. 521. 2003. Ghosh, S.; Moulik, S. P. Interfacial and Micellization Behaviors of Binary and Ternary Mixtures of Amphiphiles (Tween-20, Brij-35, and Sodium Dodecyl Sulfate) in Aqueous Medium. Journal of Colloid and Interface Science 208. 357366. 1998. Burda, S.; Oleszek, W. Antioxidant and Antiradical activities of flavonoids. J. Agric. Food Chem. 49. 2774-2779. 2001. Pietta, P.; Flavonoids as antioxidants. J. Nat. [Link] 63, 1035-1042. 2000. Heim, K.E.; Tagliaferro, A.R.; Bobyla, D.J. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structureactivity relationships. Journal of Nutritional Biochemistry. Review: Current topics. 13. 572-584. 2002. Bors, W.; Michel, C.; Schikora, S. Interaction of flavonoids with ascorbate and determination of their univalent redox potentials: a pulse radiolysis study. Free Rad. Biol Med. 19. 1. 48-52. 1995. Dangles, O.; Fargeix, G.; Dufour, C. One electron oxidation of quercetin and quercetin derivatives in protic and no protic media. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2. 1387-1395. 1999. Goupy, P.; Dufour, C.; Loonis, M.; Dangles, O. Quantitative kinetic analysis of hydrogen transfer reactions from dietary polyphenols to the DPPH radical. J. Agric. Food Chem. 51. 615-622. 2003. Acevedo, B.; Montiel, M.; Avanza, J. Efecto del tratamiento trmico en la capacidad Antioxidante total de jugos de pomelo, naranja y mandarina. Archivo [Link] Rapisarda, P.; Tomaino, A.: Lo Cascio, R.; Bonina, F.; De Pasquale, A.: Saija, A. Antioxidant effectiveness as influenced by phenolic content fresh oranges juices. J. Agric. Food Chem.. 47. 4718-4723. 1999.

[11]

[2]

[12] [13]

[3]

[4]

[14]

[5]

[15]

[6]

[16]

[7]

[17]

[8]

[18]

[9]

[10]

128

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina.

7.1- INTRODUCCION El sabor dulce presente en los alimentos que consumimos diariamente est dado por diversos compuestos, algunos naturales y otros diseados para cubrir las expectativas de sabor de personas obligadas a ingerir dietas pobres en azcares o con menor poder calrico, denominadas edulcorantes. Segn el Cdigo Alimentario Argentino (CAA) los edulcorantes se definen como aquellas sustancias diferentes de los azcares que aportan sabor dulce a los alimentos. Para que un compuesto o mezcla de compuestos sea aceptada como edulcorante debe satisfacer algunos
O N-Na+ S O O

requisitos bsicos: Ser inocuo Poseer un alto poder endulzante Adecuada solubilidad y estabilidad Ser aceptable al paladar, con buena relacin costo-dulzor La Figura 7.1 muestra algunos de los edulcorantes utilizados actualmente, aprobados por el CAA. Sin embargo, el consumo de algunos de estos edulcorantes es polmico ya que han surgido estudios que indican que algunos de ellos son nocivos para la salud.
MeO O N H

H O N S O-Na+
O

O COOH NH2

Sacarina Sdica

Ciclamato de Sodio

Aspartamo

Figura 7.1: Estructura qumica de edulcorantes sintticos comnmente utilizados.

129

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

OH
RO O
OHH+

OH
RO OH
H2

OH
RO OH

OH

OH

OH

Figura 7. 2: Obtencin de DhCh de N

Tanto la bsqueda de edulcorantes inocuos, como la tendencia actual de los consumidores por preferir sustancias naturales, ha motivado el inters de la industria y la ciencia de los alimentos al descubrimiento de nuevos sustancias con poder endulzante que puedan reemplazar a las existentes. Entre estas sustancias, las dihidrochalconas, DhCh, generalmente obtenidas por hidrogenacin de las chalconas, satisfacen los requisitos antes mencionados, Figura 7.2. Sin embargo, y tal como se describi en el Captulo 2, no todas las DhCh presentan sabor dulce. Horowitz y col [1] plantean que el sabor de estas sustancias est relacionado con factores tales como la presencia de ciertos glicsidos en la molcula. De manera general se acepta que las DhCh rutinsidos (6-O--L-ramnosil-D-glucsido), entre las que se encuentra H y su DhCh, carecen de sabor, mientras que las DhCh neohesperidsidos (2-O--Lramnopiranosil--D-glucopiranosa), donde se incluye a Naringina dihidrochalcona, NDhCh, y Neohesperidina Dihidrochalcona (NhDhCh), presentan sabor dulce. Estos derivados de Ch, entre los que se incluyen sus correspondiente

glicsidos han sido empleados como agentes edulcorantes de alimentos. Dihidroxichalconas xilsidos y galactsidos son 1.5-2 veces ms dulce que la sacarina [2]. En nuestro pas, el CAA, incluye a Neohesperidina dihidrochalcona para su utilizacin como aditivo alimentario, (Cap XVIII. Res 1545, 12.09.90), Figura 7.3. Las caractersticas de esta dihidrochalcona en cuanto a la paladabilidad indican un sabor residual mentolado, por lo que acta apropiadamente en gomas de mascar, lavados bucales, pastas dentales y mezclas con otros productos.

CH2OH OO OH OH O OH O CH3 OH OH
OH

OMe
OH

OH

Figura 7. 3: Estructura qumica de Neohesperidina dihidrochalcona

Dado que el objetivo de este captulo es obtener sustancias con poder edulcorante, de las flavanonas ctricas estudiadas en los captulos anteriores, slo N constituye una alternativa no slo 130

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

Y RO OH X z

+
OH O O

OHY X RO OH z

OH calor

O H2 / Pd Y

Y X RO O z OHH2/Pd OH O OH O RO X OH

Figura 7. 4: Reacciones de sntesis de DhCh.[4]

para la obtencin de su dihidrochalcona, NDhCh, Figura 7.4, equivalente en base molar a la sacarina [3], sino tambin por ser precursora de la Neohesperidina dihidrochalcona a travs de una conversin a Floroacetofenona-4-neohesperidsido y posterior condensacin con isovainillina. Los procedimientos para la obtencin de dihidrochalconas son variados pero generalmente se realizan por hidrogenacin cataltica. Se han publicado trabajos en los cuales se sintetiza la chalcona correspondiente a travs de una reaccin de condensacin

de Claisen-Schmidt [4]. Esta Ch es posteriormente reducida, o bien su correspondiente flavanona en medio bsico [4,5] Figura 6.4. Tambin se ha reportado la obtencin de DhCh por transformacin microbiolgica de flavanonas glicosiladas [6]. Por otra parte, Briot y col [7], desarrollaron un mtodo alternativo a partir de un o-halofenol y 1-aril-2-propen1-ol, catalizada por Paladio, Figura 7.5. Periasamy y Thirumalaikumar informan la obtencin de DhCh por reduccin de Ch con NiCl2NaBH4 [8].

131

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

R
X + OH OH

[Pd]

R
OH O

Figura 7. 5: Esquema general para la sntesis de DhCh a travs de la reaccin de arilacin catalizada por Paladio. [7].

Contando con los resultados de los captulos anteriores, donde se realiz el estudio del efecto del solvente, el pH y la luz sobre el equilibrio flavanonachalcona se eligieron las condiciones apropiadas para la reaccin de hidrogenacin. En primer lugar se estudi la reaccin de hidrogenacin en medio neutro, descartndose EtOH como solvente por la tendencia de NCh a cerrar a Fl y el H2O no slo por la inestabilidad de NCh sino tambin por considerarse poco apropiada para la hidrogenacin cataltica. Experimentos preliminares indicaron que NCh es estable en soluciones metanlicas por lo que se eligi este solvente como medio de reaccin, tanto para medio cido como para bsico. Si bien bajo esta

ltima condicin de pH los resultados indicaron la existencia de una mezcla de N y NCh los experimentos se realizaron bajo la hiptesis de que de ambas especies slo se puede hidrogenar la forma NCh, adems si la reaccin tiene lugar el Principio de Le Chatelier predice que, el equilibrio se desplazar hacia la forma NCh. Por otra parte, teniendo en cuenta el efecto de la luz sobre NCh (Captulo 5) todos los experimentos se realizaron evitando la exposicin de las soluciones a la luz. En este captulo se presenta la obtencin de la DhCh derivada de N, (NDhCh), mediante hidrogenacin cataltica de soluciones metanlicas de NCh, utilizando PtO2. (IV) y negro de Pt.
Manmetro del tanque de gas

Tanque de reserva de gas Manmetro de la botella de reaccin

Botella de reaccin

Conexin al tanque de gas

Figura 7. 6: Hidrogenador Parr

132

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

H2 C H2C C H H H

H2 C CH3 C H H2C H H H C C H H2 C H2 C CH3 H H H2 H2C C C C CH2 CH3 H H2C H

H2 C C

H2 C C CH3 H H

Catalizador

Catalizador

Catalizador

Catalizador

Figura 7. 7: Mecanismo de la hidrogenacin cataltica heterognea [9].

Las reacciones fueron monitoreadas por espectroscopa UV-Vis y por HPLC, detalles experimentales en el Captulo 8 7.2OBTENCIN DIHIDROCHALCONAS HIDROGENACION CATALITICA DE POR

De las diferentes reacciones que se pueden utilizar para la reduccin de compuestos orgnicos, la hidrogenacin cataltica tiene un gran campo de aplicacin ya que ofrece grandes ventajas y simplicidad experimental. La reaccin de hidrogenacin cataltica se lleva a cabo utilizando un Hidrogenador Parr, Figura 7.6. El procedimiento consiste en disolver el compuesto a hidrogenar en un solvente adecuado, (alcohol, alcano o cido actico) al cual se le adiciona el catalizador y se agita continuamente bajo atmsfera de H2. El progreso de la reaccin puede monitorearse fcilmente midiendo el consumo de hidrgeno y el producto reducido se asla ordinariamente con una filtracin del catalizador seguida de la evaporacin del solvente. En nuestro caso la reaccin se sigui por

espectroscopia UV-Vis, dado que el espectro de la NDhCh es diferente al de su Ch precursora, Figura 7.8. Tal como lo indican los textos de Qumica Orgnica bsica, la reaccin de hidrogenacin se verifica en la superficie del metal, donde la sustancia a reducir, adsorbida sobre el catalizador, se pone en contacto con el hidrgeno [9,10], Figura 7.7. El hidrgeno se adsorbe en la superficie del catalizador, debilitndose el enlace H-H. Una cara del enlace del alqueno se enlaza con el catalizador producindose la adicin del hidrgeno adsorbido. El producto se libera del catalizador, ambos tomos de hidrgeno se agregan a la cara del doble enlace que est unida en forma compleja con el catalizador. 7.3- REACCION DE OBTENCION DE NDhCh POR HIDROGENACION CATALITICA La Figura 7.8 muestra los cambios espectrales y el cromatograma obtenido para la reaccin de hidrogenacin cataltica de Ch como catalizador. Las reacciones se llevaron a cabo disolviendo NCh en MeOH a la cual

133

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

1.5

0.08

0 - 180 min
0.06

t=0 min t=180 min

Ch

1.0

Abs

0.04

0.5

0.02

DhCh

0.00
0.0 200 300

(nm)

400

500

600

tiempo (min)

12

15

Figura 7. 8: Cambios espectrales y cromatogramas obtenidos para la reaccin de obtencin de DhCh Condiciones PH2 2 atm. Catalizador PtO (IV) (Relacin Ch/Cat 2) columna Wakosil II, Fase mvil H2O-ACN-HOAc (74.5:25:0.5, v/v). Flujo de 1.0 ml/min. Deteccin 330 nm

se le adicion el catalizador, PtO2 para el caso de la Figura 7.8. La presin de H2 fue de 3 atm y la reaccin se llev a cabo a una temperatura de 25C. En los espectros UV-Vis se observa la disminucin de la banda asociada a la forma NCh, 366 nm, con la aparicin simultnea de una banda centrada a 282 nm, caracterstica de la forma NDhCh. La reaccin fue corroborada por HPLC observndose el mismo comportamiento, la disminucin del pico asociado con NCh, tR =11.5 min., y la aparicin del pico de NDhCh, tR=12 min, corroborado por inyeccin de DhCh patrn, Figura 7.8. A fin de optimizar las condiciones para la obtencin de NDhCh, se compararon los rendimientos porcentuales utilizando dos catalizadores, PtO2 (IV) y negro de Pt en diferentes proporciones Ch/catalizador, se utilizaron diferentes presiones de H2, etc. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 7.1. En todos los casos, se verific el consumo total del reactivo en un tiempo promedio de 180 min. 134

PH2 (atm) 3 3 2 2 1.5 3 3

Catalizador PtO2 PtO2 PtO2 PtO2 PtO2 Negro Pt Negro Pt

Relacin Ch/Cat 20 2 20 2 2 20 2

% Rendimiento 33 19 22 33 23.5 8.5 26.5

Tabla 7. 1: Rendimientos para la reaccin de hidrogenacin cataltica de NCh.

El mximo rendimiento, 33% se obtuvo con PtO2 en una relacin Ch/cat de 20 bajo una presin de H2 de 3 atm y tambin con una relacin Ch/cat de 2 y una presin de H2 de 1.5 atm. Sobre la base de que la optimizacin del proceso implica el menor tiempo, el menor gasto de H2 y sobre todo el menor consumo del catalizador, la primera condicin sera la ms conveniente para la obtencin de NDhCh. Los bajos rendimientos obtenidos se deben probablemente a la reaccin de otros grupos presentes en la molcula susceptibles a la hidrogenacin, por ejemplo el grupo carbonilo o la inactivacin del catalizador, entre otras.

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

Finalmente, se estudi la hidrogenacin en medio bsico, sin embargo la reaccin no se produjo en estas condiciones. Este resultado puede asociarse a que en medio alcalino la deprotonacin de los grupos fenlicos, especialmente los del anillo B, provocan deslocalizacin en el sistema lo que probablemente dificulta la reaccin. Dada la importancia de la reaccin estudiada, resulta interesante continuar los estudios trabajando con otros catalizadores, solventes, como as tambin reacciones alternativas como por ejemplo reduccin del doble enlace por reaccin con agentes reductores en fase homognea, etc.

135

Captulo 7

Obtencin de Dihidrochalcona de Naringina

Bibliografa
[1] Horowitz, R. Taste Effects of flavonoids. Plant Flavonoids in Biology and Medicine: Biochemical, Pharmacological and StructureActivity Relationships. 163-175. Alan R. Liss. Inc. 1986. Dhar, D. N. The Chemistry of chalcones and related compounds. Wiley-Interscience Publication. Chapter twenty nine. 1981 y bibliografa all citada. Horowitz, R. M.; Gentili, B. Taste and Structure in phenolic glycosides. J. Agric. Food Chem. 17. 4 . 696-700. 1969. Krbechek, L.; Inglett, G.; Holik, M.; Dowling, B.; Wagner, R.; Riter, R. Dihydrochalcones. Synthesis of Potential sweetwning agents. J. Agric. Food. Chem. 16. 1.. 108-112. 1968. Br, A.; Borrego, F.; Benavente, O.; Castillo, J.; Del Rio, J. A. Neohesperidin dihydrochalcone: properties and applications. Lebensm.-Wiss. U.-Technol. 23.371376. 1990. Linke, A.H.B.; Natarajn, S.; Eveleigh, D. E. A new screening agent to detect the formation of dihydrochalcone sweeteners by microorganisms. Abstract of the Annual Meeting of the American Society of Microbiology. P 171. Abstract 184. 1973 Briot, A.; Baher, C.; Brouillard, R.; Wagner, A.; Mioskoswki, Ch. Concise Synthesis of Dihydrochalcones via Palladium-Catalyzed Coupling of Aryl Halides and 1-Aryl-2-propen-1-ols. J. Org. Chem. 69. 1374- 1377. 2004. Periasamy, M.; Thirumalaikumar, M. Methods of enhancement of reactivity and selectivity of sodium borohydride for applications in organic synthesis.J Organometallic Chem/. 609. Issue 12. 137-151. 2000. Wade, L. G. Qumica Orgnica. Segunda Edicin. Ed. Prentice- Hall Hispanoamericana. 1993 Carey, F., Sundberg, R. Advanced Organic Chemistry. Part. B. Reactions and synthesis. Plenum U. S. Ed. Fourth Edition. May 2001.

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9] [10]

136

Captulo 8

Materiales y Mtodos

Materiales y Mtodos

MATERIALES Y METODOS 8.1.- REACTIVOS Y SOLVENTES 8.1.1- Flavonoides Los F utilizados en este trabajo de tesis fueron: Naringina (N) al 97% Fluka (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland) sin tratamiento posterior, Hesperidina (H), Quercetina (Q), Rutina (R), al 97% recristalizadas antes de usar provistas por Parafarm. Las agliconas Naringenina (Ng), Hesperetin (Ht) fueron sintetizadas en nuestro laboratorio siguiendo el procedimiento de hidrlisis cida descrito por Mabry y Markham.[4], este procedimiento es aplicable a la hidrlisis de todos los F O-glicosilados. La tcnica consiste en mezclar el F glicsido con 5 ml de solucin acuosa de HCl al 6 %. La solucin resultante se calienta en un bao de vapor durante 45 min., se enfra y se adiciona ter etlico. La fase acuosa contiene los azucares, mientras que de la evaporacin del solvente de la fase etrea se obtiene las correspondientes agliconas. NDhCh fue cedida por el Dr Paulo Bobbio y NCh se sintetiz de acuerdo al procedimiento descrito a continuacin.

[Link].- Obtencin de Chalcona de Naringina (NCh) La forma Chalcona de Naringina se obtuvo a partir de la correspondiente flavanona por el mtodo recomendado por Shimokoriyama:[1] el cual consiste en adicionar 1 g de Naringina a 4 ml de una solucin de etanol-agua (1:1) conteniendo 2 g de hidrxido de Potasio y se calienta en bao de vapor por dos minutos. A la solucin roja obtenida se le adiciona HCl en exceso (aproximadamente 20 ml) enfriado a hielo producindose un precipitado, el cual es filtrado a vaco, predisuelto en EtOH y enfriado nuevamente. Posteriormente se adicionan gotas de ter sulfrico para recristalizarlo, se filtra nuevamente y se seca bajo atmsfera de nitrgeno. De este procedimiento se obtuvo un polvo de color amarillo cuyo punto de fusin fue de 182186 C, concordante con lo informado en literatura; 185 200 C [2] y 170 183 C[3] El anlisis del espectro UV-Vis en etanol estuvo de acuerdo con lo esperado,[3,4] con max= 366 nm, log = 4.51. El anlisis por HPLC (ver detalles ms adelante) dio un 98% de pureza. 137

Captulo 8

Materiales y Mtodos

8.1.2- Reactivos de uso general Durante las diferentes etapas de este trabajo de tesis se utilizaron los siguientes reactivos: cido clorhdrico (HCl), hidrxido de sodio (NaOH), hidrxido de potasio (KOH) acetato de sodio (NaOAc), cido Ctrico, Carbonato y Carbonato cido de Sodio (Na2CO3 y NaHCO3) de Ciccarelli. Fosfato cido, dicido de sodio (Na2HPO4 y NaH2PO4, respectivamente) de grado analtico de Merck Qumica Argentina (Buenos Aires, Argentina). Etanol absoluto (EtOH), ter sulfrico (Et2O), metanol (MeOH) y cloroformo (CHCl3) de Ciccarelli, noctanol provisto por Riedel-de Hen. Para la preparacin de las soluciones se utiliz agua tridestilada. Los anlisis por Cromatografa Lquida de Alta resolucin (HPLC) se realizaron utilizando Acetonitrilo (ACN), cido Actico (HOAc) provistos por Sintorgan, sin tratamiento posterior y agua ultrapura obtenida a partir de osmosis inversa .

8.1.3-Reactivos Especficos En la determinacin de la AAO y AAR de los F se emplearon los siguientes reactivos: Radical 2,2-Difenil1-picrilhidrazilo (DPPH.) provisto por Aldrich, cido Ascrbico (AA) de Parafarm, -caroteno Sigma previamente purificado por cromatografa en columna de slica, Tween 20 (Polioxietileno sorbitan monolaurato) provisto por Aldrich. 8.2- METODOLOGIA e INSTRUMENTAL 8.2.1-EQUIPAMIENTO UTILIZADO Las determinaciones por espectroscopia UV- Vis se realizaron utilizando un espectrofotmetro UV-Vis Hewlett-Packard 8453 con deteccin de arreglo de diodos, operando en modo espectral y cintico. El intervalo de deteccin est comprendido entre 190 1100 nm, con ancho de banda de 1 nm La temperatura del portacelda del espectrofotmetro fue controlada a 0.1 C, mediante circulacin de agua termostatizada, que acciona adems un
E s pectrofotmetro de arr eglo de diodos Hewlett-P ackard 8453

0.4
1.5

Abs 426 nm

0.3 0.2 0.1 0.0 0 4 000 8 000 12 000

Mues tra
tim e (s)

1.0

Abs
0.5 0.0 200

300

(nm)

400

500

600

PC
T ermos tato ( 0.1 C) rango: 15 T (C) 45

Figura 8. 1: Esquema del equipo utilizado para las determinaciones por espectroscopia UV-Vis.

138

Captulo 8

Materiales y Mtodos

sistema de agitacin magntica en la base del portacelda permitiendo la homogeneizacin de la muestra. (Figura 8.1) El haz analizador fue atenuado con un filtro de densidad neutra, a fin de evitar reacciones secundarias, especialmente para el caso de NCh, donde experimentos preliminares indicaron la formacin de un producto secundario, descrito en el Captulo 5. Los experimentos por cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) se llevaron a cabo empleando un Cromatgrafo Lquido Konik, modelo KNK 500 Serie A, equipado con una columna Konik ODS- 2 (250x 46 mm i.d.; 5m) operado a 25 C con fase mvil agua-acetonitrilo-cido actico (79.5:20:0.5, v/v) en modo isocrtico con un flujo de 1.2 ml/min. La deteccin se realiz usando un detector Konik UV- Vis 200. El efecto de la luz se realiz irradiando las muestras con una lmpara de Xe de 150 W conectada a un monocromador con red de difraccin de 1200 surcos/mm con una resolucin espectral mxima de 2.5 mm. 8.2.2-METODOLOGIAS CAPITULO 4: Efecto de la composicin del solvente sobre el equilibrio Flavanona-chalcona de Naringina Los experimentos se llevaron a cabo adicionando l de soluciones stock (1 mM) de N, NCh y H a una celda de cuarzo de 1 cm de paso ptico conteniendo 2 ml de solvente (EtOH, H2O y mezclas de ambos con 0.03 XW 1.00) de manera tal de obtener una concentracin de N NCh inicial de aproximadamente 40 M. Para el caso

de H, dada su baja solubilidad en agua, se procedi a preparar soluciones sobresaturadas las cuales fueron posteriormente filtradas y cuyas concentraciones se determinaron, por espectroscopia UV-Vis. A las celdas conteniendo las correspondientes flavanonas se adicionaron la cantidad necesaria de solucin acuosa de NaOH 0.1 M de forma tal que la concentracin final de base fue variada entre 0.062 y 12.5 mM. Los experimentos se realizaron en recipientes protegidos de la luz a fin de evitar reacciones secundarias. Los espectros de absorcin fueron tomados a intervalos de 15 segundos a partir del momento de adicin de la base durante el tiempo suficiente como para no observar cambios espectrales mayores que 1%. La composicin final de las soluciones se determin por anlisis del espectro UV-Vis dado que N y NCh presentan espectros caractersticos diferenciales (Figura 1.2). En algunos casos, la composicin final tambin se realiz por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) mediante la utilizacin de las correspondientes curvas de calibracin. Ambos mtodos dieron resultados similares dentro de un 10% de desviacin estndar. Todos los experimentos se realizaron por duplicado, reportndose los valores promedios con sus respectivas desviaciones estndar. CAPITULO 5: Estudio del efecto de la luz sobre el equilibrio FlavanonaChalcona de Naringina

139

Captulo 8

Materiales y Mtodos

Los datos cinticos del efecto de la luz sobre el equilibrio Fl-Ch se llevaron a cabo adicionando, con microjeringa, alcuotas de soluciones stock tanto de N como de NCh a celdas de cuarzo conteniendo: soluciones acuosas de buffer citrato fosfato (pH: 3) para los experimentos en medio cido, EtOH y soluciones acuosas y etanlicas bsicas cuyo pH se ajust adicionando los l apropiados de una solucin concentrada de NaOH (0.1M). Para las reacciones denominadas a oscuras o sin irradiacin las celdas fueron cuidadosamente protegidas de luz, utilizndose en el espectrofotmetro filtros de corte al mximo de absorcin UV-Vis de la forma NCh. La irradiacin se llev a cabo en las mismas celdas iluminandolas con una fuente de luz conectada a un monocromador de manera de ajustar la longitud de onda al mximo de la forma NCh. Simultneamente con el anlisis por espectroscopia UV-Vis las reacciones se monitorearon por HPLC bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. CAPITULO 6. Determinacin de las propiedades antioxidantes de los flavonoides Determinacin de la Actividad Antiradicalaria de Flavonoides A una celda de cuarzo conteniendo 3 ml de solucin metanlica de DPPH de concentracin aproximada 2 x 10-5 M, (determinada a partir de su coeficiente de absorcin molar, = 12509 [5]), se adicionaron diferentes alcuotas de soluciones stock de cada F, AA, combinaciones de AA con F de manera

de lograr distintas relaciones de moles entre F y DPPH. La disminucin de la absorbancia a 515 nm se determin en forma continua durante el tiempo necesario para alcanzar el estado estacionario, es decir hasta no observar cambios en la absorbancia del radical. La solucin de DPPH se prepar diariamente controlndose que la variacin en su absorbancia no fuera mayor al 5% durante el intervalo de tiempo de cada experimento. Determinacin de la AAO por el mtodo del beta-caroteno Una alcuota de una solucin stock de -caroteno en cloroformo (0.2 mg/ml) se adicion a un erlenmeyer conteniendo 600 l de Tween 20, se mezcl y se evapor el cloroformo bajo corriente de Nitrgeno por 10 minutos. A continuacin, se adicionaron 150 ml de agua previamente burbujeada con oxgeno por 5 minutos y a la emulsin resultante se la coloc en un bao termostatizado a 50C durante 20 minutos para su estabilizacin (solucin madre). Alcuotas de 20 ml de la solucin madre se adicionaron a frascos hermticos con septo de goma, conteniendo una mezcla de 10 l de cido linoleico ms los l apropiados de soluciones metanlicas estndar de cada F. Las mezclas se introdujeron nuevamente en el bao termostatizado protegidas de la luz y se monitorearon cada 15 minutos hasta consumo total del carotenoide. Debido a que esta metodologa es muy sensible a las condiciones del experimento, las

140

Captulo 8

Materiales y Mtodos

alcuotas se extrajeron con una jeringa de manera de no abrir los recipientes y obtener resultados reproducibles. Junto a cada serie de experimentos se prepararon blancos, sin adicin de cido linoleico ni F con el objeto de monitorear la estabilidad trmica del carotenoide y muestras control, sin adicin de F que representaron el proceso de oxidacin del cido graso. La reaccin se analiz por espectroscopia UV-Vis al mximo de absorcin del -caroteno, 460 nm, durante el tiempo necesario para consumir el carotenoide (120 minutos). Para el caso particular de NCh, y debido a que en agua neutra cierra inmediatamente a la forma Fl, se procedi en primer lugar a monitorear su estabilidad en la micela para luego realizar el anlisis de la AAO. Con el objeto de determinar la capacidad de cada F para penetrar en la micela de Tween 20 se determinaron los coeficientes de particin en n-octanol solvente que presenta un valor de constante dielctrica similar al reportado para Tween 20 [6]. El procedimiento consisti en disolver cada F en n-octanol, se los coloc en frascos hermticos a los cuales se les adicion igual volumen de agua. Los frascos se colocaron en un bao termostatizado a 50C por 1 h. Los valores de absorbancia en la fase orgnica se determinaron al comienzo del experimento (A0) y a intervalos regulares de tiempo hasta obtener valores de absorbancia constantes (Ax). Las constantes de particin descritas en la Tabla 6.2, Ko/w y las fracciones de cada F en la fase

organica se calcularon de acuerdo a la ecuacin 6.4. Una solucin de n-octanol saturado con agua se us como blanco. Determinacin de la AAR de combinaciones de cido Ascrbico con Flavonoides A fin de determinar la interaccin los F con AA frente a DPPH se procedi en primer lugar a determinar el consumo de radical tanto de cada F como de AA en forma individual. A una celda conteniendo 3 ml de solucin metanlica de DPPH se adicionaron alcuotas de solucin stock de cada F y de AA. La reaccin se monitore por espectroscopia UV-Vis a 515 nm hasta alcanzar el EE. Una vez determinados los consumos individuales se prepararon las diferentes combinaciones. Para los experimentos donde se parti de una mezcla de ambas sustancias (F y AA) se procedi de la siguiente manera: a una celda se adicionaron las alcuotas correspondientes a las concentraciones utilizadas en el primer paso y luego de adicionar 3 ml de la solucin de DPPH se monitore la reaccin de acuerdo a lo descrito anteriormente determinndose los consumos de radical en el EE. Para analizar las posibles reacciones entre F-AA y entre las formas oxidadas de una especie y la otra, se procedi a realizar las reacciones en etapas, esto es se hizo reaccionar con el radical libre uno de los compuestos (F y/o AA) hasta el estado estacionario, o sea hasta su forma completamente oxidada y luego se adicion el segundo

141

Captulo 8

Materiales y Mtodos

compuesto, analizndose los consumos de radical. Las concentraciones de los compuestos, expresadas como relacin de moles en funcin de moles de DPPH, se escogieron en funcin de las reactividades, teniendo en cuenta los factores estequiomtricos determinados anteriormente (Tabla 7.1) Los resultados se expresan como % consumo DPPH para distintas relaciones F-AA. Determinacin de la AAR de jugos ctricos naturales La capacidad antiradicalaria de los diferentes jugos se determinaron utilizando el mtodo de decoloracin del radical libre DPPH . Los jugos se obtuvieron a partir de frutos adquiridos en comercios de la ciudad Capital de Santiago del Estero en Diciembre de 2004. A cada fruto se lo lav, cort y exprimi en un exprimidor domstico. El jugo obtenido fue filtrado a travs de algodn y luego se centrfugo a 1500 r.p.m durante 5 minutos. Del sobrenadante se tomaron alcuotas de 20, 15, 10 y 5 l y se adicionaron a una cubeta conteniendo 3 ml de solucin metanlica de DPPH. La reaccin se monitore a 515 nm durante el tiempo suficiente como para no observar cambios en la absorbancia del radical. Los anlisis se realizaron por triplicado reportndose el valor promedio junto a la desviacin estndar. La cuantificacin de AA en los jugos se realiz por HPLC segn el mtodo propuesto por Correa de Souza y col [7] utilizando una columna SS Wakosil C18 RS (250x 4.6 mm i.d.; 5m)

operado a 25 C, utilizndose como fase mvil una solucin acuosa de H2SO4 (pH 2.5) en modo isocrtico con un flujo de 0.7 ml/min. La deteccin se realiz a 254 nm usando un detector Konik UV- Vis 200. CAPITULO [Link] de Dihidrochalcona de Naringina (NDhCh) La reaccin de obtencin de NDhCh se realiz por hidrogenacin cataltica, utilizndose un Hidrogenador tipo Parr (Figura 6.6). El procedimiento consisti preparar una solucin metanlica de NCh conteniendo aproximadamente 0.2 mg/ml. Luego, la solucin se trasvaso al frasco de reaccin y se adiciono el catalizador (Negro de Platino u Oxido de Platino (IV)) en diferentes cantidades (expresadas como relacin Ch/Cat, Tabla 6.1) Dado que los primeros experimentos no mostraron formacin de NDhCh se procedi a activar el catalizador sonicndolo por 10 minutos y transcurrido ese tiempo se la coloco en el Hidrogenador bajo una presin de 2-3 atm obtenindose as resultados positivos. Las reacciones fueron monitoreadas por espectroscopia UVVis, dado que las formas NCh y NDhCh muestran mximos espectrales bien diferenciados, 282 nm y 366 nm respectivamente, Figura 6.8.A y por HPLC, columna Wakosil II, (250x 46 mm i.d.; 5m) operado a 25 C con fase mvil agua-acetonitrilo-cido actico (74.5:25:0.5, v/v) en modo isocrtico con un flujo de 1.0 ml/min. La deteccin se realiz a 330 nm usando un detector Konik UV- Vis 200.

142

Captulo 8

Materiales y Mtodos

Bibliografa
[1] M. Shimokoriyama, Interconversion of chalcones and flavanones of a phloroglucinol-type structure. J. Am. Chem. Soc. 79, 4199 4202. 1957 Shimokoriyama, M. Interconversion of chalcones and flavanones of a phloroglucinol-type structure. J. Am. Chem. Soc. 79, 4199 4202. 1957. C.O. Miles, and L. Main, The kinetics and mechanism, and the equilibrium position as a function of pH, of the isomerization of naringin and the 4rhamnoglucoside of 2,4,4,6tetrahydroxychalcone. J. Chem. Soc. Perkin Trans. II. 195 198. 1988. T. Mabry, K. Markham, and M. Thomas. The systematic identification of flavonoids. SpringerVerlag, New York, 1970. Captulos VI y VII. Brand-Williams, W.; Cuvelier, M. E:; Berset, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft and Technologie. 28. 25-30. 1995. Ghosh, S.; Moulik, S. P. Interfacial and Micellization Behaviors of Binary and Ternary Mixtures of Amphiphiles (Tween-20, Brij-35, and Sodium Dodecyl Sulfate) in Aqueous Medium. Journal of colloid and interface science 208. 357366. 1998. Correa de Souza, M. C.; Toledo Benassi, M.; Almeida Meneghel, R.F.; Ferreira da Silva, S. Stability of unpasteurized and refrigerated orange juice. Brazilian Archives of Biology and Technology. 47.3.391397. 2004.

[2]

[3]

[4].

[5]

[6]

[7]

143

Captulo 9

Conclusiones Generales

Conclusiones Generales

En este trabajo de se realiz un estudio cintico del efecto del solvente en agua, EtOH y mezclas de ambos sobre el equilibrio entre las formas flavanona-chalcona de N y H, dos flavanonas presentes en ctricos. Se plante un mecanismo de reaccin en condiciones bajo las cuales la isomerizacin es controlada por la formacin de un carbanin intermediario o mecanismo E1cB. Mediante la utilizacin de espectroscopia de absorcin UV-Vis y cromatografa lquida de Alta Resolucin (HPLC) se determinaron los parmetros cinticos y termodinmicos asociados a la reaccin de isomerizacin mediante la utilizacin de espectroscopia de absorcin UV-Vis y Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC). Se analiz el efecto del agregado de base, NaOH, sobre las constantes de velocidad de la reaccin de apertura de flavanona, ka, y cierre de chalcona, kc, observndose que para N, ka alcanza un mximo en mezclas con XW 0.4-0.5, mientras que para la constante de cierre kc prcticamente no se observan mayores cambios con la composicin de 145

la mezcla. Para H se observ un comportamiento diferente a N, donde la composicin del solvente afecta slo a la constante de velocidad de la reaccin de cierre, kc siendo mxima para una mezcla XW 0.8. Esto se explic en funcin de las diferencias en la sustitucin del anillo B que presentan N y H. Para N el efecto donor del grupo 4-Odel anillo B facilita la expulsin del grupo O- en posicin C-2 de la flavanona, favoreciendo la reaccin de apertura. Por el contrario, en H la deprotonacin del grupo hidroxilo en posicin C-3 no presenta ninguna estructura resonante que influya sobre el heterociclo C, consecuentemente el C tiene menor densidad electrnica que en el caso de N dificultando la partida del grupo O- en posicin C-2 de la flavanona, predominando la reaccin de cierre. Estos efectos hacen que, en medio bsico, pH aproximado de 11, N se encuentre desplazada hacia su forma Ch ocurriendo lo contrario para H. Los parmetros termodinmicos, entalpa y entropa, para la reaccin de isomerizacin de ambas flavanonas correlacionaron linealmente, sugiriendo

Captulo 9

Conclusiones Generales

la existencia de un efecto de compensacin entalpa-entropa. La presencia de dicho efecto es una evidencia de que ambas reacciones operan bajo el mismo mecanismo, E1cB. Los hechos experimentales sugieren que es posible obtener flavanona o chalcona controlando las variables pH, composicin del solvente. Para la obtencin de Ch, los valores de Keq, Tabla 4.2, indican que la reaccin se encuentra ms desplazada hacia la forma Ch a Xw =0.52 para N y Xw=0.24 para H ambas a pHap= 11. Se estudi el efecto de la luz sobre las velocidades de reaccin del equilibrio Fl-Ch en medio acuoso cido, en EtOH neutro y en ambos solventes en medio bsico, pH aparente 11. Como primer resultado se observ que la irradiacin no ejerce efecto sobre H ni su chalcona en ambas condiciones de pH. Para N, tanto en agua pH 3 como en EtOH neutro, la luz no ejerce efecto sobre las velocidades de reaccin, observndose que en estas condiciones el equilibrio se encuentra desplazada hacia la forma Fl. Se plante el mecanismo para la reaccin de ciclizacin de NCh el cual implica una enolizacin catalizada por cido y se determinaron los parmetros cinticos y termodinmicos. Los resultados indican que la reaccin de ciclizacin es ms rpida en EtOH que en las soluciones acuosas cidas, a pesar que los valores de entalpa de activacin son mayores en EtOH. Esto indic que la reaccin est controlada por entropa En medio bsico se observ que, la irradiacin cataliza la formacin de un

producto P, el cual se forma a partir del estado excitado de NCh, tal como lo indicaron los parmetros cinticos obtenidos. Sobre los hechos experimentales se dedujo la estructura de dicho producto, el cual corresponde a la familia de las hidroxidihidrochalconas, denominndose -hidroxi-4,2`,4`trihidroxi dihidrochalcona. Teniendo en cuenta los efectos benficos para la salud que provoca la ingesta de F se determinaron las AAR y AAO de N, H, sus agliconas como as tambin la especie NCh, su correspondiente dihidrochalcona, NDhCh y los flavonoles R y, Q emplendose dos mtodos ampliamente utilizados: el mtodo de decoloracin del radical libre DPPH y el mtodo del blanqueamiento de -caroteno durante la cooxidacin con cido linoleico. Con el objeto de simular las condiciones existentes en los jugos ctricos se realiz un estudio de las capacidades antirradicalarias de combinaciones de AA y F en diferentes concentraciones. Finalmente se determinaron las AAR de jugos naturales de naranjas, pomelos y limones. Los resultados obtenidos indican que R y Q presentan la mayor AAR y AAO respectivamente, mientras que de las flavanonas, N presenta la mnima AAR y AAO. Sin embargo los resultados obtenidos durante el estudio de la interaccin con AA indican que la combinacin N-AA presenta efecto positivo comparado con la suma de los consumos individuales. Esto se explic en funcin de los potenciales de reduccin de las cuplas, los cuales indican que N reacciona con la forma

146

Captulo 9

Conclusiones Generales

oxidada del cido ascrbico, DHA, regenerndolo. Dentro de los derivados de las flavanonas, NDhCh, la forma hidrogenada de NCh, la cual presenta propiedades edulcorantes, presento la mayor AAO y AAR por lo que su uso en la alimentacin tendra efectos benficos adicionales, ya que presenta propiedades tanto como endulzante y como AO. La determinacin de las AAR de jugos de naranjas, pomelos y limones, indicaron que el jugo de naranja es el ms eficiente en para atrapar radicales libres. Dado que el AA es el componente mayoritario de los ctricos, se determinaron las concentraciones de este compuesto en cada jugo, y se encontr que existe una relacin lineal entre la concentracin de AA y la AAR. Conocida las concentraciones de AA en los jugos se compararon los consumos de radical de los mismos con soluciones equimolares stock de .AA. Los resultados indicaron que el consumo de radical por parte de los jugos es mayor que el esperado, este hecho se explic por la presencia de otras sustancias polifenlicas capaces de atrapar radicales libres entre las cuales

se encuentran los F que contribuyen a la AAR total, adems de la posibilidad de que dichas sustancias puedan interactuar de manera positiva con el AA. Finalmente, se obtuvo la forma Dihidrochalcona de N, un poderoso edulcorante de posible utilizacin en alimentos, mediante reaccin de hidrogenacin cataltica. Los resultados indicaron que el mximo rendimiento, se obtuvo en soluciones metanlicas neutras con PtO2 como catalizador, en una relacin en peso Ch/cat de 20, bajo una presin de H2 de 3 atm. En conclusin, a partir de residuos o desechos de la industria citrcola, actualmente desaprovechados, es posible la extraccin de sustancias tales como las flavanonas de gran inters tanto para la industria alimentara por ser precursoras de edulcorantes semisintticos, como para la nutracutica por sus propiedades AO. Esta tesis plantea una alternativa interesante de aprovechamiento de fuentes naturales de nuestra regin, tales como las cscaras de los ctricos, que actualmente son poco explotadas para la obtencin de productos de alto valor agregado

147