Real-Time RT-PCR para la Detección del COVID-19

INSTRUCCIONES

RT-PCR en tiempo real para la detección cualitativa in vitro del coronavirus 2019 (2019-
nCoV) en muestras respiratorias. Los juegos de cebadores y sondas 2019-nCoV están
diseñados para la detección universal de coronavirus similares al SARS y para la
detección específica de 2019-nCoV.
Manejo y almacenamiento de muestras

 Las muestras se pueden almacenar a 4°C hasta 72 horas después de la

recolección.
 Si se espera un retraso en la extracción, almacene las muestras a -70°C o menos.
 Los ácidos nucleicos extraídos deben almacenarse a -70°C o menos.
Reactivos y Suministros

 Conjunto de sonda/primers
 Control positivo N y RP
 Enzima GoTaq
 Agua grado molecular libre de nucleasas
 Guantes de nitrilo desechables libres de polvo.
 Puntas con filtro 10µl, 20µl, 200µl y 1000µl microlitros.
 Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml estériles, libres de nucleasas
Equipo

 Estación de trabajo campana UV-PCR.

 Mezclador Vortex
 Microcentrífuga
 Micropipetas (10 μl, 200 μl y 1000 μl)
 bloque frío de 96 pocillos
 Congelador de -20°C y Ultracongelador de -70°C; Refrigerador 4°C.
 Sistema de detección de PCR en tiempo real
 Sistema de extracción de ácido nucleico.
Controles de ensayo

 Los controles deben ser procesados de manera simultánea en cada una de las
corridas del día.
 PC: control positivo con un rango de valores de ct (<35).
 NC: control negativo agregado durante la configuración de la reacción RT-PCR
 RP: todas las muestras clínicas deben analizarse para determinar el gen de la
ARNasa P (RP) humana para evaluar la calidad de la muestra(ct<35).
 Nota: Siga ejecutando registros de rendimiento de CP. Después de cada corrida
de muestras clínicas de RT-PCR, se deben registrar los valores de ct de control.
Ensayo para RT-PCR
Preparación de reactivos
Cebadores de RT-PCR / sondas / primers (listos para su uso)

 Precauciones: estos reactivos solo deben manipularse en un área limpia y

almacenarse a temperaturas apropiadas. Mantener en el bloque frío cuando se
descongela.
Control Positivo N y RP.
Rotule microtubos de 1.5 – 2.0 ml, tal como (N POS) y (RP POS)
Realizar una dilución de 1.0µl de cada control en 999.0µl de agua libre de nucleasas,
quedando a una concentración de 200 copias por microlitro, esto de acuerdo al proveedor
de los reactivos.

 Precauciones: este reactivo debe manipularse con precaución en un área

dedicada a la manipulación de ácidos nucleicos para evitar una posible
contaminación. Mantener en bloque frio cuando se descongela.
 Se utiliza para evaluar el rendimiento de los ensayos de RT-PCR.
 El CP-RP, contiene ADN humano que sirve como control positivo para el ensayo
de RP.
Preparación de equipos
1) Limpie y descontamine todas las superficies de trabajo, pipetas, centrifugadoras y otros
equipos antes de usar.
2) Encienda el termociclador.
3) Realice la configuración y seleccione el protocolo de ciclado en el instrumento.
4) Configuración del instrumento: Detector (FAM); Quencher (Ninguno); Referencia
pasiva: (ninguna); Modo de ejecución: (estándar); Volumen de muestra (20μL).

Paso Tiempo Tm Ciclos

1 15 min 45°C 1
2 2 min 95°C 1
3 3 seg 95°C
4 30 seg 55°C 45

* Los datos de fluorescencia (FAM) deben recopilarse durante el paso de incubación a

55°C.
Nota: La configuración del ROTOR-DISC puede variar con el número de muestras y la
organización del día de trabajo.
Mezcla maestra de reacción y configuración de placa
1) En la campana limpia de la sala de preparación de reactivos, coloque el buffer, la
enzima y el cebador/sondas en hielo o bloque frío. Mantener frío durante la preparación y
el uso.
2) Descongele los reactivos de 20 – 30 minutos antes de usar.
3) Mezcle el buffer, la enzima y los primers/sondas por inversión 5 veces.
4) Centrifugue brevemente el buffer y los primers/sondas y vuelva al hielo.
5) Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL para cada conjunto de cebador/sonda
(N1, N2, RP).
6) Determine el número de reacciones (N) por cada primer/sonda a preparar. Es
necesario hacer un exceso de mezcla de reacción para las reacciones CN, CP-N1, CP-
N2, CP-RP y para compensar el error de pipeteo. Use la siguiente guía para determinar N:
7) Para cada conjunto de cebador/sonda, calcule la cantidad de cada reactivo que se
agregará para cada mezcla de reacción (N = # de reacciones), tome en cuenta los
volumenes extras antes mencionados.

N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
B U F F ER 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 0 110 12 0 13 0 140 150 16 0 170 18 0
G OTA Q 0 .4 0 .8 1.2 1.6 2 2 .4 2 .8 3 .2 3 .6 4 4 .4 4 .8 5.2 5.6 6 6 .4 6 .8 7.2
P R IM ER 1.5 3 4 .5 6 7.5 9 10 .5 12 13 .5 15 16 .5 18 19 .5 21 2 2 .5 24 2 5.5 27
H2 O 3 .1 6 .2 9 .3 12 .4 15.5 18 .6 2 1.7 2 4 .8 2 7.9 31 3 4 .1 3 7.2 4 0 .3 4 3 .4 4 6 .5 4 9 .6 52 .7 55.8

N 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
B U F F ER 190 200 2 10 220 230 240 2 50 260 2 70 280 290 300 3 10 320 330 340 3 50 360
G OTA Q 7.6 8 8 .4 8 .8 9 .2 9 .6 10 10 .4 10 .8 11.2 11.6 12 12 .4 12 .8 13.2 13 .6 14 14 .4
P R IM ER 2 8 .5 30 3 1.5 33 3 4 .5 36 3 7.5 39 4 0 .5 42 4 3 .5 45 4 6 .5 48 4 9 .5 51 52 .5 54
H2 O 58 .9 62 6 5.1 6 8 .2 71.3 74 .4 77.5 8 0 .6 8 3 .7 8 6 .8 8 9 .9 93 9 6 .1 9 9 .2 10 2 .3 10 5.4 10 8 .5 111.6

N 37 38 39 40
B U F F ER 3 70 380 390 400
G OTA Q 14 .8 15.2 15.6 16
P R IM ER 55.5 57 58 .5 60
H2 O 114 .7 117.8 12 0 .9 12 4

Todos los volúmenes serán medidos en µl.

 N= # de reacciones para cada sonda/primer
8) Dispense reactivos en cada microtubo (N1, N2, RP) de 1,5 ml. Después de la adición
de los reactivos, mezcle la preparación con pipeta o con toque del vortex.
9) Centrifugue durante 5-10 segundos para recoger el contenido en el fondo del tubo y
luego coloque el tubo en el bloque frío.
10) Coloque microtubos de reacción de 200µl en la rejilla negra de 96 pozos. Los tubos de
reaccion se ennumeran de manera consecutiva del 1 hasta X sea el caso, y se utilizan 3
por cada muestra, 1-3 muestra 1, 4-6 muestra 2, 7-9 muestra 3, etc…y 3 para CP y una
para CN.
11) Dispense 15 μL de cada mezcla (N1 en la columna A, N2 en la columna D, RP en la
columna G, esto puede variar según el analista) en los pozos que atraviesan la columna
segun como se muestra a continuación:

Adición de control positivo y negativo.

12) Pipetee 5 μL de ARN nCoV-CP(N y RP) en los pocillos de muestra de la columna
asignada para cada una de las sondas, CP-N en los marcados como N1+ y N2+, CP-RP
en el microtubo marcado como RP+. Cubra bien los pocillos después de agregar el ARN
de control.
.Asegúrese de tener todos los pocillos cerrados antes de continuar.
La posición del control CN puede variar, esto dependiendo del consumo de las
sondas/primers
13) Pipetee 5 μL de agua libre de nucleasas en el pocillo asignado y marcado como CN,
tape bien el pozo antes de continuar.
Adición del RNA muestra.
1) coloque los tubos de muestras de ácidos nucleicos extraídos en el rack frío.
3) Las muestras deben agregarse a la filas 1,2,3,etc según el numero de muestras a
procesar. Pipetee cuidadosamente 5μL de la primera muestra en todos los pocillos
asignados para esa muestra es decir, fila 1, pocillos 1, 2 y 3, segunda muestra fila 2,
pocillos 4, 5 y 6, seguir de esa manera para cada una de las muestras. Mantenga los
otros pozos de muestra cubiertos durante la adición. Cambiar las puntillas después de
cada adición.
4) Tape de forma segura la fila a la cual se ha agregado la muestra para evitar la
contaminación cruzada y garantizar el seguimiento de la muestra.
5) Lavar guantes con etanol 70% entre muestra y muestra, y cambie los guantes con
frecuencia y cuando sea necesario para evitar la contaminación.
6) Repita los pasos 3, 4 y 5 para las muestras restantes.
7) Centrifugue durante 5 - 10 segundos.
8) realice protocolo de termociclacion.
Análisis de los datos
1) Después de completar la ejecución, guarde y analice los datos siguiendo las
instrucciones del fabricante del instrumento. El análisis debe realizarse por separado para
cada una de las muestras y controles utilizando una configuración de threshold manual.
Los threshold deben ajustarse para caer dentro de la fase exponencial de las curvas de
fluorescencia y por encima de cualquier señal de fondo (consulte la Figura). El
procedimiento elegido para establecer el threshold debe usarse de manera consistente.
Interpretación de resultados
• Los CN deben ser negativos y no mostrar curvas de crecimiento de fluorescencia que
crucen la línea de umbral.
o Si se produce un falso positivo con una o más de las reacciones CN del cebador y
la sonda, puede haberse producido una contaminación de la muestra. Invalide la
ejecución y repita el ensayo con un cumplimiento más estricto de las pautas del
procedimiento.
• La reacción CP debería producir un resultado positivo con un valor de Ct esperado para
cada objetivo incluido en la prueba.
o Si no se logra la reactividad positiva esperada, invalide la ejecución y repita el
ensayo con un cumplimiento más estricto de las pautas del procedimiento.
o Determinar la causa de la reactividad CP fallida, implementar acciones correctivas
y documentar los resultados de la investigación y las acciones correctivas.
o No utilice reactivos CP que no generen el resultado esperado.

• RP debe ser positivo en o antes de 35 ciclos para todas las muestras clínicas y CP, lo
que indica la presencia de suficiente ácido nucleico del gen RNasa P humano y que la
muestra es de calidad aceptable.
o La falla en la detección de RNasa P en CP puede indicar:
 Configuración y ejecución de ensayos inadecuados
 Mal funcionamiento de reactivo o equipo
o Detección de RNasa P en CP, pero la falla en la detección de RNasa P en
cualquiera de las muestras clínicas puede indicar:
 Extracción inadecuada de ácido nucleico de materiales clínicos que resulta en la
pérdida de ácido nucleico o la transferencia de inhibidores de PCR de muestras
clínicas
 Ausencia de suficiente material celular humano en la muestra para permitir la
detección.

o Si en alguna sonda/primer en específico de 2019-nCoV(N1 o N2) exhibe una curva

de crecimiento que cruza la línea de umbral, interprete lo siguiente:
 Puede haberse producido la contaminación de reactivos de extracción de ácido
nucleico. Invalide la ejecución y confirme la integridad de los reactivos de
extracción de ácido nucleico antes de realizar más pruebas.
 La contaminación cruzada de las muestras ocurrió durante los procedimientos de
extracción de ácido nucleico o la configuración del ensayo. Invalide la ejecución y
repita el ensayo con un cumplimiento más estricto de las pautas del procedimiento.
 Mal funcionamiento del equipo (ROTORGENE, sea el caso).
• Cuando todos los controles exhiben el rendimiento esperado, una muestra se
considera negativa o NO DETECTADO si todas las curvas de crecimiento del
threshold del ciclo de los marcadores 2019-nCoV (N1, N2) NO cruzan el umbral Y la
curva de crecimiento RNase RP cruza la línea del umbral.
2019-nCoV RT-PCR, interpetacion de resultados obtenidos.

2019 nCoV N1 2019 nCoV N2 RP INTERPRETACION

+ + +/- 2019 nCoV DETECTADO
SI SOLO UNO ES POSITIVO +/- NO CONCLUYENTE
- - + 2019 nCoV NO DETECTADO
- - - INVALIDO

• Cuando todos los controles exhiben el rendimiento esperado, una muestra se

considera positiva o DETECTADO para 2019-nCoV si todos los marcadores (N1, N2,
RP) curva de crecimiento del threshold del ciclo cruza la línea del threshold. La RNase
P puede o no ser positiva como se describió anteriormente, pero el resultado 2019-
nCoV sigue siendo válido.
• Cuando todos los controles exhiben el rendimiento esperado y las curvas de
crecimiento para los marcadores 2019-nCoV (N1, N2) y el marcador RNase P NO
cruzan la curva de crecimiento del threshold del ciclo, el resultado no es válido. El
ARN extraído de la muestra se debe volver a analizar. Si el ARN residual no está
disponible, vuelva a extraer el ARN de la muestra y vuelva a realizar la prueba. Si la
muestra analizada nuevamente es negativa para todos los marcadores y todos los
controles exhiben el rendimiento esperado, el resultado es "Inválido".
 • Cuando todos los controles exhiben el rendimiento esperado y se observa solo una
curva de crecimiento para un (N1 o N2) acompañada o no de curva RNase P, el
resultado no es concluyente para 2019-nCoV. Vuelva a extraer el ARN de la muestra
residual y vuelva a probar.

Limitaciones del ensayo

• Los analistas deben estar capacitados y familiarizados con los procedimientos de prueba
y la interpretación de los resultados antes de realizar el ensayo.
• Puede producirse un resultado falso negativo si hay un número inadecuado de
organismos presentes en la muestra debido a una recolección, transporte o manipulación
inadecuados.
• Los virus de ARN en particular muestran una variabilidad genética sustancial. Aunque se
hicieron esfuerzos para diseñar ensayos de RT-PCR en regiones conservadas de los
genomas virales, la variabilidad que resulta en coincidencias erróneas entre los cebadores
y las sondas y las secuencias diana puede dar como resultado una disminución del
rendimiento del ensayo y posibles resultados falsos negativos.