Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas
Práctica 10 Reacción de transaminación y su reconocimiento por
medio de cromatografía en papel
Grupo: 4QV2 Fecha: 03/04/2022
Alumno: Carpiette Bolaños Guadalupe Valeria
Asignatura: Bioquímica General
Profesores:
Almanza Hernández Octavio
Aguirre Alvarado Charmina
Peñaford Soleto Victor Hugo
Rivera Rosas Mónica
1
INTRODUCCIÓN
Las reacciones de transaminación ocupan un lugar central en el metabolismo de los
aminoácidos, son catalizadas por unas enzimas que reciben el nombre de transaminasas
y su función es remover el grupo amino de los aminoácidos, dando como uno de los
productos el esqueleto de carbonos, hidrógenos y oxígenos que forman la estructura
del aminoácido, el cual se puede transformar, dependiendo del aminoácido, en acetil-S
- CoA, piruvato o algún intermediario del Ciclo de Krebs. De esta forma esos átomos
pueden ser degradados hasta agua y bióxido de carbono, o bien ser convertidos en
carbohidratos o lípidos.
En una reacción de transaminación intervienen como sustratos un aminoácido y un
cetoácido, el primero se convierte en un cetoácido y el segundo en un aminoácido. Las
transaminasas son transferasas que pasan grupos amino de una molécula de aminoácido
a un cetoácido.
Transporte del amonio extrahepático al hígado
El amonio generado en la desaminación oxidativa es tóxico para las células, por lo que
es convertido a urea en el hígado. Ya que todos los tejidos extrahepáticos producen
amonio, es necesario un sistema de transporte adecuado. La mayoría utiliza a la enzima
glutamina sintetasa para convertir el amonio en glutamina, producto atóxico. La
glutamina se trasporta por la sangre al hígado, en donde la glutaminasa la hidroliza y
se libera el amonio. Por otro lado, dado que el músculo obtiene energía principalmente
de la glucólisis, utiliza una ruta diferente, el ciclo de la glucosa-alanina. El piruvato que
se genera en la glucólisis experimenta una transaminación con glutamato,
consecuentemente se forma alanina. El glutamato a 2 su vez ha obtenido su nitrógeno
del amonio gracias a la glutamato deshidrogenasa. La alanina se transporta del músculo
al hígado donde pierde su nitrógeno en forma de amonio mediante transaminación y
desaminación. La transaminación de alanina genera piruvato a partir del cual se
sintetiza glucosa por gluconeogénesis. La glucosa se libera a la sangre para dirigirse al
músculo o para nutrir al cerebro. Este proceso cíclico permite al músculo eliminar el
amonio y tener glucosa disponible.
OBJETIVO
o Cuantificar la actividad de transaminasa ALAT/TGP en extracto de
hígado por medio de cromatografía.
o Elaborar una curva tipo en base a la cromatografía para su posterior
lectura en espectroscopio.
2
BIBLIOGRAFIA
Guerra, JJM (sf). Reacciones de transaminación | LIBRO ELECTRÓNICO DE
BIOQUÍMICA | Juan José Martínez Guerra . UAA. Recuperado el 3 de mayo de
2022, de [Link]
[Link]
Nava, C. (sf). METABOLISMO DE LOS COMPUESTOS NITROGENADOS .
[Link]. Recuperado el 3 de mayo de 2022, de
[Link]
DIAGRAMA DE FLUJO
1.- REACCIÓN DE TRANSAMINACIÓN
TUBO P TUBO T
Preparación cruda de Preparación cruda de
Transaminasa Transaminasa
1mL 1mL
Regulador de fosfatos Regulador de fosfatos
0.006M 0.006M
pH 7.4 1mL pH 7.4 1mL
Alanina 100 μmoles/ml Alanina 100 μmoles/ml
0.5mL 0.5mL
Preincubación a 37oC Preincubación a 37oC
durante 5 min. durante 5 min.
Agua destilada 0mL Agua destilada 0.5mL
Ácido alfa-cetoglutárico Ácido alfa-cetoglutárico
100μmoles/mL 100μmoles/mL
0.5mL 0mL
Incubar a 37oC durante 1 Incubar a 37oC durante 1
hora hora
Alcohol 96o Alcohol 96o
4mL 4mL
Centrifugar 10 minutos a 2 Centrifugar 10 minutos a 2
500 rpm 500 rpm
3
2.- PREPARACIÓN DEL CROMATOGRAMA
Colocar respectivamente, en los
En los primeros cinco puntos
Cortar una tira de papel Whatman cuatro puntos restantes, 60 L de
Marcar con lápiz en la última línea colocar 5, 10, 15, 20 y 25 uL
No. 1 de 23 x 57 cm y trazar con Con un secador de aire caliente los tubos P y T de la reacción de
(8.0 cm) nueve puntos respectivamente, de una solución
lápiz, a lo ancho del papel, tres después de cada aplicación. transaminación, 20 uL de agua y 5
equidistantes. de ácido glutámico de 20
líneas paralelas a 2.5, 6.0 y 8.0 cm uL de la solución tipo de alanina,
umoles/mL,
secando con un secador.
Saturar el cromatograma durante
Sacar el cromatograma de la Desarrollar el cromatograma 2hrs en una cámara de
secar en la estufa para
cámara, marcar el frente de durante 18 horas aprox con el cromatografía saturada con el
cromatografía a 70oC
corrimiento. disolvente, 3/4 partes recorridas. disolvente etanol:metanol:agua-
urea
Recortar las manchas Recortar una porción de
Revelar el cromatograma Fragmentar cada una de las
Colocar el cromatograma correspondientes a la curva papel a la misma distancia
por aspersión con una porciones de papel y
en la estufa para tipo de ácido glutámico y recorrida por el ácido
solución de ninhidrina al colocarlas en tubos de
cromatografía a 80oC manchas del ácido glutámico en el carril
0.05% en etanol. ensayo,
glutámico formado donde se aplicó el agua
3.-REVELADO Y Calcular la concentración
de ácido glutámico
Leer en el Colocar los tubos de
añadir 1 ml de solución de
espectrofotómetro a ensayo en baño maría a
ELUCIÓN DE LAS obtenido por acción de la
transaminasa.
540nm. 80oC durante 2 minutos.
ninhidrina al 1% en butanol
MUESTRAS