ELISA
La técnica ELISA (acrónimo del inglés
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:
‘ensayo por inmunoabsorción ligado a
enzimas’) es una técnica de inmunoensayo en
la cual un antígeno inmovilizado se detecta
mediante un anticuerpo enlazado a una enzima
capaz de generar un producto detectable, como
cambio de color o algún otro tipo; en
ocasiones, con el fin de reducir los costos del
ensayo, nos encontramos con que existe un
anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario
que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir
indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de
sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de
variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo, que si no se
ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.
La técnica ELISA fue propuesta como una alternativa al radioinmunoensayo, ya que este último suponía un
riesgo para la salud debido a los isotopos radiactivos utilizados.
Esta técnica se diferencia de otras basadas en la reacción Ag-Ac en que la unión a una superficie sólida
permite la identificación de reacciones específicas y, por lo tanto, la obtención de resultados cuantitativos.
Índice
Usos
Dispositivos empleados en ELISA
Fases de un ensayo ELISA
Tipos de ensayos ELISA
Utilidades diagnósticas
Quimioluminiscencia
Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados
Prueba ELISPOT
Referencias
Usos
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene
una infección o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones
que conviene conocer:
En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa
necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado
enferma y que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría
un falso positivo.
En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que
estos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo.
Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se
encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o
que estén infectadas por una cepa extraña.
En tercer lugar, pueden aparecer falsos negativos cuando se da inespecificidad entre
antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de enfermedad, es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de
células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y puedan ocasionar un resultado falso positivo,
careciendo aquel de especificidad. También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar
una enfermedad que posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población —es decir, que
esa enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población—, es necesario volver a confirmar el
resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva a cabo un
western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma
infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen al menos 5
bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en el sujeto frente a esa infección. Es
entonces cuando se diagnostica como positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto y simple en
su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción
libre.
Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes,
cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA
(radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la
cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de
anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.
Dispositivos empleados en ELISA
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal
de los orígenes hasta las actuales microplacas de 96 pocillos de
plástico tratado, para aumentar su capacidad de adsorción (en su
superficie) de moléculas, y con fondos de pocillo ópticamente
claros que permitan realizar las medidas de densidad óptica en
instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas
que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se
están desarrollando dispositivos de mayor capacidad —por
ejemplo, con 384 y 1536 pocillos—, adecuados para los sistemas de screening masivo de los sistemas
robotizados (HTS, High-throughput system).
Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar
lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A
diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de
leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de
manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de
filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de
onda; son la que se corresponden con las necesarias para
determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente
utilizados. La técnica ELISA.
Fases de un ensayo ELISA
1. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos.
La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con
facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen
gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de
recubrimiento de los pocillos debe realizarse
cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden
obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco
antígeno, esto dará lugar a una reacción falsa negativa.
2. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una
enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo
conjugado a la enzima se emplea en los ensayos
directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno
marcado se emplea en ensayos de competición de
Fases de un ensayo ELISA, en
antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-
italiano: *ELISA: ensayo
enzima ha de producirse durante un determinado
inmunoenzimático principios de
período de tiempo en aras de producir una solución
coloreada y que pueda ser valorada visualmente o base. *Pocillo *Anticuerpo primario
cuantificada por medio de un espectrofotómetro específico para el antígeno que hay
(normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no que individualizar. Está ligado al
transcurre el tiempo adecuado para que se dé la fondo del pocillo. *Agregado de la
reacción, no se evidenciará ningún color, solución en la cual se busca la
interpretándose este resultado como un falso negativo y presencia del antígeno. *Unión del
disminuyendo la sensibilidad de la técnica. antígeno con el anticuerpo primario.
3. Revelado de la reacción enzimática. Después de un *Lavado *Agregado del anticuerpo
lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no secundario específico conjugado con
fijadas en forma de inmunocomplejos, se añade el una enzima. *El anticuerpo
sustrato enzimático, se incuba durante un tiempo secundario conjugado con la enzima
estandarizado por cada casa comercial, en el cual se se liga al antígeno. *Lavado
producirá una reacción enzimática, luego se frena esta *Agregado del sustrato de la enzima.
reacción mediante el uso de una solución stop y se lee *La enzima convierte el sustrato en
la densidad óptica mediante espectrofotometría. un compuesto coloreado (amarillo,
en este ejemplo). *Prueba positiva.
4. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la
placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o
empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti-primario marcado
(ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir
uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa, se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan
diferentes relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el
ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores
tiempo y temperatura de incubación para evitar la aparición de falsos negativos. En el caso
del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el
color no será evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la
temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo antígeno-anticuerpo
tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las proteínas
(antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y, por tanto, disminuyen su capacidad para
interaccionar, dando igualmente falsos negativos.
Tipos de ensayos ELISA
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos
ELISA que permiten la cuantificación de un antígeno
en solución, la detección de un anticuerpo en una
solución (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos
monoclonales) o la determinación de la subclase
(idiotipo) de un anticuerpo. A continuación se
describen los más comunes.1
ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos
capas). Las placas ELISA se preparan
recubriendo los pocillos con las soluciones
en las que se sospecha se encuentra el
antígeno. Se incuban con anticuerpos
marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir
controles negativos que serán muestras del mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...),
pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se
incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado).2
ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los
controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario.
La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular,
como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso es
un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por tener un
eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución que contiene el
anticuerpo primario —por ejemplo, suero sanguíneo— es un factor muy importante a tener
en cuenta para evitar la aparición de falsos negativos, ya que si la muestra está muy diluida,
no saldrá positiva si la titulación de anticuerpos es muy baja. (Es decir, aunque los
anticuerpos están presentes, la prueba no da positivo porque la concentración de
anticuerpos específicos contra el antígeno que está pegado en el fondo del pocillo no es
suficiente como para dar una señal detectable.).
El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos
séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas
recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase
sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra
epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar
anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infección.3
ELISA inhibidor o competitivo: Este tipo de ELISA es el más complejo. Se utiliza para
detectar o cuantificar antígenos presentes en bajas cantidades. Se denomina así ya que se
utiliza un antígeno de referencia que competirá con el antígeno de la muestra por la unión al
anticuerpo. El procedimiento simplificado sería el siguiente: 1. El antígeno de referencia
se inmoviliza sobre la placa. 2. Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin
marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno de interés, dando lugar a la
formación de complejos antígeno-anticuerpo 3. Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo
a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno de la muestra por
unirse al anticuerpo 4. Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo
solubles 5. Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que
se unirá al anticuerpo primario anclado al antígeno de referencia. 6. Se añade el sustrato
que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible.
ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con
un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo, se aplica la
muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material
no retenido, se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así,
pues, cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y
un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y
sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.
ELISPot. ELISpot es un método altamente sensible en la inmunología para enumerar las
células que producen una citoquina dada. Las células se estimularon en una placa de
microtitulación per-recubierta con un anticuerpo específico anti-analito. En respuesta a la
estimulación, las células liberan citocinas que se unen al anticuerpo anti-analito. Después
de una etapa de lavado, que elimina las células de los pozos, la ubicación de citoquinas
secretadas se visualiza mediante un anticuerpo de detección marcado con enzima y su
sustrato cromogénico correspondiente. El resultado final es un conjunto de manchas de
color, cada uno de los cuales representa un área donde se había localizado una célula que
secreta la citoquina. Existe un método de ELISpot estándar y una variación denominada de
células dendríticas DC-ELISpot para la detección de las células tras la estimulación con
oligopéptidos y antígenos de proteína, respectivamente.
Utilidades diagnósticas
Cáncer: identificación de biomarcadores para su diagnóstico en
etapas tempranas
Hepatitis B:
Detección del antígeno de superficie del VHB (agHBS
Detección de anticuerpos contra el antígeno del core del
VHB (agHBS). Estos pueden ser IgG, que persisten
durante toda la vida, o IgM, que solo duran 6 meses, por
lo que indican hepatitis B aguda.
Detección de anticuerpos antiplaquetarios para el diagnóstico de enfermedades como la púrpura
trombocitopénica inmune (PTI) o el lupus sistémico eritematoso.4
Detección de VIH mediante la determinación simultánea de anticuerpos anti- VIH y antígeno p24.5
Quimioluminiscencia
Durante determinadas reacciones químicas, la luz generada por este
fenómeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible
para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA
que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que
genera luz, en lugar del sustrato cromógeno de las reacciones
ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidación del
compuesto luminol por peróxido de hidrógeno y la enzima
peroxidasa de rábano (HRP), que producen luz. La luz que se
genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su
capacidad de sensibilizar una película fotográfica. La medición
cuantitativa de la emisión de luz puede hacerse mediante el uso de
un luminómetro.
La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las
cromógenas es la mejoría de la sensibilidad. En general, el límite de
detección puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un
sustrato cromógeno por uno que emita luz, y más de doscientas Ensayo ELISA para el VIH.
veces cuando se adicionan agentes potenciadores.
Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados
En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimáticos más comúnmente empleados en ensayos
ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos.
Enzima sustrato tampón
HRP (peroxidasa de rábano) OPD 10 mg/25 mL de tampón citrato sódico 0,15 M pH 5;
añadir microL de 30 % peróxido de hidrógeno 30 %.
TMB 2,5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampón citrato sódico 0,1 M pH 6;
añadir 5 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
ABTS 60 mg/100 mL de tampón citrato sódico 0,1 M pH 6; añadir 35 microL de peróxido de
hidrógeno 30 %; parar con fluoruro sódico 1,25 %; leer a 405 nm.
DAB 10 mg/20 mL de tampón Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y añadir 20 microL de peróxido de
hidrógeno 1 %.
CNP 6 mg en 1 mL de metanol; añadir 10 mL de tampón Tris 50 mM pH 7,4; filtrar y añadir
40 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampón acetato 0,1 M
pH 4,5; filtrar y añadir 50 microL de peróxido de hidrógeno 30 %.
ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6,0 con 1 mM NaOH y añadir
10 % por volumen de 0,05 % peróxido de hidrógeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M.
AP (fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampón dietanolamina-HCl 0,1 M pH 9,8 +
1 mM cloruro de magnesio.
NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de
vidrio (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/10 ml de tampón Tris 0,05 M pH 9,2 - 2 mM cloruro de
magnesio. Mezclar A + B y filtrar.
NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio
(B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampón Tris 0,05M pH 9,2 - 2 mM cloruro de magnesio.
Mezclar A + B y filtrar.
BCIP 1 mg/mL en solución AMP (2-amino-2-metil-propanol).
beta-G ONPG 2,5 mg/ml en tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,0 + 1 mM cloruro de
magnesio + 0,1 M beta-mercaptoetanol.
ureasa BP 8 mg/1,48 ml de 0,01 M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; añadir
100 mg de urea y EDTA a 0,2 mM; ajustar el pH a 4,8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a
4 °C.
PG IS Añadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en
secuencia: (A) 1 % (peso/vol) gelatina en 0,1 M tampón fosfato pH 7,0; (B) 1 % (peso/vol)
almidón en agua destilada caliente; (C) 3,04 mg/mL de benzil-penicilina en 0,1 M tampón
fosfato pH 7,0 (5000 U/mL); (D) 0,01 N ioduro en 0,1 M KI solución stock (en una botella
oscura).
Prueba ELISPOT
Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el número de
células en una población productora de anticuerpos específicos contra un antígeno determinado o un
antígeno contra el que se dispone de un anticuerpo específico. Aquí, dichas placas se recubren con el
antígeno reconocido por el anticuerpo de interés o con el anticuerpo específico para el antígeno cuya
producción se valora. Seguidamente, se añade a las placas recubiertas una suspensión de la población
celular que se investiga e incuba. Las células se disponen en la superficie de la placa, y las moléculas
secretadas reactivas a las moléculas de captura son unidas en la cercanía de las células secretoras,
produciéndose un anillo de complejos antígeno-anticuerpo alrededor de cada célula que sintetiza la
molécula de interés. Después, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima específico para el antígeno
secretado, o para la especie de anticuerpo secretado, se añade y deja que se unan. El posterior revelado del
ensayo mediante adición de un sustrato cromógeno o emisor de luz adecuado indica la posición de cada
célula productora de anticuerpo (o de antígeno) como un punto de color o luz.6
Referencias
1. ELISA ([Link] Springer. ISBN 978-1-4939-
2741-8. Consultado el 30 de marzo de 2016.
2. Lin, AV (de de 2015). «Direct ELISA.». Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1318: 61-
7. PMID 26160564 ([Link]
3. Lin, AV (de de 2015). «Indirect ELISA.». Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1318:
51-9. PMID 26160563 ([Link]
4. Paz Cruz, Osiris Y.; Bencomo Hernández, Antonio A.; Barranco Peregrino, Belkis;
Fernández Franch, Neyda (2011-08). «Detección de autoanticuerpos antiplaquetarios por
ELISA en pacientes con púrpura trombocitopénica autoinmune» ([Link]
hp?script=sci_abstract&pid=S1025-02552011000400003&lng=es&nrm=iso&tlng=es).
Revista Archivo Médico de Camagüey 15 (4): 653-664. ISSN 1025-0255 ([Link]
sn/1025-0255). Consultado el 7 de enero de 2020.
5. «ELISA Applications» ([Link]
x). [Link] (en inglés). 6 de diciembre de 2018. Consultado el 7 de enero de
2020.
6. Navarrete, MA (de de 2015). «ELISpot and DC-ELISpot Assay to Measure Frequency of
Antigen-Specific IFNγ-Secreting Cells.». Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 1318:
79-86. PMID 26160566 ([Link]
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