Marcadores RFLP, RAPD y AFLP
Marcadores moleculares RFLP
Los marcadores RFLPs (Fragmentos de restricción de longitud polimórfica), fueron los primeros
marcadores de ADN descritos, se originan de la variación en la secuencia de AND, misma que
es reconocida por enzimas de restricción.
Inicialmente es necesario extraer el ADN, cabe mencionar que es recomendable cuantificar la
cantidad de ADN extraído, ya que de esta forma se puede emplear la misma cantidad en todas
las reacciones a llevar a cabo. Posteriormente, existe una digestión con enzimas de restricción,
misma que debe ser de larga duración, para ello se suelen emplear enzimas que reconocen 3 –
4 bases.
El tercer paso es la electroforesis, esta debe ser de larga duración, con un bajo voltaje lo que
ayuda en obtener una mejor resolución y menor degradación por calor, así mismo se emplea
una agarosa que permita una separación de entre 500pb y 20kb. Para completar el traslado de
ADN a una membrana, se realiza una despurinización con HCl, luego el ADN se desnaturaliza
con NaOH y finalmente se transfiere por capilaridad o por vacio a una membrana de micro
celulosa o nylon.
Finalmente de da la hibridación, esta consiste en poner en contacto la membrana donde se
encuentran las muestras con una sonda marcada, cuyo origen puede ser diverso. Con la
hibridación concluida, se lleva a cabo la detección por marcaje con radioactividad o con
digoxigeninas, obteniéndose como resultado un conjunto de fragmentos que corresponden
con aquellos que cortaron con las enzimas de restricción.
El polimorfismo puede causarse debido a:
Aparición de un nuevo sitio de restricción, generando un fragmento de menor tamaño.
Aparición de un nuevo sitio de restricción en la región complementaria a la sonda,
generando dos fragmentos de menor tamaño.
Desaparición de un sitio de restricción, generando un fragmento de mayor tamaño.
Desaparición de un sitio de restricción, caso especial, donde RFLP dominante.
Delección, genera un fragmento de menor tamaño.
Inserción, genera un fragmento de mayor tamaño.
Ventajas y desventajas de estos marcadores
Ventajas
Codominancia
Metodología sólida
No se requiere información acerca de la secuencia.
Polimorfismo: Combinaciones enzima/sonda
Desventajas
Requieren de distribución de sonda a los laboratorios colaboradores.
Requieren grandes cantidades de ADN.
No permiten automatización.
Exigencias técnicas moderadas
Costosos
Pocos loci detectados por ensayo
Marcadores moleculares RAPD
Los marcadores moleculares RAPDs (Fragmentos de ADN polimórfico amplificados al azar), son
un sistema de detección de polimorfismo en la secuencia de ADN, basado en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Amplifica secuencias no específicas de la cadena de ADN
mediante PCR.
Para amplificar por PCR un fragmento de ADN, se emplean dos cebadores conllevando a que
se conozca la secuencia a amplificar. Para facilitar este proceso los marcadores RAPDs
emplean único cebador, de secuencia aleatoria. Para identificar polimorfismo entre distintos
individuos, se amplifican fragmentos genómicos de las muestras, estos se separan según su
tamaño mediante electroforesis en gel, logrando así, que en cada PCR se amplifique un
conjunto de fragmentos arbitrariamente distribuidos en el genoma del individuo analizado.
El polimorfismo se lo visualiza como presencia o ausencia de bandas, interpretándolo como un
marcador dominante. Los marcadores RAPDs han sido utilizados por:
Simplicidad técnica.
No requiere conocimiento de secuencia.
Económicos
Sin embargo, entre sus desventajas encontramos:
Limitación por dominancia
Poca reproducibilidad
Limitación de interpretación
Los polimorfismos RAPD son heredados de forma mendeliana y son empleados para elaborar
mapas genéticos y para detectar variabilidad. Por lo que han sido empleados en estudios de
diversidad: animal, vegetal y de poblaciones de patógenos.
Marcadores moleculares AFLP
Los AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados), son un grupo de
marcadores multi-locus, lo que permite analizar al azar regiones de ADN dispersadas en todo el
genoma sin tener conocimiento previo de este.
Inicialmente el ADN se corta en 2 enzimas de restricción (una de corte muy frecuente y otra de
corte poco frecuente) con la finalidad de obtener fragmentos de un tamaño apropiado, para
realizar las amplificaciones. Los fragmentos de unen a moléculas adaptadoras
(oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas usadas) y se amplifican por PCR.
Tras la ligación de estas moléculas adaptadores, se dispone una secuencia conocida que
permitirá amplificar los fragmentos generados a lo largo del proceso. Cabe mencionar que se
producen 2 amplificaciones (pre-amplificación y amplificación selectiva), en la primera
amplificación es preselectiva, mientras que la segunda es selectiva. En la amplificación
selectiva se adhieren 2 nucleótidos extra a los que ya había sido unido al cebador.
La visualización de los resultados se puede realizar por medio de geles de poliacrilamida o por
analizadores de fragmentos. Por otra parte, las fuentes de polimorfismo son:
Cambios en las enzimas de restricción: mutaciones, inserciones o delecciones.
Cambios en la secuencia del cebador (únicamente en la región 3`)
Pequeñas inserciones o delecciones dentro de las secciones que se amplifican.
Ventajas
Alta reproducibilidad
Gran cantidad de información por reacción
No requiere conocimiento de secuencia o generación de sondas
Desventajas
Alta complejidad técnica
Dominante
Problemas de co-migración