“Año del Bicentenario del Perú: 200 años de Independencia”
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
E. A. P. AGROINDUSTRIAL
TEMA:
PRACTICA – Bioprocesamiento de la vitamina 12
ASIGNATURA:
BIOINDUSTRIAS
DOCENTE:
Mg. Any Berenice Córdova Chang
INTEGRANTES:
López Margarito Jesús
Saavedra Zegarra Dannika
Sullón Azaña Rocío
CICLO:
X
NUEVO CHIMBOTE
2022
I. INTRODUCCIÓN
II. ANTECEDENTES
En 1925, Wipple y Robbins, al estudiar el efecto terapéutico que poseía el
hígado de res sobre la anemia perniciosa, sospecharon la existencia de un factor
específico responsable de la reversión de los síntomas causados por esta
enfermedad. A pesar de los esfuerzos hechos para aislar este factor, recién en
1948 Rickes y colaboradores, y Smith independientemente, lograron aislar ese
factor como cristales puros.
Posteriormente, Castle sugirió que para que se efectuara la absorción de esta
vitamina por el organismo humano también era necesaria la presencia de un
factor presente en el jugo gástrico: una mucoproteína de bajo peso molecular,
conocida más tarde como factor intrínseco de Castle. En humanos carentes de
este factor, la absorción puede ser provocada por medio de la administración de
dosis superiores a las presentes en humanos normales (15 mg/día).
Dohkin y colaboradores, en 1955 revelaron la estructura de la vitamina B12, por
medio de cristalografía de Rayos X. Su síntesis química tomó 10 años desde los
primeros trabajos de Woodward y Eschenmoser, hasta su culminación con los
trabajos de Krieger (1973) y Maugh (1973), con un proceso de 70 pasos.
Los primeros procesos fermentativos para su obtención fueron con Bacillus
megatherium y con Streptomyces olivaceus. También se hizo un proceso no
fermentativo de extracción de aguas negras. Las concentraciones finales de
vitamina obtenidas en estos procesos variaban entre 4 y 20 mg/L de peso seco de
producto fermentado.
Posteriormente se descubrió que Pseudomonas denitrificans y ciertas especies
del género Propionibacterium, tenían una mayor capacidad de producción de
vitamina B12, incrementándose los rendimientos aún más después de utilizar
métodos de mutación y selección de cepas de estos microrganismos, lográndose
concentraciones de cianocobalamina de 150 mg/L de medio de cultivo, o más.
III. MARCO TEORICO
III.1. VITAMINAS
Las vitaminas son compuestos orgánicos imprescindibles para la vida, que al
ingerirlos en forma equilibrada y en dosis esenciales promueven el correcto
funcionamiento fisiológico. Son requeridas por el cuerpo en pequeñas
cantidades para el crecimiento y mantenimiento; no son sintetizadas en el ser
humano y en el organismo animal o se forman sólo cantidades insuficientes.
Por esta razón, deben ser consumidas regularmente en la dieta, ya sea como tal
o como un precursor (provitamina) que se puede convertir en la vitamina en el
cuerpo.
Para los seres humanos, las fuentes más importantes son los alimentos
vegetales y animales. Las funciones metabólicas de estas son principalmente
catalíticas o reguladoras. Un inadecuado suministro de una vitamina conduce
a síntomas de deficiencia patológicos típicos que puede remediarse por la
ingesta de la vitamina deficiente. Las vitaminas se dividen en dos grupos, a
saber, solubles en grasa (A, D, E, y K) y solubles en agua (C y el complejo B).
Las vitaminas liposolubles se almacenan en el hígado y pueden ser
conservadas durante largos períodos de tiempo. Las solubles en agua son
solamente retenidas por períodos cortos de tiempo, por lo que se pueden
agotar rápidamente.
Está demostrado que las vitaminas del grupo B son imprescindibles para el
correcto funcionamiento del cerebro y el metabolismo corporal. Debido a que
son hidrosolubles, son eliminadas principalmente por la orina, lo cual hace
que sea necesaria la ingesta diaria y constante de todas las vitaminas del
complejo “B” (B12: carnes en general, huevos, productos lácteos, sardinas,
atún, y almejas).
III.2. VITAMINA B12
El término vitamina B12 se utiliza para describir compuestos de la familia de
los corrinoides de cobalto, en particular los del grupo de las cobalaminas. Es
un grupo de moléculas grandes y complejas. Es una vitamina hidrosoluble
esencial para el funcionamiento normal del cerebro, del sistema nervioso, y
para la formación de la sangre y de varias proteínas. Normalmente está
implicada en el metabolismo de las células del cuerpo humano, especialmente
en la síntesis y regulación del ADN; también en la metabolización de los
aminoácidos, de los ácidos grasos y de los glúcidos.
En el grupo de las cobalaminas se incluyen la adenosilcobalamina,
metilcobalamina, hidroxicobalamina y cianocobalamina. Las dos primeras son
inestables a la luz y se transforman fácilmente en hidroxicobalamina en
solución acuosa. Por esta razón, casi todos los preparados de comerciales
consisten en la cianocobalamina estable que, como tal, no es la forma química
en la que la vitamina B12 se puede encontrar en la naturaleza. Al ingerirla, los
animales y las personas convierten la cianocobalamina en una de las formas
naturales de la vitamina B12, como la metilcobalamina o la 5'-desoxi-
adenosil-cobalamina, requeridas para que actúen como coenzima para diversas
conversiones bioquímicas. Ni los hongos, ni las plantas, ni los animales
pueden producir esta vitamina. Sólo las bacterias y las arqueobacterias tienen
las enzimas necesarias para su síntesis, no obstante muchos alimentos son
fuente natural de B12 debido a la simbiosis bacteriana. Estructuralmente
hablando, esta es la vitamina más compleja y puede ser producida
industrialmente únicamente por fermentación.
III.3. CARACTERÍSTICAS DE LOS MICROORGANISMOS
La producción de vitamina B12 incluye una gran variedad de bacterias, pero
entre las seleccionadas para uso a nivel industrial por su rendimiento se
encuentran Propionibacterium freudenreichii spp. shermanii,
Propionibacterium freudenreichii spp. freudenrenchii y Pseudomonas
denitrificans.
Pseudomonas denitrificans: es un grupo importante de bacilos Gram
negativos quimiorganotróficos aeróbicos, rectos o curvados y presentan un
tamaño de 0,5 a 1 micrómetro por 1,5 a 4 micrómetro, sin esporas.
Presentan un metabolismo respiratorio y son capaces de producir
aeróbicamente pequeñas cantidades de ácido procedentes de glucosa o de
compuestos orgánicos de bajo peso molecular. Algunos son
quimiolitotróficos y utilizan H2 o CO como únicos donadores de
electrones. Por otro lado, requieren condiciones mínimas de humedad y un
pH neutro, entre 7 y 7,8.
Figura 1. Vista al microscopio de la bacteria Pseudomonas dentrificans.
Propionibacterium freudenreichii spp. shermanii: es una bacteria Gram
positiva, no móvil, anaeróbica con forma de vara, mesófila y no esporulada.
Los miembros del género Propionibacterium son ampliamente utilizados en
la producción de vitamina B12, de compuestos de tetrapirrol, y de ácido
propiónico, así como en los probióticos y las industrias de queso a partir de
hidratos de carbono, ácido láctico y polihidroxialcoholes. Dado que esta
especie no produce exotoxinas o endotoxinas, son consideradas como
seguras para uso humano según la Administración de Alimentos y
Medicamentos de Estados Unidos, por lo que son las preferidas para la
producción de dicha vitamina.
Figura 2. Vista al microscopio de la bacteria Propionibacterium
freudenreichii spp. shermanii.
Propionibacterium freudenreichii spp. freudenreichii: pertenece al
grupo de las bacterias propiónicas y, como todas ellas, es Gram positiva,
de crecimiento lento, inmóvil, con forma de bacilo y no formadora de
esporas. En cuanto a su metabolismo, suelen ser anaerobias estrictas o,
como mucho aerotolerantes. Llevan a cabo procesos fermentativos
produciendo ácido propiónico, dióxido de carbono y ácido acético.
Figura 3. Vista al microscopio de la bacteria Propionibacterium
freudenreichii spp. freudenreichii.
III.4. MERCADO MUNDIAL DE LA VITAMINA B12
Latinoamérica es uno de los mercados de productos relacionados con la salud
más dinámicos del mundo, impulsado por una diversidad de tendencias
económicas, de consumo y regulatorias, así como por una cada vez mayor
atención por parte de un gran número de gigantes globales de la industria. Las
vitaminas y suplementos alimenticios o VDS juegan un especial y creciente
papel en la vida de los consumidores latinoamericanos. El reciente impulso
económico y el aumento de los ingresos disponibles han incrementado
significativamente la accesibilidad de estos productos para muchos de los
millones de residentes latinoamericanos. La creciente adopción de tendencias
hacia la salud y el bienestar por parte de los consumidores y el mayor énfasis
en el cuidado preventivo de las recientes políticas de salud pública también
han contribuido a un mayor consumo de VDS. Como resultado, el valor de
ventas retail de las VDS creció a una tasa de crecimiento anual compuesto
(TCAC o CAGR del inglés Compound Annual Growth Rate) de 4,9% durante
el 2008 al 2013, el segundo crecimiento más rápido en todas las regiones a
nivel global, solamente superado por Australasia.
Gráfico 1. Latinoámerica: valor de ventas retail por tipo de VDS 2008-
2013.
IV. DESCRIPCION DEL PROCESO
En la actualidad las vitaminas, en general, se producen por cuatro métodos
diferenciados: aislamiento a partir de fuentes naturales, síntesis química, síntesis
bioquímica y síntesis microbiana. En el caso concreto de la producción de
cobalamina:
El aislamiento no es viable económicamente, por no conocerse fuentes
naturales en las cuales se encuentre en cantidades lo suficientemente
elevadas como para que se rentabilice su extracción, que resulta cara y
compleja.
La síntesis química resulta muy tediosa, comprendiendo hasta 70 etapas de
reacción, debido a la elevada complejidad estructural de la molécula, por lo
que se considera inviable tecnológicamente.
La síntesis bioquímica implementa procesos de reacción enzimática,
simplificando la síntesis química y reduciendo el número de etapas de
reacción. No obstante, la simplificación resulta insuficiente, pues en la
actualidad sigue sin ser viable desde el punto de vista tecnológico, aunque se
postula como una posible opción de futuro.
La síntesis microbiana es actualmente la única opción viable de producción
industrial. Este proceso consiste en obtener el producto de interés a través
del metabolismo de un microorganismo. Los más ampliamente estudiados
son: Acetobacterium sp., Propionibacterium freudenreichii y Pseudomonas
denitrificans.
El procedimiento consiste en realizar la fermentación en un medio de cultivo
adecuado, separar la biomasa producida y extraer la vitamina B12 generada. En
la actualidad los científicos orientan sus investigaciones hacia las técnicas de
manipulación genética para producir esta vitamina por métodos más
económicos. Su obtención microbiológica se expone a continuación teniendo en
cuenta tres aspectos importantes. En primer lugar, se identifican los
microorganismos productores de la misma y la cepa a utilizar. Luego se plantea
el proceso de biosíntesis y el proceso de producción industrial propiamente
dicho, que incluye la fase de fermentación y las etapas de purificación y
extracción.
IV.1. MICROORGANISMOS
La vitamina B12 es el cofactor más complejo en la naturaleza y es sintetizado
exclusivamente por ciertas procariotas. La biosíntesis de esta vitamina implica
aproximadamente 30 reacciones enzimáticas de las cuales varias son altamente
sensibles al oxígeno. La producción a escala industrial se ha realizado
utilizando Pseudomona denitrificans (vía aeróbica) y Propionibacterium
freudenreichii (vía anaeróbica) con rendimientos máximos informados de
aproximadamente 200 mg/L (Vandame & Revuelta, 2016). Ambas especies
son atractivas para la producción biotecnológica debido a su rápido
crecimiento con una simple demanda de nutrientes, su accesibilidad genética,
sus altos rendimientos y sus altas productividades volumétricas.
A continuación, se analizan las especies que, como ya se mencionó, han sido
estudiadas más ampliamente en la producción de vitamina B12:
• Los procesos que emplean Pseudomonas denitrificans presentan el
inconveniente de ser aerobios, lo que dificulta en gran medida la
operación, siendo el oxígeno el elemento fundamental a controlar en
el sistema reaccionante.
• Los procesos que emplean Acetobacterium sp. presentan la ventaja
de resultar sencillos y versátiles, adaptándose a una gran diversidad
de sustratos, pero tienen una productividad notablemente más baja
que el resto de los procesos (4 mg/L).
• En caso de usarse Propionibacterium [Link] o
ssp. freudenreichii, se deberán implementar estrategias de control
para mantener la concentración de ácido propiónico, subproducto
metabólico, en condiciones de correcta operación. Además, en
algunos de los procesos que emplean este tipo de cepas se obtienen
producciones elevadas, que pueden llegar a los 200 mg/L por ciclo de
operación (Vandame et al., 2016) empleando medios de cultivo
relativamente sencillos y sin necesidad de incluir operaciones previas
de ingeniería genética que, a priori, podrían complicar y encarecen en
gran medida la preparación de las cepas.
IV.2. PROCESO DE PRODUCCIÓN
El proceso de producción se compone de 3 etapas bien diferenciadas, a saber:
1. Propagación de cultivo: comienza en el laboratorio con la cepa
liofilizada. Este material microbiológico seleccionado constituye el punto
de partida con el cual se debe aumentar la cantidad de este mediante
sucesivos pasajes en erlenmeyers de volúmenes crecientes que son
generalmente operados en agitadores de vaivén o rotatorios en cámaras de
cultivo.
2. Fermentación: con el material obtenido anteriormente, se siembra el
tanque de inoculación y se pasa posteriormente al prefermentador y
fermentador industrial. Un proceso esencial ligado a la producción es la
preparación y esterilización de los medios que se lleva a cabo también en
esta etapa (previamente a la inoculación) mediante un intercambiador de
calor.
3. Operaciones y proceso de separación y purificación de los productos:
estas etapas comprenden en forma general y sucesivamente:
a) separación de la biomasa por centrifugación;
b) lisis celular por tratamiento térmico o mecánico con molino de bolas;
c) conversión a cianocobalamina por adición de cianuro de hidrógeno o
de potasio (esta etapa no es estrictamente necesaria)
d) separación por extracción o adsorción;
e) purificación por cristalización y finalmente
f) aislamiento del producto.
IV.2.1. PROPAGACIÓN DEL CULTIVO
La cepa del propio microorganismo se adquiere en la forma liofilizada
de algunas de las colecciones de cultivos mencionadas con
anterioridad y no debería ser adquirida más que al comienzo de la
operación de la planta, en caso de conservarse en condiciones en las
que su reproducción pudiese llevarse a cabo correctamente cuando
correspondiese. Al tener la cepa liofilizada, es necesario realizar
algunas operaciones previas para disponer del microorganismo en
forma activa para la fermentación. Las más relevantes se mencionan a
continuación:
ACTIVACIÓN DE LA CEPA: El microorganismo se
reconstituye y se siembra utilizando el medio de cultivo, las
condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las
instrucciones del organismo proveedor de la cepa. Luego de
activar la cepa se debe ir incrementando el volumen del recipiente
de cultivo, para conseguir la velocidad de crecimiento adecuada.
Es vital esta operación para que a escala industrial se alcancen los
resultados óptimos.
PREPARACIÓN DEL INÓCULO: El inóculo se prepara con la
composición idéntica al medio de fermentación, pero en menor
volumen, realizando el mismo ajuste de pH y condiciones de
esterilidad. Después se realiza el pasaje celular de la cepa activada
y por último se procede a la incubación a 30 °C, con agitación
durante 24 horas (Wang, Zhang, Jiao, Liu y Wang, 2015).
Finalmente se agrega el mismo al fermentador para iniciar la
fermentación, siendo el volumen del inóculo el 5% del volumen
del fermentador.
Figura 4. Preparación del inóculo. Fuente: elaboración propia.
IV.2.2. FERMENTACIÓN
Un proceso de fermentación típico es esencialmente un proceso que se
lleva a cabo en un recipiente llamado fermentador o en general,
biorreactor, mediante el cual determinados sustratos que componen el
medio de cultivo son transformados por acción microbiana en
metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su
concentración en el transcurso del proceso al mismo tiempo que el
medio se va modificando y se forman productos nuevos como
consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas.
Las funciones del biorreactor son:
a) Mantener las células uniformemente distribuidas en todo el
volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentación o la
flotación.
b) Mantener constante y homogénea la temperatura.
c) Minimizar los gradientes de concentración de nutrientes.
d) Suministrar oxígeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo
cuando sea necesario.
e) El diseño debe ser tal que permita mantener el cultivo puro; una
vez que todo el sistema ha sido esterilizado y posteriormente
sembrado con el microorganismo deseado.
Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el
biorreactor esté provisto de un sistema de agitación, así como una
camisa o un serpentín por donde circula un fluido caliente o frío,
además para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en
el cultivo (Ertola et al., 2006).
Entre los objetivos principales de un sistema de agitación, caben
destacar los siguientes:
Mezclar los fluidos y la fase gaseosa,
Dispersar el aire y permitir la transferencia del oxígeno,
Poner en suspensión las partículas sólidas y,
Mantener un entorno uniforme y homogéneo en todo el recipiente
(Stanbury, Whitaker & Hall, 1995).
Esto último es particularmente importante para la dispersión de la
biomasa y la transferencia de calor. Los productos metabólicos y el
calor se dispersan fácilmente, por lo que, no son un factor limitante
para el crecimiento del microorganismo. La barrera principal de
transferencia del oxígeno en la fase líquida es su baja solubilidad en
agua y, al hacerse mayor la capa de agua que debe cruzar, aumenta la
dificultad para que llegue a la célula (Alvarado Palacios, 2009).
IV.2.3. SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS
Este proceso incluye las diversas etapas de procesamiento que se
llevan a cabo después de la etapa de fermentación o bioconversión,
incluida la separación, purificación y envasado del producto. Como se
mencionó anteriormente, las fermentaciones producen una mezcla de
metilcobalamina (MeB12), hidroxicobalamina (OHB12) y
adenosilcobalamina (AdoB12). La hidroxicobalamina se obtiene
cuando las cobalaminas se convierten a la forma de cloro, sulfato o
nitrato durante la extracción y luego se someten a un intercambio
iónico alcalino. La AdoB12 y la MeB12 se aíslan directamente del
medio de fermentación.
El objetivo principal de estas etapas es aislar y producir B12 con un
alto grado de pureza, particularmente cuando el organismo productor
no es de calidad alimentaria o está genéticamente modificado. La
vitamina B12 y sus derivados están presentes dentro de la célula, por
lo cual, se aísla y purifica o la masa celular seca se usa como
concentrado en alimentos para animales.
Este proceso de separación y purificación para la B12 intracelular
comienza cuando se envía el medio de cultivo a una centrífuga. En
este dispositivo se centrifuga en régimen continuo retirándose el
sobrenadante. El líquido obtenido en la centrifugación, que es una
disolución acuosa de los componentes del medio de cultivo y los
subproductos del metabolismo bacteriano, se envía a tratamiento de
efluentes, mientras que el sólido sobrenadante, compuesto por la
población de bacterias productora de la fermentación, se envía a la
etapa siguiente de disrupción celular. En esta última el objetivo es
romper las células de manera de liberar la vitamina B12 contenida
dentro de ellas y existen dos procesos diferentes para lograrlo. En uno
de ellos, la ruptura celular se produce en un molino de bolas, donde se
obtiene un sólido, compuesto por los residuos de la membrana celular
húmeda, y un líquido, el medio intracelular en el cual está contenida la
vitamina B12 producida por la bacteria. Se considera que en su
operación no se produce aumento de temperatura, al actuar el líquido
como lubricante en el equipo. En el otro proceso, la masa celular
centrifugada se calienta como una suspensión acuosa para lisar las
células a una temperatura entre 80-120 °C durante 10-30 minutos a
pH 6,5-8,5. Las formas de B12 producidas se convierten en
cianocobalamina (CNB12), mediante la adición de cianuro de potasio,
generalmente en presencia de nitrito de sodio y calor. La suspensión
obtenida en la etapa anterior (por cualquiera de los métodos) se puede
separar ya sea por centrifugación o por filtración. Aquí, se separa una
fase líquida, compuesta por el citoplasma (fundamentalmente agua),
material genético, lípidos y la propia vitamina B12, de una fase sólida,
compuesta por los restos de membrana plasmática y pared celular
(fundamentalmente lípidos). La fase sólida se envía a tratamiento de
residuos, mientras que el líquido obtenido se envía a un adsorbedor o
columna de intercambio iónico. El adsorbedor consiste en una torre de
lecho fijo empaquetado de Duolite S861. Para abastecer las
necesidades del proceso se necesitan dos torres, cada una alterna los
períodos de adsorción y desorción. Por lo tanto, de los adsorbedores
salen y entran alternativamente diferentes corrientes líquidas, según se
esté llevando a cabo la operación de adsorción o regeneración.
Cuando se produce la operación de adsorción, a la torre de lecho fijo
entra la corriente líquida procedente de la centrífuga (o del equipo de
filtración) y sale una corriente líquida cuya composición es idéntica a
la de la alimentación, pero habiéndosele retirado toda la vitamina B12.
Esta queda adsorbida en el lecho de la resina Duolite S861. Para la
operación de desorción o regeneración, se alimenta a la torre con una
disolución acuosa de metanol al 40 %, extrayéndose un efluente
enriquecido en cobalamina. El lecho adsorbe durante un período de 25
horas hasta saturarse, mientras que el proceso de desorción se lleva a
cabo en un tiempo de 10 minutos. Ambos procesos se llevan a cabo a
25 °C y pH 5. El lecho está compuesto por partículas de 0,4 mm de
diámetro, con una porosidad de 0,4. La disolución acuosa de metanol
y cobalamina que proviene de la regeneración del lecho de adsorción,
se envía al cristalizador, donde se concentra por evaporación a un
vacío del 85 % (0,15 atm de presión) y una temperatura de 48 °C. La
solución se concentra al evaporarse el disolvente, saliendo este último
en estado gaseoso del equipo hacia el condensador. Aquí se enfría
hasta 25 °C para reutilizarse, recirculándose como agente extractor en
el adsorbedor. La disolución concentrada con la cobalamina
precipitada pasa del cristalizador al filtro-secador donde, por una
parte, se obtiene el sólido precipitado como cobalamina de alta pureza
(98 %), y por otra, una disolución acuosa de metanol y cobalamina,
saturada de ésta, la cual se recircula mezclándose con el efluente del
adsorbedor, compuesto también por agua, metanol y cobalamina.
Finalmente, la vitamina debe almacenarse a 4 °C para evitar su
deterioro. En la imagen que sigue se muestra el proceso de producción
de vitamina B12 y sus etapas principales:
Figura 5. Bioproceso de producción de vitamina B12.
V. REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS
Bertholet, Y. y Mercatante, M. (2019). Producción de vitamina b12 por
fermentación microbiana. Universidad Tecnológica Nacional.