LABORATORIO N° 8
Demostración experimental del metabolismo del glucógeno en el hígado
1. Introducción
La glucosa se almacena en el hígado como glucógeno en el período postprandial
bajo la acción de la insulina que incrementa su síntesis (glucogénesis) por
activación de la glucógeno sintasa. El hígado acumula glucógeno hasta 5% de su
peso haciendo un total promedio de 90 gramos
En el ayuno el glucagón aumenta la degradación del glucógeno (glucogenólisis)
vía AMP cíclico activando la fosforilasa cinasa y la glucógeno fosforilasa, y la
glucosa es liberada a la sangre gracias a la glucosa 6 fosfatasa a fin de que los
tejidos que necesitan glucosa como el cerebro y hematíes puedan utilizarla. La
adrenalina también aumenta la gliucogenólisis hepática.
.
El objetivo de esta práctica es demostrar la presencia de glucógeno en el hígado
y su variación con el tiempo, de modo que disminuye del tiempo 0 a los 60 minutos
( por la glucogenólisis). Por otro lado la concentración de glucosa en los tubos de
incubación se espera que aumente por la glucogenólisis desde el tiempo 0 hasta
los 60 minutos
2. Material y reactivos
Lugol 1 :30
Solución Krebs
Ácido tricloroacético TCA 5 %
Reactivo de Fehling
Cobayo
Pinza
Centrífuga
Baño maría
Tijeras
3. Procedimiento
1. Sacrificar un cobayo. Extraer el hígado y colocarlo en trozos de 1 cm
aproximadamente en un Petri con suero fisiológico a O°C
2. Marcar tres tubos de ensayo de incubación con 0 min, 30 min y 60 min, colocar
en cada uno de ellos 3 ml de solución de Krebs y colocar 3 a 4 cortes de hígado
en cada tubo.
3. Extraer de inmediato los cortes de hígado del tubo 0 minutos y colocarlo en
un mortero con 4 ml de ácido tricloroacético.
Molerlos bien y centrifugar por 5 minutos a 3500 rpm.
El sobrenadante pasarlo a un tubo marcado como SN-0.
Colocar líquido de los tubos de incubación (donde estuvieron inicialmente los
trozos de hígado) en un tubo marcado con LI-0 para determinar la glucosa en
él.
4. A los 30 y 60 minutos de incubación, repetir el procedimiento con los cortes
de hígado a los tubos 30 min. y 60 min. Respectivamente. Marcar los tubos
como SN-30 y SN-60.
Asimismo marcar los tubos LI-30 y LI-60 y colocar los líquidos de incubación
de los tubos de 30 y 60 minutos
En el tubo donde estuvieron los fragmentos del hígado antes de ser triturados
se asemeja al líquido sanguíneo y al medir la glucosa se espera que aumente
porque se simula un ayuno ya que el hígado no recibe glucosa
En el sobrenadante resultante de triturar el hígado, se mide el glucógeno y
se espera que disminuya por acción de la glucogenólisis
5. Determinación del glucógeno en los sobrenadantes de cortes de hígado según
tiempo de incubación
Fundamento: el lugol con el glucógeno da un color rojizo al formar un
complejo de adsorción que se puede cuantificar en cruces. Asimismo la
turbidez guarda relación directa con la concentración de glucógeno
Para determinar el glucógeno armar el siguiente sistema (Sistema 1):
Tubo 1 (0 Tubo 2 (30 Tubo 3 (60 Tubo
min) min) minj) Control
SN-0 1 ml
SN -30 1 ml
SN-60 1 ml
TCA 5 % 1 ml
Lugol 1:30 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Agitar los tubos. Observar la coloración de los tubos y anotar la turbidez como
mayor presencia de glucógeno
Expresar en cruce la coloración: +, ++, +++
Expresar en cruces la turbidez: + , ++ y +++
6. Determinación de la glucosa según los tiempos de incubación
Fundamento: la glucosa del medio reduce al ión cúprico (azul celeste) a
cuproso (rojo naranja)
Para determinar la glucosa rotular armar el siguiente sistema (Sistema 2)
Tubo 0 Tubo 30 Tubo 60
LI-O 2ml
LI-30 2 ml
LI-60 2ml
[Link] 2ml 2ml 2 ml
Empleando pinzas colocar por 3 minutos al mechero o en baño de agua
hirviente. Observar el cambio de color y el precipitado de color rojo en cada
tubo.
Expresar el cambio de color : + , ++, +++ según la intensidad
Precipitado color rojo: +, ++ , +++
Opcionalmente puede determinarse glucosa por método de glucosa oxidasa
usando el líquido de incubación 0, 30 y 60 min
4. Resultados
4.1. Determinación de glucógeno:
Resultado Tubo 1 (0 Tubo 2 (30 Tubo 3 ( 60 Tubo Control
min) min) min)
Color +++ ++ + -
Turbidez ++ + ++ + -
4.2. Determinación de la glucosa
Resultado Tubo 0 Tubo 30 Tubo 60
Cambio de color - ++ +++
Precipitado rojo - + a ++ +++
5. Interpretación
Interprete los resultados tanto en la determinación de glucógeno como en la de
la glucosa según los tiempos de incubación.
6. Cuestionario
1. ¿Cuál es la estructura del glucógeno y cuál es su función?
• FUNCIONES DEL GLUCÓGENO
➢ Forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable
➢ El exceso de glucosa de la dieta se almacena como glucógeno. Se moviliza cuando
surge una necesidad: actividad muscular, entre comidas (reserva energética 12 -
24 h)
➢ Se encuentra en el citosol: gránulos de 10-40nm. Contiene las enzimas para su
degradación y biosíntesis y las enzimas reguladoras.
➢ Lugares principales de almacenamiento: hígado y músculo esquelético
➢ Funciones diferentes: regular el nivel de Glucosa en sangre (hígado) y
suministrar glucosa para la actividad muscular vigorosa (músculo)
➢ Existen defectos enzimáticos congénitos que alteran el metabolismo del
glucógeno: enfermedades de almacenamiento del glucógeno
2. ¿Qué cambios sufre el metabolismo del glucógeno en el ayuno y
estadopostprandial? Haga un esquema
3. ¿Cómo se regula la glucogénesis? Haga un e
oLa gluconeogénesis es una ruta anabólica donde se sintetiza nueva glucosa a
partir de moléculas como piruvato y lactato. Durante dicha ruta se llevan a
cabo las reacciones inversas de glucólisis por medio de las mismas enzimas.
La gluconeogénesis se lleva a cabo principalmente en el hígado, aunque
también ocurre en menor medida en otros órganos como riñón y músculo.
Esta no es una ruta aislada pues está ligada a otros procesos como el ciclo de
Cori y el de la Glucosa-Alanina y es un proceso muy importante pues
algunos órganos y células como eritrocitos, testículos y médula renal
dependen enteramente de glucosa para la producción de ATP, de tal manera
que la gluconeogénesis auxilia a mantener los niveles de glucosa sanguínea
para distribuirse en dichos tipos celulares
4. ¿Cómo se regula la glucogenólisis? Haga un esquema
5. ¿Cuáles son las semejanzas y diferencias del metabolismo del
glucógenohepático y muscular?
6. Haga un cuadro con las principales glucogenosis
7. Referencias biobliográficas
1. Lezama P y Obeso W. Bioquímica Teoría y Práctica. UPAO 2015
2. Mia Palacios. Determinación de glucosa y glucógeno en el hígado
[Link]
higado-cobayo/[Link]
3. Rodwell, V, Bender D., Botham, K, Kennelly P, Weil, P. Harper. Bioquímica
ilustrada 31 edición, 2018