Benemérita
CPS Ritchie Universidad
Autónoma de Puebla
Parasitología I, equipo 6
Parasitología I Equipo 6
Portada
BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
Facultad de Ciencias Químicas
Parasitología I
CPS Ritchie
NRC 19857
Equipo 6
Vila Madrid Manuela Monserrat
Reyes Mendoza Fernanda
Palafox Arroyo Itzel
Flores Juárez Beatriz
Amaro Espinoza Israel
Otoño 2021
CPS Ritchie
Parasitología I Equipo 6
Índice
Portada ____________________________________________________________________ 1
Índice _____________________________________________________________________ 2
Introducción ______________________________________________________________ 3
Fundamento ______________________________________________________________ 3
Objetivos _________________________________________________________________ 3
Materiales y equipo _______________________________________________________ 3
Reactivos _________________________________________________________________ 4
Material biológico _________________________________________________________ 4
Procedimiento ____________________________________________________________ 4
Esquema de trabajo _______________________________________________________ 5
Procesamiento y reporte de resultados ____________________________________ 7
Cálculo de resultados_________________________________________________________ 7
Reporte de resultados ________________________________________________________ 7
Resultados esperados ________________________________________________________ 8
Confiabilidad analítica _____________________________________________________ 9
Control de calidad _________________________________________________________ 9
Fase preanalítica _____________________________________________________________ 9
Fase analítica ________________________________________________________________ 4
Fase post analítica____________________________________________________________ 5
Ventajas __________________________________________________________________ 5
Bibliografía _______________________________________________________________ 7
CPS Ritchie
Parasitología I Equipo 6
Introducción
En 1917, Charles y Barthelemy describieron el primer método de concentración
por sedimentación utilizando solución salina, éter y formaldehído, años más tarde
en 1948, Richie describió un método semejante, el cual hasta la fecha se sigue
utilizando. En evaluaciones comparativas con este método, se ha demostrado
su utilidad para el diagnóstico de parasitosis intestinales, leves o moderadas.
La sedimentación es menos eficaz que la flotación para la concentración de quistes
de protozoarios y abundantes huevos, pero es más útil para la búsqueda de huevos
de esquistosoma y operculados.
El método de Ritchie o también llamado método de concentración en éter formalina
es una técnica de sedimentación que se basa en la concentración de huevos de
helmintos, larvas y quistes de protozoarios mediante la centrifugación, con la ayuda
de formol y éter para separar y visualizar los elementos parasitarios.
Fundamento
El empleo del éter y formaldehído permite con el primero liberar las formas
parasitarias de las grasas, por disolución de las mismas, y con el formol se
fijan y conservan. La concentración se hace por centrifugaciones sucesivas.
Es fundamento de la técnica se basa en el uso de la fuerza centrífuga que obligara
a los parásitos a ir al fondo del tubo, del éter que elimina los detritus orgánicos,
mientras que el formol ayuda a mantener la integridad de las formas parasitarias
que se concentran.
Objetivos
Desarrollo y comprensión de la técnica para aprender a concentrar por
sedimentación e identificar parásitos intestinales en heces fecales frescas.
Materiales y equipo
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Reactivos
• Solución salina isotónica
• Solución de formaldehído al 10%
• Éter etílico
• Solución de yodo-lugol
Material biológico
• Muestra biológica: heces fecales frescas
Procedimiento
1. Tomar con el abatelenguas aproximadamente 1 gr de materia fecal y colocar en
el vaso de precipitados, añadir 10 ml de solución salina y homogeneizar.
2. Se filtra la suspensión a través de la gasa doblada en cuatro partes y colocada
en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.
3. Centrifugar el filtrado a 2000 rpm por 2 minutos.
4. Decantar el líquido sobrenadante y resuspender con el aplicador de madera el
sedimento con solución salina. Centrifugar nuevamente, decantar y resuspender
dos veces más.
5. Al último sedimento se agregan 5 ml de solución de formaldehído al 10%, se
mezcla y se deja reposar durante 10 minutos en la gradilla.
6. Se añaden 0.5 ml de éter, se tapan los tubos y se agitan enérgicamente durante
30 segundos.
7. Centrifugar durante 2 minutos a 2000 rpm.
8. La función de la centrífuga en esta práctica fue de suma importancia, puesto que
utiliza la fuerza centrípeta para separar sustancias de diferentes densidades. Al
centrifugar la mezcla del sedimento con el formol y el éter se menciona la presencia
de 4 capas, las cuales son:
1. Éter en la superficie
2. Un tapón de restos fecales y grasos
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3. Formaldehído
4. Sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.
Después de centrifugar se observan cuatro capas: El método de Ritchie es uno de
ellos, y se basa en el principio de la densidad. Usa sustancias químicas, como lo
son el formaldehído y el éter, que permiten remover material lípido y coloidal y
obtener así un sedimento más “puro”. Además, la formaleina conserva huevos,
larvas y quistes, por lo que el material puede examinarse horas o incluso días
después.
9. Decantar el sobrenadante.
[Link] la pipeta Pasteur hasta el sedimento, extraer con cuidado una gota del
sedimento y colocarla en el portaobjetos.
11. Añadir una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos
homogeneizar, y cubrir con el mismo.
[Link] la preparación con al microscopio con objetivos 10x y 40x
13. Informar los resultados.
Esquema de trabajo
CPS Ritchie Figura 1: esquema del proceso de CPS Ritchie
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Figura 2: proceso paso a paso de CPS Ritchie
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Procesamiento y reporte de resultados
Los resultados indicarán el(los) método(s) empleado(s), el género o la especie del
parásito observado y su estadio evolutivo. La densidad parasitaria puede
expresarse como el número de formas parasitarias observadas por campo de
microscopio con objetivo de 10X y 40X. Todo formato de respuesta de resultados
debe contener los datos de identificación: nombre, edad, sexo, fecha, las
características organolépticas de las heces (consistencia, color, presencia de
sangre y moco), datos de la observación microscópica (presencia de leucocitos,
eritrocitos, levaduras, fibras musculares no digeridas y parénquima de células
vegetales en cantidad considerable), ya que esta información facilitará un mejor
diagnóstico clínico.
Se reportará la fase del parásito, con su género y especie.
En el caso de encontrar
Se reporta como negativo quistes se reporta como
Como positivo en caso de “quistes de …
sino se encuentra ningún
presencia de parásitos.
parasito. En el caso de huevos se
reporta como “huevos de…
Cálculo de resultados
El numero total de huevos o larvas encontrados se multiplican por 5; se obtiene de
esta manera el número de huevos de la totalidad de preparación.
Reporte de resultados
El resultado se expresa en fase, género y especie y cruces por campo.
Se expresa en huevos por gramos de heces (hgh), toda vez obtenidos resultados,
estos se vacían en una libreta o cuaderno.
Ejemplo
Reporte
Protozoarios:
1 a 4 Trofozoitos por campo (+)
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1 a 4 Quistes por campo (+)
5 a 8 Trofozoitos por campo (++)
5 a 8 Quistes por campo (++)
9 o más Trofozoitos por campo (+++)
Helmintos: 1 a 5 Huevos en la preparación (+)
Resultados esperados
Figura 3. Frotis de trichomona vaginalis
En la figura 3 se pueden apreciar claramente quistes de trichomona vaginalis.
Figuras 4. Quistes de Entamoeba histolytica/dispar
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En el caso de Entamoeba histolytica (figura 4) fue más sencillo de identificar debido
a la forma circular o esférica de sus quistes y además por presentar en el interior de
1 a 4 núcleos.
Confiabilidad analítica
Se deberá introducir la pipeta Pasteur para la toma de la muestra del fondo del tubo
con el mayor cuidado, pues se pueden presentar problemas al momento de la
observación por el arrastre de grasa.
Control de calidad
Fase preanalítica
• Solicitud de análisis: Nombre completo, edad, sexo, fecha. Estado de
nutrición. Ingesta de bario o antiparásitos. Diagnóstico clínico.
En un formato similar a este
• Preparación del paciente: evitar el consumo de fármacos o ciertos
alimentos (melón, rábanos, carnes crudas y semi crudas, especias en exceso
como pimienta y chile), ayuno estricto, no ingerir licor, no hacer ejercicio
durante 72 horas antes de la muestra, no fumar, en pacientes pediátricos es
recomendable realizar un hisopado rectal, las mujeres deberán evitar
recolectar la muestra durante la menstruación, no tomar laxantes ya que la
evacuación de las heces debe ser espontánea.
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• Recolección de la muestra: leer correctamente el manual.
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• Conservación de la muestra: La muestra, una vez recogida, se tiene que
transportar al laboratorio en un tiempo no superior a 2 horas tras su
emisión. La muestra se puede conservar hasta su entrega en el laboratorio
durante 24 horas en casa (guardar en un lugar sin humedad y a temperatura
ambiente)
• Transporte: Para el envío de muestras se deberán apegar al instructivo del
Sistema básico de triple de embalaje emitido por el InDRE
Las muestras en recipiente primario (medio de transporte) se colocarán en una caja,
rodeándolas con papel absorbente, asegurando que los recipientes no se muevan
durante el transporte.
El o los recipientes(s) secundario(s) se coloca(n) en un paquete externo de envío
que protege su contenido de los elementos externos del ambiente, a fin de evitar
posibles daños físicos y filtración de agua, mientras se encuentra en tránsito.
Adjuntar documentos que identifican y describen las muestras, éstos deberán
adherirse a la parte interior del paquete externo de envío. Es importante que los
documentos primero se introduzcan en un sobre de plástico para protegerlos. Toda
muestra debe ir acompañada del formato institucional de envío de muestras y
formato de estudio epidemiológico del paciente.
Sellar la caja y colocar las etiquetas correspondientes.
Transportar las muestras a los laboratorios de las unidades médicas o nivel
estatal.
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Etiquetado
El recipiente primario que contiene la muestra debe llevar la etiqueta propia que
cada laboratorio adhiere con los datos básicos del paciente y escritos de forma
legible.
Los recipientes secundarios deben llevar las etiquetas de:
• Riesgo biológico
• Riesgo secundario (según sea el caso)
• Datos del laboratorio al que van referidos
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• Señal de orientación
El paquete externo de envío debe llevar las siguientes etiquetas:
• Riesgo biológico
• Riesgo secundario (según sea el caso)
• Datos del remitente
• Datos del destinatario o receptor
• Señal de orientación
• Mantenimiento del microscopio: La calibración del microscopio debe
realizarse por cada ocular y por cada objetivo que se utilice en este.
Paso 1: Coloca el retículo dentro del ocular. Luego, ajusta el ocular de tal manera
que la escala que está grabada en el retículo quede correctamente enfocada.
Paso 2: Coloca el calibre micrométrico en la platina del microscopio. Hay un círculo
grabado en el micrométrico que puede verse a simple vista.
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Usa el círculo para centrar el micrómetro, y enfoca el microscopio usando la lente
objetivo de menor aumento. Luego, coloca el objetivo deseado en posición y enfoca
correctamente la escala de calibre micrométrico.
Paso 3: Usa las perillas x-y para controlar el movimiento de la platina. Alinea el
retículo ocular con el calibre micrométrico. Una vez que coincidan los dos conjuntos
de líneas, busca otra ubicación donde coincidan precisamente de nuevo.
Paso 4: Calcula la distancia entre las dos líneas del micrómetro que coincidan. Por
ejemplo, si la distancia entre dos divisiones es de 10 micrómetros, y hay 15
divisiones entre las dos líneas que coinciden, la distancia total es de 150
micrómetros.
Paso 5: Cuenta el número de divisiones en el retículo ocular entre las dos líneas
que coinciden, luego calcula la distancia ente cada línea. Por ejemplo, si hay 30
divisiones entre las dos líneas que coinciden, y sabemos por el calibre micrométrico
que la distancia es de 150 micrómetros, la división en el ocular representa 150
micrómetros / 30 divisiones = 5 micrómetros / división.
• Calibración de la centrifuga: En la calibración de las centrífugas se usa de
forma habitual los tacómetros ópticos. Estos equipos emplean un haz de luz
que se debe enfocar sobre el eje marcado previamente con una pegatina o
pintura que reflejará la luz con mayor intensidad que el resto de superficie.
Esto es captado por un sensor que incorpora el tacómetro que informará de
la velocidad de giro de la centrífuga en revoluciones por minuto (rpm).
• Control de coloraciones.
• En casos de síndrome diarreico las muestras deberán ser enviadas
inmediatamente al laboratorio, respetando siempre los procedimientos
descritos anteriormente.
• Todos los componentes de CPS Ritchie deben ser almacenados en su
embalaje original a temperatura ambiente (entre 4° y 30°C).
• Usar vestuario de seguridad y guantes adecuados.
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• Pacientes con sintomatología sugestiva; pacientes asintomáticos con
antecedentes epidemiológicos relevantes; control o control post-tratamiento.
• 48 a 72 horas antes de realizarse el estudio (libre de frutas, verduras y grasas
dado que estas preparaciones obstaculizan la visualización microscópica lo
que puede conducir a resultados Falsos Negativos o Falsos Positivos).
Fase analítica
• Se utilizarán láminas de referencia como control de calidad.
• Se recomienda la experiencia de un analista en la aplicación de la técnica
(dominio de la técnica)
• Tiempo y velocidad de centrifugación deben ser adecuados.
• El material debe estar limpio o estéril y en óptimas condiciones.
• Se deberá usar vestimenta de laboratorio adecuada (bata, guantes,
cubrebocas).
• El área de trabajo deberá estar libre de mecheros encendidos, pues el
éter es inflamable.
• La finalidad de repetir el proceso de centrifugación con solución salina es
porque de esa manera también se elimina la mayor cantidad de restos
fecales, vegetales y grasas que estén presentes, que intervienen la mayoría
de las veces en la visualización microscópica. Por lo que es importante
realizar todos los procesos de centrifuga como indica la práctica.
• Tiempo y velocidad de centrifugación inadecuados.
• Al mezclar y agitar la suspensión de materia fecal con el éter, el tubo
debe destaparse lentamente para evitar que el contenido se proyecte
bruscamente hacia el exterior.
• Estudio macroscópico (Consistencia: moldeada, pastosa, semilíquida. Color:
marrón, amarillo, macilla, negruzco, verdoso. Olor: “sui generis”, fétido,
butírico. Presencia de elementos anormales: sangre, mucus, pus. Presencia
de seudoparásitos. Búsqueda de parásitos macroscópicos)
• Estudio microscópico (Lugol. Objetivo 10 x. Objetivo 25-40 x. Habitualmente
no se emplea objetivo de inmersión. Importante: No diluir demasiado las
muestras.)
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Fase post analítica
• El resultado se expresa de forma correcta en cuanto a fase, género y
especie y cruces por campo.
• Conocer las características morfológicas de los parásitos también son
importantes.
• Se reporta como negativo sino se encuentra ningún parasito.
• En el caso de encontrar quistes se reporta como “quistes de … En el caso
de huevos se reporta como “huevos de…
• Informe (nombre número de registro y fecha de realizado del estudio,
especificación de la técnica de Ritchie, observaciones, firma y
contrafirma, documento medico-legal, interrelación clínico-diagnóstica).
Ventajas
Entre las muchas ventajas que tiene este procedimiento están:
[Link] y no deforma las posibles formas parasitarias.
2. Permite que se pueda transportar y almacenar la materia fecal procesada
antes de ser examinada, pues los agentes químicos conservan a los parásitos
que existan en la muestra.
3. Se usa cuando necesitan una técnica para evaluación de tratamiento y
determinación de frecuencia.
4. Concentra bien quistes y todo tipo de huevos.
5. La implementación de técnicas confiables constituye una necesidad para el
diagnóstico certero de las infecciones parasitarias la técnica de Ritchie (1948)
es una técnica utilizada en los laboratorios como método de diagnóstico de
helmintos y protozoos ya que su empleo permite que pueda observarse tanto un
quiste de protozoo como un huevo de helminto y a la vez resulta más confiable,
además es reportado su uso en investigaciones tanto para protozoos como
helmintos, con resultados positivos.
6. El método de Ritchie es una prueba sencilla y de bajo costo, lo que hace
apropiada para un diagnóstico seguro, eficiente, eficaz e inmediato.
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7. Cuando se emplea la formalina, los huevos, larvas y quistes tienden a
conservarse, por lo que el material puede examinarse horas o incluso días
después.
Otros dispositivos comerciales
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Bibliografía
Magaró, H., Uttaro, A., Serra, E., Ponce de Leon, P., Echenique, C., Nocito, I.,
Vasconi, M.D., Bertolini, G., Bogino, B., Indelman, P. (s.f.). Técnicas de
diagnóstico parasitológico. Rosario: Universidad Nacional de Rosario.
Campo Polanco, L. F., Botero, L.E., Gutiérrez, L. A., Cardona Arias, J. A. (2015).
Reproducibilidad del examen directo de heces y de la concentración
formoléter y validez del examen directo de heces para el diagnóstico de
parásitos intestinales. iMedPub Journals, 11 (4), doi: 10.3823/1266
Biagi Francisco, Enfermedades Parasitarias, 3ra edición, Manual Moderno, 2004
Tay Jorge, Parasitología, 6va edición, Méndez Editores, 2010.
Becerril Marco, Parasitología Médica, 2da edición, Mc Graw Hill, 2008.
Gómez Marín Jorge E., Protozoología Médica, 1ra edición Manual Moderno, 2010.
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