PRACTICA NO 3 CURSO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
COLORACIÓN DE CÁPSULA
La cápsula se puede definir como una estructura superficial que está presente en muchas
bacterias en sus ambientes naturales, consistente en acumulación de material mucoso
viscoso, situado externamente respecto de la pared celular.
Las cápsulas son estructuras inertes “no vivas” carentes de papel activo (metabólico),
pero que confiere a las bacterias importantes propiedades:
• Adhesión a células hermanas, generando microcolonias y consorcios
• Adhesión a sustratos inertes o vivos, lo que les permite la colonización de sus
nichos ecológicos ( p. ej. Tejidos de organismos superiores)
• Protección contra agentes antibacterianos
Su observación a microscopía óptica en fresco es difícil, ya que su índice de refracción es
similar al del medio. Al ser una estructura muy hidratada (99% de agua), su observación
con las técnicas habituales de microscopía electrónica de transmisión (MET) y de barrido
(MEB) revela una notable contracción de su estructura. Además, los colorantes habituales
tienen poca afinidad hacia ella.
Cápsula
Figura 1. Fotografía de cápsula bacteriana de Lb. Plantarum 100X
La cápsula de las bacterias no tiene la misma afinidad por los colorantes que otros
componentes de las células y por eso exige el empleo de métodos de coloración
especiales.
Algunos están destinados a colorear la célula y el fondo pero no la cápsula de manera
que en la envoltura se aprecia por contraste, como el método de Anthony. Otros
procedimientos producen un efecto colorante diferencial, cuando la cápsula admite un
contra colorante. Otro procedimiento utiliza el principio de la coloración negativa como el
método de tinta china.
MATERIALES
- Cristal violeta al 1%
- Sulfato de cobre al 20%
- Agua destilada en frasco lavador
- Papel limpiamente para objetivos
- Aceite de inmersión
- Gotero
- Mechero
- pinza de madera
- asas de inoculación
- Cultivos bacterianos (Klebsiella pneumoniae.)
- Bandejas de coloración
METODO DE ANTHONY
1. Preparar un extendido fino y uniforme de un cultivo de Klebsiella pneumoniae
extendiéndolo con un portaobjetos en ángulo recto.
2. 2. Secar al aire. No fijar al calor
3. 3. Colorear con solución acuosa de cristal violeta al 1% durante 2 minutos
4. Lavar con solución de sulfato de cobre al 20%
5. Dejar secar al aire en posición vertical y observar al microscopio
La cápsula aparece sin colorear contra un fondo de color púrpura; las células se tiñen de
violeta intensamente (Fig. 1).
METODO CON TINTA CHINA
Esta es na tinción negativa en la que se obscurece el fondo de la preparación y es
utilizado un colorante para teñir a la célula.
COLORANTES:
-Tinta china a o nigrosina
-Colorante fucsina
METODO:
1. Se toma un portaobjeto y en uno de los extremos se coloca una gota de tinta china
2. Del material de cultivo bacteriano (Klebsiella sp.) líquido se toma una gota con
pipeta Pasteur y esperar que la mezcla de bacterias se mezcle con la nigrosina
3. Sobre las gotas se coloca el borde de otro portaobjeto y se inclina efectuando un
extendido sobre el portaobjeto con un solo movimiento. La muestra debe formar
una película uniforme (Fig. 2).
4. Cuando la preparación está seca, es adicionado el colorante fucsina en toda la
superficie para teñir los microorganismos productores de cápsula. Se espera un
minuto y se lava cuidadosamente la muestra para evitar desprendimiento de esta.
5. Se escurre y deja secar al aire
6. Se observa en el microscopio en el objetivo de 100X con aceite de inmersión.
Fig. 2 Preparación de extendido con Fig. 3 Observación de tinción de
Nigrosina. Cápsula negativa
CUESTIONARIO
- Qué e la capsula bacteriana? (ubicación, composición)
- Cuál es la importancia del reconocimiento de los microorganismos productores e
cápsulas en la industria alimenticia?
- Cite los microorganismos más importantes productores de cápsula, que pueden
interferir en la industria de alimentos
- Mencione las características de protección que la cápsula otorga al
microorganismo.
- Como se correlaciona la presencia de cápsula con la virulencia de una bacteria
patógena.
COLORACIÓN DE ESPORAS
Ciertas especies de bacterias producen en su interior estructuras especiales denominadas
endosporas. Las endosporas son células diferenciadas extraordinariamente resistentes al
calor y difíciles de destruir incluso recurriendo a compuestos químicos muy agresivos. Las
bacterias que forman esporas se encuentran habitualmente en el suelo y se puede decir
que prácticamente cualquier muestra del suelo contiene endosporas.
El descubrimiento de las endosporas bacterianas tuvo una gran trascendencia para la
microbiología porque el conocimiento de estas formas de gran resistencia al calor fue
decisivo para el desarrollo de métodos de esterilización, no solo para medios de cultivo
sino también para alimentos y otros productos perecederos. Aunque muchos otros
organismos distintos a las bacterias forman esporas, la endospora bacteriana es única en
cuanto a su grado de termo resistencia. La endosporas son resistentes igualmente a otros
agentes nocivos como la desecación, radiación, ácidos y desinfectantes químicos; pueden
además permanecer en estado latente por períodos de tiempo muy prolongados.
Por lo tanto, los métodos de rutina para coloración como en la coloración de Gram,
aparecen como cuerpos retráctiles no coloreados. Por lo general en métodos especiales
de coloración se requiere que el calor penetre para permitir que las esporas se coloreen.
en la figura 2. Las formas de estas estructuras se observan en la Figura 2. De acuerdo
con la ubicación en la célula se clasifican en terminales, sub-terminales y centrales.
MATERIALES
- Solución acuosa de Verde de Malaquita al 5%
- Solución acuosa de safranina al 0.5%
- Cultivo bacteriano de Bacillus cereus
- Bandejas de coloración
- Agua destilada en frasco lavador
- Papel limpialente para objetivos
- Aceite de inmersión
- Gotero
- Mechero
- pinza de madera
- asas de inoculación
- Bandejas de coloración
- Tira de papel filtro
- Baño maría 95°C para vaporización de placas
- Varillas de vidrio para el baño
. A B C
Figura 2. Microfotografias de esporas bacterianas. A. Centrales. B. Subterminales C. Terminales
METODO
1. Realizar um extendido de una colonia de Bacillus cereus tomada del Agar com
el asa microbiológica.
2. Cubrir el porta objetos con una tira de papel filtro
3. Bañar todo el porta objetos con solución acuosa de Verde de Malaquita al 5%
4. Calentar al vapor durante 3 a 6 minutos sin dejar secar
5. Enjaguar con agua destilada
6. Contra colorear con solución de Safranina al 0.5% durante 30 segundos y lavar
7. Al observar al microscopio las esporas se observan en forma de esférulas
verdes y el citoplasma coloreado de rojo o fucsia.
PRUEBA DE MOTILIDAD
Algunas bacterias presentan movilidad debido a La presencia de flagelos. Este
hecho puede ser fácilmente demostrable en condiciones de laboratorio.
MATERIALES
- Cultivo de Pseudomonas sp.
- Tubos con agua destilada
- Láminas cubreobjetos y portaobjetos
- Asas
METODO
1. Colocar una gota de água sobre la lámina portaobjetos
2. Com un asa previamente esterilizada, tome suavemente um poco de muestra
de cultivo bacteriano y disolver en la gota de água sin esparcir.
3. Observar los movimientos y reportar
CUESTIONARIO
1. Las esporas son más difíciles de colorear que las células vegetativas por qué?
2. En su preparación se observan esporas libres y en el interior de las células
vegetativas. Como puede incrementarse el contenido del material capsular?
3. Los frotis de bacterias encapsuladas no se lavan con agua ni se calientan. Por
qué?
Tome fotografías y señale las estructuras observadas de acuerdo con las
coloraciones diferenciales preparadas.
Referencias
1. Covadonga A, Silóniz M, Serrano S. Técnicas básicas de
Microbiología. Observación de bacterias. Reduca (Biología). Serie
Microbiología. 2010; 3 (5): 15-38. D
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña
S, Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Las tinciones básicas en
el laboratorio de microbiología. [Link]. 2014; 3 (1): 10-
18. Disponible en: [Link]
3. Gil M. Tinción negativa: fundamento, técnica, ventajas y
desventajas. [Link].
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Diagnóstico Microbiológico
de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana S.A
5. Tankeshwar A. Capsule Stain: Principle, Procedure and Results.
2019. Medical Microbiology Guide. Available in: [Link]