PRACTICA 1. MICROSCOPIA.
TINCIÓN SIMPLE
¡Bienvenid@! es un gusto saludarte. En esta clase obtendrás los conocimientos para manipular el
microscopio y conocerás la metodología más adecuada para la observación de diferentes muestras
de los reinos monera y fungi. Además, emplearás la técnica de tinción simple lo que te permitirá
adquirir la habilidad de preparar frotis de buena calidad para su observación al microscopio. Iniciemos
repasando las generalidades de esta herramienta.
El instrumento que nos permite obtener imágenes amplificadas de objetos muy pequeños (no
visibles a simple vista) es el microscopio. Desde el punto de vista óptico, se reconocen dos tipos de
microscopios: Simple (usa solamente una lente, llamada lupa,) y Compuesto (usa cuando menos dos
lentes). En el microscopio compuesto la imagen producida por la primera lente (objetivo) es amplificada
en la segunda lente o sistema de lentes (ocular).
Los microscopios modernos pueden ser de luz, electrónicos o de efecto túnel, si son
fotones, electrones o el efecto cuántico de túnel los que van a formar las imágenes. En la actualidad
existe una gran variedad de microscopios cuyo uso específico depende del tamaño del objeto a
observar, el grado de detalle que se pretende y la naturaleza, estado y preparación del espécimen.
La característica más importante de un microscopio es su poder de resolución, es decir, la capacidad
de distinguir dos objetos cercanos como identidades diferentes. El límite de resolución o distancia
mínima a la cual dos objetos pueden estar separados para ser percibidos como objetos distintos
depende de la longitud de onda de la luz usada y de la apertura numérica (AN). El valor de AN
generalmente es proporcionada por el fabricante y depende del índice de refracción del medio a través
del cual pasa la luz después de dejar un objeto y antes de entrar al lente del objetivo. De las relaciones
utilizadas para expresar el límite de resolución y la apertura numérica se puede deducir que: a) a
mayor AN o menor longitud de onda, mayor poder de resolución (límite de resolución menor); b) debido
a que el aceite de inmersión tiene un índice de refracción mayor que el aire e igual al vidrio, mejora el
valor de AN.
El aumento total (AT) que se puede alcanzar con un microscopio compuesto depende de la
combinación de los aumentos del ocular y el objetivo que se utilice según la relación:
AT= Aumento del objetivo X Aumento del ocular.
Tanto los aumentos totales como la resolución son muy importantes para el microbiólogo, una
combinación adecuada de ambos permite una mayor calidad de imagen.
Las técnicas de tinción que se usan en Microbiología se desarrollaron como una necesidad
para poner de manifiesto a las bacterias y sus estructuras. Los colorantes fueron usados por los
microscopistas para mejorar el contraste entre los objetos que observaban y el medio que los rodeaba.
La tinción simple es aquella donde se aplica un solo colorante, el cual generalmente se
encuentra en solución acuosa. La concentración final del colorante varía desde 0,5% a 5% (p/v), según
sea la intensidad del color. Se obtienen mejores resultados si se utilizan soluciones de baja
concentración por un tiempo largo en lugar de soluciones concentradas por un tiempo corto.
Algunos de los colorantes más comúnmente usados para la tinción simple son azul de
metileno, fucsina básica y cristal violeta. Todos estos colorantes funcionan bien en bacterias porque
tienen iones (cromóforos) que están cargados positivamente, el hecho de que las bacterias tengan un
poco de carga negativa produce una atracción pronunciada entre los cromóforos catiónicos y el
organismo. Tales colorantes se clasifican como colorantes básicos mientras que aquellos colorantes
que tienen cromóforos aniónicos son llamados colorantes ácidos.
Los tiempos usados en la tinción simple son por lo general de 30 segundos a 2 minutos,
dependiendo de la afinidad del colorante; después de que el frotis ha sido teñido el tiempo requerido,
se lava con suavidad, se deja secar y es examinado directamente con aceite de inmersión.
Antes de centrar la atención en los métodos a desarrollar, es necesario que tengas en mente
las partes del microscopio y sus funciones, y no olvides la posibilidad de hacer mediciones de los
microorganismos observados con ayuda de las escalas del ocular y de la platina.
Figura 1. Partes del microscopio (izquierda). Escalas del ocular y de la platina para la medición de
microorganismos (derecha). (2)
Para el desarrollo de esta sesión necesitamos: Microscopio de campo brillante; Portaobjetos y
cubreobjetos; asa bacteriológica, mechero Fisher; Hisopos de algodón; soluciones de cristal violeta,
safranina, azul de metileno y fucsina básica, puentes de coloración; aceite de inmersión; tela suave;
papel seda y lápices de colores; además de los siguientes materiales biológicos: Cultivos de levaduras,
bacterias y hongos filamentosos.
Métodos.
Cuidados del microscopio.
1. Transportar el microscopio en forma vertical, tomándolo del brazo con una
mano y de la base con la otra.
2. Colocar el microscopio con cuidado sobre la mesa. Es conveniente que
asegurarse de que no existan vibraciones o aparatos que las provoquen en
la mesa donde sea colocado.
3. Limpiar el soporte mecánico del microscopio con una tela que no deje pelusa
y la parte exterior del sistema óptico con papel seda. Si las lentes se
encuentran demasiado sucias, pueden limpiarse con un hisopo de algodón
impregnado con agua. En caso extremo recurrir a un experto. Jamás aplicar
solventes orgánicos.
4. Evitar arrastrar, golpear o inclinar el microscopio.
5. Nunca debe limpiar con el dedo el aceite del objetivo de inmersión.
Figura 2. Transporte y limpieza
del microscopio. (2)
Manejo del Microscopio.
1. Iluminación del campo visual.
a) Conecta y prender la lámpara
b) Sube el condensador hasta el tope.
c) Abre o cierra el diafragma del condensador hasta tener un campo adecuadamente
iluminado y con el mayor contraste posible. Recuerda: los campos excesivamente
iluminados disminuyen el contraste de las estructuras del objeto que se observa y los
campos poco iluminados no permiten distinguir los colores.
2. Colocación de la preparación
a) Coloca la preparación en la platina y sujétala con las pinzas. Acerca el objetivo a la
preparación.
Figura 3. Colocación de la muestra
en la platina. (2)
3. Enfoque de la preparación:
a) Cuando sea necesario, debes colocar cubreobjetos en la preparación.
b) Enfoca la preparación con el objetivo seco débil (10 X) usando primero el tornillo
macrométrico y después el tornillo micrométrico hasta obtener una imagen clara.
c) Sin mover los tornillos ni la platina, cambia al objetivo seco fuerte (40X) girando del
revolver y mueve el tornillo micrométrico hasta enfocar de nuevo.
d) Coloca una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación. Con cuidado,
cambia al objetivo de inmersión e intente enfocar la preparación con el tornillo
micrométrico. Cuando se está enfocando una preparación que se pretende observar
con el objetivo de inmersión NUNCA se debe mover el tornillo macrométrico. Es
importante que tengas cuidado al estar buscando el enfoque correcto ya que a veces por
descuido se presiona demasiado el portaobjetos con el objetivo hasta que se rompe.
4. Al terminar de hacer las observaciones, debes limpiar el microscopio como se indicó
anteriormente y revisar que:
a) Tenga la lámpara apagada,
b) No tenga el cable, para lo cual quítelo con cuidado, enróllelo y guárdelo en el sitio
correspondiente,
c) La platina se encuentre hasta el tope inferior,
d) El revolver está colocado en el objetivo de menor aumento o donde no lo tiene,
e) El microscopio está cubierto con una funda,
f) No olvides anotarte en los cuadernos de control de uso de cada microscopio.
AVISE AL PROFESOR DE CUALQUIER IRREGULARIDAD QUE NOTE EN EL MICROSCOPIO.
Frotis a partir de un medio sólido
1. Marque un extremo de los portaobjetos limpios y
desengrasados.
2. Coloque con el asa una pequeña gota de agua en el
centro del portaobjetos.
3. Tome con el asa estéril, una porción muy pequeña del
crecimiento y haga una suspensión homogénea en la
gota de agua, extienda para formar una película fina.
4. Deje secar al aire.
5. Fije el frotis al calor pasando rápidamente 2-3 veces
por la llama del mechero.
Frotis a partir de un cultivo en medio líquido
1. Marque en un extremo los portaobjetos limpios y
desengrasados.
2. Sin poner agua, tome con el asa estéril dos o tres gotas
del cultivo y colóquelas en el centro del portaobjetos;
extienda para formar una película delgada y uniforme
3. Deje secar al aire.
4. Fije con calor pasando rápidamente 2-3 veces por la Figura 4. Preparación de frotis. (2)
llama del mechero.
Tinción simple de los frotis
1. Coloque los portaobjetos de los frotis sobre el puente de coloración.
2. Cubra los frotis con unas gotas del colorante y déjelo actuar por unos minutos.
3. Con unas pinzas, tome el portaobjetos por un extremo y escurra el colorante.
4. Lave el exceso de colorante con un chorro suave de agua.
5. Deje secar al aire.
Figura 5. Tinción simple. (2)
Preparaciones.
Procedimiento para realizar preparaciones con bacterias en el laboratorio de Microbiología.
1. Realiza dos frotis de muestra de bacterias de acuerdo con las instrucciones mencionadas
anteriormente. Importante: Si tu preparación es a partir de un medio sólido debes cuidar la
cantidad de muestra para evitar que un exceso de esta te impida el análisis correcto.
2. Haz una tinción simple a uno de los frotis. Observa ambos al microscopio (10X, 40X, 100X)
y reporta tus observaciones, al pie de tu esquema debes indicar el aumento microscópico
utilizado, nombre del microorganismo utilizando el esquema binomial Género especie, tipo
de tinción. Estos datos son necesarios para validar tus resultados.
A continuación, encontrarás los esquemas que ilustran los resultados esperados en esta sección.
Figura 6. Izquierda: Escherichia coli bacilo corto sin teñir, derecha: Escherichia coli teñida con cristal
violeta (100X). (1)
Las bacterias pueden presentar diferentes morfologías y agrupaciones como las mostradas en el
esquema siguiente:
Figura 7. Formas bacterianas comunes. (3)
Procedimiento para realizar preparaciones con Hongos filamentosos y levaduras en el laboratorio de
Microbiología.
1. Realiza dos frotis con muestra de hongos filamentosos y de levaduras por separado. En este
caso, se realizará análisis de la muestra en fresco por lo que los frotis no deben fijarse.
2. La tinción simple para este tipo de muestras consiste en poner una gota de colorante azul
de algodón lactofenol sobre la muestra sin fijar, poner un cubreobjetos y observar de
inmediato. Observa ambos al microscopio con 10X y 40X y reporta tus observaciones.
Podrás observar algunas de las estructuras mostradas en la parte inferior dependiendo de la muestra
utilizada. No olvides al pie de tu esquema indicar el aumento microscópico utilizado, nombre del
microorganismo utilizando el esquema binomial Género especie, tipo de tinción; ya que estos datos
son necesarios para validar tus resultados.
Figura 8. Ascosporas y ascas. (1) Figura 9. Conidias asexuales del hongo Figura 10. Levaduras Candida
Penicillium en cadenas al final de los albicans.(1)
conidióforos.(1)
Figura 12. Esporangios con esporas del
hongo Mucor sp. (5).
Figura 11. Zigosporas en Mucor.(1)
Figuras 8 - 12. Estructuras microscópicas de levaduras y hongos filamentosos.
En esta ocasión hemos terminado, te invito a contestar el cuestionario y realizar la actividad que
corresponden a esta sesión; y te espero en la próxima clase para que conozcas algo más sobre los
microorganismos que tuviste oportunidad de identificar en esta práctica.
BIBLIOGRAFIA
1. Alexander S. K. & Strete D. (2001). Microbiology: a photographic atlas for the laboratory. United
States of America: Benjamin Cummings
2. Benson H. (2002). Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology.
Boston Mass: McGraw-Hill.
3. Harley J. P. (2005). Laboratory exercices in Microbiology. New York: McGraw Hill.
4. Reyna L. G. (2008). Manual de Prácticas. Laboratorio de Bacteriología y Micología Generales.
México: Universidad de Guanajuato
5. [Link]