ANTOLOGÍA

ANÁLISIS FÍSICO, QUÍMICO Y MICROBIOLÓGICOS

NORBERTO ARRIAGA SANTANA

3-AM ALIMENTOS

MTRA. MARÍA MIRNA PIMENTEL CANIZAL

H. Zitácuaro Michoacán a 27 de enero del 2021

 ÍNDICE

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………….4

Capitulo I. ANÁLISIS FISICO, QUÍMICO Y MICROBIOLÓGICO

1.1 Generalidades a introducción del tema……………………………………….5
1.1.1 Muestra..…...………………………………………………………………………6
1.1.2 Unidad de muestra..……………………………………………………………...6
1.1.3 Lote..………………………………………………………………………………..6

l.2 TOMA DE MUESTRA, EQUIPO Y MATERIAL…………..…..……….…………7

1.2.1 Análisis de muestreo…..…………………………………………………………7
1.2.2 Tipos de muestreo……………...…………………………………………………7

l.3 PARÁMETROS DE DECISIÓN……...…..…………………………………………..8

Capitulo 2. PRUEBAS DE PLATAFORMA

2.1. Definición…...………………………………………………………………………..9
2.2. Tipos de pruebas de plataforma……...………………………………………..10

Capitulo 3. ANÁLISIS MICROBIOLOGICO

3.1. ¿Qué es la microbiología?...…………….……………………………………..15
3.2. Importancia de los análisis microbiológicos……….……………………...16
3.3 Preparación de material………………………………………………………….16

3.4. Medios de cultivo………………………………………………………………….16

3.4.1 Definición ………………………………………………………………………..16
3.4.2. Tipos de medios de cultivo ..…...…………………………………………….18
3.4.3. Procedimiento…………………………………………………………………21

2
3.5 SIEMBRA E INCUBACIÓN
3.5.1. Definición de siembra…………………...……………………………………..21
3.5.2 Tipos de siembra………………………………………………………………..22
3.5.3. Características de una siembra………………………………………………27

3.6 Incubación…………………………………………………………………………..28
3.6.1. Proceso de incubación……………………………………………………..…29

3.7 FROTIS Y TINCIÓN…………………………………………………………………30

BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………....34

3
 INTRODUCCIÓN

La siguiente antologia nos presenta ua nueva investigación del tema ANANLISI

FISICO, QUIMICO Y MICROBIOLOGICO. En ella encontraras lo fundamental de
algunos de los conocimientos basicos para la carrera de Producción industrial de
Alimentos (PIA). Su finalidad es poder conocer a fondo los tres tipos de análisis.

En el capitulo 1. Se enmarca una pequeña introducción de los tipos de análisis y

sus generalidades, como, muestra, tipo de muestra, unidad de muestra, lote, la
toma de muestra, equipo y material y su procedimiento, pero no dejando fuera los
parámetros de decisión.

El capitulo 2. Nos habla y se enfoca a la definición y todos los tipos de pruebas de

plataforma que podemos llevar a cabo en un análisis.

El capitulo 3. Da a conocer todo lo relacionado con los análisis microbilogicos,

como es : la definición de la microbiologia, su importancia y como debe de
prepararse; así como son los medios de cultivo, siembra e incubacion. Finalizando
con la información de como se lleva a cabo un frotis y tensión.

Es importante mencionar que dicha investigación será un instrumento de gran

ayuda para toda aquella persona que requiera llevar a acabo algún tipo de
análisis de los cuales estamos abordando.

4
 Capitulo I. ANÁLISIS FISICO, QUÍMICO Y MICROBIOLÓGICO

Análisis Físico
Se trata de un método cuyo objetivo es estudiar las relaciones entre propiedades
físicas y composición del sistema para establecer interacciones entre los
componentes químicos.

El análisis físico químico se encarga de medir diversas propiedades como

temperaturas, conductividad, densidad, viscosidad o dureza con el objetivo de
garantizar la calidad alimentaria de tus productos.

Análisis Químico
Un análisis químico es el conjunto de técnicas y procedimientos empleados en
muchos campos de la ciencia para identificar y cuantificar la composición química
de una sustancia mediante diferentes métodos. En el sector alimentario el análisis
químico se usa para determinar si un alimento tiene la cantidad correcta de grasa
bruta, hidratos de carbono, almidón, ácidos grasos o colorantes … entre otras.

Análisis Microbiológico
Consisten en una inspección de alimentos o sustancias por medio de pruebas que
permiten detectar si se presentan o no elementos patógenos. De acuerdo con la
cantidad de agentes patógenos encontrados y el grado de contaminación que
tengan los alimentos o sustancias analizadas, se puede determinar si es apto o no
para su posterior procesamiento y consumo en humanos o animales.

5
1.1.1. Muestra
Es la parte representativa de un todo es decir de un lote.

1.1.2 Unidad de muestra

Es la cantidad de muestra que se va a analizar esto depende del tipo de análisis y

del método que se utilizara.

1.1.3. Lote

Es un producto elaborado en el mismo espacio y tiempo.

1.2. Toma de muestras

6
Equipo y material
- Caja de Petri o tubo de ensayo con agar
- Mechero
- Aza bacteriológica
- Guantes estériles
- Batas y campos estériles
-Gasas estériles

1.2.1 Procedimiento

Se lleva la muestra a la temperatura del Laboratorio (20 – 25 °C) y se

homogeneiza invirtiendo repetidamente (20 - 25 veces) el recipiente o trasvasando
(sin agitación fuerte para evitar la formación de espuma), a los efectos de distribuir
bien la grasa, especialmente si no se trata de leche homogeneizada.

A veces es necesario elevar la temperatura a 35 - 40°C, para homogeneizar el

producto y luego enfriar a la temperatura indicada precedentemente (esto no debe
hacerse cuando se requieran análisis microbiológicos). El análisis debe efectuarse
de inmediato; en caso contrario se debe mantener la muestra en el refrigerador a
una temperatura inferior a 10°C o se le debe agregar algún conservante que no
cause modificaciones en los datos analíticos.

1.2.2. Tipos de muestreo

Muestra de tanque de leche.

La  toma  de  muestras debe realizarse siempre por la parte superior del tanque,
de forma aséptica y en un recipiente estéril, previa agitación de la leche de entre 5
a 10 minutos, si el ordeño lleva más de una hora finalizado. La cantidad de la
muestra mínima debe ser de unos 50 ml  pero depende de la analítica solicitada.

7
Muestra de leche individuales de vacas.
Es la toma de una muestra de leche de una vaca concreta. Se utiliza con finalidad
diagnóstica sobre la sanidad de la ubre, procesos de falta de estabilidad en la
leche del tanque, inhibidores en la leche del tanque, etc. Es el tipo de muestreo
más utilizado como herramienta de muestrear la producción de la vaca, a lo que
denominaremos muestra compuesta, o bien tomar la muestra de leche de un solo
cuarterón.

En este tipo de muestreo es aún más importante la forma de tomar la muestra.

Debe ser totalmente aséptica, desinfectando previamente la punta del pezón con
alcohol al 70 % con una gasa o torunda estéril. Hay que utilizar recipientes
estériles y de fácil manejo.

1.3. Parámetros de decisión

Para que el muestreo sea más preciso existen los programas de muestreo que
son 2: De 2 clases y de 3 clases. En el programa de muestreo hay parámetros
(reglas) de decisión y son 4:

n= Número de muestras.
c= Número máximo permitido de errores que se pueden encontrar en las muestras
analizadas.
m= Programa de 2 clases (si es aceptable o rechazable).
M= Programa de 3 clases (provisionalmente aceptable o provisionalmente
rechazable).

8
Valor de referencia m = 10S:
Análisis de 10 muestras
8 muestras con carga c < 10s... ACEPTABLE
2 muestras con carga 10S < c < 10S+1...RECHAZABLE

Capítulo 2. PRUEBAS DE PLATAFORMA

Las pruebas de plataforma específicamente en lácteos sirven como criterio en la

determinación de la calidad de la leche y el resultado se traduce en una leche apta
para el procesamiento y si será aceptable o rechazable según lo que los catadores
consideren.

El principal objetivo de dichas pruebas es ver si la leche es apta para su consumo

es decir que no tenga ninguna bacteria patógena que dañe el funcionamiento del
cuerpo del consumidor, otro objetivo de estas pruebas en ver los componentes
físicos y químicos que contiene la leche.
2.2. TIPOS DE PRUEBAS

9
2.2.1 Acidez
La acidez es probablemente uno de los parámetros más importantes, el cual
controla la calidad en el proceso de la leche. La leche actúa como un buffer, que
es un sistema químico que resiste los cambios de concentración de los iones
hidrógeno bajo condiciones internas y externas. La capacidad buffering de la
leche, es solamente afectada por los iones de calcio y magnesio que se precipita
como un fosfato coloidal cuando el pH es elevado y es solubilizado a un pH bajo.

Uno de los análisis más comunes de la leche fresca y de los productos

fermentados es la acidez titulable, la cual mide la cantidad de álcali necesario para
elevar el pH hasta 8.4 (empleando fenolftaleína como indicador) el resultado se
expresa normalmente como cantidad equivalente a ácido láctico.

2.2.2. Determinación de pH
El pH es una forma de designar la concentración real de iones H+ y, por tanto,
también la de iones OH. En general, la leche tiene una reacción iónica cercana a
la neutralidad. La leche de vaca tiene una reacción débilmente ácida, con un pH
comprendido entre 6.5 y 6.6 como consecuencia de la presencia de caseína y de
los aniones fosfóricos y cítricos, principalmente. El pH no es un valor constante,
sino que puede variar en el curso del ciclo de la lactación y bajo la influencia de la
alimentación.

No hay que olvidar que la escala de pH es logarítmica, es decir que un valor de pH

7 es 10 veces superior a otro pH de 6. La diferencia que existe entre el pH y la
escala Dornic es que el pH nos indica la acidez real que existe en ese momento,
en el caso de la leche, sería la cantidad de ácido láctico que se ha producido a
partir de la lactosa; mientras que la acidez Dornic es potencial; nos indica la

10
cantidad de ácido láctico que se puede producir a partir de la lactosa. Cuando toda
la lactosa se ha transformado en ácido láctico, el pH y la acidez Dornic coinciden.

2.2.3 Prueba de fermentación láctea

La prueba de fermentación, tiene suma importancia en queserías, proporciona
datos muy eficientes, sobre la calidad o tipo de infección predominante en la leche,
sin necesidad de exámenes microscópicos, revelándonos también el grado de
contaminación y conservación, desde la ordeña hasta la fábrica; además de
informar sobre las condiciones sanitarias. Sobre esta práctica se ha de considerar
la abundante producción gaseosa, escasa coagulación, descomposición pútrida y
demás alteraciones de la leche.

2.2.4. Prueba de fermentación por cuajo

El cuajo es una enzima proteolítica secretada por él estómago de los rumiantes
jóvenes, bajo una forma inactiva el ”procuajo” que se transforma en cuajo por un
fenómeno auto catalítico de activación; acelerado por los iones H+ , como es el
caso del pepsinógeno. El cuajo se segrega en el cuarto compartimiento del
estómago de los rumiantes es abomaso o cuajal. El cuajo es muy sensible a las
variaciones del pH, no llega a coagular la leche ligeramente alcalina (en un pH 7.4)
y se inactiva a un pH de 8.

2.2.5 Espesantes de la leche

La leche contiene 12.5% aproximadamente de sólidos totales y un 87.5% de agua.
La alteración de este líquido se da frecuentemente por diferentes compuestos y
sustancias, con el objeto de aumentar esta cantidad de extracto seco.

2.2.6. Prueba de coagulación

11
El punto de coagulación se refiere a cuando la leche esta coagulada, es decir, se
forma el gel. La coagulación parece que surge bruscamente, las medidas físicas
demuestran que el fenómeno es progresivo. Las curvas en función del tiempo
transcurrido después de la adición del cuajo, trazados con los valores de
viscosidad, difusión de la luz y turbidez en capa muy fina, no muestran una
modificación brusca que pueda corresponder a un cambio de estado. Estas curvas
se presentan, tras la adición del cuajo, una parte aproximadamente horizontal que
corresponde a la reacción primaria.

2.2.7. Prueba de alcohol

Esta prueba es una de las más fáciles, empleadas para determinar diversas
alteraciones en la leche y obtener una rápida orientación de su estabilidad frente a
los tratamientos térmicos. El principio de dicha determinación está basado en la
reacción de la mezcla de alcohol etílico con la leche, provocando la deshidratación
de ciertos coloides hidrófilos desnaturalizándolos y un estado de desequilibrio
entre sus dos fases discontinuas (emulsión grasa y suspensión coloidal) flocular.
Este cambio sólo se produce cuando la mezcla final alcanza un cierto contenido
de alcohol, abajo del cual, la leche térmicamente estable no floculará.

2.2.8. Prueba de ebullición

Una de las pruebas más sencillas y que requiere solamente del material
indispensable en el laboratorio, es la prueba de ebullición, que nos permite, en un
mínimo de tiempo, observar la estabilidad de la leche.

2.2.9 Determinación del aguado por el peso especifico

La densidad de la leche, es el peso de una unidad de volumen a una temperatura
determinada. La gravedad específica es la densidad de una sustancia, dividida por
la densidad del agua a la misma temperatura, la cual es esencialmente 1000 a
4°C. La gravedad específica es determinada por los grandes componentes de la

12
leche: agua, sólidos no grasos y cantidad de grasa, como también por el estado
físico de sus constituyentes y el grado de cristalización de la grasa o hidratación
de las proteínas.

2.2.10. Prueba de bicarbonato

Los conservadores son sustancias antisépticas que, en cantidades pequeñas,
generalmente sin pesar, se emplean para alargar el período de conservación de la
leche. Su empleo cada vez mayor, sobre todo en tiempo de calor, constituye un
gran peligro para la salud pública.
El bicarbonato es el fraude de mayor frecuencia y empleo, no sólo por ser el más
conocido de los conservadores, sino porque su precio y posibilidad de adquisición,
lo ponen al alcance de todos. Es además el producto que más afecta a la
composición de la leche, desintegrando sus proteínas, saponificando las grasas,
modificando los fosfatos de calcio y magnesio y favoreciendo el desarrollo de toda
clase de gérmenes.

El bicarbonato de sodio neutraliza la acidez de la leche, pero facilita el desarrollo

de las bacterias que por causa de la acidez habían, eventualmente interrumpido
su crecimiento; con lo cual no se hace más que entrar en un círculo vicioso, siendo
preciso volver a neutralizar pronto, sobre todo si el vendedor guarda la leche para
otro día.

2.2.11. Prueba del agua oxigenada

Otra forma especial de conservar la leche es mediante el agua oxigenada. Este
método se denomina de peroxi-catalasa, por conocerse el agua oxigenada
también con el nombre de peróxido de hidrógeno y ser la catalasa la que
descompone el agua oxigenada en el agua y oxígeno, privándole de la leche.

13
2.2.12. Determinación de carbonatos en leche natural
Los carbonatos presentes en la ceniza de la leche se hacen reaccionar con
H2SO4, se elimina el gas carbónico por ebullición y los resultados se expresan en
gramos de carbonato sódico por litro de leche.

2.2.13. Prueba bioquímica

La reductasa es una enzima que nos sirve para calcular el contenido total de
bacterias en la leche. El poder reductor aumenta con la incubación de la leche a
37°C. Los microbios de la leche son capaces de reducir ciertas materias
colorantes. El tiempo de reducción es tanto función de la calidad como de la
cantidad de las bacterias. En lugar de contar directamente las bacterias, se
establece una correlación entre el tiempo que se necesita para reducir el colorante
de azul de metileno en la leche, a una forma incolora. Este método es muy eficaz
para un gran número de muestras en un tiempo relativamente corto.

2.2.14. Prueba de california

La prueba de California de mastitis conocida como California Mastitis Test (CMT)

es, de acuerdo con Mellenberg (2001), un examen sencillo que con exactitud
predice el conteo de células somáticas ya sea, a partir de cada cuarto o en
muestras de leche. La exactitud del CMT se fundamenta en tres principios:

1. El número de leucocitos (células blancas) incrementa enormemente en número

cuando una lesión o una infección afectan el tejido mamario.

2. Los leucocitos, especialmente los polimorfonucleares tienen un núcleo extenso

con material nuclear (ADN) comparadas con otras células o bacterias de la leche.

3. Las paredes de los leucocitos son principalmente lípidos (grasa).

Capítulo 3. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

14
Los análisis microbiológicos consisten es una inspección de alimentos o
sustancias por medio de pruebas que permiten detectar si se presentan o
no elementos patógenos. De acuerdo con la cantidad de agentes patógenos
encontrados y el grado de contaminación que tengan los alimentos o sustancias
analizadas, se puede determinar si es apto o no para su posterior procesamiento y
consumo en humanos o animales.

En ALKEMI S.A. realizamos análisis microbiológicos de los productos o alimentos

de su empresa por medio de nuestros servicios de laboratorio, que nos permiten
ofrecerle resultados confiables. Este tipo de análisis forma parte de una de las
ramas de la ciencia conocida como bromatología, que está compuesta por
el análisis toxicológico y el análisis químico.

Para garantizar la detección de bacterias y microorganismos potencialmente

peligrosos, los análisis que efectuamos en nuestra empresa están dirigidos a un
estricto control microbiológico, que previene la manufactura de productos baja
calidad microbiológica y le señala a las industrias cuáles son los factores
contaminantes o de multiplicación de microbios.

3.1 Microbiología

La microbiología es la ciencia encargada del estudio y análisis de

los microorganismos, seres vivos diminutos no visibles al ojo humano
(del griego «μικρος» mikros “pequeño”, «βιος» bios, “vida” y «-λογία» -logía,
tratado, estudio, ciencia), también conocidos como microbios.2 Se dedica a
estudiar los organismos que son sólo visibles a través del microscopio:
organismos procariotas y eucariotas simples. 
Son considerados microbios todos aquellos seres vivos microscópicos, estos
pueden estar constituidos por una sola célula (unicelulares), así como pequeños
agregados celulares formados por células equivalentes (sin diferenciación celular);

15
estos pueden ser eucariotas (células que poseen envoltura nuclear) tales como
hongos y protistas; y procariotas (células sin envoltura nuclear) como
las bacterias. Sin embargo la microbiología tradicional se ha ocupado
especialmente de los microorganismos patógenos entre bacterias, virus y hongos,
dejando a otros microorganismos en manos de la parasitología y otras categorías
de la biología.

3.2. Importancia de hacer análisis microbiológicos

Los análisis microbiológicos ayudan a asegurar la calidad e inocuidad desde la

producción, de alimentos, hasta la entrega. De aquí surge la importancia
de mantener la precisión y evidencia rigurosa sobre los resultados microbiológicos,
para de esta forma cubrir las exigencias y análisis de riesgos. Además de  proteger
la salud y la vida de los consumidores.

3.3. Preparación de material

Primeramente se debe esterilizar en una olla exprés, una vez esterilizada se saca
y se ponen en una manta limpia y seca, a su vez colocarla en una mesa para que
se seque el papel ya que si esta húmedo contamina el material y este se deja
reposar hasta que este completamente seco, ya que este listo tomo mi vaso de
precipitado, matraz Erlenmeyer donde vaya a pesar se coloca en la balanza, se
saca la tara del vaso, veo cuanto pesa el vaso y se agrega el medio de cultivo.

3.4 Medios de cultivo

3.4.1. ¿Qué es un medio de cultivo?

Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en los que crece y se

multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar diferentes
especies bacterianas, con el fin de identificarlas y realizar estudios
complementarios.

16
Características

Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un

medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van,
desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto
de caldo de carne.

Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por

muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las
células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos
reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia
macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la
original.

Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como

cultivo puro de un solo tipo de bacteria. La principal diferencia entre un medio de
cultivo sólido y uno líquido es que el medio de cultivo sólido contiene un 1,5–2%
de agar-agar, mientras que el medio líquido no contiene agar-agar.

Un medio de cultivo debe contener lo siguiente:

 Disponibilidad de nutrientes
 Consistencia adecuada del medio.
 Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases.
 Condiciones adecuadas de humedad (mantener en frigorífico).
 Luz ambiental.

17
 pH adecuado.
 Temperatura.
 Esterilidad.

3.4.2Tipos de medio de cultivo

Pueden clasificarse según su:

- Consistencia
- Origen
- Composición
- Utilización

Según su utilización y su composición los medios de cultivo se pueden clasificar

en:

Medios Simples
Poseen los requisitos nutricionales para permitir el desarrollo bacteriano general,
ejemplos: agar nutritivo, caldo nutritivo, entre otros.

Medios enriquecidos

18
Son medios simples o comunes, a los que se le añaden ciertos elementos como
sangre, suero, líquido ascítico, huevo, glucosa, vitaminas, etc. lo que permite el
aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibidores
del crecimiento en bacterias exigentes nutricionalmente, entre algunos ejemplos:
agar sangre, medio de Löwenstein-Jensen, enriquecido con huevo para facilitar el
crecimiento de Mycobacterium; agar desoxicolato-lactosa (DLA), enriquecido con
lactosa y desoxicolato.

Medios selectivos
Se consiguen añadiendo al agar nutritivo compuestos químicos nocivos para
algunas bacterias cuyo crecimiento no es de interés o también mediante una
alteración de las condiciones físicas del medio, entre algunos ejemplos tenemos:

-El agar Mac Conkey que contiene cristal violeta.

-Thayer-Martin medio selectivo para Neissar, ya que este posee antibióticos como
la vancomicina colistina y nistatina.

-Caldo lactosado bilis verde brillante en donde la bilis inhibe el crecimiento de

bacterias gran positivas.

-Löwenstein-Jensen con verde de malaquita es selectivo para Mycobacterium.

19
Medios diferenciales
A estos medios se le adiciona sustancias para que solo crezcan ciertas bacterias y
estas, al actuar sobre alguna de las sustancias adicionadas, permiten observar
macroscópicamente ciertas propiedades de crecimiento que ayudan a diferenciar
sus colonas de otras especies diferentes, entre algunos ejemplos encontramos:

-Agar eosina azul de metileno (EMB), diferencia E. coli (color verde metálico
brillante) de colonias de Enterobacter aerogenes (color rosado, consistencia
mucosa y crecimiento abundante).
-Agar sangre, diferencia variedades de Streptococcus pyogenes en Streptococcus
betahemolíticos de Streptococcus alfa hemolítico y gama hemolítica.

-Agar Salmonella-Shigella tiene lactosa y un indicador de pH que permite

diferenciar las colonias de bacterias fermentadoras de este disacárido.

20
Medios de enriquecimiento
Son medios líquidos que favorecen o permiten la multiplicación de las bacterias
cuando la muestra obtenida es muy pobre, por ejemplo:

-Caldo tioglicolate, favorece el crecimiento de las bacterias anaeróbicas.

-Caldo tetrationato favorece crecimiento de bacterias microaerófilas.
-Los caldos bilis y de Muller-Kauffman, favorecen el crecimiento del género
Salmonella.
-Caldo o agua peptonada se utiliza para el crecimenot de Vibrio Cholerade.

3.4.3. Procedimiento

- Pesar todos los productos, excepto el agar, y disolverlos en parte del agua en un
vaso de precipitados (pesar el extracto de carne sobre un vidrio de reloj)

- Medir el pH y ajustarlo con NaOH y HCl a 7,2

- Añadir el agar y el resto del agua hasta 500 ml

- Calentar al baño maría hasta que el agar esté fundido.(EI medio adquiere un
aspecto transparente)

- Antes de que se enfríe el medio (y por tanto solidifique) repartir parte de él en

tubos de ensayo, el resto ponerlo en un matraz de 500 mI.

- Limpiar bien la boca de los tubos y del matraz y tapar con algodón.

3.5. Siembra e incubación

3.5.1. Siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo)
en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Para sembrar en

21
microbiología es necesario mantener la habitación sin corrientes de aire y estar al
lado de la llama de un mechero (no más de 15 cm. de distancia). También se
puede trabajar bajo campana, o en flujo laminar, previa esterilización con luz UV.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

Que se efectúen asépticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando ansa,
hilo, o bien hisopo o pipeta estéril. Se debe esterilizar en la llama (hasta que todo
el filamento se haya puesto al rojo vivo) el ansa o el hilo y enfriar, antes y después
de realizada la siembra.

Para transferir los microorganismos, se recomienda:

a) Medio líquido a medio líquido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo.
b) Medio líquido a medio sólido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo, e
hisopo. c) Medio sólido a medio sólido: utilizar ansa o hilo.
d) Medio sólido a medio líquido: ansa o hilo. Luego de sembrado, el medio de
cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

3.5.2. Tipos de siembra

Existen diferentes tipos de siembra:

Tipos de siembra en Placa.
Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el
mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza
para microorganismos aerobios.

22
 
Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una
vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para
cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este método se utiliza para
microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.
 
Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo
fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de
una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción  total por el
medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos
aerobios estrictos.
 
Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y
se deja solidificar.
 
Siembra volumétrica: Este método de siembra consiste en sembrar una muestra
liquida cuyo volumen no puede ser predeterminado, en medio de cultivo sólidos o
líquidos. Por ejemplo: En las muestras de exudado vaginal tomadas con pipetas
de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que este tipo de pipeta carece
de escala de graduación, sin embargo, la orina empleadas en el urocultivo o la
sangre para el hemocultivo se puede determinar con pipeta o jeringuilla
respectivamente el volumen que será sembrado.
 
Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar
la espátula de Driglaski. En este caso la gota de muestra liquida se esparce con la
espátula por toda la superficie del medio de cultivo sólido imprimiéndo un
movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar con un
hisopo grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento
sobre toda la superficie de una placa de agar.

23
Técnicas de cultivo en placa:
 
Técnica de siembra por estría en placa
 Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello,
con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a
continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en
una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas).
Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van
depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación,
se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y
se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar
aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A
continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las
células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado
de una sola célula, no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron
depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para
asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el
procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las
colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda seguridad,
cultivos axénicos.
 
 

 
 

24
 
Técnica de extensión en placa:
Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de
agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La
suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la
superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las
colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que
las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar
solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos
hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan
la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el
método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una
cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos
 
 

 
 
Tipos de siembra (Tubo)
 
Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo
simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el  tubo con el uso del asa
cargada con el  material bacteriológico, se agita, con movimientos moderados.
 
Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material  en la superficie de el
agar inclinado en un tubo de ensayo,  allí se extiende por toda la superficie con el
asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada con el material a sembrar,

25
haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la
parte más profunda de la superficie inclinada  y se termina la estría en la parte
más cerca de la boca del tubo.
 
Siembra por punción: Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la
aguja de platino y el medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo.
Las manipulaciones y la observancia de las precauciones de asepsia, son
similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método, es
que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de
cultivo.
 
 
Técnicas de siembra (tubo)
 
Siembra por inoculación o agitación:
Con un asa bacteriológica, esterilizada, se toma cantidad de inoculo, se intorduce
en el centro del medio liquido, agitándose, no tocando la pared del tubo.
 
 

 
 
 
Siembra por estría ( en tubos de agar inclinado):
Muestra de material en asa de siembra, deslizar en zigzag, empezar por superficie
mas profunda.
 

26
 
Siembra por picadura: Asa recta, tomar la muestra, sembrar en agar semisólido,
en el tubo de ensayo hasta que la muestra quede bien impregnada al agar.
 
Siembra por vertido en placa: Diluciones en varios tubos, pipeta 1cc de muestra o
dilución, agregar tubo de ensayo estéril, se agrega medio licuado, mantener a
55°C, movimientos rotatorios, solidificar.
 
 

3.5.3. Características de una siembra

Las colonias pueden ser muy pequeñas, moderadas o grandes y su aspecto

puede ser seco o mucoide, brillante u opaca. Según la textura puede variar entre
lisa y rugosa y, según la forma, pueden ser circulares, planas, convexas. Según el
color pueden ser: incoloras, blancas, amarillas, rosadas, fucsias, rojas, naranja,

27
beige, grisáceas, verdosas, marrón, negra o con brillo metálico, dependiendo de la
bacteria involucrada y del medio de cultivo utilizado.

Los bordes de las colonias pueden ser regulares o irregulares. Otras, en cambio,
pueden presentar una película uniforme que se distribuye en casi la totalidad del
medio denominada “swarming”. Esto es característico de Proteus sp. Algunos
cultivos bacterianos emiten olores que son bastante característicos de la especie
involucrada. Por ejemplo, un cultivo de Pseudomonas aeruginosa tiene un
característico olor a frutas, mientras que el género Proteus presenta un olor
característicamente putrefacto.

3.6. Incubación

En microbiología una incubadora es un dispositivo para controlar la temperatura, la

humedad y otras condiciones en las que se está cultivando un cultivo
microbiológico. Las incubadoras simples son cajas aisladas con un calentador
ajustable, que van normalmente hasta 65°C. Algunas incubadoras pueden ir un
poco más alto, pero en general no más de 100°C. Incubadoras más avanzadas
pueden tener la capacidad para bajar la temperatura (a través de refrigeración),
y/o la capacidad de controlar los niveles de humedad o de CO2. Esta
característica está diseñada específicamente para el crecimiento celular.

La mayoría de las incubadoras proporcionan puertas de vidrio interior y exterior

para transparencia. El controlador principal incluye un temporizador. Algunos
también pueden ser programados para desplazarse en diferentes temperaturas,
niveles de humedad, etc. Las Incubadoras pueden variar en tamaño desde
unidades de tableros de mesa a unidades del tamaño de habitaciones pequeñas.

28
Las Incubadoras también pueden proporcionar características especiales, tales
como la regulación de la velocidad de batido

En cuanto a la temperatura, 37°C es una temperatura de uso común en

incubadoras siendo la temperatura normal del cuerpo humano. La mayoría de las
bacterias, especialmente el frecuentemente utilizado E. Coli, crecen bien en tales
condiciones. Para otras aplicaciones se requieren temperaturas más bajas (para
células de peces una temperatura de crecimiento de 25°C es óptima).

3.6.1 Procesos de incubación

La mayoría de las unidades de incubadora estándar están diseñados con la toma

de aire exterior a través de un filtro seguido de calor y la distribución uniforme del
aire en toda la cámara. Esto asegura impacto incluso en las muestras colocadas
en (normalmente) bandejas perforadas en cualquier lugar en el volumen de la
cámara. El aire de escape se descarga al exterior a través de un puerto en la parte
superior de la unidad. El único parámetro de interés es la temperatura y el rango
de temperatura es típicamente 25 a + 70°C. Las muestras se colocan a menudo
en recipientes cerrados, así que no hay posibilidades de contaminación cruzada.

Las Incubadoras biológicas son más complejas en el diseño, ya que no sólo la

temperatura sino también la humedad y CO2 son monitoreados y controlados. El
aire también se introduce desde el exterior, pero ahora a través de un filtro estéril y
se mezcla con un suministro estéril de CO2. Para aumentar los niveles de
humedad por encima de ambiente normal, un depósito de agua está equipado en
la parte inferior y para asegurar la homogeneidad en toda la cámara normalmente
un ventilador está empujando el aire alrededor del flujo laminar.

29
Las incubadoras biológicas se utilizan principalmente para la estabilización de las
bacterias y las células en recipientes abiertos (platos de Petri). La interacción de
CO2 con los medios de suspensión ajusta el nivel de PH para un crecimiento
óptimo. Los altos niveles de humedad, entre alrededor de 95-98% de humedad
relativa, impiden a las muestras que se concentren o resequen durante la
incubación, que puede durar varios días o incluso semanas completas. Por lo
general los parámetros controlados en incubadoras biológicas son:

Temperatura + 25 ° C a + 60°C (+/- 2°C)

Humedad 95-98% (+/- 2%)
Nivel de CO2 3-7% (+/- 0,3%)

3.7. Frotis y Tinción

Preparación de un frotis bacteriano

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una
muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya
que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen
clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos
para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación
al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos
lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden
inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

Realización del frotis

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es

necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de

30
 siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una
mínima gota de agua, que resulta suficiente.

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña

cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua.
Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión
homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar
los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la
suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre
el portaobjetos.

3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando

el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución
de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o
romperse.

Fijación de las bacterias al portaobjetos

4. Por calor: Pasar cinco veces el portaobjetos por la llama durante unos
segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases.

Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser
observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar
con el proceso de tinción.

Tinción del frotis bacteriano

5. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que
indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos.
En ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure

31
 su actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama
del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de
que no llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células.

6. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se

realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte
superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido
directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la
máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con
cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo.

7. Secar el porta: en ningún caso se debe frotar el porta.

8. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si

se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de
inmersión.

Montaje definitivo de la preparación

La técnica siguiente es de aplicación para cualquier preparación microscópica que

se desee montar de forma definitiva. Se anotará en un extremo del portaobjetos el
contenido de la preparación, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno.

9. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones

manteniéndolos un mínimo de 5 minutos en cada baño. La serie de alcoholes
puede modificarse en función de la disponibilidad de los reactivos, pero el
objetivo es que la preparación quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el
reactivo antes de introducirlo en el siguiente baño.

a Alcohol de 70º

32
 b Alcohol de 95º

c Acetona pura

d Acetona-xilol (1:1)

e Xilol

10. Montar la preparación. Emplear bálsamo de Canadá, euparal o algún medio de

montaje sintético. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm.

33
BIBLIOGRAFIA…

Livia M. Negri. (2005). El ph Y LA ACIDEZ DE LA LECHE. 26/01/21, de INTA Sitio

web: [Link]

Ellab. (2008). Incubación Validation. 26/01/21, de Ellab Sitio web:

[Link]

Emmanuel Hernández Gonzáles. (07/17/19). Medios de cultivo. 27/01/21, de

EduLabC Sitio web: [Link]

Equipos y Laboratorio de Colombia. (2020). TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL

CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE BATERIAS.
27/01/21, de Equipo y Laboratorio de Colombia Sitio web:
[Link]
para-el-cultivo-de-microorganismos:-siembra-y-estudio-de-bacterias

Maria Mirna Pimentel Canizal. (2020). MANUAL DE ANÁLISIS FISICOQUÍMICO

DE LA LECHE. Cbtis 162 Zitácuaro Mich: Cbtis 162.

Daniel Tomás. (2020). PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO

BACTERIANO. 27/01/21, de IES AVASTOS, VALENCIA Sitio web:
[Link]
prep_medio_cultivo.html

Barrero L. (2016). Siembra bacteriana. 27/01/21, de StuDocu Sitio web:

[Link]
ecuador/microbiologia-i/informe/siembra-bacteriana/5342622/view

Lifeder (Ene 27, 2021) Cultivo de bacterias: tipos, características, métodos,

requerimientos. Recuperado de [Link]

34
35