UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA

INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

DATOS INFORMATIVOS:
Estudiantes: Buitrón Ángeles
Coca Andrea
Cunalata Erick
Hidalgo Kassandra Docente: PhD. Verónica Carrera
Santamaría David Ciclo Académico: Octubre – Febrero 2021
Asignatura: Análisis Instrumental Fecha de Realización: 22/01/2021
Curso: Tercero “B” Fecha de Presentación: 26/01/2021

Práctica N° 07 (Segundo-Parcial)

1. TEMA
“TÉCNICAS DE SEPARACIÓN- CROMATOGRAFÍA”

2. OBJETIVOS

Objetivo General
• Identificar los beneficios y capacidades con las que cuenta la técnica de
cromatografía en base a la resolución de ejercicios prácticos bastante comunes
dentro del laboratorio.

Objetivos Específicos

• Analizar el principio básico que tiene la cromatografía de papel mediante mezclas

homogéneas.
• Determinar el contenido de ciertas sustancias en diferentes muestras por medio de la
cromatografía, así como también sus porcentajes en las mismas.
3. RESULTADOS

Ejercicio 1
En un análisis cromatográfico de una mezcla de dos componentes, Ay B, el tiempo de
retención del componente A es de 6.39 minutos, con una anchura de base de 0.86 minutos,
mientras que el componente B eluye a los 7.57 minutos con una anchura base de 0.54
minutos. Calcular la resolución entre los picos.
Datos:
𝑡𝑅𝐴 = 6.39 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠
𝑡𝑅𝐵 = 7.57 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠
𝑤𝐴 = 0.86 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠
𝑤𝐵 = 0.54 𝑚𝑖𝑛𝑢𝑡𝑜𝑠
2∆𝑡𝑅
𝑅=
𝑤𝐵 + 𝑤𝐴
2(7.57 − 6.39 )
𝑅=
0.86 + 0.54
𝑅 = 1.69
La resolución es mayor a 1.5. Ambos picos se resuelven bien

Ejercicio 2
Para analizar los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA) en un suelo, se pesan 2.520
g de suelo seco y se extraen los HPA con 25.00 mL de disolvente adecuado. Se filtra, y se
toma 1 mL del extracto y se diluye a 10 mL en un matraz aforado. De esta dilución se
toman 𝟓𝝁𝒍 y se inyectan en el equipo de HPLC obteniéndose una señal de 0.218. Cuando
se analizan las mismas condiciones 𝟓𝝁𝑳 de un patrón de 20.00 mg/L de fluoranteno, la
señal medida es de 0.259. Indicar la concentración de HPA en el suelo, en mg de
fluoranteno/ g suelo.
Datos:
𝑚𝑠𝑢𝑒𝑙𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 = 2.520 𝑔
𝑆𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 = 0.259

𝐶𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 = 20 𝑚𝑔/𝐿

𝑆𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 = 0.218
𝑣𝑝𝑎𝑡𝑟ó𝑛 = 5𝜇𝑙

S= C∗k
 S 0.218
k= =
C 20 mg/L
k = 0.0109 L/𝑚𝑔
Usando el valor de K
S 0.259
C= =
k 0.0109 mg/L
C = 23.76 mg/L
Concentración en la muestra original
mg 1L 10 ml 25 mL
23.76 ∗ ∗ ∗
L 1000 mL 1 mL 2.510 g
mg fluoranteno
Cmg/g = 2.357
g suelo
Ejercicio 3
Se analiza el contenido de nitrosodimetilamina en una muestra de cerveza por
cromatografía. Para ello se toma 50 ml de la misma y se agrega como patrón interno 0,19
ug de nitrosodipropioamina. Las áreas de los picos en la cromatografía para la muestra
son 16210 y 14600 para el nitrosodimetilamina y el nitrosodipropioamina,
respectivamente. Calcule el porcentaje de nitrosodimetilamina en la muestra.
Datos
Nitrosodimetilamina = 1
Nitrosodipropioamina = 2
V1= 50 Ml
m2=0,19 ug
a1= 16210
a2= 14600
Figura 1.- Recta de regresión de la muestra de cerveza
 Recta de regresión muestra de cerveza
16000
14000
picos de cromatografía
12000
y = 76842x - 3E-12
10000
R² = 1
8000
6000
4000
2000
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2
-2000
patrón interno

𝑦 = 76842𝑥 − 3𝑥10−12
16210 = 76842𝑥 − 3𝑥10−12
16210
𝑥=
76842
𝑥 = 0,21 𝑢𝑔
m = 0.4 ug
0.21 𝑢𝑔
%𝑚 = 𝑥100
0.4 𝑢𝑔
%𝑚 = 52,5 %

Ejercicio 4
𝑡𝑅 = 6,55 𝑚𝑖𝑛
𝑡𝑀 = 0,42 𝑚𝑖𝑛
𝑡𝑅
𝐾´ =
𝑡𝑀
6,55 𝑚𝑖𝑛𝑠
𝐾´ =
0,42 𝑚𝑖𝑛𝑠
𝐾 ´ = 15,59

Ejercicio 5
En el mismo análisis que el planteado en el ejercicio propuesto anterior, el tiempo de
retención del ácido Z es de 4,70 min, ¿Cuál es el factor de selectividad para los ácidos X
y Z?
 DATOS
(tR)B= Tiempo de retención ácido X.
tR= 6,55 min
(tR)A= Tiempo de retención ácido Z.
tR= 4,70 min
tM= Tiempo muerto.
tM = 0,42 min
CÁLCULO FACTOR DE SELECTIVIDAD
𝐾𝐵
𝛼= >1
𝐾𝐴
(𝑡𝑅 )𝐵 − 𝑡𝑀
𝛼=
(𝑡𝑅 )𝐴 − 𝑡𝑀
6,55 − 0,42
𝛼=
4,70 − 0,42
𝜶 = 𝟏, 𝟒𝟑 𝒎𝒊𝒏

Ejercicio 6
Calcula la resolución para el metilciclohexano y el metilcilohexeno, si tras eluirlos en un
cromatógrafo de gases se obtienen los siguientes datos:
- Tiempo muerto: 1,8 min
- Metilciclohexano: Tiempo de retención: 9,7 min
Ancho de pico: 0,74 min
- Meticiclohexeno: Tiempo de retención: 10,5 min
Ancho de pico: 0,80 min
DATOS
tRA= 9,7 min
WA= 0,74 min
tRB= 10,5 min
WB= 0,80 min
CÁLCULO
2(𝑡𝑅𝐴 − 𝑡𝑅𝐵 )
𝑅=
𝑊𝐵 + 𝑊𝐴
 2(10,5 − 9,7)𝑚𝑖𝑛
𝑅=
(0,80 + 0,74)𝑚𝑖𝑛
1,6
𝑅=
1,54
𝑹 = 𝟏, 𝟎𝟒

Ejercicio 7
Calcule el porcentaje de cada uno de los esteroides en la mezcla:
Tabla 1. Datos de los compuestos con su área relativa de pico y su factor de respuesta

Compuesto Área Relativa de Pico Factor de Respuesta del

Reactor
Estradiol 27,4 0,72
Testosterona 58,6 0,74
Estriol 32,3 0,78

Cálculo del porcentaje de cada uno de los esteroides en la mezcla

• Estradiol
𝐴𝐴 ∗ (𝐹𝑅 )𝐴
%𝐴𝐴 = ∗ 100
∑ 𝐴𝐴 ∗ (𝐹𝑅 )𝑛

27,4 ∗ 0,72
%𝐴𝐴 = ∗ 100
(27,4 ∗ 0,72) + (58,6 ∗ 0,74) + (32,30 ∗ 0,78)

%𝑬𝒔𝒕𝒓𝒂𝒅𝒊𝒐𝒍 = 𝟐𝟐, 𝟑𝟒

• Testosterona

𝐴𝐴 ∗ (𝐹𝑅 )𝐴
%𝐴𝐴 = ∗ 100
∑ 𝐴𝐴 ∗ (𝐹𝑅 )𝑛

58,6 ∗ 0,74
%𝐴𝐴 = ∗ 100
(27,4 ∗ 0,72) + (58,6 ∗ 0,74) + (32,30 ∗ 0,78)

%𝑻𝒆𝒔𝒕𝒐𝒔𝒕𝒆𝒓𝒐𝒏𝒂 = 𝟒𝟗, 𝟏𝟏

• Estriol
𝐴𝐴 ∗ (𝐹𝑅 )𝐴
%𝐴𝐴 = ∗ 100
∑ 𝐴𝐴 ∗ (𝐹𝑅 )𝑛
 32,3 ∗ 0,78
%𝐴𝐴 = ∗ 100
(27,4 ∗ 0,72) + (58,6 ∗ 0,74) + (32,30 ∗ 0,78)

%𝑬𝒔𝒕𝒓𝒊𝒐𝒍 = 𝟐𝟖, 𝟓𝟑

Ejercicio 8
En un laboratorio de control de calidad se quiere poner a punto un método de
análisis por HPLC en fase inversa de una mezcla de dos compuestos A y B. Se sabe que,
en columna de octadecil sílice de 25 cm de longitud y utilizando una fase móvil de
metanol- agua, los tiempos de retención son 6.25 y 7.10 min respectivamente, el tiempo
muerto es 1.4 min y la resolución es 1.05 En un laboratorio de control de calidad se quiere
poner a punto un método de análisis por HPLC en fase inversa de una mezcla de
dos compuestos A y B. Se sabe que, se utiliza una fase móvil de metanol-agua, los tiempos
de retención son 6.25 y 7.10 min respectivamente, el tiempo muerto es 1.4 min y la
resolución es 1.05. Calcular los factores de retención de A y B. A partir de los siguientes
datos calcular la concentración de A y B en la muestra.

Cálculo de los factores de retención

𝑡 6,25 𝑚𝑖𝑛
𝐾′𝑎 = 𝑡 𝑟 𝐾′𝑎 =
𝑚 1,4 𝑚𝑖𝑛

𝐾′𝑎 = 4,46

𝑡 7,1 𝑚𝑖𝑛
𝐾′𝑏 = 𝑡 𝑟 𝐾′𝑎 = 1,4 𝑚𝑖𝑛
𝑚

𝐾′𝑏 = 5,071

Cálculo de las concentraciones de los analitos A y B

Tabla 2. Datos de las muestras, los factores de retención y áreas

Muestra A, mg/L B, mg/L P.I., mg/L Área A Área B Área PI

1 2.0 2.0 1.0 25542 36216 13320
2 1.0 1.0 1.0 11830 18115 12320
3 2.0 2.0 2.0 24210 35980 26150
4 𝑥1 = 1.95 𝑥1 = 0,93 1.0 21240 15227 11425

Tabla 3. Concentraciones y áreas de los picos del analito y del patrón interno (p.i.) obtenidas
de la muestra
 Muestra 𝑪𝒂𝒏𝒂𝒍𝒊𝒕𝒐 (𝑨)/𝑪𝒑.𝒊 𝑪𝒂𝒏𝒂𝒍𝒊𝒕𝒐(𝑨)/𝑪𝒑.𝒊 Á𝒓𝒆𝒂𝒂𝒏𝒂𝒍𝒊𝒕𝒐 (𝑨) Á𝒓𝒆𝒂𝒂𝒏𝒂𝒍𝒊𝒕𝒐 (𝑨)
/Á𝒓𝒆𝒂𝒑.𝒊 /Á𝒓𝒆𝒂𝒑.𝒊
1 2 2 1,9175 2,718
2 1 1 0,96 1,47
3 2 2 0,9258 1,375
4 𝒙𝟏 𝒙𝟏 1,859 1,3327

Cálculo de la concentración del analito A

Datos
Á𝑟𝑒𝑎(𝐵)
𝑦= = 1,859
𝐴𝑝.𝑖

𝑦 = 1,425𝑥 − 0,932

𝑦 + 0,9315
𝑥=
1,4245

1,859 + 0,9315
𝑥=
1,4245

𝑥1 = 1,958 𝑚𝑔/𝐿

Cálculo de la concentración del analito B

Datos
Á𝑟𝑒𝑎(𝐵)
𝑦= = 1,3327
𝐴𝑝.𝑖
𝑦 = 1,2955𝑥 − 0,127

𝑦 + 0,127
𝑥=
1,2955

1,3327 + 0,127
𝑥=
1,2955

𝑥2 = 0,93 𝑚𝑔/𝐿

Ejercicio 9
¿Qué orden de la salida cabe esperar para los siguientes compuestos, si son eluidos en una
columna con relleno de fase inversa?
 a) n-hexano, benceno

Respuesta: Benceno es más polar que n- hexano, por lo tanto, saldrá primero de la
columna.

b) Acetato de etilo, ácido acético

Respuesta: Ácido acético es más polar que acetato de etilo, por lo tanto, saldrá primero
de la columna.

c) Dicloro benceno, benceno

Respuesta: Dicloro benceno es más polas que benceno, por lo tanto, saldrá primero de
la columna.

SIMULACIÓN (LABORATORIO VIRTUAL)

Muestra Solvente Rf Color Compuesto
compuesto identificado
Espinaca verde Acetona 0.69 Verde claro Clorofila a
Espinaca verde Alcohol 0.30 Verde Clorofila b
isopropílico oscuro
Arce en Acetona 0.56 Verde Clorofila b
primavera/verano oscuro
Arce en Alcohol 0.98 Caroteno Amarillo-Naranja
primavera/verano isopropílico
Arce en Acetona 0.82 Antocianina Rojo
otoño/invierno
Arce en Alcohol 0.78 Antocianina Rojo
otoño/invierno isopropílico
Follaje de otoño Acetona 0.85 Xantofila Amarillo
Follaje de otoño Alcohol 0.98 Caroteno Amarillo-Naranja
isopropílico

4.3
𝑅𝑓 = = 0.69
6.2
1.9
𝑅𝑓 = = 0.30
6.2
3.5
𝑅𝑓 = = 0.56
6.2
6.1
𝑅𝑓 = = 0.98
6.2
 4.1
𝑅𝑓 = = 0.82
5
3.9
𝑅𝑓 = = 0.78
5
4.7
𝑅𝑓 = = 0.85
5.5
5.4
𝑅𝑓 = = 0.98
5.5

4. INTERPRETACIÓN SIMULACIÓN
La cromatografía se basa en la separación de los componentes de una muestra mediante
dos fases inmiscibles, la fase estacionaria donde se entra el solvente y la fase móvil del
analito de interés. Se identificaron los pigmentos obtenidos en la simulación virtual en base
a un análisis cromatográfico de estándares predeterminados, basándose en su factor de
retención, el cual es característico para cada muestra (Harris, 2007). Las variaciones
existentes en este factor se deben principalmente a la solubilidad del analito respecto a la
fase estacionaria, por lo que, al usar diferentes solventes, existe una variación de esta
variable.

5. CUESTIONARIO
Escriba las ventajas y desventajas de la cromatografía de gases y HPLC
Tabla 4. Ventajas y desventajas de la cromatografía de gases.
Ventajas Desventajas
 Puede generar miles de platos  Manipulación únicamente de
teóricos en unos pocos minutos muestras volátiles
 Separa isómeros con puntos de  Técnica “deficiente” para análisis
ebullición muy próximo cualitativos
 Usos más variados como la mejor  Inadecuada para tratar compuestos
columna de destilación iónicos
 Muchas separaciones útiles se  Dificultad para trabajar con
completan en tan solo 10 minutos compuestos de elevada polaridad
 A altas presiones se han logrado  Imposible trabajar con compuestos
terminar análisis completos en de peso molecular superior a 600
apenas unos segundos
  Mide nano gramos (10−9 g)  Nunca puede ser inexacta la
inyección de la muestra debe ser
exacta
 Método preferido para el análisis de  Las condiciones del sistema no
trazas deben cambiar de una inyección la
otra
Fuente: (Mendieta et al., 2017)

Tabla 5. Ventajas y desventajas de la cromatografía HPLC.

Ventajas Desventajas
 Resultados obtenidos son de alta  Difícil de detectar coelución
resolución
 Fácil de leer los resultados  Categorización de compuesto
incorrecto
 Reproducción de las pruebas con  Alto costo para el equipo necesario
facilidad a través del proceso
automatizado
 Proceso automático que toma sólo  Baja sensibilidad a ciertos
unos pocos minutos compuestos
 Fuerza al compuesto a través de un  No existe detector universal
tubo densamente empaquetado
 Resultados cuantitativos  Difícil análisis cualitativo
 Uso de la gravedad en lugar de una  Funcionamiento complejo del
bomba de alta velocidad equipo
Fuente:(Muñiz-Valencia et al., 2019)

6. CONCLUSIONES
• La cromatografía es una técnica que resulta bastante útil dentro del laboratorio, esto
debido a que se emplea en la caracterización de mezclas complejas cuyo objetivo es
separar los distintos componentes, además de que también es posible medir la
proporción de dichos componentes en la mezcla.
• Se analizó el principio o fundamento que contiene la cromatografía de papel
conociendo que tipo de mezcla se usa este tipo de cromatografía, en el que se usa
 mezclas homogéneas, estas ya sea sólidas o líquidas. En la misma que se analizó la fase
estacionaria que es el papel filtro y fase móvil que son las gotas de solución que se
requirió separar.
• Por medio de la cromatografía se puede realizar la identificación de distintos analitos
en muestras conocidas y desconocidas, además se puede realizar el cálculo de los
porcentajes de analito en la muestra realizando rectas de regresión y relaciones entre
masas.

7. RECOMENDACIONES

• Conocer otros métodos de cromatografía para el uso de diferentes compuestos, que se

encuentren en distintos estados.
• Poner en mantenimiento los diferentes equipamientos de cromatografía cada cierto
tiempo para que no exista errores en los resultados.
• Realizar los cálculos para la identificación de concentraciones con las fórmulas dadas
en clases.

8. BIBLIOGRAFÍA

Harris, D. C. (2007). Análisis químico cuantitativo. Reverté.

Mendieta, C., Ortega, N., Solano-Cueva, N., & Figueroa, J. (2017). Metodología para la
Determinación de Pesticidas Organoclorados mediante Cromatografía de Gases Acoplado
Espectrometría de Masas y Detector de Captura de Electrones. Revista Politécnica, 40(1),
21–28. [Link]

Muñiz-Valencia, R., Leyva-Morales, J. B., Jurado Jurado, J. M., Sarabia-Garcia, O. R.,

Hernández Madrigal, J. V., Ceballos-Magaña, S. G., & Bejarano Ramirez, I. C. (2019).
Determinación de plaguicidas en suelo agrícola mediante extracción en fase sólida y
cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC) acoplada a un detector de arreglo de
diodos (DAD). Acta Universitaria, 29, 1–14. [Link]