UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA: LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO

ASIGNATURA: CITOLOGÍA I
DOCENTE: MgS. GISNELLA CEDEÑO
TERCER SEMESTRE “A”
ESTUDIANTE:
SALGADO MANRIQUE LAURA PAOLA

PRÁCTICA DE LABORATORIO
INFORME 05
TEMA:
TINCIÓN DE PAPANICOLAOU PARA MUESTRAS CÉRVICO - VAGINALES

FECHA DE ENTREGA:
05 DE JUNIO DE 2019

PERIODO:
ABRIL-AGOSTO 2019
 TINCIÓN DE PAPANICOLAOU PARA MUESTRAS CÉRVICO - VAGINALES

OBJETIVO GENERAL:
Realizar adecuadamente la tinción de papanicolaou a una muestra de secreción vaginal para
su posterior montaje y observación microscópica.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Identificar los colorantes utilizados en la tinción de papanicolaou, su naturaleza y su

acción en las células.
• Determinar el procedimiento más acertado para una correcta tinción de papanicolaou
• Establecer las diferencias entre las tinciones más usadas en citología como son
Papanicolaou, Giemsa y Ziehl Neelsen

MATERIALES
Materiales Sustancias o reactivos Muestra
• Equipo de bioseguridad Hematoxilina de Harris Secreción vaginal
para protección personal Orange (OG6)
(guantes, mascarilla, Eosina Alcohólica 50
mandil) Alcohol al 96%
• Portaobjetos Neoclear
• Clips
• dermolábil
• Lápiz N°2
• Batería de tinción
MARCO TEÓRICO:
TEORÍA DE LA COLORACIÓN
Se sabe que las imágenes producidas por absorción, en preparaciones coloreadas, son mucho
más fáciles de interpretar que las imágenes de difracciones dada por preparaciones no
coloreadas. Además, los diversos elementos de los tejidos poseen poco más o menos el
mismo índice de refracción lo que hace que el reconocimiento sea una tarea difícil (1).
Estos dos argumentos hacen comprender la necesidad de las coloraciones para el estudio
morfológico de células y tejidos (1).
Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo.
La mayor parte de los colorantes artificiales (y aún los naturales como la hematoxilina),
derivan de cuerpos incoloros, por ej. carburos aromáticos (1).
La coloración es la propiedad que tienen ciertos cuerpos de ejercer una absorción selectiva
sobre la luz. Dicho de otra manera, un cuerpo se ve de tal color porque trasmite por
trasparencia o por difusión las radiaciones complementarias de las que él absorbe (1).
Tipos de colorantes
Según su origen se clasifican en:

• Naturales: son relativamente escasas y se obtiene en forma de extractos a partir de

ciertas plantas, insectos o moluscos. Son ampliamente utilizados en anatomía
patológica y citología (3).
• Artificiales: en su mayor parte derivan de la anilina. Comenzaron a utilizarse a mitad
del s. XIX y sirven a numerosas coloraciones, inicialmente se obtenían del alquitrán
y actualmente se sintetiza en el laboratorio (3).
Según su acción y apetencia se clasifican en:
• Colorantes Básicos: asociación de un cromógeno de baja intensidad y de carácter
débilmente ácido al que se le añade grupos auxocromos catiónicos fuertemente
básicos que son los responsables de la carga global del colorante por eso se utilizan
para teñir estructuras ácidas (2).
• Colorantes Ácidos: productos de la unión de un cromógeno de baja intensidad
débilmente básico al que se le añaden grupos auxocromos fuertemente acido lo que
le dan dicho carácter al colorante y tiñe estructuras básicas celulares en el citoplasma
(2)
.
• Colorantes Neutros: unión colorante ácido y básico para formar un precipitado
comúnmente insoluble en agua y muy estable en disolución alcohólica de esta forma
siendo su carga floral neutra conservan en parte la propiedad de colorear conjunta o
separadamente diferentes estructuras dependiendo de que sean o no capaces de
atrapar algunos iones generando cuando la sal se disocia tras ser inestabilizada al
 colocarla en disolución acuosa. Las estructuras así coloreadas adquieren una
tonalidad policroma = multicolor (2).
• Colorantes Indiferentes: En condiciones normales colorean los tejidos por un
mecanismo de impregnación física no poseen carácter ácido, básico o salino definido
por ejemplo la tinción argéntica (2).
• Colorantes Metacromáticos: en condiciones normales la mayor parte de los colorantes
tiñen los tejidos con un color parecido a él, esta propiedad es la ORTOCROMASIA,
sin embargo, cuando se utilizan ciertos colorantes básicos derivado de la anilina
algunas estructuras titulares se tiñen con tonos diferentes al que cabría esperar por el
colorante usado. Por ejemplo, los gránulos de los mastocitos presentan color rojo con
el azul de metileno o el azul de toluidina, este efecto es la METACROMASIA y
estructuras teñidas CROMOTROPAS, los colorantes metacromáticos son sustancias
químicamente puras y no de carácter salino. Se cree que esta acción se debe a que se
produce una polimerización entre las moléculas de colorante adyacente a las
estructuras a teñir. Existen estructuras como son por ejemplo glúcidos complejos o
cartílago que se observan mejor con estos colorantes metacromáticos (2).

Existen dos teorías que explican el procedimiento de la coloración:

• Teoría física: Considera que la coloración es un proceso físico de adsorción. Así, las
partículas de las sustancias colorantes disueltas penetran en los espacios intra e
intercelulares en los que se mantienen adheridas debido a la cohesión molecular. Por
ejemplo, la coloración de las grasas o lípidos es una tinción por adsorción; los
Sudanes III o IV tiñen las grasas por la facilidad que tienen para disolverse en ellas
(3)
.
• Teoría química: El colorante se une a la sustancia coloreable combinándose con ella
íntimamente debido a la presencia de agrupaciones moleculares ácidas o básicas en
los componentes celulares o tisulares que se unen respectivamente a los cromógenos
básicos y ácidos de los colorantes, formando sales insolubles. Una prueba de ello es
el hecho de la casi imposibilidad de separar completamente el colorante de los
componentes en donde ejerció su acción de tinción aun empleando sus líquidos
solventes. De acuerdo con esta teoría los colorantes se unen (ligan) a los tejidos por
enlaces iónicos, covalentes o de hidrógeno. El enlace iónico o electrostático ocurre
cuando el colorante y la sustancia que se va a teñir, desarrollan diferentes cargas
eléctricas y entonces se atraen una a la otra, por ejemplo, el citoplasma se colorea
porque las proteínas citoplasmáticas poseen carga eléctrica (+) y las partículas del
colorante tienen carga eléctrica (-) (3).
Tipos de coloraciones:
• Coloración progresiva: en ella se deja actuar el colorante hasta que la coloración
alcanza la intensidad deseada, se lleva el control exacto de los tiempos y el punto
exacto se controla con el microscopio (2).
 • Coloración regresiva: en ella una se sobre colorea y luego se elimina el exceso de
colorante, a este último proceso se le llama diferenciación que se puede hacer con
agua, con ácidos, alcohol, bases o con soluciones metálicas (2).
• Coloración Terminal: Colorea estructuras cuya intensidad es independiente del
tiempo que actúa el colorante (2).
• Impregnación: en ella se utilizan sales metálicas como cloruro de oro, nitrato de plata
y se origina precipitados metálicos en las estructuras (2).
• Coloración en bloque: en ella las piezas se tiñen, se incluyen, se cortan tal cual.
• Coloración directa: el colorante tiñe por el mismo, necesita mordiente (2).
• Coloración indirecta: el colorante no tiñe por sí mismo, sino que hay que tratar con
un mordiente (2).
• Coloración Topográfica: es aquella que proporciona una visión de conjunto, de
manera que se pueden separar todos los componentes arquitecturales (2).
• Coloración estructural: nos sirve para resaltar ciertas estructuras titulares. Ejemplo:
núcleos, fibras elásticas (2)
TINCIONES MÁS USADAS EN CITOLOGÍA:
Tricrómica de papanicolaou:
Método de coloración policrómica, que consta de una coloración nuclear y un contraste
citoplasmático. Está basado en la diferenciación de los diversos componentes de la célula, se
aplica a los diversos tipos celulares para el diagnóstico de cambios malignos y la tipificación
celular.
Utiliza los siguientes colorantes:
HEMATOXILINA. Es un colorante natural, de origen vegetal que se extrae de la corteza del
árbol hematoxylon campechianum, oriundo de Centroamérica. En el comercio se encuentra
en forma de cristales rosados o amarillentos solubles en agua o en alcohol. Tradicionalmente
se ha mantenido que la hematoxilina no es un colorante que pueda ser utilizado como tal si
no que debe ser oxidado primeramente con hemateína. Tras el proceso de oxidación,
normalmente, debe implementar su capacidad tintorial agregándole alumbre de potasio o de
aluminio como mordientes. Es un colorante básico con cargas positivas que se une a cualquier
sustancia que tenga acido como es el caso del ADN del núcleo o las proteínas nucleares que
tienen carga negativa (1).
ORANGE (OG6). Es un colorante ácido, de origen artificial que junto con la eosina
alcohólica tiñen el citoplasma. Aunque este colorante puede prepararse en el laboratorio, con
Orange, etanol y ácido fosfotúngstico, comercialmente se lo expende como OG6, tiñe de
color naranja el citoplasma de las células que contienen queratina, por ejemplo, las células
del carcinoma epidermoide (1).
EA. (EOSINA ALCOHÓLICA). Comercialmente se encuentra ya diluida constituyendo las
mezclas EA36 EA50 EA 55 que proporcionan buenos resultados para cualquier tipo de
muestra, en determinadas ocasiones es recomendable usar alguna en particular, este es el caso
de las muestras ginecológicas con frecuencia gruesas en las que es preferible utilizar EA50
ya que no colorea tan intensamente el fondo de la preparación o lo hace menos verde, además
el empleo de esta mezcla permite mejor la diferenciación del adenocarcinoma de endocérvix
(citoplasma color rosado) con el adenocarcinoma de endometrio (citoplasma azulado). El
EA50 contiene verde claro amarillento, pardo Bismark, eosina amarillenta, ácido
fosfotúngstico y carbonato de litio (1).
Se puede realizar de la siguiente manera (1):
1. Luego de la fijación, se procede a lavar con agua corriente preferible en agua tibia,
hasta eliminar el fijador (principalmente cuando son fijadas las muestras con cito-
spray. Las placas deben hidratarse ya que el primer colorante es acuoso.
2. Les sumergimos en hematoxilina. El tiempo de coloración, depende del tipo de
hematoxilina utilizada.
3. Lavar por agua tibia corriente para eliminar el exceso de colorante. (el agua tibia da
mejor viraje de color y azulamiento)
4. DESHIDRATACIÓN
Alcohol potable 85%........... 1´
Alcohol potable 85%.............1´
Metanol 95-97%....................1´
5. REACTIVO DE OG6 en promedio unos 5 minutos
6. DESHIDRATACIÓN Y LAVADO
Lavar con agua 2 minutos
Alcohol potable 85%........... 1´
Alcohol potable 85%.............1´
Metanol 95-97%....................1´
7. REACTIVO DE EA 50 durante 4 minutos para contraste
8. DESHIDRATACIÓN Y LAVADO
Lavar con agua 2 minutos
Alcohol potable 85%........... 1´
Alcohol potable 85%.............1´
Metanol 95-97%....................1´
9. ACLARAMIENTO Y SECADO
NEO CLEAR 1 2 minutos
NEO- CLEAR 2 2 minutos

RECOMENDACIONES PARA LA TINCIÓN DE PAPANICOLAU

• Filtre los reactivos, en especial la hematoxilina antes de cada tinción
• Si la hematoxilina es nueva, disminuya los tiempos, pues un exceso de coloración
podría producir falsos positivos
• Los tiempos se pueden ir cambiando, según el ritmo de trabajo y el número de
placas que se tiñan en cada proceso.
Tinción de Giemsa:
Es un tipo de coloración de muestras clínicas, basada en la mezcla de colorantes ácidos y
básicos. Su creación estuvo inspirada por el trabajo realizado por Romanowsky, donde
Gustav Giemsa, químico y bacteriólogo originario de Alemania, la perfeccionó agregando
glicerol para estabilizar los compuestos. Los cambios generados a la técnica original de
Romanowsky permitieron mejorar considerablemente las observaciones microscópicas, por
lo tanto, la técnica fue bautizada con el nombre de tinción de Giemsa. La técnica de tinción
de Giemsa es muy útil para estudios citológicos, ya que permite la observación de estructuras
específicas de las células. Esta técnica tiñe los citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacuolas y
gránulos de las células, pudiéndose distinguir incluso finas trazas de cromatina. Además, se
pueden detectar cambios significativos en el tamaño, forma o coloración del núcleo, donde
es posible visualizar la pérdida de la relación núcleo – citoplasma. Esta tinción utiliza una
mezcla formada por un colorante ácido (eosina) y uno o varios colorantes básicos (azul de
metileno, azur A, azur B y azur C) (4)
Se puede realizar de la siguiente manera (4):
1. Después de la fijación, colocar con un gotero la solución final de tinción hasta cubrir
la totalidad de la lámina. Dejar actuar por 15 minutos. Algunos autores recomiendan
hasta 25 min. Depende de la casa comercial.
2. Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua destilada o con solución buffer a 7,2.
3. Sobre un papel secante dejar secar las láminas al aire libre, dispuestas en forma
vertical con ayuda de un soporte.
4. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para
eliminar cualquier resto de colorante.
Tinción de Ziehl – Neelsen
Es una técnica de coloración para identificar microorganismos alcohol-ácido resistentes
(AAR). El nombre de este procedimiento de microbiología hace referencia a sus autores: el
bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen. Esta técnica es un tipo de
coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos colorantes con la finalidad de crear
contraste entre las estructuras que se desean observar, diferenciar y posteriormente identificar
(5)
.
El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de
estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados ácidos
micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas. Cuando los ácidos grasos
presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los colorantes con mayor facilidad.
Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir mediante tinción de Gram, debido al
alto contenido de ácidos micólicos de la pared celular (5).
En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un colorante
básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared celular, la cual
es de textura cerosa a temperatura ambiente. La tinción con carbol fucsina es mejorada en
presencia de calor, debido a que la cera se derrite y las moléculas de colorante se mueven
con mayor rapidez hacia el interior de la pared celular (5).
El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas
porque su pared no era lo suficientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del
decolorante ácido es capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta
decoloración se llaman ácido-resistentes (5).
Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con otro colorante, generalmente
se utiliza el azul de metileno o el verde de malaquita (5).
El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en consecuencia, crea contraste a las
estructuras que fueron teñidas en el primer paso. Solo las células decoloradas absorben el
segundo colorante (contra-tinción) y toman su color, mientras que las células ácido-
resistentes conservan el color rojo (5).
Se puede realizar de la siguiente manera (5):
1. Después de la fijación, cubrir con la solución de carbol fucsina (colorante básico
primario).
2. Calentar el frotis. Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un desprendimiento de
vapor (aproximadamente a 60 °C). Es importante no sobrecalentar y evitar quemar la
muestra.
Con relación al calentamiento, se debe tener mucho cuidado al calentar el carbol
fucsina, especialmente si la tinción se lleva a cabo sobre una bandeja u otro recipiente
en el que se hayan recogido productos químicos altamente inflamables de la tinción
previa. Solo se debe aplicar una pequeña llama debajo de los portaobjetos usando un
hisopo encendido previamente humedecido con unas gotas de alcohol ácido, metanol
o etanol al 70 %. Evitar usar un hisopo grande empapado en etanol porque esto es un
riesgo de incendio.
3. Lavar el frotis agua limpia. Si el agua del grifo no está limpia, lavar el frotis con agua
filtrada o destilada, preferiblemente.
4. Cubrir el frotis con alcohol ácido. Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La cobertura
se lleva a cabo durante 1 minuto o hasta que el frotis esté lo suficientemente
decolorado, es decir, de color rosa pálido. Hay que tomar en cuenta que el alcohol
ácido es inflamable; por lo tanto, debe usarse con mucho cuidado. Se debe evitar estar
cerca de fuentes de ignición.
5. Lavar el frotis agua limpia. Si el agua del grifo no está limpia, lavar el frotis con
agua filtrada o destilada, preferiblemente.
6. Cubrir el frotis con el colorante secundario. Puede ser colorante verde de malaquita
(0,5 %) o azul de metileno (0,3 %) durante 1 o 2 minutos, utilizando el tiempo más
prolongado si el frotis es delgado.
7. Lavar el frotis agua limpia. Si el agua del grifo no está limpia, lavar el frotis con
agua filtrada o destilada, preferiblemente.
 8. Drenar. Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar el frotis en un
estante de drenaje, para que esta se seque al aire (no usar papel absorbente para el
secado).

PROCEDIMIENTO:

• Después de la fijación, sumergir la muestra en agua durante 20 minutos para

hidratarla, es importante ya que el primer colorante tiene afinidad con el agua.
• Sumergir la muestra en Hematoxilina de Harris durante 1 ½ minutos.
• Lavar la muestra con agua corriente a chorro suave para eliminar el exceso de
colorante.
• Sumergir en Alcohol N°1 durante 2 minutos.
• Sumergir en Alcohol N°2 durante 2 minutos.
• Sumergir en Orange (OG6) durante 3 minutos.
• Lavar en una cuba con agua en reposo (aproximadamente 20 segundos) para eliminar
el exceso de colorante.
• Sumergir en Alcohol N°1 durante 2 minutos.
• Sumergir en Alcohol N°2 durante 2 minutos.
• Sumergir en Eosina Alcohólica 50 (EA50) durante 3 minutos
• Lavar en una cuba con agua en reposo (aproximadamente 20 segundos) para eliminar
el exceso de colorante.
• Sumergir en Alcohol N°1 durante 2 minutos.
• Sumergir en Alcohol N°2 durante 2 minutos.
• Sumergir en Neoclear N°1 durante 3 minutos
• Sumergir en Neoclear N°2 durante 3 minutos
• Secar la parte posterior de la placa con una toalla de papel absorbente
• Dejar que la muestra se seque al aire
• Reservar para el montaje
NOTA:
El tiempo que se sumerge la muestra en los colorantes depende de la calidad de los mismos,
es decir, que con un colorante nuevo debe disminuirse el tiempo para evitar sobre
coloraciones y falsos positivos. También es recomendable filtrar los reactivos antes de iniciar
el trabajo.
CONCLUSIONES:

• Los colorantes usados en la tinción de papanicolaou son: Hematoxilina de Harris, es

un colorante natural, básico, por lo que va a teñir estructuras ácidas en la célula
(núcleos); Orange (OG6), es un colorante ácido, de origen artificial que tiñe
estructuras básicas en la célula (citoplasma) y Eosina alcohólica (EA50) también de
 origen artificial y naturaleza ácida, que además de teñir estructuras básicas
(citoplasma) le da el contraste final a la tinción.

• El procedimiento más acertado para la tinción de papanicolaou es: hidratación de la

placa, sumergir la muestra en Hematoxilina de Harris durante 1 ½ minutos. Lavar la
muestra con agua corriente a chorro suave para eliminar el exceso de colorante,
Sumergir en Alcohol N°1 y N°2 durante 2 minutos cada uno, sumergir en Orange
(OG6) durante 3 minutos, eliminar con agua el exceso de colorante, sumergir en
Alcohol N°1 y N°2 durante 2 minutos cada uno, sumergir en Eosina Alcohólica 50
(EA50) durante 3 minutos, eliminar con agua el exceso de colorante, sumergir en
Alcohol N°1 y N°2 durante 2 minutos cada uno, aclarar colocando en Neoclear N°1
y N°2 durante 3 minutos cada uno, secar la parte posterior de la placa con una toalla
de papel absorbente y dejar que la muestra se seque al aire para su posterior montaje.

• Se establecen las diferencias entre las tinciones mas usadas en la siguiente tabla:

TINCIÓN
DIFERENCIAS Papanicolaou Giemsa Ziehl - Neelsen
Colorantes Hematoxilina Solución de Carbol fucsina
OG6 Giemsa Azul de metileno
EA50 o verde malaquita
Tipo de tinción Estructural Estructural Regresiva
(diferencial)
Estructuras que se Células Células Microorganismos
tiñen alcohol ácido
resistentes
Tiempo de tinción Aproximadamente Aproximadamente Aproximadamente
media hora 15 minutos 10 minutos

RECOMENDACIONES:
• Uso del equipo de bioseguridad y protección personal (guantes, mandil, mascarilla y
gafas protectoras de ser posible).
• Filtrar los reactivos antes de empezar la tinción.
• No exceder los tiempos tanto en coloración como en decoloración ya que esto puede
producir errores en la lectura microscópica.

BIBLIOGRAFÍA:
1- Ramos, Y. (2005). La citología cervicouterina [Texto impreso] [Citado 2019 junio
02]
2- Ramos, L; Rivera, C… Otros (sf) Manual de citología cérvico – uterina. Secretaria
Seccional de Salud y Protección Social de Antioquia. [PDF] [Citado 2019 junio 02]
Disponible en:
[Link]
3- Universidad autónoma de Madrid. Técnicas de tinción. Facultad de Medicina – Depto
de Anatomía Patológica [PDF] [Citado 2019 junio 02] Disponible en:
[Link]
4- Gil, M. (sf.) Tinción de Giemsa. Fundamento, técnica y utilización. [Internet] [Citado
2019 junio 02] Disponible en: [Link]
giemsa/#Proceso_de_tincion
5- Briceño, K. (sf.) Tinción de Ziehl - Neelsen. Fundamento, técnica y utilización.
[Internet] [Citado 2019 junio 02] Disponible en: [Link]
ziehl-neelsen/

ANEXOS

Anexo 1. Procedimiento de la toma de muestra:

 Inserción del espéculo
Funete: Laboratorio de Citología UNACH

Toma de muestra
Funete: Laboratorio de Citología UNACH
 Fijación de la muestra con citospray
Fuente: Laboratorio de Citología UNACH

Retiro del espéculo

Fuente: Laboratorio de Citología UNACH