INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA GENERAL Y QUIMIOTERAPIA
PRÁCTICA 8
SECRECIÓN TUBULAR ACTIVA DEL ÁCIDO P-AMINOHIPÚRICO EN LAS REBANADAS
DE LA CORTEZA DE LA RATA
Grupo: 6FM2 Equipo: 2
Integrantes:
● Callejas Madera Rebeca Meztli
● Campos Silva Yaneli Rubi
● Castillo Meléndez Andrea Alejandra
● Carreon Fuentes Valery
● Cebada Vite Alejandra
● Cervantes Alonso Nadia Sayde
II. OBJETIVO
Cuantificar la acumulación de p-aminohipurato en rebanadas de la corteza de riñón de rata
y determinar cómo dicha acumulación se ve afectada por la presencia de probenecid o por
ausencia de energía metabólica.
III. FUNDAMENTO QUÍMICO (1 pto.)
La concentración del p-aminohipurato acumulada en las rebanadas de corteza de riñón de
rata se determina por la reacción de Bratton-Marshall. La técnica comprende la diozoación
de la amina en solución ácida, posteriormente se elimina el exceso de ácido nitroso por
reacción con ácido sulfámico, después se añade el agente de acoplamiento (N-(1-naftil)
etilendiamina), con lo que se produce una solución coloreada debido a la absorción de luz
por el producto diazo acoplado (Figura 1) (Connors, 1981).
En medio ácido los compuestos que tienen un grupo amino libre o un anillo aromático
forman con el nitrito un compuesto azoado. El sulfamato de amonio neutraliza el nitrito que
no reacciona con la arilamina. El compuesto azoado al conjugarse con la
N-naftiletilendiamina, forma un colorante hidrosoluble que muestra absorbancia máxima a
545 nm. (Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 2001).
Figura 1: Reacción química de Bratton y Marshall
IV. RESULTADOS (2 ptos.): Incluir un ejemplo de un cálculo, hacer una gráfica de barras
donde se representen las diferentes condiciones contra la relación t/m. Hacer un ANOVA
unifactorial (SNK) y describir los resultados.
Cálculo matemático
La ecuación de la recta obtenida de la curva tipo fue 𝑦 = 0. 044𝑥 + 0. 0066 con un R² =
0.9994.
Se despeja “x” y se interpola la densidad óptica D.O. en la ecuación de la recta,
sustituyendo en “y” dichos valores, para conocer la concentración de ácido p-aminohipúrico
(PAH) correspondiente en μM.
𝑦−0.0066
𝑥= 0.044
0.2315−0.0066
𝑥= 0.044
= 5. 11 μ𝑀
Para calcular la masa de PAH en μM, se realizó el ajuste de acuerdo a la dilución realizada.
1 μM - 1000 mL
x - 5 mL
x= 0.005 μM
Multiplicando la concentración interpolada por 0.005
m PAH= (0.005)(5.11)= 0.0255 μM
Para obtener los μM por gramo de tejido, se divide el dato calculado previamente por el
peso húmedo de las rebanadas de corteza renal en gramos, para este dato corresponde un
peso húmedo de 0.0346 g.
μM/ g de tejido= 0.0255 μM/ 0.0346 g= 0.7386 μM/g
Requerimos trabajar con los datos en unidades de mmol/kg para ello se realiza la siguiente
conversión.
0.7386 μ𝑚𝑜𝑙 1000 𝑔 1 𝑚𝑚𝑜𝑙 0.7386 𝑚𝑚𝑜𝑙
𝑔
𝑥 𝑘𝑔
𝑥 1000 μ𝑚𝑜𝑙
= 𝑘𝑔
Posteriormente para obtener la relación tejido/medio el valor de PAH en mmol/kg se divide
entre el valor constante del agua difundida pasivamente en el riñón, con un valor de 0.75
mmol/kg.
Relación t/m = 0.7386/0.75 = 0.9848
Finalmente se debe corregir la relación t/m restando la media de la relación t/m de la
cámara A (donde no había PAH), que tiene un valor de
Relación t/m corregida = 0.9848-0.0364 = 0.9484
Estos cálculos y correcciones se realizaron, con todos los valores de las cámaras B, B´, C,
D y E. Posteriormente se graficó la media ± EE de cada cámara. (Figura 1).
Figura 2: Relación tejido medio (media ± EE) de la secreción tubular activa renal in vitro en
cámaras con distintas condiciones, donde, B y B´; PAH 1 mM (condiciones normales), C;
PAH 1 mM y Probenecid 10 mM (competidor de transportadores) , D; PAH 1 mM y 2,4-DNF
1 mM (inhibidor de la cadena respiratoria), E; PAH 1 mM en ausencia de oxígeno.
Diferencias significativas en un análisis estadístico ANOVA unifactorial (Student Newman
Keuls) entre las relaciones t/m de las diferentes cámaras: *(p<0.05) respecto a la cámara B,
#(p<0.05) respecto a la cámara B´.
V DISCUSIÓN (5 ptos.):
Los riñones son órganos en forma de judía que se encuentran en la cavidad retroperitoneal
del cuerpo, estos cumplen diversas funciones, como órganos excretores aseguran que el
exceso de sustancias o aquellas perjudiciales se excreten por la orina en cantidades
adecuadas. Como órganos reguladores, los riñones mantienen un volumen y una
composición constantes de los líquidos corporales al variar la excreción de solutos y agua.
Las unidades funcionales del riñón son las nefronas, cada riñón contiene aproximadamente
1 millón de ellas, cada una consta de un glomérulo y un túbulo renal (Constanzo, 2018).
La formación de orina implica tres procesos básicos: filtración glomerular, reabsorción y
secreción. Estos procesos le permiten a los riñones eliminar solutos indeseables producto
del metabolismo celular u obtenidos en la dieta, y regular el equilibrio hidroelectrolítico de
acuerdo con las condiciones medioambientales en las que se encuentre el individuo. Pero
puesto que el filtrado glomerular es abundante, el riñón debe de contar con mecanismos
tubulares que le permitan modular el volumen y composición de la orina en forma
satisfactoria (Restrepo, 2018).
El p-aminohipurato (PAH) es un anión orgánico hidrosoluble pequeño (peso molecular de
194 D) que se filtra con libertad y se secreta también con avidez mediante el epitelio del
túbulo proximal. A concentraciones plasmáticas bajas (1,0 a 2,0 mg /100 ml) cerca del 90%
del PAH que entra en el riñón se retira del plasma y se excreta en la orina. Por tanto su
depuración es casi tan grande como el flujo plasmático renal. De hecho la depuración de
PAH se emplea como medición del flujo plasmático renal, que suele denominarse flujo
plasmático renal efectivo para indicar que su valor es un poco menor que el flujo plasmático
renal verdadero (Eaton y Pooler, 2006). Además se sabe que la secreción del ácido
orgánico p-aminohipurato (PAH) en el riñón de rata se produce en el túbulo proximal y es de
naturaleza activa porque procede contra una diferencia de potencial electroquímico. El
primer paso en el transporte transepitelial es la captación de PAH a través de las
membranas contraluminales que se acompaña de una acumulación intracelular (Berner y
Kinne, 1976).
La secreción tubular activa en el túbulo proximal interviene de manera importante en la
eliminación de muchos fármacos. Este proceso requiere aporte de energía y puede ser
bloqueado mediante inhibidores metabólicos (Le, 2020). La secreción se realiza mediante
procesos de transporte activo localizado en el túbulo proximal de las nefronas y, para ello,
las células proximales expresan proteínas transportadoras con especificidad para diversos
sustratos (Jaramillo, 2019). Dichos transportadores los podemos hallar en la membrana
basolateral de las células de los túbulos proximales a los transportadores OAT1, OAT3 y a
nivel apical los transportadores Urat1, OAT2, y OAT5. La mayoría de los OAT operan como
intercambiadores de aniones y tienen la capacidad de concentrar intracelularmente aniones
orgánicos (AOs) en contra de su gradiente de concentración, forzando su entrada debido a
la diferencia de potencial de membrana negativo en el interior. Por ende se requiere de
energía para poder lograr dicho transporte (Bulacio, 2015).
En el caso de la práctica su finalidad fue poner en evidencia la secreción tubular activa del
PAH, este proceso al ser un transporte activo tiene las características de ser saturable,
competitivo, estereoespecífico y tiene una relación tejido/medio >1 (Boron, 2017).
En la cámara B y B´ se obtuvo una relación mayor a 1, lo que indica que es
mayoritariamente la concentración de PAH en el tejido que en el medio, así se deduce que
el transporte no depende del gradiente de concentración, es decir, es propio de transporte
activo que implica un gasto de energía ATP, el cual utiliza transportadores que pueden
conducir sustancias en contra de su gradiente de concentración como es el caso del
p-aminohipurato que es secretado en la membrana peritubular de los túbulos proximales por
medio de transportadores de aniones OAT1 y OAT3.
En la cámara C como se muestra en la figura 2 se observa que hay una relación
tejido/medio cercana a 1, debido a que específicamente en esa cámara se añadió
probenecid compitiendo con el PAH, el probenecid es un fármaco con alta afinidad hacia los
transportadores OAT (organic anion transporter), al unirse a ellos impide que otros aniones
puedan transportarse y secretarse, como es el caso del PAH, por lo que se ve disminuida la
acumulación de este último en las rebanadas de corteza de riñón de rata.
En la cámara D la relación tejido/medio es aproximadamente igual a 1, esto debido a que
hay presencia de 2,4-dinitrofenol (2,4-DNF) que es un agente desacoplante de la cadena de
transporte de electrones de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias (Agencia Española
de Protección de la Salud en el Deporte, 2015), por tanto la corriente de electrones se
escapa a través de las membranas, de manera que se pierde la diferencia de cargas que
hay a un lado y a otro de dichas membranas y como consecuencia de ello falla la
acumulación de energía en forma de ATP (González, 1979), debido a esto los
transportadores al ser proteínas que requieren de energía ATP para ejercer su función, se
ven inutilizadas por la falta del mismo, por lo que la secreción del PAH se da por difusión
pasiva y es por eso que hay una disminución en su acumulacion en las cortezas de riñón.
Finalmente en la cámara E hubo ausencia de oxígeno, este es el receptor final de la cadena
de electrones, cuando hay ausencia de oxígeno se reduce la síntesis de energía por la
formación de ATP (Crosara, 2015), por tanto esta ausencia de O2 detiene la síntesis de ATP
y los OAT no tendrán el sustrato energético para realizar su función y de igual forma la
secreción del PAH se llevará a cabo por difusión pasiva dando como resultado una relación
tejido/medio igual 1 como se muestra en la figura 2, y con ello disminuye la acumulación de
PAH en nuestro tejido.
VI CONCLUSIONES (1.5 ptos.):.
● La secreción tubular renal activa es un proceso dependiente de ATP.
● La secreción de PAH disminuye en presencia de probenecid (inhibidor competitivo).
● La presencia de 2,4-DNF evita la generación de ATP disminuyendo la secreción de
PAH.
● La ausencia de oxígeno disminuye la secreción de PAH.
VII REFERENCIAS ADICIONALES (0.5 ptos.):
● Agencia Española de Protección de la Salud en el Deporte, Alerta Internacional 2,
4-dinitrofenol, 2015 [internet] Madrid [Publicado: 13, mayo, 2015. Citado: 19, Mayo
2021] Disponible en:
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● Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. 2001. Facultad de Ciencias Químicas.
Fundamento de la Técnica de Bratton-Marshall. Documento PDF. Disponible en:
[Link]
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icas%20Farmacolog%C3%ADa%[Link].
● Berner, W., Kinne, R. Transport of p-aminohippuric acid by plasma membrane
vesicles isolated from rat kidney cortex. Pflugers Arch. 361, 269–277 (1976).
Disponible en: [Link]
● Boron Walter F. 2017. Fisiología Médica. 3ra edición. Elsevier. España. Pp. 739-742
● Bulacio R. 2015. Excreción urinaria del transportador de aniones orgánicos 5 (Oat5)
en nefrotoxicidad inducida por cisplatino. Potencial biomarcador temprano de esta
patología. Argentina: Universidad Nacional de Rosario. Pp 18-21.
● Connors K, A.1981. Curso de análisis farmacéutico: Ensayo del Medicamento.
Reverte. España. Pp 247.
● Constanzo L. 2018. Fisiología. Capítulo 6; Fisiología renal. 6ta edición. Elsevier.
[Link] 245.
● Crosara D. 2015. Alteraciones agudas del metabolismo del oxígeno. Revista
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● Eaton D y Pooler J. 2006. Fisiología renal de Vander. 6ta edición. McGRAW-HILL
INTERAMERICANA EDITORES, S.A. de C.V. Pp 40-41.
● González F., Arroyo P. 1979. Efecto de cuatro inhibidores metabólicos (INH, DNP,
2,4-D y CMU) sobre la actividad fotosintética de plántulas de cebada y maíz. Madrid:
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● Jaramillo F., Cardona E., Rincón A. 2019. Farmacología general. 1° ed. en coedición.
Aguascalientes: Universidad Autónoma de Aguascalientes. Pp 128-130.
● Le J. Excreción de los Fármacos, 2020. [Internet] USA: University of California San
Diego [Actualizado: octubre, 2020, citado: 19, mayo, 2021] Disponible en:
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nica/farmacocin%C3%A9tica/excreci%C3%B3n-de-los-f%C3%A1rmacos
● Restrepo C. 2018. Anatomía y Fisiología Renal. Documento PDF. Consultado
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