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Uso de vectores derivados de virus adenoasociados para el

tratamiento de la enfermedad de Morquio A

Article · January 2009

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Olga Echeverri Shunji Tomatsu

Pontificia Universidad Javeriana Nemours/Alfred [Link] Hospital for Children
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Carlos Javier Almeciga-Diaz Luis Barrera

Pontificia Universidad Javeriana Pontificia Javeriana University (Bogota)
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Uso de vectores derivados de virus

adenoasociados para el tratamiento de la
enfermedad de Morquio A
CARLOS JAVIER ALMÉCIGA-DÍAZ1
MARÍA ANDREA RUEDA-PÁRAMO1
OLGA YANETH ECHEVERRI1
ADRIANA MARÍA MONTAÑO2
SHUNJI TOMATSU2
LUIS ALEJANDRO BARRERA1

Resumen

En el desarrollo de una estrategia de terapia génica para la mucopolisacaridosis IV A

(enfermedad de Morquio A), en el presente trabajo se evaluó la capacidad de un vector
adenoasociado (AAV) para expresar el gen de la enzima sulfatasa N-acetilgalactosamina-
6-sulfato (GALNS, N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase) en células HEK293, fi-
broblastos humanos con mucopolisacaridosis IV A y condrocitos de ratón con
mucopolisacaridosis IV A.

En el lisado celular, la actividad de la GALNS se incrementó entre 5 y 24 veces los valores

observados en las células sin transfectar. La coexpresión con el gen del factor activador de
sulfatasas 1 (SUMF1, sultatase modifiying factor 1) permitió un incremento en la activi-
dad de la GALNS en el lisado celular de hasta 4,5 veces los valores observados en las
células cotransfectadas con AAV-GALNS. La actividad de la GALNS en el medio de
cultivo sólo se detectó en células cotransfectadas con AAV-SUMF1.

Estos resultados constituyen evidencia valiosa sobre la posibilidad de realizar la corrección

del defecto genético en la mucopolisacaridosis IV A empleando vectores AAV.

Palabras clave: Morquio A, terapia génica, GALNS, SUMF1 y virus adenoasociados.

1 Instituto de Errores Innatos del Metabolismo, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana.
2 Department of Pediatrics, School of Medicine, Saint Louis University, MO, USA.
Este trabajo fue realizado en la Pontificia Universidad Javeriana (Bogotá) y en Saint Louis University
(MO, USA).
Recibido: 26-01-2009 Revisado: 24-04-2009 Aceptado: 25-06-2009

Alméciga-Díaz C.J., Rueda-Páramo M.A., Echeverri O.Y., Montaño A.M., Tomatsu S., Barrera L.A., Uso de vectores...
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Title de las unidades D-galactosa-6-sulfato

del queratán sulfato[1, 2].
Adenoassociated virus-derived vectors for the
treatment of Morquio A disease
La mucopolisacaridosis IV A es
Abstract una enfermedad rara, con una in-
cidencia promedio de 1:250.000
Toward the development of a gene therapy strategy
for the mucopolysaccharidosis IV A (MPS IV A, ([Link], [3]). A pesar de
Morquio A), in this work we evaluated the capability que no se dispone de información
of an AAV vector to express the N-acetilgalacto- sobre su incidencia en Colombia, se
samine-6-sulfate sulfatase (GALNS) gene in
HEK293 cells, human mucopolysaccharidosis IV ha documentado el hallazgo de es-
A fibroblasts and murine MPS IV A chondrocites. culturas precolombinas con claros
GALNS activity in lysated cells was increased rasgos de individuos afectados con
between 5 and 24 folds compared to non-
transfected cells. Also, the effect of coexpression
la mucopolisacaridosis IV A[4] y, en
with the sultatase modifiying factor 1 (SUMF1) la experiencia del Instituto de Erro-
was evaluated. res Innatos del Metabolismo, es la más
diagnosticada hasta el momento en el
GALNS activity was increased up to 4.5 folds in
lysated cells compared to those values observed in país [5, 6].
AAV-GALNS transduced cells. Noteworthy,
enzyme activity was only detected in culture media La mucopolisacaridosis IV A es
when cells were cotransfected with AAV-GALNS
and AAV-SUMF1. una enfermedad caracterizada por la
acumulación lisosomal de los gluco-
These results represent a valuable step in the deve- saminoglicanos queratán sulfato y
lopment of a gene therapy strategy for
mucopolysaccharidosis IV A using AAV vectors.
condroitín 6 sulfato, principalmente en
hueso y córnea[3]. El fenotipo de la
Key words: Morquio A, gene therapy, GALNS, enfermedad varía desde una forma
SUMF1 and adenoasociated virus. grave, caracterizada por una importan-
te displasia esquelética, estatura cor-
Introducción ta, facies tosca, hipoplasia de la
odontoides, pectus carinatum, cifoes-
La mucopolisacaridosis IV A (MPS coliosis, genu valgum, laxitud de arti-
I VA, enfermedad de Morquio A, culaciones, pérdida del oído, opacidad
OMIM #253000) es una enfermedad de corneal, enfermedad de válvulas
depósito lisosomal de tipo autosómica cardiacas y hepatoesplenomegalia
recesiva, producida por la deficiencia leve, hasta formas medias o atenua-
de la enzima N-acetilgalactosamina-6- das, con menor compromiso óseo. Sin
sulfato sulfatasa (GALNS, EC [Link]), embargo, a diferencia de otras muco-
la cual hidroliza el grupo 6-sulfato de polisacaridosis los pacientes con la
las unidades N-acetilgalactosamina-6- MPS IV A no presentan compromiso
sulfato del condroitín 6 sulfato (C6S) y de la esfera mental[7, 8, 2, 3].

Univ. Med. Bogotá (Colombia), 50 (3): 356-379, julio-septiembre, 2009

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En la actualidad, no se dispone de (c) es posible la corrección de célu-

una terapia efectiva para el tratamien- las no transfectadas mediante el
to de mucopolisacaridosis IV A y sólo mecanismo de corrección cruza-
se han empleado medidas paliativas e da por captura de la enzima por
intervenciones quirúrgicas para tratar los receptores de manosa-6-
algunas manifestaciones[3]. Aunque fosfato[15, 16];
el trasplante de médula ósea ha pro-
bado tener un gran impacto en las (d) los ensayos preclínicos en diferen-
manifestaciones somáticas en diferen- tes modelos animales (ratón, rata,
tes mucopolisacaridosis, tiene un efec- perro y gato) han permitido niveles
to limitado sobre las anormalidades enzimáticos terapéuticos hasta por
cardiacas, visuales y esqueléticas[9, 1,5 años en ratón y 7 años en pe-
10]. La terapia de remplazo enzimáti- rros, con importantes correcciones
co para la mucopolisacaridosis IV A bioquímicas y clínicas, tras una
se encuentra en fase preclínica, con única administración[17-20], y
resultados prometedores en el mode-
lo murino de la enfermedad[11]. Sin (e) en las enfermedades producidas por
embargo, los pacientes requerirían la deficiencia de una sulfatasa (como
infusiones intravenosas semanales de MPS II, MPS III A, MPS III D, MPS
la enzima recombinante, con costos IV A y MPS VI), la coexpresión con
anuales por paciente que superan los el factor activador de sulfatasas
US$ 300.000 y con posibles compli- (SUMF1), involucrado en la activa-
caciones inmunológicas debidas a la ción del sitio activo de todas las sul-
administración de grandes cantidades fatasas, ha permitido incrementos
de enzima[12]. entre 2 y 3 veces en los valores
de actividad de diferentes sulfa-
La terapia génica es una alterna- tasas recombinantes, con un no-
tiva para el tratamiento de las enfer- table efecto en la distribución de
medades de depósito lisosomal, por las la enzima[21], la proporción de la
siguientes razones: enzima secretada y las manifesta-
ciones bioquímicas y clínicas de la
(a) no se requiere una estricta re- enfermedad[22, 23].
gulación de la expresión del
gen[13]; Entre los diferentes vectores virales
y no virales empleados en terapia
(b) los niveles cercanos al 10% de los génica para enfermedades de depósi-
valores normales permiten pasar to lisosomal, los vectores derivados de
de un fenotipo grave a uno ate- virus adenoasociados (AAV) han mos-
nuado o intermedio[14]; trado importantes beneficios clínicos

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y expresiones prolongadas en mode- intensificador temprano y promotor del

los animales de la enfermedad de citomegalovirus (CMV), en células
Gaucher, la enfermedad de Fabry, la HEK293 y en fibroblastos de huma-
enfermedad de Pompe, la leucodistro- nos y condrocitos de ratón, ambos con
fia metacromática, la enfermedad de mucopolisacaridosis IV A. Además, se
Niemann-Pick A y las mucopolisaca- evaluó el efecto de la coexpresión con
ridosis I, II, III A, III B, IV y VII (revi- el gen SUMF1, mediante la coadmi-
sado en[24, 25]. nistración de AAV-GALNS con el
vector AAV-SUMF1. Estos resultados
Los vectores virales adenoasocia- muestran el potencial de los vectores
dos son virus no patógenos con un AAV y de la coexpresión con SUMF1,
ADN lineal de cadena sencilla de 4,7 para la corrección del defecto en la
kb, el cual requiere de la presencia de mucopolisacaridosis IV A.
un virus ayudador, tipo adenovirus o
herpes simplex, para su replica- Materiales y métodos
ción[26]. La administración intraveno-
sa de vectores AAV en modelos Construcción de los plásmidos. El
animales de enfermedades de depósi- plásmido pAAV-CMV-GALNS, pre-
to lisosomal, ha llevado a incremen- viamente construido[30], porta el ADNc
tos en la actividad enzimática de hasta de la GALNS humana bajo el control
16 veces los valores normales en san- del intensificador temprano y el pro-
gre, hígado, bazo, riñón y músculo, motor del citomegalovirus, un intrón
con reducción de las acumulaciones sintético, la señal de entrada al ribosoma
de glucosaminoglicanos y restaura- IRES, que permite la transducción de
ción de la arquitectura del tejido[27, dos secuencias en un mismo ARNm,
19, 28, 16]. Para la mucopolisacari- el gen de resistencia a neomicina y la
dosis IV A no se han publicado expe- señal de poliadenilación de la hormo-
rimentos de terapia génica in vivo y na de crecimiento bovina, flanqueados
sólo existe el reporte de la transfección por los ITR del serotipo AAV2. El
de diferentes líneas celulares emplean- plásmido pAAV-CMV-SUMF1 se
do vectores retrovirales, con los que construyó remplazando el ADNc de
se logró un incremento en la activi- GALNS en pAAV-CMV-GALNS, por
dad enzimática entre 5 y 50 veces los el fragmento EcoRI de 1,2 kb, corres-
valores normales[29]. pondiente al gen de SUMF1 humano,
obtenido mediante digestión del
En el presente trabajo se evaluó el plásmido pCXN-SUMF1. Todos los
perfil de expresión del vector AAV- procedimientos moleculares se lleva-
GALNS, el cual porta el gen humano ron a cabo empleando protocolos es-
de la GALNS bajo el control del tándar[31].

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Producción de los vectores. Las bre de antibióticos y suero fetal bovi-

partículas virales recombinantes de no. La transfección se realizó em-
virus adenoasociados se produjeron pleando la mezcla de liposomas
por el método de triple transfección catiónicos Lipofectamine 2000®
libre de adenovirus, desarrollado por (Invitrogen), de la siguiente manera:
Xiao et al.[32]. En este método, las en un tubo estéril de 15 ml se mezcla-
células HEK293 son cotransfectadas ron los plásmidos pAAV-CMV-
con: (a) el plásmido que porta el gen GALNS o pAAV-CMV-SUMF1 con
de interés flanqueado por los ITR los plásmidos pXX2 y pXX6-80, en
(pAAV-CMV-GALNS o pAAV- una relación molar 1:1:1 que corres-
CMV-SUMF1), (b) el plásmido de ponde a una relación 5:5:15 en térmi-
empaquetamiento pXX2, el cual por- nos de µg de ADN, para un total de
ta las secuencias de los genes Rep y 25 µg de ADN por cada caja de culti-
Cap de AAV2, y (c) el plásmido vo. Todos los ADN de los plásmidos
ayudador pXX6-80 que porta las se- utilizados se purificaron empleando el
cuencias adenovirales necesarias para kit QUIAEX-Maxi-prep (QIAGEN),
la replicación y el empaquetamiento según las instrucciones del fabrican-
del genoma viral. te. Como control de cotransfección,
producción y transfección, se produ-
Las células HEK293 se cultivaron jeron partículas virales nativas, me-
en medio esencial mínimo de Eagles diante cotransfección con el plásmido
MEM (Gibco), con suplemento de pe- pSUB201, el cual contiene el genoma
nicilina-estreptomicina (Gibco) 100 U/ del virus adenoasociado serotipo 2.
ml-100 µg/ml, glutamina (GIBCO) 2
mM y suero bovino fetal (SFB - La mezcla de ADN del plásmido
Invitrogen) al 15%, en una atmósfera (25 ìg) se diluyó en 1,5 ml de medio
al 5% de CO2 a 37ºC. Cuarenta y ocho de cultivo libre de suero Opti-MEM®I
horas antes de la transfección, se sem- (Invitrogen) y se mezcló suavemente.
braron 1x10 6 células en placas culti- En otro tubo, se diluyeron 60 ìl de
vo de 10 cm con 15 ml de medio Lipofectamine 2000® con 1,5 ml de
crecimiento sin antibióticos. Las célu- Opti-MEM®I. La mezcla se agitó sua-
las se incubaron durante 48 horas a vemente y se incubó a temperatura
37ºC y 5% de CO2, tiempo en el que ambiente durante 5 minutos. Luego,
se debe lograr una confluencia entre se mezclaron las dos soluciones y se
80% y 90%. incubaron por 20 minutos a tempera-
tura ambiente, para permitir que los
Dos horas antes de la transfección, liposomas incorporaran el ADN. Pa-
el medio de cultivo se cambió por 15 sados los 20 minutos, la solución
ml de medio de crecimiento fresco, li- ADN-Lipofectamine 2000® se adicio-

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nó a los cultivos de células HEK293, El gradiente se construyó de la si-

mezclando suavemente por rotación guiente manera: en tubos Ultra-Clear
para permitir que los complejos se dis- de 25x89 mm (Beckman), se adicio-
tribuyeran uniformemente en la caja naron lentamente 9 ml de iodixanol al
de cultivo. Las células transfectadas se 15% y NaCl 1M en solución tampón
incubaron en una atmósfera de 5% de PBS-MK (Na2HPO4 1,09 g, NaH2PO4
CO2 a 37ºC. Doce horas después de la 0,32 g, NaCl 9 g por litro a pH 7,2,
transfección, el medio se remplazó con MgCl2 1 mM, KCl 2,5 mM), 6 ml de
medio de crecimiento MEM fresco y iodixanol al 25% en PBS-MK con rojo
se continuó con la incubación en las fenol (15 µl de una solución al 0,5%),
mismas condiciones descritas durante 5 ml de iodixanol al 40% en PBS-MK
48 horas, momento en el que las célu- y 5 ml de iodixanol al 60% (Optiprep,
las se tripsinizaron y resuspendieron es una solución acuosa estéril de
en 15 ml de buffer de lisis (0,15 M iodixanol al 60%). Finalmente, se agre-
NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,5). Las garon lentamente 15 ml de la solución
células se lisaron mediante tres ciclos viral primaria clarificada. El gradiente
de congelación y descongelación, al- se centrifugó a 25.000 rpm durante 16
ternando los tubos entre un baño de horas a 18ºC. Trascurrido este tiem-
hielo seco con etanol y un baño po, se tomaron, aproximadamente, 2,5
serólogico a 37ºC. Finalmente, la sus- ml de la fase del 60% y 2,5 m de la
pensión se centrifugó a 3.700 g du- fase del 40%, mediante punción del
rante 20 minutos a temperatura tubo con una aguja calibre 23G.
ambiente. El sobrenadante representó
la solución viral primaria, la cual se La fracción de iodixanol se con-
almacenó a -80ºC para su posterior centró mediante ultrafiltración por
purificación y cuantificación. membrana de 100 kDa. Para tal fin, 2
ml de muestra fueron cargados en un
Purificación y cuantificación de Centricon® 100K (Millipore) y
los vectores recombinates AAV. Las centrifugados a 1.000 g por 30 minu-
partículas virales se purificaron em- tos y 4ºC, y se descartó la fracción que
pleando el método desarrollado por pasaba a través de la membrana. Este
Zolotukhin et al.[33]. Este método paso se repitió hasta que la totalidad
emplea un gradiente discontinuo no de la muestra (aproximadamente, 5 ml)
iónico de iodixanol (OptiPrep– fue centrifugada. Finalmente, se hicie-
Sigma) y posterior ultrafiltración por ron dos lavados con 2 ml de NaCl
una membrana de 100 kDa para con- 0,9% para remover el iodixanol, el
centrar la muestra y remover el cual interfiere con el proceso de
iodixanol. cuantificación.

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Las soluciones virales se cuantifi- nucleótido: A=312,2 Da, C=288,2 Da,

caron por el método espectrofotomé- G=328,2 Da y T=303,2 Da. Igualmen-
trico desarrollado por Sommer et al. te, el cálculo de la relación de cápsides
(34). Este método se basa en la medi- por genoma viral (cp/gv) se calculó
ción de absorbancia a 260 y 280 nm con la ecuación 2:
de una solución viral purificada. El
cálculo de los genomas virales por ml 1,76x10–6 (1,80 – A260 / A280)
(vg/ml) tiene en cuenta, tanto los co- cp/gv = MWDNAx (2)
eficientes de extinción de las proteí- A260 / A280 – 0,59
nas de la cápside del serotipo AAV2
(VP1, VP2 y VP3), como el del ADN La relación cp/gv es igual a 1,
viral, que depende del peso molecu- cuando el 100% de las partículas con-
lar del genoma del vector. Este méto- tienen ADN y es >50 cuando sólo hay
do permite la cuantificación rápida, presentes partículas virales vacías.
económica y reproducible de solucio-
nes virales purificadas, con una corre- Transfección de células HEK293.
lación de 98% con otros métodos de Veinticuatro horas antes de la
cuantificación, como ELISA y dot-blot transfección, se sembraron 1x105 cé-
(34). Para la cuantificación, se incu- lulas HEK293 por pozo en placas de
baron 100 µl de la solución viral puri- 24 pozos, cultivadas en 1 ml de me-
ficada por 10 minutos a 75ºC con 0,5 dio esencial mínimo de Eagle DMEM
µl de SDS al 20%, y se midió la con suplemento de SFB al 15% y
absorbancia de la muestra a 260 y 280 antibióticos a 37ºC y 5% de CO2. El
nm. Como blanco se empleó una so- medio de cultivo se cambió 2 horas
lución de NaCl al 0,9%, la cual fue tra- antes de la transfección por medio fres-
tada de igual forma que las muestras. co y 1x1010 gv (1x10 5 gv/célula) de
los vectores AAV-GALNS y AAV-
La concentración de genomas SUMF1 fueron adicionados a cada
virales (gv/ml) se calculó empleando pozo. Al cabo de dos días, el medio
la ecuación 1: se remplazó por uno con suplemento
de geniticina (Gibco) en una concen-
4,47x1019 (A260 – 0,59 A280) tración de 400 µg/ml. Como control
gv/ml = (1) se emplearon células HEK293 sin
MWDNA transfectar. Todas las transfecciones se
realizaron por triplicado.
donde, MWADN corresponde al peso
molecular de la secuencia flanqueada A los 2, 4, 8 y 10 días después de
por los ITR para cada vector, basado la transfección, a las células se tripsi-
en el peso molecular de cada nizaron y resuspendieron en 200 µl de

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solución de lisis (acetato de sodio 25 cultivaron en medio esencial mínimo

mM, ß-glicerolfosfato 1 mM, pH 5,5, de Eagle DMEM con suplemento de
tritón X-100 1%), y lisadas mediante SFB al 15%, prolina y antibióticos.
tres ciclos de congelación/desconge- Veinticuatro horas antes de la
lación. La solución se clarificó por transfección, se sembraron 1,5 x105
centrifugación a 2.500 g por 5 minu- células/pozo en placas de 12 pozos.
tos y se almacenó a -80ºC para poste- El medio se cambió 2 horas antes de
riores análisis. El medio de cultivo fue la transfección y 1,5 x1010 gv (1x105
recolectado a los 2, 4, 8 y 10 días des- gv/célula) fueron adicionados. Al cabo
pués de la transfección. La solución de dos días, el medio se remplazó por
se clarificó por centrifugación a 2.500 uno con suplemento de geniticina
g por 5 minutos y se almacenó a -80ºC (Gibco) en una concentración de 400
para posteriores análisis. µg/ml. Como control se emplearon fi-
broblastos normales y MO18 sin
Para la cotransfección con CMV- transfectar. A las células se agregó trip-
SUMF1, 1,5 x105 células/pozo fueron sinizaron a los 4 días después de la
sembradas en placas de 12 pozos, 24 transfección y el lisado celular y el
horas antes de la transfección. El me- medio de cultivo se obtuvieron como
dio de cultivo se remplazó por medio se describió para las células HEK293.
fresco dos horas antes y las células La cotransfección con CMV-SUMF1
fueron transfectadas con 1,5 x1010 gv se hizo como se describió previamen-
en una relación 1:1 y 1:2 GALNS: te para las células HEK293, con 1,5
SUMF1. Al cabo de 48 horas, el me- x10 10 gv en una relación 1:1 y 1:2
dio se cambió por uno que contenía GALNS:SUMF1. Todas las transfec-
geniticina y, al cuarto día después de ciones se hicieron por triplicado.
la transfección, las células tripsiniza-
ron. El lisado celular y el medio de Aislamiento y transfección de con-
cultivo se procesaron como se descri- drocitos de ratón. Los condrocitos de
bió anteriormente. ratón se obtuvieron a partir del apén-
dice xifoides de ratones knock-out
Transfección de fibroblastos de C57BL/6J silvestres y con mucopoli-
mucopolisacaridosis IV A. Se obtuvie- sacaridosis IV A (Galns-/-), como des-
ron fibroblastos de piel provenientes criben Tomatsu et al.[35]. El tejido se
de un paciente con síndrome de tomó bajo condiciones estériles y la-
Morquio A (MO18), con la mutación vado con solución de Hanks (Sigma-
I113F/R361G (fenotipo grave), del Aldrich). Los tejidos se incubaron en
banco de células del Pediatric medio de crecimiento de condrocitos
Research Institute de Saint Louis (CGM, Cambrex Bio Science) con
University. Los fibroblastos MO18 se 0,4% de pronasa durante 1 hora a 37ºC

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y, posteriormente, con 0,05% de lución C a tubos de borosilicato de

colagenasa bacteriana durante 18 ho- 12x75 mm (Fischer) y se mezcló con
ras a 37ºC. Las células resultantes (con- 100 µl de solución estándar de
drocitos) se filtraron a través de una albumina sérica bovina (BSA), frac-
membrana de nailon de 80 µm ción V, o 100 µl de una dilución 1:10
(Millipore) en un tubo de centrífuga del lisado celular. La mezcla fue
de 50 ml con medio CGM y se centri- homogeneizada por vórtex e incuba-
fugaron a 1.000 rpm durante 10 mi- da 10 minutos a 37ºC en baño de Ma-
nutos. Luego de cuatro lavados con ría. Trascurrida la incubación, se
medio libre de colagenasa, los con- adicionaron 100 µl de una dilución 1:1
drocitos se cultivaron en placas de 24 en agua destilada de reactivo Folin &
pozos con 2 ml de medio de creci- Ciocolten’s Phenol 2N (Sigma-
miento. Luego de alcanzar una con- Aldrich). La mezcla se homogeneizó
fluencia de 60% a 70%, los condrocitos rápidamente por vórtex y se incubó
Galns -/- fueron transfectados con durante 30 minutos a temperatura
1x1010 gv de AAV-GALNS, en ausen- ambiente. Finalmente, la absorbancia
cia o presencia de AAV-SUMF1 en se midió a 660 nm. La curva de BSA
relación 1:2. El medio se remplazó 24 empleada fue de 4 a 40 µg de BSA,
horas después de la transfección. Cua- considerándose adecuada para la
tro días después de la transfección, se cuantificación cuando el r2 era supe-
recolectó el medio y las células se la- rior a 0,99. Cada muestra se cuantifi-
varon tres veces con NaCl 0,9% y se có por duplicado.
resuspendieron en 100 µl de deoxi-
colato de sodio al 1%. Se empleraron Determinación de la actividad
condrocitos de ratones Galns-/- y sil- enzimática. La actividad enzimáti-
vestres sin transfectar como control. ca se determinó por el método des-
Todas las transfecciones se hicieron crito por van Diggelen et al. (37).
por triplicado. Este método emplea la acción
secuencial de dos enzimas: inicial-
Cuantificación de la proteína por mente, GALNS remueve el grupo
el método de MicroLowry. La proteí- sulfato del sustrato 4-metil-umberife-
na en los lisados celulares se cuantifi- ril ß-D-galactopiranosido-6-sulfato
có por el método de MicroLowry (36). y, finalmente, el fluorógeno 4-met-
Inmediatamente antes del análisis, las ilumbeliferona es liberado por la en-
soluciones A (Na2CO3 20 g/L, NaOH zima ß-galactosidasa. La cantidad de
16 g/L, tartrato de sodio 0,8 g/L) y B 4-metilumbelifarona liberada es di-
(CuSO4·5H2O 5 g/L) se mezclaron en rectamente proporcional a la cantidad
una proporción 50:1, para obtener la de GALNS presente en la muestra
solución C. Se adicionó un ml de so- analizada.

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Para la reacción, en tubo de PCR) del genoma y ARNm de los

borosilicato 10x75 mm (Fischer), se vectores, se sembraron 2 x105 células
mezclaron 2 µl de muestra con 9 µl de HEK293 por pozo en placas de 6 po-
sustrato 4-metil-umberiferil ß-D-ga- zos, como se describió previamente.
lactopiranosido-6-sulfato (Toronto Las células fueron transfectadas con
Research Chemicals) 22 mM en solu- 2 x1010 gv de CMV-GALNS y tripsini-
ción tampón NaCl 0,1M, acetato de zaron a los 2, 4, 8 y 10 días después de
sodio 0,1M, pH 4,3. La mezcla fue la transfección. Se emplearon células
homogeneizada por vórtex e incuba- HEK293 sin transfectar como control.
da 18 horas a 37ºC. Como blanco de El ADN genómico y el ARN total se
reacción, se emplearon 2 µl de agua extrajeron empleando el kit AllPrep
destilada. Transcurrida la incubación, DNA/RNA mini (QIAGEN), siguien-
se adicionó 1 µl de una solución 10 do las instrucciones del fabricante. La
mg/ml de ß-galactosidasa de Aspergi- calidad del ADN y del ARN se evaluó
llus oryzae (SIGMA), homogeneizan- por electroforesis en gel de agarosa al
do por vórtex e incubando por 30 1,2% y por cuantificación espectrofo-
minutos 37ºC. Finalmente, se agrega- tométrica a 260/280 nm. Todas las
ron a la mezcla 1,9 ml de solución de transfecciones se hicieron por dupli-
parada (glicina, 24 g/L; Na2CO3, 21,2 cado.
g/L; NaOH, 7,5 g/L, pH10). La fluo-
rescencia de la muestra se determinó Para la identificación del ADN viral,
en un fluorómetro Turner Biosystems se emplearon los cebadores TOMF23
modelo 9200-000 a lex366/lem450. Las y TOMF34R, los cuales son específi-
unidades de enzima (nm de 4- cos para el ADNc de GALNS humano
metilumbeliferona liberada por hora y amplifican un fragmento de 235 pb.
por ml) se calcularon empleando la Los sitios de unión para TOMF23 y
ecuación 3: TOMF34R en la secuencia genómica
de GALNS, se encuentran en los
10 nm x 1.000 µL exones 10 y 12, respectivamente, que
U= (3) teóricamente amplificarían un frag-
2µL x 1mL x tiempo de incubación (h) mento de 4,1 kb, pero, bajo las condi-
ciones de la PCR, permiten amplificar
Para los lisados celulares, las uni- específicamente el genoma viral. La
dades de enzima se dividieron por los amplificación se llevó a cabo a 95ºC
miligramos de proteína en el lisado por 5 minutos, 30 ciclos de 95ºC por
(U/mg). 30 segundos, 64ºC por 30 segundos y
72ºC por 30 segundos y 72ºC por 10
PCR y RT-PCR. Para el análisis minutos. Los productos de la PCR se
semicuantitativo por PCR (semiQ- visualizaron en agarosa al 1,5%.

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366

Para el análisis del ARNm viral, la pri- dia ± desviación estándar. Para el aná-
mera cadena de ADN se sintetizó por RT- lisis estadístico, las medias se compa-
PCR con 500 ng de ARN total y un raron mediante la prueba t de Student
oligo-dT, empleando el kit SuperScript II para muestras independientes, em-
First-Strand ADNc Synthesis System pleando el programa SPSS 13.0 para
(Invitrogen), según las instrucciones del Mac OS X. Una diferencia se consi-
fabricante. Del producto de reacción, se deró significativa con valores p<0,05.
amplificaron 2 µl con TOMF23-
TOMF34R y con cebadores para el gen
Resultados
de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogena-
sa (GADPH), GADPHS 5-ACCACA El esquema de los vectores AAV-
GTCCATGCCATCAC-3 y GADPHR 5- GALNS y AAV-SUMF1 se ilustra en
TCCACCACCCTGTTG CTGTA-3, los la figura 1. El método de producción,
cuales amplifican un fragmento de 452 pb, purificación y cuantificación de los
el que fue usado para la normalización de vectores recombinantes empleado en el
los resultados. La amplificación se llevó a presente trabajo permitió obtener
cabo como se describió para el ADN viral. aproximadamente 1 ml de solución
Los productos de la PCR se visualizaron viral purificada con títulos virales del
en agarosa al 1,5% y la densidad de las orden de 1013 vg/ml (tabla 1), superio-
bandas (intensidad/mm2) se midió em- res a los reportados por Zolotukhin et
pleando el programa Image J 1,38x (http:/ al. (33) y Sommer et al.[34], los cuales
/[Link]. [Link]/ij/, National Institutes of estaban en el orden de 1011 vg/ml.
Health, USA). Los valores se reportaron
como la relación de la densidad de la ban- Las relaciones cp/gv, las cuales son
da de GALNS Vs. la de GADPH. un indicativo del número de cápsides
vacías presentes en la preparación
Análisis estadísticos. Todos los re- viral, fueron menores a las reportadas
sultados son reportados como la me- por Sommer et al.[34].

Tabla 1
Cuantificación de los vectores recombinantes por método espectrofotométrico

Vector Tamaño Peso A 260/A 280 A 260/A 280 Rendimiento

(pb) molecular Teórico
A 260 Observado
vg/ml cp/vg (%)
(g/mol)

AAV2 4.677 1,44 x106 1,4578 2,868 0,928 3,24 x1013 6,53 63,7%
AAV-GALNS 4.937 1,52 x106 1,4707 2,884 1,118 4,01 x1013 3,45 76,0%
AAV-SUMF1 4.467 1,37 x106 1,4464 2,535 1,140 3,97 x1013 2,90 78,8%

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Figura 1. Esquema del virus AAV2 (nativo) y de los vectores virales recombinantes AAV-
GALNS y AAV-SUMF1. CMV: intensificador temprano y promotor del citomegalovirus
humano; GALNS: ADNc de GALNS humana: SUMF1: ADNc de SUMF1 humana; IVS:
intrón sintético; IRES: sitio interno atenuado de entrada al ribosoma del virus de la
encefalomiocarditis; Neo: secuencia codificante de neomicina fosfotransferasa; PolyA:
fragmento codificante de la señal de poli-A de la hormona de crecimiento bovina; Amp: gen
de resistencia a ampicilina (ß-lactamasa).

El rendimiento del proceso de de iodizanol 60%, pueden haber ju-

producción se calculó comparando gado un papel importante en estos ren-
la relación A 260/A 280 obtenida expe- dimientos. No se observó ninguna
rimentalmente, contra la calculada relación entre el tamaño del vector y
para una preparación con el 100% de el título viral o el rendimiento, aun-
partículas que contenían genoma, en que los títulos y rendimientos fueron
donde la relación cp/gv es igual a más elevados en los vectores recom-
1[34]. Empleando la ecuación 3, se binantes (AAV-GALNS y AAV-
calculó el valor de A260/A280 para una SUMF1), que en el virus nativo
preparación sin partículas vacías, el (AAV2).
cual corresponde a 1,4578; 1,4707 y
1,4464 para las soluciones virales Transfección de células HEK293
AAV2, AAV-GALNS y AAV- con los vectores virales. Se transfec-
SUMF1, respectivamente. taron células HEK293 con el vector
AAV-GALNS y la actividad enzimá-
Como se observa en la tabla 1, los tica en los lisados celulares y medios
rendimientos del proceso de empa- de cultivo se determinó a los 2, 4, 8 y
quetamiento se encuentran entre 63% 10 días después de la transfección (fi-
y 79%, valores más altos que los re- gura 2). Se observó un aumento en la
portados por Sommer et al.[34], quie- actividad enzimática a partir del segun-
nes obtuvieron rendimientos alrededor do día después de la transfección, y
de 50%. se logró un incremento en la activi-
dad hasta de 20 veces los valores ob-
Modificaciones, como el uso de servados en las células sin transfectar
liposomas para la cotransfección y la (0,63 ± 1,10 U/mg). Los valores de
remoción del rojo de fenol en el paso actividad enzimática se mantuvieron

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368

relativamente constantes durante los viral se amplificó empleando

10 días de cultivo y sólo se observó cebadores específicos para el ADNc
un ligero aumento en la actividad, no de GALNS, los cuales reconocen se-
significativo (p>0,05), con una activi- cuencias ubicadas en los exones 10
dad enzimática final de 12,64±1,25 U/ (TOMF23) y 12 (TOMF34R), evitan-
mg al cabo de los 10 días, correspon- do interferencia del ADN genómico.
diente a 20 veces los valores observa- Como se muestra en la figura 3A, la
dos en células sin transfectar. En el cantidad de ADN viral del vector
medio de cultivo no se detectó activi- AAV-GALMS se mantuvo constante
dad enzimática durante los 10 días si- durante los 10 días de cultivo. En
guientes al cultivo. Debido a que los cuanto al análisis del ARNm, la pri-
mayores valores de actividad se obtu- mera cadena de ADN fue sintetizada
vieron en el cuarto día después de la por RT-PCR empleando oligo-dT y,
transfección, este intervalo fue selec- posteriormente, el ARNm viral fue
cionado para los ensayos en fibroblas- amplificado con los mismos cebadores
tos de mucopolisacaridosis IV A y las empleados para el análisis del ADN
cotransfecciones con CMV-SUMF1. viral (figura 3B). Como se observó en
el perfil de actividad enzimática, las
El análisis del ADN y el ARNm células HEK293 presentaron niveles
viral se muestra en la figura 3. El ADN basales de ARNm GALNS. El perfil

Figura 2. Transfección de células HEK293 con el vector AAV-GALNS. La actividad

enzimática en el lisado celular fue cuantificada por el método fluorométrico a los 2, 4, 8 y 10
días después de la transfección. No se detectó actividad en el medio de cultivo.

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de expresión de ARNm fue similar al La cotransfección con AAV-

observado en la actividad enzimática, SUMF1 en una relación 1:1 produjo
aunque en este caso se observó un pico un incremento en la actividad GALNS
de expresión hacia el cuarto día (alre- de 2,4 veces (p<0,01), con respecto a
dedor de 1,4 veces los valores basa- las células transfectadas sin CMV-
les), un leve descenso en el octavo día, SUMF1 (figura 4A). Se observó un
para finalmente alcanzar su valor fi- incremento adicional en la actividad
nal, 1,14 veces los valores basales. de 1,8 veces (p<0,01), cuando se em-

Figura 3. Análisis del ADN y ARNm viral en células HEK293 transfectadas con los vectores
virales. Células HEK293 fueron transfectados con 2 x1010 vg de AAV-GALNS y tripsinizadas
a los 2, 4, 8 y 10 días después de la transfección. (A) El ADN viral se amplificó empleando
cebadores específicos para el ADNc de GALNS. (B) El perfil de expresión del ARNm viral
fue construido con la relación de la densidad de la banda de GALNS Vs. la de GADPH. La
densidad de las bandas (intensidad/mm2) fue medida empleando el programa ImageJ 1.38x.

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370

pleó una relación 1:2 GALNS:SUMF1, tada cuando éstos fueron cotransfec-
lo cual corresponde a un aumento fi- tados con SUMF1 en una relación 1:2
nal en la actividad de 82,1 (51,7±5,59 (figura 4B), lográndose un valor de
U/mg) veces con respecto a los valo- 0,36±0,31 U/ml, el cual fue 1,9 veces
res encontrados en células HEK293 sin los valores obtenidos en fibroblastos
transfectar. No se detectó actividad en normales.
el medio de cultivo de células
HEK293 sin transfectar o en células En condrocitos de ratón knock-out
transfectadas únicamente con CMV- con mucopolisacaridosis IV A, la
GALNS. Sin embargo, la coexpresión transfección con AAV-GALNS pro-
con SUMF1 en una relación 1:1 llevó dujo niveles enzimáticos en el lisado
a un leve incremento en la actividad celular equivalentes a 70% del valor
(figura 4A). Se observó un incremen- encontrado en condrocitos de ratón
to adicional de 1,8 (p<0,05) cuando normales (24,12±6,23 U/mg vs.
las células fueron cotransfectadas en 34,0±16,47 U/mg) (figura 5). A dife-
una relación 1:2 GALNS:SUMF1. rencia de los resultados obtenidos en
células HEK293 y fibroblastos, la co-
Transfección de fibroblastos y con- transfección con SUMF1 no tuvo efec-
drocitos con mucopolisacaridosis IV to sobre la actividad GALNS en el
A. En los fibroblastos humanos con lisado celular. En el medio de cultivo,
Morquio A, la transfección con AAV- los valores de actividad enzimática en
GALNS permitió alcanzar valores de condrocitos transfectados con AAV-
actividad enzimática correspondientes GALNS fueron 2,3 veces mayores que
al 36,5% respecto a la actividad en fi- los normales (figura 4C). La cotrans-
broblastos normales (figura 4B). fección con AAV-SUMF1 no produjo
Como se observó en HEK293, la co- un incremento en la actividad GALNS
transfección con AAV-SUMF1 en una en las células cotransfectadas con
relación 1:1 llevó a un incremento de AAV-GALNS.
1,6 veces en la actividad GALNS, lo
que permitió alcanzar el 60% de la Discusión
actividad enzimática normal
(8,05±0,69 U/mg vs. 13,47±1,46 U/ La enfermedad de Morquio A, o
mg). Un incremento adicional de 1,5 mucopolisacaridosis IV A (MPS IV
veces se observó cuando se empleó la A), es una enfermedad de depósito
relación GALNS: SUMF1 1:2. A dife- lisosomal rara que afecta, en prome-
rencia de lo observado en el medio de dio, 1 de 250.000 nacidos vivos
las células HEK293, en fibroblastos de ([Link]). Aunque no exis-
mucopolisacaridosis IV A, la actividad ten cifras sobre la incidencia de esta
en el medio de cultivo sólo fue detec- enfermedad en Colombia, los estudios

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Figura 4. Cotransfección de vectores AAV-GALNS y AAV-SUMF1. (A) Células HEK293

fueron cotransfectadas con 1 x1010 vg de AAV-GALNS y AAV-SUMF1 en una relación 1:1
y 1:2. (B) Fibroblastos humanos de piel con mucopolisacaridosis IV A fueron cotransfectados
con 1 x1010 vg de AAV-GALNS y AAV-SUMF1 en una relación 1:1 y 1:2. (C) Condrocitos
de ratón con mucopolisacaridosis IV A fueron cotransfectados con 1 x10 10 vg de AAV-
GALNS y AAV-SUMF1 en una relación 1:2. La actividad enzimática en el lisado celular y el
medio de cultivo fue determinada fluorométricamente 4 días después de la transfección. *,
p<0,05 y **, p<0,01.

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372

preliminares apuntan a éste podría ser Además, se evaluó el efecto de la co-

uno de los países con mayor número transfección con un vector portando
de individuos afectados por esta en- el gen humano de SUMF1.
fermedad[5, 6]. En la actualidad, no
se dispone de un tratamiento específi- La transfección de células HEK 293
co, por lo cual se maneja exclusivamen- mostró que AAV-GALNS es capaz de
te mediante correcciones quirúrgicas entrar en la célula y expresar el gen
y tratamiento farmacológico[3]. GALNS (figura 2). Como se muestra
en el análisis del ADN durante los diez
La mucopolisacaridosis IV A es días de seguimiento, las variaciones
una excelente candidata para trata- observadas en la actividad enzimática
miento por terapia de remplazo enzi- no fueron producto de pérdidas del
mático, terapia génica o terapia de ADN viral durante el proceso de divi-
reducción de sustrato, debido a la au- sión celular (figura 3A). Por el contra-
sencia de síntomas del sistema nervio- rio, estas variaciones estuvieron
so central. Las observaciones en otras relacionadas con el nivel de ARNm,
enfermedades por depósito lisosómi- lo cual muestra que la actividad enzi-
co de importantes correcciones bio- mática estuvo directamente relaciona-
químicas y clínicas con niveles de da con la expresión inducida por el
actividad enzimática de 10% o me- promotor CMV (figura 3B). Es impor-
nos[13, 24] y los altos costos y efec- tante anotar, en ese punto, que la en-
tos adversos asociados con la terapia zima GALNS presenta una vida media
de remplazo enzimático[12, 38], cons- de 30 minutos a pH neutro[39, 35],
tituyen hallazgos a favor del desarro- por lo que la actividad encontrada en
llo de una estrategia de terapia génica las células HEK293 transfectadas no
para esta enfermedad. Igualmente, el fue producto de enzima presente en
reporte de correcciones completas de las preparaciones virales.
la enfermedad en diferentes modelos
animales (ratón, rata, gato, perro), son Como se observa en la figura 4, los
hallazgos a favor de la posibilidad de valores de actividad GALNS en el
realizar la corrección del defecto en- lisado celular fueron mayores en cé-
zimático en humanos[13, 24, 25]. En lulas HEK293, seguidos por los ob-
el desarrollo de una estrategia de tera- servados en condrocitos de ratón y,
pia génica para la mucopolisacarido- finalmente, los encontrados en fibro-
sis IV A, en el presente trabajó se blastos humanos. Esta diferencia pue-
evaluó la capacidad de un vector de- de deberse a factores propios de la
rivado de virus adenoasociados células, como eficiencia de transcrip-
(AAV) que portan el gen GALNS, para ción, transducción, de entrega de la
transfectar diferentes tipo de células. proteína a su sitio de acción (tráfico

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 373

desde el retículo endoplasmático has- cantidad endógena de SUMF1 no es

ta el lisosoma) y lo más importante, el suficiente para la activación de la sul-
tipo y la extensión del procesamiento fatasa que se encuentra sobreexpresa-
posterior a la transducción. Aunque da y la de las otras sulfatasas[42].
HEK293 no es el sistema de expresión
de proteínas recombinantes más usa- La cotransfección con AAV-
do, presenta una mayor eficiencia para GALNS y AAV-SUMF1 en células
la expresión de un transgen que la HEK293 y fibroblastos humanos de
observada por cultivos celulares pri- mucopolisacaridosis IV A, produjo un
marios[40]. Otros aspectos que pue- incremento en la actividad de hasta 4,5
den afectar los niveles de actividad son y 2,6 veces, respectivamente, en una
la eficiencia en la entrada del vector relación 1,2; mientras que, en condro-
por una expresión diferencial de los citos de ratón con mucopolisacarido-
receptores de membrana o las diferen- sis IV A cotransfectados con SUMF1,
cias en el tráfico del vector en el inte- el incremento de actividad fue de 1,3
rior de cada célula[40, 41]. veces (figura 4). Cosma et al. (42) re-
portaron un incremento de 16, 3, 1,5
Desde el descubrimiento y aisla- y 2 veces en la actividad de arilsulfa-
miento del gen SUMF1, el cual codi- tasa A en células COS-7, hepáticas,
fica para la enzima activadora de HEK293 y U2OS (línea celular de
sulfatasas o enzima generadora de osteosarcoma), respectivamente, co-
formilglicina, y su asociación con la transfectadas con vectores derivados
deficiencia múltiple de sulfatasas, la del virus del herpes simplex, que por-
coexpresión con SUMF1 ha mostrado taban los genes de arilsulfatasa A y
ser de gran importancia, tanto en la SUMF1. Por otro lado, Takakusaki et
producción de enzimas para terapia de al.[44] reportaron un incremento en
remplazo enzimático, como en el tra- la actividad de arilsulfatasa A de 5,8
tamiento de estas enfermedades me- y 6,1 veces en células HEK293 co-
diante terapia génica[42, 43]. Cuando transfectadas mediante liposomas,
una sulfatasa lisosomal es sobreexpre- con plásmidos que portaban los dos
sada, su activación es incompleta, lo genes.
que se manifiesta por una disminución
de los rendimientos de producción, Uno de los trabajos más completos
para el caso de la terapia de remplazo en este campo fue el desarrollado por
enzimático[42]. De otro lado, esta Fraldi et al.[22] en el cual se evaluó el
sobreexpresión puede reducir la acti- efecto de la coexpresión de SUMF1
vidad enzimática de otras sulfatasas, sobre 5 sulfatasas, empleando vectores
lo que lleva a la obtención de un be- lentivirales y virus adenoasociados en
neficio parcial de la terapia, pues la fibroblastos de leucodistrofia meta-

Univ. Med. Bogotá (Colombia), 50 (3): 356-379, julio-septiembre, 2009

374

cromática, condrodisplasia punctata cotransfectadas con SUMF1, el cual

ligada al X, y mucopolisacaridosis II, también fue dependiente del tipo de
III y VI. El incremento en la activi- célula utilizada. En células HEK293,
dad de las sulfatasas estuvo entre 1 y la actividad en medio fue observada
2,1 veces, con respecto al observado con una relación 1:1 e incrementada
en células no cotransfectadas con hasta 4 veces cuando se empleó la re-
SUMF1; e incrementos en la relación lación 1:2, mientras que, en fibroblas-
sulfatasa:SUMF1 por encima de 1:2 no tos humanos de mucopolisacaridosis
produjeron incrementos significativos IV A, esta actividad en el medio se
en la actividad o en la reducción de detectó exclusivamente en células
los glucosaminoglicanos[22], motivo cotransfectadas en una relación 1:2.
por el cual en el presente trabajo sólo Esta diferencia entre la línea celular
se evaluaron las relaciones GALNS: HEK293 y los fibroblastos humanos
SUMF1 1:1 y 1:2. de mucopolisacaridosis IV A (un cul-
tivo primario), está relacionada con la
En cuanto a la coexpresión de mayor eficiencia de HEK293 para ex-
GALNS y SUMF1 en células HEK293, portar proteínas al medio[40].
los valores reportados en el presente
trabajo son 1,7 veces mayores que los Por su parte, los condrocitos de
reportados por la cotransfección de ratón con mucopolisacaridosis IV A
dos plásmidos que porten el gen de presentaron un comportamiento inte-
GALNS y SUMF1 bajo el control del resante. La transfección de los vectores
promotor CMV, mediante el uso de AAV sin CMV-SUMF1 llevó a un in-
liposomas[45]. Aunque es difícil com- cremento en la actividad enzimática en
parar los resultados del presente tra- el medio de cultivo (figura 4), con
bajo con los reportados en la literatura valores de actividad promedio supe-
debido que existe un claro efecto de riores a los observados en el medio de
la enzimas (a pesar de que todas son cultivo de condrocitos de ratón nor-
sulfatasas), promotores, técnicas de males, mientras que la contransfección
transfección y vectores, los incremen- con AAV-SUMF1 no produjo un in-
tos en la actividad enzimática fueron cremento en la actividad GALNS en
similares a los observados con otras el medio de células cotransfectadas
sulfatasas. con AAV-GALNS. Estos resultados en
condrocitos apuntan hacia la existen-
Otro hallazgo similar a lo observa- cia de un mecanismo de control o de
do en reportes de literatura[44, 22], y una ruta saturable durante el procesa-
de gran importancia en terapia génica, miento de la enzima en estas células,
fue el incremento de la actividad en el que regulan los niveles de enzima que
medio de cultivo de las células son secretados. El incremento en la

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 375

actividad GALNS en el medio de cul- al.[49], quienes detectaron la apa-

tivo de células cotransfectadas con rición de hepatocarcinomas en ra-
SUMF1 está relacionado con el incre- tones con mucopolisacaridosis VII,
mento en la estabilidad de la enzima, no se han generado efectos adver-
que evita su degradación y permite sos importantes en 60 estudios clíni-
superar un umbral de enzima activa cos realizados a la fecha, algunos de
en el interior de la célula, por encima ellos con más de 8 años de seguimiento
del cual ésta es secretada en mayor pro- ([Link]
porción[44]. clinical/).

Los valores de actividad enzimáti- Al comparar estos resultados con

ca en el lisado celular y el medio de los obtenidos en trabajos previos con
cultivo fueron menores que los repor- el gen GALNS, se destaca que los va-
tados por Toietta et al.[29], quienes lores de actividad enzimática fueron
emplearon retrovirus para transfectar mayores que los obtenidos con
diferentes cultivos celulares. Aunque vectores AAV (30) y plásmidos trans-
los retrovirus presentan la ventaja de fectados por métodos no virales[45].
generar elevados niveles de expresión En el primer caso, el incremento en la
y transfectar diferentes tipos de célu- actividad enzimática puede ser pro-
las, su principal desventaja radica en ducto de la purificación de los
la capacidad de generar cánceres por vectores, mientras que, en el segun-
mutagénesis por inserción o activación do, el incremento se debe a la mayor
de oncogenes tras su integración. eficiencia de entrega del gen por par-
te del vector AAV que cuando se em-
Hacein-Bey-Abina et al.[46] repor- plean métodos no virales. En la
taron la generación de leucemia en 4 actualidad, estos vectores y otros que
de 10 niños con inmunodeficiencia portan promotores eucarióticos están
combinada grave tratados con células siendo evaluados, tanto in vitro como
hepatomopoyéticas transfectadas con in vivo, en la búsqueda de la mejor
un vector retroviral. En los cuatro ca- estrategia de terapia génica para la
sos, el efecto adverso se produjo por enfermedad de Morquio A.
la activación de diferentes oncogenes
y sólo tres de ellos respondieron posi- Conclusiones
tivamente a la quimioterapia[47]. Por
el contrario, los vectores AAV se pre- El vector AAV-GALNS permitió la
sentan como vectores más seguros, expresión del gen GALNS en células
pues permanecen principalmente de HEK293, fibroblastos humanos de mu-
manera episómica[48] y, con excep- copolisacaridosis IV A y condrocitos de
ción de los hallazgos de Donsante et ratón con mucopolisacaridosis IV A,

Univ. Med. Bogotá (Colombia), 50 (3): 356-379, julio-septiembre, 2009

376

lográndose un incremento en la acti- el Desarrollo de la Ciencia y la Tec-

vidad enzimática entre 5 y 24 veces nología, Colciencias.
los valores basales. La cotransfección
con AAV-SUMF1 permitió un incre-
Bibliografía
mento hasta de 4,2 veces en la actividad
GALNS, con respecto a células transfec- 1. Neufeld, E, Muenzer, J. The Muco-
tadas con AAV-GALNS, llevando a la polysaccharidosis. In: Scriver, C,
obtención de valores de actividad nor- Beaudet, A, Sly, W, Valle, D. eds. The
Metabolic and Molecular Bases of In-
males en fibroblastos de mucopolisaca-
herited Diseases, vol. III. McGraw-Hill:
ridosis IV A cotransfectados en una New York. 2001;3421-52.
proporción AAV-GALNS:AAV-SUMF1
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