C5. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA.
Introducción
La cuantificación de proteínas presentes en medios biológicos es utilizada como
prueba complementaria en el análisis.
Las proteínas son polímeros complejos de aminoácidos que producen las células
vivas. Cada forma de vida se define en gran parte por las proteínas que produce.
Cada proteína está formada por 20 aminoácidos en diversas cantidades y
secuencias (aminoácidos proteicos). Todas las proteínas contienen carbono,
hidrógeno, oxígeno, azufre y nitrógeno. [ CITATION Isa05 \l 2058 ]
El método de Bradford es un método colorimétrico que se basa en la unión del
colorante azul brillante Coomasie G-250 a los residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe
de las proteínas.
El método se basa en la observación de que la absorbancia máxima para una
solución ácida de Azul Brillante Coomassie G-250 cambia de 465 nm a 595 nm
cuando se produce la unión a la proteína. Las interacciones hidrofóbicas e iónicas
estabilizan la forma aniónica del colorante, causando un cambio de color visible.
[ CITATION Dav15 \l 2058 ]
El método de Bradford puede verse afectado por algunos detergentes y como una
desventaja que presenta el método es que el colorante azul de coomasie G-250 se
une fuertemente a las celdas de cuarzo, por lo que se recomienda usar celdas de
vidrio o de polipropileno.
Al igual que para determinar azúcares reductores hay varios métodos, hay varios
métodos para determinar proteína, como son: Método de Lowry (250-270nm),
Ácido bicinconínico (BCA a 562nm), etc.
Absorbancia a 280 nm
El método de cuantificación de proteína por absorbancia a 280 es directo, rápido y
conveniente, ya que no se requieren reactivos o incubaciones adicionales. No es
necesario preparar ningún estándar proteico y el procedimiento no consume la
proteína, además de que la relación entre la absorción y la concentración de
proteínas es lineal, pero debido a que diferentes proteínas y ácidos nucleicos
tienen características de absorción muy variables puede haber cierto error a
considerar, especialmente para las soluciones desconocidas o mezclas de
proteínas ya que cualquier componente no proteico de la solución que absorba la
luz ultravioleta se interferirá con las mediciones.
Las proteínas en solución absorben la luz ultravioleta a 280 nm. Los aminoácidos
con anillos aromáticos son la razón principal del pico de absorbancia a 280 nm.
Los bonos peptídicos son los principales responsables del pico a 200 nm. La
estructura secundaria, terciaria y cuaternaria afecta a la absorbancia, por lo tanto,
factores como el pH, la fuerza iónica, etc. pueden alterar el espectro de
absorbancia [ CITATION Dav15 \l 2058 ].
Objetivos
Objetivo general
determinar la concentración de proteínas por el método de espectrofotometría con
luz visible y UV
Metodología REDCATAR
Absorbancia 280 nm
Figura 1. Lectura de absorbancia de la solución proteica BSA. De la muestra dada de
BSA, se realizaron diluciones de 0 a 1000 μg/mL y se midió la absorbancia de cada
dilución a 280 nm, utilizando agua destilada como blanco. Se registraron y graficaron los
datos.
Método de Bradford
595 nm
Figura 2. Lectura de absorbancia de la solución proteica BSA haciendo uso del método de
Bradford para obtener curva patrón. De la muestra dada de BSA, se realizaron diluciones
de 0 a 1000 μg/mL. Posteriormente se colocó en una celda 250µL de disolución (por
triplicado) y 750µL de reactivo Bradford para cada disolución (en celdas distintas).
Después de cinco minutos, se determinaron las absorbancias a 595nm. Con los datos de
la absorbancia se construyó una curva patrón de solución proteica.
Resultados y Discusión
Figura 3. Curva tipo de BSA con absorbancia a 280 nm
1
0.9 f(x) = 0.11 x − 0.01
R² = 0.98
Densidad óptica [240 nm]
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900
Concentración [µg/mL]
Tabla 1. Densidad óptica UV a 280 nm a diferentes
concentraciones de BSA
Concentració Densidad
n BSA Óptica
[μg/mL] [280 nm]
0 0
100 0.117
200 0.179
300 0.317
400 0.421
500 0.513
600 0.574
700 0.802
800 0.879
900 0.914
Figura 4. Curva tipo de BSA con método de Bradford
1.2
Densidad óptica [595 nm]
1
f(x) = 0.01 x − 0.06
0.8 R² = 0.97
0.6
0.4
0.2
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Concentración [µg/mL]
Tabla 4. Densidad óptica método de Bradford a diferentes
concentraciones de BSA
Concentració Densidad
n óptica
[µg/mL] [595 nm]
0 0
10 0.014
20 0.168
30 0.339
40 0.467
50 0.508
60 0.580
70 0.790
80 0.985
Conclusiones
Se obtuvieron las curvas patrones de … ec´s. R2s y las concentraciones
determinadas
Referencias bibliográficas
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