RESUMEN

Los cultivos de leguminosas Lupinus mutabilis, Medicago sativa y Vicia faba, son
cultivos abundantes en la región del altiplano de nuestro país. Sus capacidades
de asociación con bacterias del género Rhizobium hacen posible la formación de
nódulos radiculares lo que genera el aprovechamiento del nitrógeno atmosférico
para su desarrollo. Con el aprovechamiento de la fijación biológica de nitrógeno
se tiene un beneficio social al reducir los costos de producción ya que influye en
la baja del consumo de fertilizantes químicos nitrogenados y un beneficio
ambiental al evitarse la contaminación de los recursos suelo y agua causada por
las fuentes químicas de nitrógeno.

El objetivo principal del presente trabajo de investigación, fue la de aislar e

identificar, en una primera fase, a las cepas de bacterias nativas de Rhizobium
extraídas de cultivos de leguminosas propias de la región del altiplano del
departamento de La Paz. Siguiendo el protocolo de aislamiento de cepas, se
determinó el nivel óptimo del Mannitol, identificando al mismo tiempo las
características macroscópicas y microscópicas de las bacterias para finalmente
evaluar el desarrollo y comportamiento fenotípico de las colonias bacterianas
según su forma, tamaño y crecimiento en el medio de cultivo artificial Y-M-A
(Manitol-Agar-Levadura) bajo condiciones de laboratorio.

Como resultado de evaluación de la aplicación de diferentes niveles de

Mannitol distribuidos en 5 g*L-1, 10 g*L-1 y 15 g*L-1, se observó que a mayor
dosis de Mannitol las bacterias son de crecimiento rápido desarrollándose
por completo antes de los siete días de incubación, las bacterias extraídas
de Lupinus mutabilis tuvieron mejor adaptabilidad a dosis alta de Mannitol
(15 g*L-1), mientras que la especie Vicia faba tuvo mayor desarrollo del
número de colonias bacterianas a una dosis de 5 g*L -1 de Mannitol. La
identificación de bacterias sospechosas de pertenecer al género
Rhizobium se realizó mediante la tinción de Gram, observándose que la
mayoría de las bacterias fueron móviles a simple observación
microscópica y adquirieron coloración rosada a fucsia, considerándose
bacterias Gram(–). Finalmente, según el análisis de varianza no han
existido diferencias significativas en la forma de las cepas siendo que gran

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Silvia Erika Paxi
Churata
 número de colonias bacterianas (90% de colonias) fueron de crecimiento
lento y de tamaño mediano.
1 INTRODUCCIÓN
La creciente demanda de productos y el notable incremento de la producción
agrícola, ha generado en gran manera el uso generalizado de abonos químicos,
fertilizantes y semillas mejoradas, aunque estos promovieron un incremento
considerable de los rendimientos agrícolas durante varios años, ahora son la
principal causa de la perdida de la fertilidad de los suelos, la contaminación de las
aguas subterráneas y, en muchos casos, de daños a la salud humana.
Es en este contexto, que se opta por la producción de fertilizantes orgánicos o
bio-fertilizantes nitrogenados como alternativas para la producción orgánica sin el
uso de los pesticidas químicos que se utilizaban en la agricultura convencional. La
fijación biológica de nitrógeno es la opción natural y una alternativa a la
fertilización química. De todos los seres vivos, solo un centenar de géneros de
bacterias están capacitados para fijar nitrógeno del aire, donde este elemento
constituye alrededor del 70% y convertirlo en compuestos asimilables por todos
los organismos (Rodríguez et. al., 1984).

Es así que, en el año 1994 generan tecnologías para la producción de

inoculantes de alta calidad con base a soporte sólido para soya, frejol, haba,
arveja, alfalfa, trébol y otras leguminosas que se cultivan en el departamento de
Santa Cruz, Bolivia. La producción de inoculantes alcanzó una escala semi-
industrial y el Inoculante N2 para soya, tiene amplia aceptación entre los pequeños,
medianos y grandes agricultores bolivianos (CIAT, 2011). Aproximadamente ¼ de
las 800.000 ha de soya que reportó el INE para el 2014 se sembraron en la
campaña de invierno, en la que se estima se inoculó un 80% de las semillas
(Abela et. al., 2006). En la actualidad, muchas de las especies de la familia
Fabaceae tienen una gran importancia económica sobre todo por su interés en la
alimentación humana y animal (Velázquez et al., 2010).

El lupino juntamente con la haba y la alfalfa, cultivos propios del altiplano,

tienen una capacidad de fijar el nitrógeno gracias a los nódulos que presentan en
las raíces principales y secundarias, teniendo una capacidad fijadora de nitrógeno
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Silvia Erika Paxi
Churata
de 150 – 200 Kg de N por hectárea (Cerda, 2008). El lupino o altramuz es una

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Silvia Erika Paxi
Churata
planta nueva para la investigación científica en el campo de la Rhizobiología,
respecto al reciente interés en el cultivo de variedades mejoradas; teniendo como
conocimiento de su cultivo en suelos pobres desde hace 2000 años, empleándolo
a su vez para abonado verde logrando incrementar los nutrientes nitrogenantes y
gracias a la simbiosis con bacterias del suelo pertenecientes generalmente al
género Rhizobium, promueve la fijación de nitrógeno y su incorporación al suelo.

Es desde este contexto que se realizó esta investigación con el objetivo de

consolidar una tecnología microbiana, puesto que existe un vacío de conocimiento
en el área de Rhizobiología; este estudio permitirá la preparación de un medio de
cultivo artificial, denominado Y-M-A (Yeast, Mannitol and Agar), donde el principal
componente es el manitol como fuente de carbohidratos para el desarrollo de las
bacterias, lo que permitirá la adaptación al medio de cultivo y posterior producción
de un bio-fertilizante orgánico de tenor elevado en nitrógeno. Se detalla una fase
inicial que responde al aislamiento de microorganismos de vida libre, capaces de
fijar el nitrógeno atmosférico, cuyas muestras fueron tomadas y aisladas de
cultivos de tarwi (Lupinus mutabilis), haba (Vicia faba) y alfalfa (Medicago sativa),
que son propias del altiplano y gracias a las características agronómicas que
presentan en la nodulación de bacterias fijadores de N 2, posteriormente se
pretende lograr una producción masiva de estos microorganismos bajo
condiciones de laboratorio. Para la identificación de las bacterias se realizó
mediante la tinción Gram, que nos facilita conocer las características intrínsecas
que presentan los microorganismos aislados de los cultivos andinos.
OBJETIVO GENERAL

Identificar y evaluar las cepas nativas de Rizhobium sp., aisladas de

cultivos de tarwi (Lupinus mutabilis), haba (Vicia faba) y alfalfa (Medicago
sativa) en base a tres dosis de Manitol en el Altiplano Norte – LaPaz.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Aislar las cepas nativas de Rizhobium sp. siguiendo el protocolo de

 Rhizobiología propuesto para el presente trabajo de investigación.

 Determinar el nivel óptimo de Manitol en el medio de cultivo artificial para

el desarrollo de las cepas nativas de Rizhobium sp.

 Identificar las características macroscópicas y microscópicas de los

morfotipos de Rizhobium sp. extraídos a partir de tres especies de
leguminosas.

 Evaluar el desarrollo y comportamiento fenotípico de las colonias

bacterianas según su forma, tamaño y crecimiento.
1.1 Las leguminosas

Las leguminosas son un grupo de plantas que se incluyen en la División

Magnoliofita, Clase Magnoliopsidae, y Orden Fabales. Su nombre deriva del latín
legumen (semillas con vaina). Actualmente se acepta que todas las leguminosas
pertenecen a una familia denominada Fabaceae con tres subfamilias:
Mimosoideae, Caesalpinoideae y Papillionoideae (Cronquist, 1988). La mayoría de
las especies de las subfamilias Faboideae y Mimosoideae en las que se ha
estudiado la capacidad de nodulación, son capaces de establecer simbiosis con
rhizobia. En la subfamilia Caesalpinoideae se han encontrado nódulos en pocos
de los géneros estudiados (Allen y Allen, 1981; Foster et al., 1998; Sprent et al.,
1993).

1.1.1 Clasificación taxonómica general (Contreras et al., 2007)

Reino: Vegetal
Subreino: Embriophyta
División (phyllum): Tracheophyta
Subdivisión (subphyllum):
Pteropssida Clase: Angiospermae
Subclase: Dicotyledoneae
Orden: Leguminosae (Leguminales)
1.1.2 Características morfológicas del Orden Leguminosae
Las leguminosas (Leguminosae, Fabaceae) constituyen un gran grupo de
organismos vegetales, dentro de los que se destacan árboles, arbustos, hierbas y
enredaderas. Existen alrededor de 18000 especies de leguminosas (Coiné, 2000;
Azcarraga y Rabiza, 2001). Estas se caracterizan por tener hojas compuestas y
paripinnadas o imparipimnadas; frutos en forma de “vaina” o “legumbre”, siendo
generalmente dehiscente por las dos suturas. (CIAT, 1987). El tallo de las
leguminosas es aéreo herbáceo o leñoso pero siempre flexible y con entrenudos
alargados, condición que permite clasificar a este tipo de plantas en: “volubles”,
caracterizadas por enroscarse sobre soportes u otras plantas y “con tallo
endeble”, las cuales trepan por medio de zarcillos foliares o caulinares. Las flores
son hermafroditas, zigomorfas, hipóginas, pentaméricas y vistosas, predominando
los colores amarillo, rojo y violáceo.

El cáliz en la mayoría de las especies está compuesto de cinco sépalos que

pueden ser libres o soldados en la base (disépalo), puede ser tubular, cuculiforme
o infundibuliforme. El ovario es unilocular y puede ser ovoide cilíndrico o deprimido
y sentado; los ovarios son apriétales e insertados en una sola hilera en la sutura
ventral; las semillas pueden ser reniformes, esféricas, lenticulares, poliédricas o
discoides, con superficies lisas, rugosas o estriadas; el embrión puede ser recto o
curvo, con dos cotiledones opuestos, gruesos o planos; algunas presentan
nódulos radicales fijadores de nitrógeno atmosférico capaces de convertirlo en
otros compuestos nitrogenados disponibles para la planta (CIAT, 1987).

1.1.3 Familia Leguminosae

La familia Leguminosae es la tercera familia más grande de las plantas con
flores con distribución en todo el mundo. Leguminosae está dividida en tres
subfamilias: Mimosoideae, Caesalpinoideae y Papilionoideae, basándose
fundamentalmente en diferencias florales (Sprent, 2001). Existen cerca de 152
géneros y 2 800 especies en Caesalpinioideae, cerca de la misma cantidad en
Mimosoideae y 480 géneros con 12 000 especies en Papilionoideae
(Somasegaran y Hoben, 1994).

1.1.4 Orígenes de leguminosas

Las leguminosas son originarias de los trópicos, estando relacionada la
primera infección por Rhizobium a una leguminosa de clima templado. De igual
manera se indica que la leguminosa tropical primitiva fue un árbol, y que su
evolución ha sido árbol – arbusto – trepadora – leñosa – hierba perenne – hierba
anual (Norris, 1956).
El mismo autor, indica que junto con los cereales, las leguminosas fueron las primeras plantas
cultivadas por el hombre. Hace unos 10.000 años, en el Neolítico, en la región del Próximo
Oriente situada entre los ríos Tigris y Eufrates, los asentamientos humanos comenzaron una
recolección preferencial de los frutos de la asociación existente entre plantas de trigo, cebada,
yeros y guisantes, produciéndose así el primer paso hacia el nacimiento de la Agricultura, de la
cual hay constancia en los restos fósiles de plantas de trigo, cebada, lentejas y guisantes ya
domesticadas con unos 8.000 años de antigüedad. En América, las judías se consumen desde la
época precolombina en combinación con maíz.

1.1 Tarwi o lupino (Lupinus mutabilis)

1.1.1 Características morfológicas de la especie

Para ((Aitken, 1987) el tarwi es una planta erecta anual que crece hasta
1.50 m. de alto, con flores decorativas principalmente de color azul variado al
purpura y amarillo. La inflorescencia es en racimo, compuesta de numerosas
flores que pueden ser desde 4 hasta 30 como máximo. El color de las flores varía
de blanco, amarillo, naranja, rosa, rojo, azul, verde, violeta y marrón. Es frecuente
la existencia de floraciones sucesivas, hasta tres o cuatro (Fig. 1).

Según (Box, 1961) indica que el sistema radicular es pivotante y profundo,

con diferencia entre especies en cuanto a su longitud. Tallo ramificado, glabro o
pubescente, alcanzando alturas de más de un metro. Las ramificaciones laterales
son de hasta cuarto orden, variando el punto de inserción en las especies.

Las hojas son compuestas, digitadas, increpadas en un largo peciolo. Los

foliolos son ovoides o lanceolados, según las especies, y su número varia de 5 y
12, siendo entre 7 y 9 lo más frecuente.
 Figura 1: Morfología externa de la planta Lupinus mutabilis.
Cultivo de tarwi en la comunidad de Pichari - Puerto Acosta.

Las vainas pueden contener de dos a nueve semillas, el número más

frecuente esta entre tres y seis. La dehiscencia de las vainas es un carácter propio
de las especies silvestres, como mecanismo de reproducción.
Las semillas presentan formas y tamaños muy variados. El peso de 1.000
semillas es variable según las especies: de 240 a 600g en el L. albus o de 130 a
200 g en L. angustifolius.

1.1.2 Germinación
La germinación se inicia con la inhibición de la semilla y continúa con la
aparición de la radícula; ésta última presenta una gran elongación antes de que
aparezca el hipocotilo. El lupino o tarwi, a diferencia de otras leguminosas, es una
especie de germinación epígea, lo que determina que los cotiledones sean
conducidos por el hipocotilo sobre el nivel del suelo. Al terminar el crecimiento del
hipocotilo, a partir del punto en que se presenta insertos los cotiledones, se genera
el crecimiento del epicotilo, el cual presenta una mínima elongación antes de dar
paso a la primera hoja. La radícula, luego de la emergencia de las plántulas, va
profundizando y creciendo rápidamente hasta transformarse en una fuerte raíz
pivotante. Ésta presenta múltiples ramificaciones y gran cantidad de raicillas y
pelos radicales, originándose un sistema radical de gran crecimiento. (Fig. 2).

Figura 2: Proceso de germinación y crecimiento de una semilla de Lupinus sp.

3.3 Haba (Vicia faba)

3.3.1 Características morfológicas de la especie

El haba es un cultivo herbáceo anual. La altura de la planta es muy variable

en función de las condiciones medioambientales, oscilando entre 50 y 200 cm.,
aunque hay variedades enanas.

Según (Coa, 2001) señala que el haba es un cultivo anual. El sistema

radicular es desarrollado y es capaz de formar nódulos mediante la asociación con
Rhizobium. El tallo es de sección cuadrangular, hueco y que alcanza una altura
de 0,8-1,5 m. Es de color verde y a veces se observan unas manchas más o
menos intensas, según variedades. Las hojas son compuestas con 2 o 4 foliolos
de forma oval y color verde oscuro. Están provistas de unas estipulas bastante
desarrolladas que a veces poseen manchas oscuras. Las flores se agrupan en
inflorescencias que surgen de las yemas axilares en número de 2-8. Son de color
blanco, a veces teñido de color violáceo. El fruto es una legumbre de forma y
tamaño variable. Las vainas por nudo varían de 1 a 4. En el interior de la vaina se
desarrolla un tejido blanco que le dan un aspecto y tacto característico. Las
semillas son de tamaño mediano grande y de forma oblongada. Su color es verde
o crema. El peso de las 1000 semillas se sitúa en torno a 1500g. Poseen una
capacidad germinativa de unos cuatro años.

Figura 3: Morfología externa de la planta de Vicia faba.

3.3 Alfalfa (Medicago sativa)
3.3.1 Características morfológicas de la especie
El ciclo vegetativo de la planta de la alfalfa se considera una planta
perenne. Cuando los alfares son viejos, 8 a 12 años, disminuyen notablemente su
rendimiento. Además es difícil “desatarlos” es decir ararlos nuevamente pues las
raíces de alfalfa pueden ser muy gruesas y rompen los discos, sobre todo las
puntas de los arados de vertedera. Un buen alfar no debe durar más de 6 años
aprovechando de hacer una rotación con papa cuando se “desata”.
 Planta perenne de 10-80 cm, herbácea, de pilosidad variable. Hojas
trifoliadas, folíolos obovados, más o menos estrechos, con el margen aserrado en
su extremo, el central peciolulado, estípulas sub-enteras. Flores con corola de
violeta a púrpura o amarilla. Inflorescencia con numerosas flores en racimos
densos terminales, con pedúnculo más largo que la hoja adyacente. Legumbre de
espiralada (2-3 espiras abiertas) a falcada (AIFE, 1998).

Figura 4: Morfología externa de la planta de Medicago sativa.

3.4 Simbiosis Rhizobium – Leguminosa

La asociación mutualista de rhizobia y leguminosas ha sido desde siempre la
más estudiada por la importancia agronómica, económica y social que tiene el
cultivo de estas plantas a escala mundial. Ambos partícipes son capaces de vivir
independientemente, sin embargo, los dos se benefician mutuamente de la
interacción que se caracteriza por la formación de nódulos fijadores de nitrógeno
que, en la mayoría de las leguminosas, se forman en la raíz. Los nódulos son
órganos especializados que se desarrollan como resultado de un diálogo
molecular por parte de los rhizobia y de las plantas (Gibson, 2008).
 La simbiosis es la convivencia de dos organismos no semejantes en una
relación de beneficio mutuo generándose una interdependencia fisiológica. En el
caso de la simbiosis leguminosa – rizobium, el microsimbionte, la bacteria, utiliza
el carbono y la energía fotosintética del macrosimbionte (la planta) le entrega
amoniaco, producto de la fijación de N 2 atmosférico. Este proceso se lleva a cabo
en los nódulos.

Para (Allen, 1981) la mayoría de las especies de las subfamilias Faboideae y

Mimosoideae en las que se ha estudiado la capacidad de nodulación, son
capaces de establecer simbiosis con rhizobia, formando nódulos radicales
generalmente y caulinares ocasionalmente. En la subfamilia Caesalpinoideae se
han encontrado nódulos en pocos de los géneros estudiados. Algunos autores
sugieres que esto puede ser debido a que, aunque todas las leguminosas puedan
ser capaces de tener una simbiosis con rhizobia como endófitos, no todas pueden
formas nódulos.

La fijación simbiótica de N2 tiene un alto costo energético para la planta,

mayor que el de tomar el N del suelo. La planta debe destinar entre 6 y 12 g de
compuestos carbonados por cada gramo de N fijado. La asimilación de N a partir
de nitratos del suelo es entre 6 a 8 veces energéticamente más eficiente para el
cultivo (Fernández, 2003).

El mismo autor nos indica que, la simbiosis leguminosa – rizobium es la

adaptación a un medio deficitario en nitrógeno. En suelos ricos en N, las
leguminosas de las bacterias. Por el contrario, si la bacteria está presente y los
niveles de N del suelo son bajos, la planta estimula el ingreso de los rizobios a la
raíz, que fijaran N2 atmosférico.
Según (Rodríguez, 1984) señala que dentro las propiedades de las simbiosis
cabe destacar:
a) Especificidad; o propiedad por la que el microbio infecta selectivamente a
la planta hospedadora. La magnitud de la misma varía de unas simbiosis a
otras, y así, por ejemplo, ciertas leguminosas tienen requerimientos muy
concretos para “su rizobio”, mientras que otras aceptan un espectro más
 amplio, y, viceversa, un determinado rizobio puede infectar una sola especie
de leguminosa, un grupo de especies, o incluso miembros de distintos
géneros o subfamilias. Esta especificidad, que también se da en plantas
actinrrícicas, aquellas que forman simbiosis con actinomicetos, han llevado a
definir varios grupos de Rhizobium y Frankia.
b) Infectividad, o capacidad del microbio para invadir la planta hospedadora.
c) Efectividad, o capacidad para que el nódulo se lleve a cabo la secuencia de
un proceso que conduzca a la reducción de nitrógeno atmosférico a
amoníaco. Hay una gran variedad entre las razas de in microbio infectivo,
que va desde totalmente infectivas, a otras altamente infectivas.
Del mismo modo (Rodríguez et al., 2003), señala que el microbio efectúa su
entrada en la planta, bien por los pelos absorbentes de la raíz, bien sea a través
de su epidermis. Posteriormente, se ubica en los nódulos, aislado del ambiente
exterior, encerrado en el interior de la planta hospedadora. Esta localización
plantea la necesidad de la existencia de un intercambio metabólico entre los dos
simbiontes, que implica el suministro por la planta de los nutrientes y compuestos
carbonados necesarios para el microbio.

3.5 Fijación biológica del Nitrógeno

Se conoce desde el siglo pasado, cuando se estableció que era una

actividad característica de ciertas bacterias, y que algunas plantas podían
establecer relaciones simbióticas con plantas. Según (Grisales et. al., 2005); la
fijación simbiótica de nitrógeno en Rhizobium se lleva a cabo en los bacteroides
que se encuentran en el citoplasma de las células del nódulo.
La simbiosis con capacidad de fijación biológica de N2 con mayor
importancia agronómica es entre las plantas de la familia Leguminosas (como
soja, lupino, arveja, lenteja, alfalfa, tréboles, vicia, maní, etc.) con bacterias de la
familia Rhizobiaceae o rizobios (Fernández, 2003). El Rhizobium es un
microorganismo que posee la habilidad de convertir el dinitrógeno atmosférico (N 2)
a amonio (NH4+) mediante la acción de la enzima nitrogenasa. De esta forma, el
nitrógeno molecular es incorporado a la biosfera y utilizado directamente por las
plantas a través de la fijación simbiótica. Estas especies son denominadas
diazótrofos y requieren de energía para realizar su metabolismo. Varias moléculas
de ATP son necesarias tanto, para la activación de la enzima, como para la
provisión de electrolitos para la reducción (Jiménez et al., 1998).

Según (Díaz, 2010) señala que las plantas toman el nitrógeno directamente
desde el suelo en forma de nitratos (NO3 -) o amonio (NH4+), algo que no pueden
hacer los animales, que precisan tomarlo en forma de compuestos orgánicos. Sólo
algunos procariotas pueden tomar el nitrógeno directamente desde la atmósfera,
vía fijación de nitrógeno, convirtiendo el nitrógeno molecular en nitrógeno
asimilable por otros seres vivos. Teniendo en cuenta que este elemento es muy
abundante en la atmósfera, la obtención de nitrógeno directamente desde ésta es
una de las vías más importantes para el mantenimiento del ciclo del nitrógeno, del
que forman parte las bacterias fijadoras de nitrógeno, junto con otros grupos de
bacterias que llevan a cabo procesos intermedios de transformación de
compuestos nitrogenados y de des-nitrificación, que devuelve finalmente el
nitrógeno a la atmósfera. Por lo tanto, la existencia de un equilibrio en el ciclo del
nitrógeno es fundamental para la vida en la tierra y esto conlleva el mantenimiento
de los ecosistemas microbianos presentes en los medios terrestres y acuáticos.
La fijación biológica de nitrógeno supone más del 60% de la fijación global
del nitrógeno en la tierra y los microorganismos que llevan a cabo este proceso se
denominan diazotrofos. La enzima responsable de la fijación de nitrógeno se
denomina nitrogenasa y está compuesta por dos metaloproteínas, una con Fe
(ferroproteína o nitrogenasa reductasa) y otra con Fe y Mo (ferromolibdoproteína o
nitrogenasa propiamente dicha) como grupos activos (Díaz, 2010). La nitrogenasa
es una proteína de gran tamaño que contiene Fe y es codificada por nifH, y la
proteína tetramerica que contiene (Fe) y molibdeno (Mo), codificada por los genes
de nifD y nifK (Fernández, 2003).

La eficiencia de la fijación de nitrógeno es relativamente baja en el caso de

los fijadores libres ya que el nitrógeno fijado es posteriormente metabolizado y
eliminado por desnitrificación y lavado. La fijación en vida libre sólo aporta al suelo
unos cientos de gramos de nitrógeno por hectárea y año, que si bien son
suficientes en condiciones naturales, están muy lejos de satisfacer las
necesidades de los cultivos (Olivares, 2004).

Sin embargo, la fijación en simbiosis es mucho más eficiente, calculándose

que sólo la asociación rhizobia – leguminosa puede llegar a aportar más de 300
kilogramos por hectárea y año, tal como se observa en el cuadro 1 según
señalado por (Allen et al., 1981). Por ello determinados que los cultivos de
leguminosas no requieren fertilización nitrogenada para que se incremente su
contenido en proteínas, contribuyendo además al enriquecimiento del suelo en
nitrógeno, que puede ser aprovechado por cultivos asociados o por las
plantaciones posteriores en una rotación de cultivos (Urzúa, 2005).

Cuadro 1. Valores medios de fijación de nitrógeno de algunas leguminosas

(Allen et al., 1981).

LEGUMINO NITROGENO Especie de

SA FIJADO Rhizobio
Kg N/Ha*Año
Alfalfa 200 - 250 R. meliloti
Altramuz 150 R. lupini
Trébol 100 – 150 R. tripolii
rojo
Meliloto 100 – 125 R. meliloti
Veza 100 – 120 R. leguminosarum
Guisante 100 R. leguminosarum
Lenteja 100 R. leguminosarum
Soja 80 – 90 R. japonicum
Garbanz 60 – 80 R. leguminosarum
o
Judía 50 R. phaseoli

El rol de los microorganismos fijadores en la mejora de la fertilidad del suelo

es conocido desde hace muchos años en el campo de la agricultura. Pero debido
al reciente interés que se muestra respecto a la producción de estos
microorganismos nitrogenantes donde el incremento de su aplicación puede
mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su
consiguiente efecto benéfico de fijación biológica del N2. Asimismo, tiene su relevancia porque
puede reemplazar el uso de fertilizantes químicos a fin de coadyuvar el grado de fertilidad del
suelo; por consiguiente se realizó el siguiente trabajo de investigación con la finalidad de crear
una alternativa que ayude a incrementar conocimientos en esta área logrando de esta manera
una mejora de los suelos del sector del altiplano norte que es donde se tiene mayor carencia de
nutrientes en el suelo y un déficit del manejo y uso de bio-fertilizantes lo cual ocasiona un bajo
rendimiento y menor producción agrícola.

3.3 Importancia agronómica del Nitrógeno

El nitrógeno es uno de los elementos más importantes para las plantas,

y su disponibilidad condiciona en gran medida la productividad de los
cultivos. Es indispensable para el crecimiento de todo organismo vivo. Es
también componente de moléculas esenciales para la vida de las plantas,
condicionando la calidad de las estructuras y los procesos en los que estas
intervienen. Está presente en los ácidos nucleicos (ADN y ARN), las
vitaminas y en las moléculas de almacenaje de energía (Fernández, 2003).
El efecto fertilizante de estas plantas se manifiesta también, en
pastizales, habiéndose demostrado que el aliso incrementa la producción de
un pasto de gramíneas subyacente, proporcionando al ganado un alimento
de mayor calidad proteica y digestibilidad. Asimismo, hay que hacer notar
que las especies que crecen en los márgenes de las corrientes de agua,
actúan como fuente de proteína para la alimentación de la fauna acuática, y
de todos es sabido que las zonas de pesca más ricas en aguas dulces se
sitúan precisamente en los lugares donde existen alisos (Fernández, 2003).

Respecto del problema de la erosión hay que tener en cuenta que sólo
en nuestro país, un 25 por ciento de su superficie sufre fenómenos de
erosión grave, y más del 27 por ciento sufre de erosión moderada y pasará a
engrosar el capítulo de la erosión grave si no se actúa con prontitud. Cada
año, las aguas arrancan y transportan 1.000 millones de Tm. de nuestro
suelo, parte de los cuales se
 depositan en la red de embalses, disminuyendo así gradualmente la riqueza
hidráulica al reducirse su capacidad. Todo ello presenta a nuestro país como
el único europeo en claro proceso de desertización. por consiguiente, es
urgente la realización de estudios sobre la viabilidad de la utilización de
plantas actinirrícicas, tanto para regenerar las zonas degradadas como para
fertilizar otras especies usadas en repoblación cuando ello sea posible
(Orsag, 2007).
Los suelos desérticos o no fertilizados como los del altiplano, presentan deficiencias en
nitrógeno; sin embargo, tomando en cuenta que las leguminosas tarwi, presenta simbiosis
con las bacterias fijadoras de Nitrógeno, obtener cepas de Rhizobium y Bradywhizobium
fuertemente resistentes y efectivas, lograra mejorar la simbiosis y por lo tanto la calidad
nutricional del tarwi y de las leguminosas en general, asi como la fertilización de los
suelos (Sucojayo et al., 1998).

3.3 H Género Rhizobium

Según (Díaz, 2010) indica que los microorganismos capaces de establecer

simbiosis con leguminosas se conocen con el nombre de rhizobia o rizobios y
engloban actualmente a una gran variedad de bacterias. El conocimiento de la
existencia de estos microorganismos data de finales del siglo XIX cuando, por
primera vez, Frank en 1889 denominó Rhizobium leguminosarum a las bacterias
aisladas a partir de nódulos de leguminosas. Fue este nombre el que dio origen al
genérico de rhizobia para designar a todas las bacterias formadoras de nódulos en
leguminosas.
El género Rhizobium, junto con los géneros Agrobacterium y
Chromobacterium forman la familia Rhizobiacea; este deriva su nombre del griego
“Rhiza” = raíz y “bios” = vida. La característica más importante es su habilidad
para producir nódulos en las raíces de las leguminosas, y vivir en asociación
simbiótica con estas plantas mientras fija nitrógeno libre, lo cual no ocurre cuando
los organismos están separados de la planta (Vargas De Rozo, 1969).
El mismo autor; nos indica que el rizobio es un habitante natural del suelo
que subsiste como heterótrofo, pero no necesariamente existe en todo los suelos,
también puede ser saprófito al desarrollarse en ausencia de la planta hospedante,
sin embargo, su existencia libre continua en los suelos, dependiendo de la
presencia de una raíz “hospedante” que estimule su proliferación.
El Rhizobium no es el único organismo beneficioso asociado con las raíces
y los nódulos, también lo son los actinomicetos del género Frankia y otros,
capaces de formar nódulos fijadores de nitrógeno en árboles y en arbustos de
climas templados. El Rhizobium al estar en la planta es capaz de cambiar a una
forma bacteroidal en los tejidos nodulares, lo cual también puede ocurrir en
condiciones adversas en medios de cultivo (Vargas De Rozo, 1969).
Asimismo, el mismo autor señala que la mayor parte de los rizobios están
en la capa de suelo de 0 – 1 pulgada y sólo algunos están presentes en la capa de
1 – 4 pulgadas y en los horizontes más profundos. Algunas veces los rizobios
pueden ser estimulados por leguminosas no hospedantes y aún por plantas no
leguminosas. Para ejercer el estímulo sobre los bacterios, las plantas no
leguminosas requieren estar firmemente adheridos a la superficie de la raíz, en
cambio en las leguminosas la superficie radical parece estar relativamente libre de
rizobios y el estímulo lo ejerce la raíz a distancia de 10-20 mm.

3.3.1 Morfología del Género Rhizobium

Estos rizobios son bacilos Gram negativos que miden entre 0.5-1.0 µm de
ancho por 1.3-3.0 µm de largo; contiene granos de poli–B –hidroxiburato, y se
desplazan por medio de 1-6 flagelos que pueden ser perítricos o subpolares
(Vargas De Rozo, 1969).
Las colonias son semitranslúcidas u opacas y mucilaginosas; miden de 2-4
mm de diámetro a los 3-5 días de incubación en el medio Agar – Levadura –
Manitol (Y.M.A). El crecimiento en medio de carbohidratos generalmente está
acompañado de reacción ácida y abundante cantidad de polisacárido extracelular;
son quimio-organotróficas, pues utilizan una gran variedad de carbohidratos y
ácidos orgánicos como fuente de carbono y energía; las cepas de este género son
bacterias de rápido crecimiento y productoras de ácido en Y.M.A (Coiné, 2000).
Algunas cepas requieren glucosa, galactosa, fructosa, biotina, acido nicotínico,
pantotenato o tiamina como factores de crecimiento (Martínez et al., 2000).
Según (Martínez et al., 2000) señalan que se ha reportado que los rhizobios
tienen tres diferentes estados de vida: uno, dentro de los nódulos de las
leguminosas, otro, en el suelo y otro dentro de plantas no leguminosas como
endófitos, de acuerdo con los resultados de sus estudios reconoce como el ciclo
de vida más simple de este organismo en que tiene una secuencia de cocoides
(formas muy pequeñas y móviles de las bacterias), bacilos y bacteroides, pero
estos últimos no son capaces de crecimiento y reproducción posteriores.
Morfológicamente hablando, los bacteroides pueden ser esferoidales, ramificados
o en forma de bacilo con numerosos tipos intermedios; el término “bacteroide”
debe ser usado para todas las formas de Rhizobium que se encuentran dentro de
la célula hospedante infectada, independientemente de su morfología, puesto que
todas ellas tienen la misma función en el nódulo.

3.3.2 Taxonomía de los Rhizobium

Según (Wang et al., 2001) señala que a partir de un nódulo de raíz de

leguminosa en 1888, Beijerink, obtuvo por primera vez un cultivo bacteriano puro
y llamó a la bacteria Bacillus radicicola. Posteriormente, Frank propuso el nombre
Rhizobium para estos aislados. Debido a que los aislados bacterianos eran
diferentes según el huésped específico del que se obtenían, para 1929 ya se
habían reconocido seis especies: R. leguminosarum, R. trifolii, R. phaseoli, R.
meliloti, R. japonicum y R. lupini. En esta clasificación, cada especie era un grupo
que se componía de cepas que nodulaban a un conjunto de leguminosas
huésped.
Para (Díaz, 2010) la clasificación, identificación y nomenclatura de los
rhizobia sigue las normas de la Taxonomía bacteriana. La clasificación es la
estructuración de los organismos en grupos (taxones), en función de sus
similitudes o parentesco evolutivo. La identificación consiste en determinar la
identidad de un aislado como miembro de un taxón establecido, teniendo en
cuenta que el grupo taxonómico básico en taxonomía bacteriana es la especie. La
especie es un grupo de cepas que comparten características fenotípicas y
genotípicas que son diferentes significativamente de otros grupos de cepas.
Por lo tanto, para identificar o clasificar una cepa aislada a partir de nódulos
de leguminosas deben estudiarse una serie de caracteres, tanto fenotípicos como
genotípicos, que permitan determinar su relación con los taxones establecidos.
Una vez recogidas suficientes características de un aislado, puede procederse a
su clasificación dentro de un taxón determinado. La clasificación puede ser de tipo
fenético que agrupa a las bacterias en función de sus características fenotípicas o
filogenético que las agrupa en función de sus relaciones evolutivas. Lo ideal es
aplicar ambos tipos de esquemas en la clasificación y descripción de las especies,
aplicando los principios de la “Taxonomía Polifásica”; que recoge e integra
diversos niveles de información, desde moleculares a ecológicos, para crear una
taxonomía multidimensional. En la actualidad, y siguiendo los principios de la
Taxonomía Polifásica, la taxonomía de los rhizobia se basa en características
fenotípicas, genotípicas y simbióticas (Díaz, 2010).
La caracterización fenotípica de los rhizobia, al igual que la de otras
bacterias, debe incluir fundamentalmente la descripción morfológica de células y
colonias, la velocidad de crecimiento y las condiciones de cultivo en las que se
produce, la asimilación de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno, la producción
de exo-enzimas y la resistencia natural a antibióticos. No obstante, este tipo de
clasificación (fenética) no está muy desarrollada en el caso de los rhizobia, puesto
que no se han estudiado este tipo de características de manera uniforme en todas
las cepas por lo que su utilidad está prácticamente limitada por el momento a la
descripción de nuevas especies (Álvarez, 1997).

Por el contrario, la clasificación filogenética, gracias a los avances de la

Biología Molecular, constituye actualmente la principal herramienta para la
taxonomía de los rhizobia, así como se muestra en el cuadro 2. Los genes
analizados en este grupo de bacterias son similares a los utilizados en otros
grupos considerándose a los genes ribosómicos la mejor diana para el estudio de
las relaciones filogenéticas debido a su presencia en todas las bacterias, su
constante funcionalidad y su composición altamente conservada en todos los
dominios (Díaz, 2010).
Según (Grisales et al., 2005) indica que el cúmulo de estos datos se evalúa
normalmente por un análisis de agrupamiento, la llamada taxonomía numérica.
Las características fenotípicas pueden ofrecer una visión detallada de la variación
de las bacterias dentro de una especie o entre diferentes especies. También
permite reconocer rasgos característicos de cada especie.

Cuadro 2. Características fisiológicas y bioquímicas del género Rhizobium.

CARACTERISTIC Rhizobiu
AS m
Crecimiento en EL –
Rápi
MARC Tiempo de
do
generación
Crecimiento en ácidos +
orgánicos
Crecimiento con ramosa +
Crecimiento con 2% Algunas cepas de
NaCl (0.0025%) R. meliloti
Alta afinidad por fosfato +
(+): crecimiento (-): no crecimiento
Fuente: Frioni, 1999.

3.3.3 Características de los Rhizobios

Según (Fernández, 2003); en el suelo, los rizobios son bacilos de vida

libre, móviles e incapaces de formar esporas (formas resistentes ante condiciones
adversas). Se alimentan de la descomposición de organismos muertos, materia
orgánica o compuestos químicos secretados por las raíces de las plantas.
Requieren oxígeno para vivir (son aerobios) y son incapaces de fijar nitrógeno
atmosférico. Dentro de los nódulos radicales tienen formas irregulares, aumentan
su tamaño, se alimentan de formas carbonadas sintetizadas por la planta huésped
(leguminosas), requieren bajo nivel de oxígeno, y fijan nitrógeno atmosférico que
le entregan a la planta.
 Asimismo, el mismo autor indica que; anteriormente se agrupaban todas las
bacterias que nodulaban leguminosas en el género Rhizobium por lo que
genéricamente se los denomina rizobios o rhizobios. A partir de la década del ’80
fueron reclasificados en nuevos géneros, en un principio según su velocidad de
crecimiento y características bioquímicas y posteriormente se agregaron
características genéticas.

3.6 Cultivo y aislamiento de los rizobios

El proceso de aislamiento de rizobios de los nódulos incluye varios pasos

para separarlos de los contaminantes presentes; además, es necesaria una serie
de pruebas para caracterizar y autenticar los rizobios aislados; una vez
autenticados, se puede evaluar su efectividad potencial, capacidad de fijar N2 con
leguminosas en condiciones óptimas (CIAT, 1987).
 El aislamiento del rizobio se inicia esterilizando la superficie del nódulo,
macerándolo y estriándolo. En cultivos in vitro, los rizobios por lo general pueden
ser fácilmente suplementados con levaduras y una fuente de carbohidratos como
el manitol, y compuestos nitrogenados y cantidades menores de Magnesio (CIAT,
1987; Contreras et al., 2007). El medio de cultivo comúnmente utilizado para el
aislamiento de rizobios es el Y-M-A (Extracto de Levadura, Manitol, Agar), que
además contiene fosfato dipotásico, sulfato de magnesio, cloruro de sodio y agar-
agar.
El extracto de levadura le proporciona a las bacterias productos de
degradación de las proteínas, sustratos para la respiración, vitaminas y ciertos
elementos; el manitol funciona como fuente de carbono, en tanto que las colonias
de muchas otras bacterias adquieren un color más intensos; sin embargo esta no
es una característica definitiva ya que su expresión varía con la concentración de
reactivos, la edad del cultivo, la exposición de la caja a la luz y no es lo
suficientemente selectivo. La temperatura óptima de crecimiento de rizobios en
condiciones artificiales es de 25°C y su tolerancia al PH entra de 5 a 8. (CIAT,
1987; Contreras et al., 2007).

3.7 El nódulo

Son las estructuras especializadas donde se lleva a cabo la fijación

biológica de nitrógeno que algunas familias de angiospermas han desarrollado,
principalmente en el córtex radicular posterior a la pre-infección e infección por
bacterias diazotróficas. La formación de nódulos está controlada por fitohormonas:
citoquininas, auxinas, giberelinas producidas por rizobios y por el huésped (Vicent,
1982). El exterior del nódulo puede ser liso, esculpido, estriado o costroso,
algunas veces tienen el color de la raíz vecina o está brillantemente coloreado con
pigmentos verdes o pardos, enmascarando el color de la hemoglobina del interior.
 Lupinus mutabilis Vicia faba Medicago sativa

Figura 5: Formación de diferentes tipos de nódulos en cultivos de leguminosas.

3.8 Etapas de la infección y formación de nódulos

Según (Coiné, 2000) señala que la etapa de infección involucra los

siguientes pasos:
a) Reconocimiento de la combinación adecuada de organismos, tanto por
parte de la planta como de la bacteria, y la adherencia de la bacteria a
los pelos radiculares.
b) Invasión del pelo radical y formación de un canal o hilo de infección.
c) Desplazamiento de las bacterias hacia la raíz principal a través de un
canal de infección.
d) Diferenciación de las bacterias en un nuevo tipo al que se les llama
bacteroides dentro de las células de la planta y desarrollo del estado de
fijación de nitrógeno.
e) Proceso continuado de división de las células bacterianas y vegetal y
formación del nódulo radical maduro.

El mismo autor indica que de la misma manera, el proceso en detalle incluye: en

primer lugar las plantas secretan compuestos específicos que atraen a los
rizobios, dentro de los cuales se encuentran los flavonoides, y en respuesta a ellos
dichas bacterias activan una serie de genes implicados en la nodulación (Nod);
posteriormente, ocurre la adherencia de la bacteria a la planta hospedadora.
 En la superficie del rizobio se localiza una proteína específica de
adherencia (la ricadesina), la cual se une al calcio y puede actuar captando
complejos de este átomo en la superficie de los pelos radiculares. Otras
sustancias como las lectinas, que son proteínas que contienen carbohidratos,
también cumplen una función en la adherencia planta-bacteria, siendo identificada
en los extremos de pelos radicales y en la superficie de las células de rizobio.

Después de la unión, los pelos radicales se enroscan, debido a la acción de

sustancias específicas secretadas por la bacteria conocidas como factores Nod;
algunos pelos radicales se enroscan hasta 360° formando una estructura a la que
se llama “cayado de pastor”, la bacteria penetra entonces en el pelo radical e
induce a la formación por parte de la planta de un tubo de composición similar a la
pared celular, conocido como canal de infección que avanza por el pelo radical;
este canal es un tubo vacío en el que se multiplican los rhizobios, quedando
embebidos y formando de esta manera una matriz zoogleal (Redondo et al.,
2007).

Luego la infección alcanza a las células de la raíz adyacente a los pelos

radicales, y los factores Nod estimulan la división de las células vegetales
corticales, dando origen al nódulo; los rizobios son liberados en las células
corticales, por un mecanismo similar al de endocitosis y rodeados por una
membrana producida por la planta llamada Membrana Peribacteroidal (MPB), por
la cual los rizobios quedan separados del citoplasma. Cuando la división celular
culmina las bacterias cambian de forma a unas estructuras hinchadas y deformes
(bacteroides o rizobios pleomórficos), los cuales quedan rodeados individualmente
o en pequeños grupos por la MPB (Nutman, 1956).
 Figura 6: Eventos en el proceso de nodulación (Frioni, 1999)

3.9 Morfología de los nódulos

Según (Redondo et al., 2007), los nódulos radicales de las leguminosas se

clasifican de acuerdo al lugar en donde se induzcan las divisiones mitóticas en la
raíz, dependiendo la morfología del tamaño y forma del meristemo y de la
tendencia a la bifurcación. Así, si las divisiones mitóticas que se originan en el
córtex interno desarrollan nódulos indeterminados, y si lo hacen en el cortex
externo se forman nódulos determinados. Ambos tipos de nódulos, también
difieren en la forma en que comporta la bacteria dentro de dicha estructura; a
pesar de ello, la inducción del ciclo celular en ambos sistemas sigue la misma
regulación. Los dos tipos de nódulos se forman en las raíces de las leguminosas,
de acuerdo con la disposición del meristemo su tamaño es variable, oscilando
entre 0,5 mm y 2 cm.
Según (Coiné, 2000) señala que la morfología de los nódulos es
característica de las plantas huésped. Pero en general, la forma de los nódulos
depende de la forma y tamaño del meristema y de la tendencia a la bifurcación.
Los nódulos se pueden dividir en dos tipos: nódulos indeterminados, que
contienen un meristemo persistente resultando en formas cilíndricas y a menudo
ramificadas y nódulos determinados, que carecen de un meristemo persistente y
tienen forma redondeada. Para (Nutman, 1956) el exterior del nódulo puede ser
liso, esculpido, estriado o costroso. Algunas veces tiene el color de la raíz vecina o
esta brillantemente coloreado con pigmentos verdes o pardos, enmascarando el
color de la hemoglobina del interior.

3.10 Regulación y factores que afectan la nodulación

Según (Contreras et al., 2007) señala que la nodulación de las leguminosas

es un proceso regulado por factores internos (autorregulación) y externos
(fundamentalmente de nitratos) y se ha sugerido la existencia de algún
componente común compartido por ambos tipos de regulación de la nodulación.
Experimentos realizados por estos autores, apoyan al etileno endógeno como
posible candidato mediador en el control de la formación de nódulos y en la
inhibición por nitratos; señala que el etileno exógeno es un potente inhibidor de la
nodulación pero la raíz inoculada y sobre todo los nódulos, producen
significativamente más etileno que la raíz no inoculada, siendo ese etileno de
origen vegetal. El nitrato del suelo, por un mecanismo aún desconocido, es un
efectivo inhibidor de la nodulación de las leguminosas.
Los rizobios y leguminosa, su asociación y funcionalidad, son afectados
positiva o negativamente por las condiciones ambientales durante su ciclo de vida
(Fernández, 2003). No es posible separar los factores que afectan
específicamente a la nodulación, de aquellos que son necesario para el desarrollo
normal de la planta, salvo para el suministro de nitrógeno; en términos generales,
puede anticiparse una buena nodulación bajo condiciones favorables para el
crecimiento de la planta (Vargas de Rozo, 1969).

3.10.1 Temperatura

Los rizobios son organismos mesófilos, pero, están distribuidos en todas las
regiones del mundo; Con menos de 7°C la nodulación se hace muy poco
probable; en el caso extremo de altas temperaturas, se reduce el número de
raíces laterales y pelos radicales, haciendo que la probabilidad de nodulación sea
menor; a
temperaturas extremas tiene lugar una degradación de los nódulos (Contreas et
al., 2007).
Según (Fernández, 2003) las temperaturas bajas retardan el desarrollo de
la planta, la formación de nódulos y consecuentemente, disminuyen las tasas de
fijación de Nitrógeno; asimismo, señala que para las leguminosas tropicales,
temperaturas diurnas de 25 a 32°C son óptimas para la nodulación. El
funcionamiento de la simbiosis y el crecimiento de las plantas, con variaciones
entre especies.

3.10.2 Humedad

El nivel de agua debe ser tal que no origine problemas de presión osmótica
en las células; en regiones tropicales con estaciones secas, el número de rizobios
en las capas superficiales del suelo disminuye rápidamente. La disminución del
potencial hídrico del suelo limita también el transporte de los productos de la
fijación a la planta, y altas humedades limitan la FBN (Frioni, 1999). El crecimiento
máximo y la máxima nodulación de las leguminosas se produce por lo general en
suelos con contenido de agua de 75 al 85% de su capacidad de retención de agua
(Fernández, 2003).

3.10.3 Nitrógeno

Las plantas absorben el nitrógeno en forma de nitratos o amonio; esta

obtención de nitrógeno es energéticamente menos costosa para la planta que el
proceso simbiótico. Por lo tanto, el exceso de nitrógeno especialmente en forma
de nitratos, tiene un efecto inhibitorio sobre la simbiosis en todos los pasos, desde
la infección, formación de nódulos y la fijación de N2. Los niveles bajos de
nitrógeno en los primeros estadios vegetativos en los que todavía los nódulos no
son funcionales pueden ser benéficos. Sin embargo, a medida que el nitrógeno
proveniente del suelo o del fertilizante aumenta, el nitrógeno derivado de la fijación
biológica y la nodulación disminuyen (Fernández, 2003).
3.10.4 Fosforo y potasio

La simbiosis rizobio-leguminosa es altamente sensible a la carencia de

fósforo; el fósforo forma parte de las moléculas de ATP, que son las responsables
de la liberación e intercambio de la energía, también es indispensable para la
fijación biológica de nitrógeno por la alta energía que este proceso consume (16
moléculas de ATP/N2 fijado). Para que sea posible la nodulación y fijación de N2,
es necesario un aporte adecuado de fósforo, cuando la concentración de P en la
planta es inferior al 0.2% la nodulación y la fijación de nitrógeno son casi
despreciables (Fernández, 2003).

3.10.5 Potencial de Hidrogeno (pH), Calcio, Magnesio, Molibdeno y Magnesio

La acidez del suelo afecta todos los aspectos de la simbiosis, desde la

supervivencia y multiplicación de los rizobios en el suelo, la infección y nodulación
hasta la fijación del N2. El crecimiento y la nodulación son satisfactorios en pH 5.4
a pH 8.0, porque la acidez afecta a la simbiosis ya sea directamente por el pH que
tienen que soportar ambos simbiontes, como indirectamente al generar
toxicidades o deficiencias de nutrientes (Fernández, 2003).
Según (Frioni, 1999) señala que el calcio es un elemento que se requiere
en alto nivel en leguminosas noduladas, si el nivel es bajo se inhibe el
encurvamiento de los pelos y la nodulación; asimismo, se encontraron pruebas de
que la formación de nódulos es sensible al calcio tanto en las especies de zonas
tropicales como en las zonas templada; se descubrió que la principal necesidad
del Rhizobium era el magnesio, antes que el calcio, pues la escasez de cationes
divalentes (Ca, Mg) conduce a pérdidas marcadas de viabilidad.
El molibdeno es un elemento clave en la nitrogenasa, responsable de la
transferencia de electrones de la reductasa de la nitrogenasa hacía N2. Se
reconoció el efecto estimulante de este elemento en la fijación del nitrógeno
observándose una marcada disminución en el rendimiento de las plantas
deficiente en molibdeno.
 Los altos niveles de magnesio causan un descenso en el número y el
volumen de los nódulos. El calcio, sin embargo reduce los efectos adversos del
magnesio y los altos niveles de fósforo tienden a incrementar la absorción del
manganeso (Frioni, 1999).

3.10.6 Luz y carbohidratos

La luz afecta la nodulación a través de la fotosíntesis, controlando la

cantidad de carbohidratos para el desarrollo y funcionamiento del nódulo; la mala
nodulación está asociada con la baja intensidad de luz y los días cortos del
invierno. Debido a que estos factores retardan la fotosíntesis, reducen la fracción
de carbohidratos en la planta; sin embargo, los rayos excesivamente altas o bajas
de carbohidratos solubles con relación a los compuestos nitrogenados solubles
son perjudiciales para la nodulación de las leguminosas (Frioni, 1999).

3.11 Los rizobio como inoculantes de leguminosas

Uno de los objetivos principales del análisis de poblaciones de rhizobia que

nodulan diferentes leguminosas en distintos suelos y localizaciones geográficas es
la selección de cepas autóctonas para el diseño de biofertilizantes fijadores de
nitrógeno en simbiosis con leguminosas que permitan la reducción de la utilización
de fertilizantes nitrogenados químicos y, por lo tanto, el desarrollo de una
agricultura productiva más respetuosa con el medio ambiente y con la salud
humana y animal (Díaz, 2010).
Asimismo, el mismo autor nos señala que el planteamiento básico para la
selección de cepas de alta efectividad nitrofijadora consta de dos etapas
(Sessitsch et al. 2002). La primera es optimizar la interacción entre el genoptipo de
la leguminosa (Gl) y el genotipo de los rhizobia (Gr). La segunda consiste en
optimizar la interacción entre las cepas seleccionadas en la etapa anterior (G2), y
el medio ambiente en el que va a producirse el cultivo (E). El primer paso puede
ser evaluado en condiciones controladas sobre un sustrato de crecimiento estéril e
inerte, regado con una solución nutritiva libre de nitrógeno. En estas condiciones
se controlan y optimizan los parámetros ambientales esenciales para el desarrollo
de las plantas, nodulación, y fijación de nitrógeno, por lo que el crecimiento acaba
dependiendo exclusivamente de la actuación del conjunto de genes huésped –
bacteria disponible para la fijación de nitrógeno. El segundo paso consiste en
seleccionar entre las cepas preseleccionadas según el paso anterior, aquéllas
capaces de proporcional mejor fijación de N en las condiciones edafoclimáticas de
la zona de cultivo elegida. Con frecuencia lo que se analiza es la producción final
en condiciones controladas, en macetas rellenas con suelo de la zona de cultivo
(microcosmos), aunque posteriormente sea necesaria una validación en campo.

1.2 Áreas de muestreo

El muestreo se llevó a cabo durante los meses de Enero a Junio de

2014 en la Comunidad de Pichari, municipio de Puerto Acosta de la provincia
Camacho, donde se establecen cultivos de leguminosas como el Tarwi
(Lupinus mutabilis) y Haba (Vicia faba) considerado como cultivos propios
del altiplano norte. Puerto Acosta es la primera sección municipal de la
provincia Camacho, limita al norte con la provincia Saavedra y la República
del Perú, al sur con el lago Titicaca y la provincia Omasuyos, al este con la
provincia Muñecas y al oeste con el lago Titicaca. Fisiográficamente,
constituye una variación de mesetas, cumbres, terrazas y depresiones; entre
los principales ríos de la zona se encuentran el Huaycho, Suches y Escoma,
su clima es frío, con una temperatura media anual de
7.4 °C.

El municipio de Puerto Acosta tiene superficies con praderas donde se

encuentran especies vegetales como la totora, chilligua, chiji, kento muña,
mostaza, malva, missi missi, cebadilla, etc. Sus suelos son aptos para
producción de pasturas. Otra de sus actividades productivas, constituye la
ganadería basada en la cría de ovinos de especies criollas, adaptadas a las
condiciones del clima altiplánico, producción que también está destinada al
consumo familiar. La carne de ovinos y camélidos es la más consumida, ya
sea en su forma fresca o deshidratada, mientras que el ganado bovino es
comercializado como ganado en pie.
 Para realizar el muestro de leguminosas de Alfalfa (Medicago sativa),
se realizó en la Estación Experimental de Choquenaira dependiente de la
Universidad Mayor de San Andrés, que tiene una extensión de 160 Has,
ubicado en la localidad de Choquenaira, provincia Ingavi del departamento
de La Paz. La temperatura promedio de los últimos años (1994 – 2005) fue de
6.6°C, la precipitación pluvial promedio de los 10 últimos años fue de 400
mm/año (SENAMI, 2005). Los suelos de Choquenaira corresponden al grupo
de los suelos zonales derivados a partir de sedimentos lacustre, finos y
depósitos aluvio locales.

La zona presenta dos épocas bien marcadas; época de lluvias, que

comprende los meses de Noviembre a Marzo, en donde el frio es menos
intenso, con mayor disponibilidad de agua y pastos; la época seca, que
comprende los meses de Mayo a Agosto, donde el frio es más intenso y
existe una escasez de agua y pastos naturales, los que sirven de alimento a
los herbívoros (vacuno, camélido y ovino); además se siempre
aproximadamente 70 Has de alfalfa y avena forrajera, las que son utilizados
como heno y ensilado en la época seca, cuando hay escases de pastos
nativos.

2 MATERIALES Y METODOS

2.1 Materiales
2.1.1 Material vegetal

Para el desarrollo del presente estudio se utilizaron tres diferentes cepas de

leguminosas contenidas los nódulos de Rhizobium, que fueron recolectados de
diferentes regiones del Altiplano Norte del departamento de La Paz; comunidad
Pichari, municipio de Puerto Acosta de la provincia Camacho y la Estación
Experimental de Choquenaira – Viacha, perteneciente a la Facultad de
Agronomía. El muestreo se llevó a cabo durante los meses de Enero a Junio del
2014, debido a que en esta época existe alta presencia de cepas de Rhizobium en
los nódulos de las raíces durante la etapa vegetativa, antes de la fructificación y
maduración de los frutos de las especies vegetales en estudio: Lupinus mutabilis,
Medicago sativa y Vicia faba.

En las áreas de las parcelas seleccionadas, se realizó una muestra

representativa, tomando entre 15 – 20 sub-muestras en forma aleatoria siguiendo
un patrón en W o (zig – zag) a una profundidad aproximada de 5 – 20 cm,
dependiendo del tipo de cultivo de donde se desee tomar la muestra; tomando al
mismo tiempo el suelo y las raíces para evitar el desecamiento de los nódulos.
Posteriormente se llevaron las muestras a bolsas plásticas individuales y se
rotularon con el número de la muestra, ubicación y fecha de recolección.
Finalmente, se realizó el traslado de los mismos a los laboratorios de estudio en la
ciudad de La Paz para su respectivo estudio de evaluación dentro del laboratorio.

2.1.2 Materiales y equipos de laboratorio

Los equipos que se usaron en el laboratorio fueron: autoclave, cámara

Incubadora, refrigerador, microondas, cámara de flujo laminar, microscopio
electrónico, pH-metro, estéreoscopio. Y los materiales empleados fueron: placas
Petri, estuche botánico, vasos de precipitación, probetas, porta y cubre objetos, pH
metro, balanza digital, balanza electrónica, matraz Erlenmeyer, pipetas, pizetas,
filtros de 1x1mm, varilla, contenedores de vidrio, papel aluminio, plasfil, mechero,
aspersor y cámara fotográfica.

2.1.3 Compuestos químicos y material vegetal

Según (Weaver et al., 1994) recomienda que la base de los requerimientos

nutritivos para el medio de cultivo de Rhizobium son: manitol 10 gr/lt -1, fosfato
dipotasico 0.5 gr/lt -1, sulfato de magnesio 0.2 gr/lt -1, levadura fresca 1.0 gr/lt -1,
cloruro de sodio 0.1 gr/lt -1 y Agar – agar 5 gr/lt -1.

Teniendo en cuenta los componntes químicos, se procedió a realizar la

preparación del medio de cultivo Y–M–A para el presente trabajo de investigación,
utilizando los siguientes compuestos químicos en las cantidades indicadas:
mannitol 10 g/l-1, fosfato di-potásico K2HPO4 0.5 g/l-1, sulfato de magnesio 0.2 g/l -1,
levadura fresca 1.0 g/l-1, cloruro de sodio 0.1 g/l-1 y agar-agar 5 g/l-1.

Asimismo, se emplearon compuestos químicos para la desinfección de los

nódulos, siendo los siguientes: hipoclorito de sodio (Na ClO 3) al 4%, etanol o
alcohol al 90%, bicloruro de mercurio al 0.1%, cloruro de mercurio 0.5 g, ácido
clorhídrico 5 ml y agua destilada esterilizada.

2.1.4 Fases
[Link] Establecimiento
a) Primera fase: Recolección de la Muestra

Una vez obtenida las plantas seleccionadas, se realizó un muestreo

representativo en forma aleatoria obteniendo las muestras a una profundidad de 5
– 20 cm, tomando al mismo tiempo juntamente con su suelo y las raíces para
evitar desecamiento de los nódulos. Se seleccionaron plantas vigorosas de 2
meses de edad, sin indicios de ataques de plagas o presencia de enfermedades.
Posteriormente, se llevaron las muestras a bolsas plásticas individuales teniendo
en cuenta el número de la muestra, el cultivo de donde se obtuvo la muestra,
ubicación y fecha de recolección.
Figura 7: Recolección de muestras vegetales. Raíces contenidos
de nódulos de las especies de Vicia faba y Lupinus mutabilis.
 Las muestras de leguminosas extraídas con suelo, previamente seleccionados
y provenientes de los diferentes lugares de muestreo, fueron colocadas en un
balde con agua para la disolución de la tierra adherida a las raíces por un lapso de
3 días, consecutivamente se retiraron los nódulos de las raíces y se lavaron éstas
llevándolos a un frasco esterilizado. Finalmente, para su análisis respectivo de los
nódulos adheridos a las raíces de cada especie de leguminosa, se retiraron las
raíces y se lavaron por separado para luego observar con el estereoscopio y
describir las características fenotípicas para cada especie de leguminosa.

b) Segunda fase: lavado de materiales – equipos y preparación del medio

de cultivo (Y – M – A)

Se realizó la limpieza, esterilización de todos los ambientes con hipoclorito de

sodio al 80% y los mesones con etanol al 90%, esta operación se hizo cada vez
que se usó los ambientes del laboratorio, juntamente con todos los equipos
requeridos. La desinfección de la cámara de flujo laminar se realizó solo con
etanol al 90% para evitar la formación de escamas (capa blanquecina que se
forma en el vidrio).

El lavado de los cristales como ser: probetas, vasos de precipitados, frascos

Erlenmeyer, frascos de vidrio, placas petri, gotero, varilla, las espátulas y para los
recipientes de cristal, se realizó el lavado con detergente, enjuagándose cuatro
veces con agua de grifo y el ultimo enjuague se realizó con agua destilada, luego
se deja sobre el mesón desinfectado (no se debe secar con ningún tipo de paño
ya que esto deja pelusas y esto puede ocasionar la contaminación del medio de
cultivo). Y para evitar los contaminantes naturales del ambiente: se utilizó
guardapolvo, gorro quirúrgico, barbijo y guantes.

Se realizó los cálculos previos y necesarios para una solución de 500 ml, para
la preparación del medio de cultivo artificial Y-M-A se utilizó las siguientes
-1
cantidades y compuestos químicos: manitol 5 gr/lt (para la prueba del primer
-1
nivel de manitol y así sucesivamente), fosfato dipotasico 0.25 gr/lt , sulfato de
magnesio 0.1 gr/lt -1, levadura fresca 0.5 gr/lt -1, cloruro de sodio 0.05 gr/lt -1
y Agar
 -1
– agar 2.5 gr/lt . Pero antes de pesar los reactivos se debe tarar la balanza
analítica a cero y pesar los reactivos en un trozo de papel aluminio.

Para preparar el medio de cultivo artificial Y–M–A se procedió de la siguiente

manera: se agregó todos los componentes del medio de cultivo en un frasco
Erlenmeyer 500ml (el frasco se utiliza según la cantidad que se desee preparar), a
excepción del agar–agar porque altera el nivel del pH del medio de cultivo
preparado por lo que se lo añade al finalizar la mezcla de todos los reactivos
anteriores. Posteriormente, se colocó en el agitador magnético regulando éste a
450 r.p.m., este procedimiento se realiza hasta que exista una homogeneidad en
la mezcla de los reactivos y se ajusta el pH a 6.8 ± 0.2 con ácido sulfúrico, debido

a q el medio de cultivo puro alcanza una elevada concentración de alcalinidad.

Finalmente, se coloca agar – agar para luego llevarlo al microondas por un tiempo
aproximado de 3 – 4 minutos, esto para que se disuelvan todos los reactivos
químicos de manera homogénea (evitando que exista formación de grumos);
luego de este proceso llevamos el medio de cultivo preparado a un frasco con tapa
rosca resistente a temperaturas superiores a 100°C para asegurarlo y evitar
cualquier derrame dentro del autoclave.

Figura 8: Medio de cultivo artificial (Y-M-A) gelificado luego del

proceso de autoclavado a 15 lbs de presión.
 Figura 9: Proceso de preparación del medio de cultivo artificial
Y-M-A (Manitol-Agar-Levadura)

El proceso de esterilización requiere unos 20 a 30 minutos a 120°C de

temperatura y 15 libras de presión. Dentro del autoclave se colocan medio de
cultivo preparado, placas Petri envueltas en papel madera y aseguradas con una
liga elástica, algodón (en forma de pequeños bollos dentro de un frasco sellado
con papel aluminio y plasfilm), agua destilada, pinzas metálicas, mangos de bisturí
y todos los demás materiales de vidrio que se requieran para trabajar dentro de la
cámara de flujo laminar. Luego del proceso de autoclavado, se lleva los materiales
autoclavados cerca de la cámara de flujo laminar para abrir el autoclave y extraer
todos los materiales completamente esterilizados. Finalmente, se vierte el
contenido del medio de cultivo de 20 – 25 ml en cada placa Petri y se deja
solidificar a temperatura ambiente y para guardar bajo refrigeración se deben
invertir y envolverlas con papel aluminio, esto evita la contaminación del medio de
cultivo.

c) Tercera fase: desinfección, aislamiento y evaluación de rizobios

Para la desinfección de los nódulos, se expusieron a rayos ultravioleta, el

medio de cultivo Y–M–A, las soluciones de etanol, lavandina, los bisturís, pinzas,
el algodón, el agua destilada, las placas Petri, los frascos de vidrio para enjuagar,
plasfilm, marcador indeleble, guardapolvo, guantes, barbijo, gorra y los mecheros
durante 30 minutos y a continuación, se procedió a apagar la luz UV dejando
reposar unos 15 minutos antes de introducir el material vegetal a la cámara de
flujo laminar.

El aislamiento de rhizobios se realizó según la metodología sugerida por

(CIAT, 1987) y se procedió de la siguiente manera: dentro de la cámara de flujo
laminar se lavaron los nódulos de las cepas y se sumergieron para desinfectarlos
en alcohol al 90% por un tiempo de 5 – 10 segundos. Luego se transfirieron a una
solución de bicloruro de mercurio al 0.1% (0.5 gr de cloruro de mercurio (HgCl) y 5
ml de ácido clorhídrico (HCl) en 500 ml de agua destilada estéril) sumergiéndolos
durante 1 min, posterior a ese proceso se colocaron los nódulos en agua destilada
esterilizada por un tiempo de 1–2 minutos, repitiendo esta operación cinco veces
para asegurarnos de la limpieza total del hipoclorito de sodio en la superficie de
los nódulos.

Para comenzar con el sembrado inicial de las cepas de leguminosas, se

procedió a limpiar la parte interna de la cámara de flujo laminar con alcohol
antiséptico y algodón estéril; al mismo tiempo, se debe realizar el encendido del
mechero con alcohol para flamear los instrumentos a usarse para el sembrado
(placas Petri, el bisturí y las pinzas), este procedimiento se ha realizado cada vez
que se utilizó la cámara de flujo laminar. A continuación, se procedió a macerar los
nódulos con la ayuda de una varilla de vidrio esterilizado obteniendo de esta
manera la liberación de los bacteroides y con la misma varilla se realizó el
sembrado en las placas Petri que contenían medio de cultivo artificial solidificado
de Y–M–A (Levadura – Manitol – Agar) y luego de realizar la siembra se colocó la
tapa de la placa Petri para incubarlo a una temperatura de 28°C por un periodo de
7 a 14 días.

Posterior a los primeros 7 días transcurridos, a partir del día 8 se realizaron las
evaluaciones correspondientes en cada colonia bacteriana de acuerdo a las
variables de respuesta. Es así que para las variables (crecimiento, tamaño de la
colonia y forma de la bacteria) se realizó mediante la observación directa al
microscopio. Toda vez que las colonias bacterianas presentaban cambios en el
desarrollo fenotípico se procedió a recolectar los datos respectivos luego de 14
días de incubación.

d) Cuarta fase: identificación de rizobios mediante Tinción de Gram

Para realizar la identificación de cepas nativas del género Rhizobium se ha

realizado a través del método descrito por (Vincent, 1970), procediendo como se
detalla a continuación: con la ayuda de un mechero se flameó un asa
bacteriológica y se esperó a que éste enfríe un poco, tomando con el mismo asa
un cultivo puro de Rhizobios para extenderla sobre una lámina portaobjetos
mediante movimientos giratorios (dando vueltas con el asa), de tal forma que al
terminar la extensión obtengamos como producto final una espiral en la parte
media de la lámina. Se fijó moderadamente sobre la llama del mechero, teniendo
en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama del mechero)
puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias
a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas
demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.
 Se cubrió la muestra con una cantidad suficiente de cristal violeta o violeta de
genciana al 1% hasta lograr cubrirla por completo, se deja actuar el colorante
durante 1 minuto; esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una
temperatura ambiente de 25°C. Al transcurrir el minuto, se procedió a enjuagar la
lámina conteniendo la muestra con agua corriente, para tal efecto se debe tener
en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra,
ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene la muestra, el
chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milímetro de
espesor esta acción se logra con la ayuda de una pizeta con agua destilada, el
enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada
hacia abajo.

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente el Lugol,

durante 3 minutos, el mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos
insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias. Luego de dejar
actuar el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75% hasta que ya no
–
escurra más liquido azul (los Gram se decoloran), para esto se utilizó el gotero
del frasco del decolorante, se fueron añadiendo cantidades suficientes del
decolorante hasta lograr que este salga totalmente transparente, es decir, hasta
que ya no escurra más liquido azul.

Para quitar los residuos del decolorante se procedió a lavar con agua
destilada esterilizada y se esperó a que seque la lámina al aire libre. Una vez que
la lámina ya secó se procedió a teñir nuevamente, pero esta vez utilizando un
colorante de contraste, la Safranina, para que tiña las bacterias Gram -, ésta de
deja actuar por 1 minuto. Luego del minuto correspondiente, se enjuagó la lámina
con agua, dejando escurrir el agua sobrante y se seca al aire libre o con la ayuda
de un mechero. De esta manera se obtuvo el frotis para su respectiva observación
microscópica.
 Figura 10: Identificación de rizobios mediante observación directa al
microscopio.

[Link] Diseño experimental

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