Rodriguez Mery
Protocolo: Hot Start Amplificación de inicio en caliente de plantillas normales
(hasta 3 kb)
Preparacion de la reacción
1. Descongele todos los reactivos congelados antes de usar.
Mezcle todos los reactivos a fondo y centrifúguelos brevemente antes de
comenzar el procedimiento.
2. Prepare la mezcla maestra en un tubo de reacción estéril de 1,5 ml (en hielo).
Agregue los componentes en el orden que se detalla a continuación. Los viales
numerados se suministran con la enzima
Master Mix (para una reacción) a)
3. Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo de PCR (o pozo) para producir
una solución homogénea mezcla de reacción. De acuerdo con las instrucciones
suministradas con su instrumento, prepare los tubos o microplaca para PCR ( p.
ej., superposición de la mezcla de reacción en un tubo con aceite mineral o sellar
el microplaca con lámina adhesiva).
4. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato.
Las mezclas de reacción completadas no deben almacenarse durante períodos
prolongados de tiempo.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil a continuación.
El siguiente perfil térmico se desarrolló para la PCR GeneAmp de Applied Biosystems
Sistema 2400. Otros cicladores de bloque térmico pueden requerir un perfil diferente.
a) Este paso tiene dos propósitos. Activa la ADN polimerasa FastStart Taq y
también desnaturaliza modelo. Para aplicaciones específicas o para aumentar
los rendimientos, puede variar el tiempo de activación de 2 minutos (para
plantillas sensibles) a 10 min (para mezclas complejas, por ejemplo, para
multiplexar hasta 14 bandas con 28 cebadores).
b) Treinta (total) ciclos suelen ser suficientes para producir una cantidad
adecuada de producto si la plantilla inicial contiene> 10 4 copias del
objetivo. Para bajas concentraciones de objetivo o objetivo complejo ( p. Ej.,
Multiplexación) mezclas, aumente el número total de ciclos a 40.
c) El aumento gradual del tiempo de alargamiento garantiza un mayor
rendimiento de los productos de amplificación. Para aumentar el rendimiento
de productos de amplificación, modifique el programa de amplificación para
que el tiempo de alargamiento aumente gradualmente ( p . ej ., por 5
segundos / ciclo) después de 15 ciclos de amplificación, (para más detalles,
consulte el paquete FastStart Taq DNA Polymerase insertar.)
d) La temperatura de recocido óptima depende de la temperatura de fusión de
los cebadores y del sistema utilizado.
e) El tiempo de alargamiento depende de la longitud del fragmento. Use 1 min /
kb para fragmentos de hasta 3 kb.
Protocolo: PCR convencional
Procedimiento de amplificación
1. Descongele todos los reactivos congelados antes de usar. Mezcle todos los
reactivos y centrifugue brevemente antes de comenzar el procedimiento.
2. Prepare dos mezclas maestras separadas en tubos de microfuga estériles de 1,5
ml (en hielo). (Master Mix 1 contiene dNTP, cebadores y ADN de plantilla;
Master Mix 2 contiene PCR tampón de reacción y enzima.)
Para cada mezcla, agregue los componentes en el orden que se detalla a
continuación.
Para preparar Master Mix 1 para más de una reacción, multiplique las cantidades de
todos los componentes de Master Mix 1 (excepto la plantilla de ADN) por Z, donde Z =
el número de reacciones a ejecutar + una reaccion adicional. Mezcle estos componentes
para formar una solución homogénea, alícuota cantidades iguales de solución a nuevos
tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (uno para cada reacción, en hielo), agregue una
plantilla de 100 a 500 ng ADN para cada uno y etiquete cada nuevo tubo como "Master
Mix 1 + (nombre del templado)”.
Para preparar Master Mix 2 para más de una reacción, multiplique las cantidades de
todos los ingredientes por Z, donde Z = el número de reacciones a ejecutar + una
reacción adicional.
3. Mezcle los reactivos en cada tubo y centrifugue brevemente.
4. Para cada reacción, se combinan 25 μ l de la mezcla 1 (incluyendo molde de
ADN) y 25 μ l Mix 2 en un tubo de PCR de pared delgada (o bien una
microplaca de PCR) en hielo. Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo de
PCR (o pozo) para producir una solución homogénea mezcla de reacción. De
acuerdo con las instrucciones suministradas con su instrumento, prepare los
tubos o microplaca para PCR (p. ej., superponer la mezcla de reacción en un
tubo con aceite mineral o sellar el microplaca con lámina adhesiva).
5. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato.
Las mezclas de reacción completadas no deben almacenarse durante períodos
prolongados de hora.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil térmico. abajo.
El siguiente perfil térmico se desarrolló para la PCR GeneAmp de Applied Biosystems
Sistema termociclador de bloque 2400. Otros instrumentos de PCR pueden requerir un
diferente perfil.
a) La temperatura de recocido optima depende de la temperatura de fusion de los
cebadores y del sistema utilizado.
b) El tiempo de alargamiento depende de la longitud del fragmento.
Protocolo: Amplificación de alta fidelidad de ADN de hasta 3 kb DNA
Sobre Pwo SuperYield DNA Polymerasa
Pwo SuperYield DNA Polymerase tiene una actividad de polimerasa y un 3! -5!
exonucleasa (corrección de pruebas) actividad. Debido a esta actividad de revisión, la
polimerasa transcribe plantilla de ADN aproximadamente 18 veces más precisa que la
ADN polimerasa Taq.
Diseñando Primers
La actividad de corrección de pruebas de la ADN polimerasa Pwo SuperYield escindirá
una cadena sencilla ADN ( p. Ej., Cebadores de PCR). Por lo tanto, debe tener en cuenta
esta actividad cuando diseña los primers. Para asegurar que las primeras 15 bases en el
extremo 5 'de cada cebador sean protegido de la degradación, haga que cada cebador
tenga una longitud de 20 a 35 bases. El final de 3 'de cada el cebador debe ser tan
homólogo al sitio de unión como sea posible.
Para resistencia adicional a la degradación lenta, considere incorporar nucleasa-
dNTP resistentes (p. ej., nucleótidos de fosforotionato) en los cebadores .
Alternativamente, maximizar el contenido de GC de los cebadores.
Configurando la reacción
1. Descongele todos los reactivos congelados antes de usar. Mezcle todos los
reactivos y centrifugue brevemente antes de comenzar el procedimiento.
2. Prepare la mezcla maestra en un tubo de reacción estéril de 1,5 ml (en hielo).
Agregue los componentes en el orden que se detalla a continuación. Los viales
numerados se suministran con la enzima
a) Para preparar una mezcla maestra para más de una reacción, multiplique las
cantidades de todos los ingredientes (excepto plantilla) por Z, donde Z = el
número de reacciones a ejecutar + una reacción adicional.
b) Utilice la solución de resolución GC-RICH solo si la plantilla tiene un
contenido GC anormal o secuencias que son difíciles de amplificar. La
solución no es necesaria para la amplificación de ADN con contenido
normal de GC.
3. Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo de PCR (o pozo) para producir
una solución homogénea mezcla de reacción. De acuerdo con las instrucciones
suministradas con su instrumento, prepare los tubos o microplaca para PCR ( p.
ej., superposición de la mezcla de reacción en un tubo con aceite mineral o sellar
el microplaca con lámina adhesiva).
4. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato.
Las mezclas de reacción completadas no deben almacenarse durante períodos
prolongados de hora.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil térmico. abajo.
El siguiente perfil térmico se desarrolló para la PCR GeneAmp de Applied Biosystems
Sistema de cicladoras de bloque térmico 2400, 2700 y 9600. Otros instrumentos de
PCR pueden requieren un perfil diferente
a) La temperatura de desnaturalización depende de la plantilla. Siempre use la
temperatura más baja que desnaturalizar la plantilla. Las temperaturas más altas
pueden conducir a la depuración de la plantilla de ADN y reducir rendimiento
del producto.
b) El número de ciclos necesarios depende de la cantidad inicial de plantilla. Para
objetivos de baja abundancia, use más ciclos.
c) La temperatura de recocido óptima depende de la temperatura de fusión de los
cebadores y del sistema utilizado.
d) El tiempo de alargamiento depende de la longitud del fragmento. Use 1 min / kb
para objetivos de hasta 3 kb de largo.
Protocolo: Amplificación de alta fidelidad de ADN de hasta 5 kb con FastStart
High Fidelity PCR System
Sistema de PCR FastStart de alta fidelidad
El sistema de PCR FastStart High Fidelity es una mezcla innovadora y novedosa que
está optimizada por especificidad, sensibilidad y rendimiento. La mezcla contiene dos
proteínas: ADN polimerasa FastStart Taq modificada químicamente, cuya actividad se
activa por una incubación de 2 minutos a 95 ° C. Una proteína de corrección
termoestable químicamente modificada que no tiene polimerasa actividad.
Esta mezcla de enzimas está inactiva a temperaturas inferiores a 75 ° C y, por lo tanto,
no se alargará híbridos de plantilla de cebador inespecíficos que pueden formarse
durante la preparación de la reacción. Una vez activado, FastStart Taq DNA Polymerase
es altamente procesivo. Además, la prueba la lectura de proteínas elimina los
nucleótidos incorporados incorrectamente para garantizar una transcripción precisa ción
Esta combinación única puede transcribir ADN (hasta 5 kb) aproximadamente cuatro
veces
más exactamente que Taq DNA Polymerase solo.
Configurando la reacción
1. Descongele todos los reactivos congelados antes de usar. Mezcle todos los
reactivos y centrifugue brevemente antes de comenzar el procedimiento.
2. Prepare la mezcla maestra en un tubo de reacción estéril de 1,5 ml (en hielo).
Agregue los componentes en el orden que se detalla a continuación. Los viales
numerados se suministran con la enzima
Master Mix (para una reacción) a
a) Para preparar una mezcla maestra para más de una reacción, multiplique las
cantidades de todos los ingredientes (excepto plantilla) por Z, donde Z = el número de
reacciones a ejecutar + una reacción adicional.
b) Use DMSO solo si la plantilla tiene un contenido GC anormal o secuencias que son
difíciles de amplificar. La solución no es necesaria para la amplificación de ADN con
contenido normal de GC.
3. Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo de PCR (o pozo) para producir una
solución homogénea mezcla de reacción. De acuerdo con las instrucciones
suministradas con su instrumento, prepare los tubos o
microplaca para PCR ( p. ej., superposición de la mezcla de reacción en un tubo con
aceite mineral o sellar el microplaca con lámina adhesiva).
4. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience la
PCR de inmediato.
Las mezclas de reacción completadas no deben almacenarse durante períodos
prolongados de hora.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con una de las perfiles a continuación.
Los siguientes perfiles térmicos se desarrollaron para la PCR GeneAmp de Applied
Biosystems Sistema termociclador de bloque 2400. Otros instrumentos de PCR pueden
requerir un diferente perfil.
Perfil térmico A (para fragmentos de hasta 3 kb de longitud):
Perfil térmico B (para fragmentos de 3 a 5 kb):
a) Este paso tiene dos propósitos. Activa la ADN polimerasa FastStart Taq y
también desnaturaliza la temperatura.
plato.
b) La temperatura de recocido óptima depende de la temperatura de fusión de los
cebadores y del sistema utilizado.
El tiempo de alargamiento depende de la longitud del fragmento. Use 1 min / kb
para amplicones de hasta 5 kb de largo, El número de ciclos necesarios depende
de la cantidad inicial de plantilla. Para objetivos de baja abundancia o complejos
mezclas objetivo (multiplexación), use más ciclos.
El aumento gradual del tiempo de extensión garantiza un mayor rendimiento de los
productos de amplificación. Por ejemplo, ciclo no. 11 es 20 s más largo que el ciclo 10,
ciclo no. 12 es 40 s más largo que el ciclo 10, ciclo no. 13 es 60 s más largo que el ciclo
10, etc.
Protocolo: PCR de templado largo
Acerca del kit dNTPack Expand Long Range
El kit dNTPack Expand Long Range proporciona una configuración de reacción sencilla
y directa para PCR de largo alcance en plantillas de 5 kb a 25 kb. Solo se necesita un
tampón de reacción, independientemente del tamaño de la plantilla. Por conveniencia,
proporcionamos un tampón de reacción con MgCl 2 y un tampón sin MgCl 2 . Este
segundo buffer podría resultar útil para esas raras ocasiones en que los resultados
óptimos
requieren ajuste de la concentración de Mg 2+ . Sin embargo, hemos encontrado que>
95% de la Los productos de PCR probados en nuestros laboratorios se pueden obtener
cuando el tampón de reacción contiene 2.5 MgCl mM 2 (la concentración en el primer
tampón de reacción).
La concentración de DMSO en la reacción debe ajustarse, dependiendo del GC
contenido de la plantilla. Debe determinar la concentración óptima de DMSO mediante
un Serie de reacciones en las que la concentración de DMSO es titulada (variada). Por
favor recuerde que aumentar la concentración de DMSO también podría reducir el
recocido temperatura.
Configurando la reacción
1. Descongele 5 × Buffer y DMSO 15 min a 37 °.Descongele todos los demás
reactivos en hielo. Mezcle todos los reactivos a fondo y centrifúguelos
brevemente antes de comenzar procedimiento.
Almacene todos los componentes en hielo, excepto DMSO. Mantenga DMSO a
temperatura ambiente
2. Prepare la mezcla maestra en un tubo de microfuga estéril en hielo. Agregue los
componentes en el orden enumerada a continuación.
Master Mix (para una reacción) a
a) Para preparar una mezcla maestra para más de una reacción, multiplique las
cantidades de todos los componentes en el mezclar por Z, donde Z = el número de
reacciones a ejecutar + una reacción adicional.
b) Para los experimentos iniciales, use 200 ng de ADN genómico / 50 μl de reacción.
Para cualquier amplificación, la cantidad máxima de ADN de plantilla es 500 ng / 50
μl reac- ción El rendimiento de la reacción no puede mejorarse usando> 500 ng de
ADN genómico; de hecho, mayores cantidades de plantilla de ADN pueden inhibir la
reacción.
3. Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo (o pozo) para producir una
reacción homogénea mezcla. De acuerdo con las instrucciones proporcionadas
con su instrumento, prepare los tubos o microplaca para PCR.
4. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato.
La mezcla de reacción completada no debe almacenarse durante largos períodos de
tiempo.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil térmico. abajo.
El protocolo para Expand Long Range dNTPack ha sido probado en lo siguiente
Instrumentos de PCR:
En general, mantenga los tiempos de desnaturalización lo más cortos posible y la
temperatura de desnaturalización lo más baja posible. La temperatura de recocido
óptima depende de la temperatura de fusión de los cebadores y del sistema utilizado.
El tiempo de alargamiento depende de la longitud del fragmento. Use 1 min de
alargamiento / longitud de kb. Incrementar gradualmente el tiempo de extensión asegura
un mayor rendimiento de los productos de amplificación. Por ejemplo, ciclo No. 11 es
20 s más largo que el ciclo 10, ciclo no. 12 es 40 s más largo que el ciclo 10, ciclo no.
13 es 60 s más largo que ciclo 10, etc.
Protocolo: amplificación de objetivos de 20–35 kb con la PCR Expand 20 kb PLUS
Sistema
Primers adecuados
Los cebadores típicos para la amplificación de objetivos de 20–35 kb deben tener una
longitud de 22 a 34 nucleótidos y tienen temperaturas de fusión similares> 60 ° C.
Tales cebadores largos permiten que el alargamiento se realice a temperaturas más altas
para mejorar especificidad de reacción Esto puede ser crítico, ya que la amplificación de
objetivos largos será comprometido si los fragmentos no específicos más cortos se
amplifican preferentemente.
Ejemplos de cebadores adecuados: el cebador directo de ß-globina humana (CAC AAG
GGCTAC TGG TTG CCG ATT) y el cebador inverso incluido en Expand 20 kb PLUS
El kit PCR System se puede utilizar para amplificar un fragmento de 23 kb del gen de
la globina humana. La temperatura de recocido para estos dos cebadores es 62 ° C.
Estos cebadores pueden usarse en una reacción de control para probar el rendimiento
de otros componentes de reacción.
Alternativamente, si usa el cebador directo TGC TGC TCT GTG CAT CCG AGT G
con el cebador inverso de ß-globina humana incluido en el kit Expand 20 kb PLUS PCR
System, y baja la temperatura de recocido a 60 ° C, puede amplificar un fragmento de
29.8 kb de El gen de la globina humana.
Arranque en caliente
No use AmpliWax. En cambio, prepare dos mezclas de reacción separadas, luego
mézclelas juntos en hielo justo antes de comenzar la PCR.
Esta estrategia elimina la necesidad de una técnica de "arranque en caliente", ya que la
enzima y el El ADN (cebadores y plantilla) se mantienen físicamente separados en
ausencia de dNTP. Así,
la actividad exonucleasa 3 ́ – 5 ́ de la corrección de la ADN polimerasa (parte de
Expand
20 kb PLUS mix de enzimas) no puede degradar parcialmente los cebadores y la
plantilla.
Configurando la reacción
1. Descongele todos los reactivos congelados y colóquelos en hielo. Mezcle todos
los reactivos brevemente y centrifúguelos antes de comenzar el procedimiento.
2. Prepare dos mezclas maestras separadas. (Master Mix 1 contiene dNTP,
cebadores y ADN de plantilla; Master Mix 2 contiene tampón y enzima) en
tubos de microfuga estériles (sobre hielo).
Para cada mezcla, agregue los componentes en el orden que se detalla a continuación.
a) Para preparar una mezcla maestra para más de una reacción, multiplique las cantidades de
todos los componentes en el mezclar (excepto el ADN de plantilla) por Z, donde Z = el número
de reacciones a ejecutar + una adicional
reacción.
b) Si usa los ADN de control provistos en el kit, entonces para la muestra de control positivo:
cebador descendente = 1 μl de cebador directo de control de beta-globina (vial 5 del kit) cebador
aguas arriba = 1 μl de cebador inverso de control de beta-globina (vial 6 del kit) plantilla de
control = 1,2 μl de ADN genómico humano (vial 4 del kit)
3. Para cada reacción, combine 25 μl de Mix 1 (incluida la plantilla de ADN) y 25 μl de
Mix 2 en un tubo de PCR de pared delgada (o bien una microplaca de PCR) en hielo.
Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo de PCR (o pozo) para producir una
solución homogénea mezcla de reacción. De acuerdo con las instrucciones
proporcionadas con su instrumento, prepare los tubos o microplaca para PCR.
4. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience la
PCR de inmediato.
Las mezclas de reacción completadas no deben almacenarse durante períodos
prolongados de hora.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil térmico. abajo
El siguiente perfil térmico se desarrolló para la PCR GeneAmp de Applied Biosystems
Sistema termociclador de bloque 2400. La plantilla de PCR larga es sensible incluso a
minutos diferencias en rampas o tasas de transferencia de calor de diferentes
cicladores de bloque térmico. Por lo tanto, siempre desarrolle y ejecute su experimento
en los mismos Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400 ciclador de bloques. Si
cambia a un bloque térmico diferente ciclador o un tipo diferente de instrumento de
PCR, ajuste las condiciones de reacción y térmica perfil para garantizar resultados
óptimos.
La temperatura de recocido óptima depende de la temperatura de fusión de los
cebadores y del sistema utilizado. Las imprimaciones para este procedimiento deben
tener temperaturas de recocido> 60 ° C. Para la reacción de control, el
la temperatura de recocido es 62 ° C. El tiempo de alargamiento depende de la longitud
del fragmento: para la reacción de control, use 18 min. Para otras reacciones, nosotros
Recomendamos los siguientes tiempos de alargamiento:
Incrementar gradualmente el tiempo de extensión asegura un mayor rendimiento de los
productos amplificados. Por ejemplo, ciclo no. 11 es 10 s más largo que el ciclo 10,
ciclo no. 12 es 20 s más largo que el ciclo 10, ciclo no. 13 es 30 s más largo que el ciclo
10, etc. El número de ciclos depende de la cantidad de plantilla (copias de ADN
objetivo) utilizada. Para genómica humana
ADN, obtenemos buenos resultados con 250 ng de plantilla y 30 ciclos (total de
programas de amplificación 1 y 2). Sin embargo, aumentar el número total de ciclos a
35 o 40 puede aumentar el rendimiento del amplicón.
Protocolo : Amplificación con GC-RICH PCR Enzyme Mix y Reaction Buffer
Configurando la reacción
1. Descongele todos los reactivos congelados antes de usar.
Mezcle todos los reactivos a fondo y centrifúguelos brevemente antes de
comenzar procedimiento.
2. Prepare dos mezclas maestras separadas en tubos de microfuga estériles de 1,5
ml (en hielo). (Maestro La mezcla 1 contiene dNTP, cebadores y ADN de
plantilla; Master Mix 2 contiene GC-RICH Mezcla de enzimas PCR y tampón
de reacción.)
Para cada mezcla, agregue los componentes en el orden que se detalla a continuación.
Los viales numerados son suministrado con el kit.
Para preparar Master Mix 1 para más de una reacción, multiplique las cantidades de
todos los componentes de Master Mix 1 (excepto la plantilla de ADN) por Z, donde Z =
el número de reacciones a ejecutar + uno reacción adicional Mezcle estos componentes
para formar una solución homogénea, alícuota igual cantidades de la solución a nuevos
tubos de microfuga de 1,5 ml (uno para cada reacción, en hielo), agregue temperatura
placa de ADN a cada uno, y etiquetar cada nuevo tubo "Master Mix 1 + (nombre de la
plantilla)".
Para preparar Master Mix 2 para más de una reacción, multiplique las cantidades de
todos los ingredientes por Z, donde Z = el número de reacciones a ejecutar + una
reacción adicional.
3. Mezcle los reactivos en cada tubo y centrifugue brevemente.
4. Para cada reacción, combine 35 μl de Mezcla 1 y 15 μl de Mezcla 2 en un tubo
de PCR de pared delgada
(o bien de una microplaca de PCR) en [Link] suavemente las soluciones en cada
tubo de PCR (o pozo) para producir una solución homogénea mezcla de reacción. De
acuerdo con las instrucciones suministradas con su instrumento, prepare los tubos o
microplaca para PCR ( p. ej., superposición de la mezcla de reacción en un tubo con
aceite mineral o sellar el microplaca con lámina adhesiva).
5. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato. Las mezclas de reacción completadas no deben
almacenarse durante períodos prolongados de hora.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil térmico. abajo.
El siguiente perfil térmico se desarrolló para la PCR GeneAmp de Applied Biosystems
Sistema termociclador de bloque 2400. Otros instrumentos de PCR pueden requerir un
diferente perfil.
Las plantillas ricas en GC requieren 95 ° C durante 3 min. Las plantillas con contenido
mixto de GC solo pueden requerir 2 minutos incubación a 95 ° C.
La temperatura de recocido óptima depende de la temperatura de fusión de los
cebadores y del sistema utilizado. Use 72 ° C para fragmentos de hasta 3 kb. Para
fragmentos> 3 kb, use 68 ° C. El tiempo de alargamiento depende de la longitud del
fragmento. Use 45 s / kb para fragmentos de hasta 5 kb.
El aumento gradual del tiempo de extensión garantiza un mayor rendimiento de los
productos de amplificación. Por ejemplo, ciclo no. 11 es 5 s más largo que el ciclo 10,
ciclo no. 12 es 10 s más largo que el ciclo 10, ciclo no. 13 es 15 s más largo que el ciclo
10, etc.
Protocolo: Amplificación con la ayuda de la solución de resolución GC-RICH
Configurando la reacción
1. Descongele todos los reactivos congelados antes de usar. Vortex todos los
reactivos a fondo y centrifugue brevemente antes de comenzar el procedimiento.
2. Prepare dos mezclas maestras separadas en tubos de microfuga estériles de 1,5
ml (en hielo). (Master Mix 1 contiene dNTP, cebadores y plantilla de ADN;
Master Mix 2 contiene Mezcla de enzimas GC-RICH PCR y tampón de
reacción).
Para cada mezcla, agregue los componentes en el orden que se detalla a
continuación. Los viales numerados son suministrado con el kit.
Para preparar Master Mix 1 para más de una reacción, multiplique las cantidades de
todos los componentes de Master Mix 1 (excepto la plantilla de ADN) por Z, donde Z =
el número de reacciones a ejecutar + uno reacción adicional Mezcle estos componentes
para formar una solución homogénea, alícuota igual cantidades de la solución a nuevos
tubos de microfuga de 1,5 ml (uno para cada reacción, en hielo), agregue temperatura
placa de ADN a cada uno, y etiquetar cada nuevo tubo "Master Mix 1 + (nombre de la
plantilla)".
3. Mezcle los reactivos en cada tubo y centrifugue brevemente.
4. Para cada reacción, combine 35 μl de Mezcla 1 y 15 μl de Mezcla 2 en un tubo
de PCR de pared delgada (o bien de una microplaca) en hielo.
5. Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo de PCR (o pozo) para producir
una solución homogénea mezcla de reacción.
6. De acuerdo con las instrucciones suministradas con su instrumento, prepare los
tubos o
microplaca para PCR ( p. ej., superposición de la mezcla de reacción en un tubo
con aceite mineral o sellar el microplaca con lámina adhesiva).
7. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato. Las mezclas de reacción completadas no deben
almacenarse durante períodos prolongados de hora.
Valoración de la solución de resolución GC-RICH
Para cada plantilla, determine la concentración óptima de solución de resolución GC-
RICH por titulación. Siga estas pautas para la valoración:
La solución de resolución GC-RICH se puede agregar a Master Mix 2 (junto con el
GC- RICH reacción tampón y mezcla de enzimas) en lugar de Master Mix 1. En ese
caso, el el volumen final de Master Mix 2 sería de 35 μl y el volumen final de Master
Mix 1 Sería 15 μl.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil a continuación.
El siguiente perfil térmico se desarrolló para la PCR GeneAmp de Applied Biosystems
Sistema 2400. Otros cicladores de bloque térmico pueden requerir un perfil diferente.
f) Este paso tiene dos propósitos. Activa la ADN polimerasa FastStart Taq y
también desnaturaliza modelo. Para aplicaciones específicas o para aumentar
los rendimientos, puede variar el tiempo de activación de 2 minutos (para
plantillas sensibles) a 10 min (para mezclas complejas, por ejemplo, para
multiplexar hasta 14 bandas con 28 cebadores).
g) Treinta (total) ciclos suelen ser suficientes para producir una cantidad
adecuada de producto si la plantilla inicial contiene> 10 4 copias del
objetivo. Para bajas concentraciones de objetivo o objetivo complejo ( p. Ej.,
Multiplexación) mezclas, aumente el número total de ciclos a 40.
h) El aumento gradual del tiempo de alargamiento garantiza un mayor
rendimiento de los productos de amplificación. Para aumentar el rendimiento
de productos de amplificación, modifique el programa de amplificación para
que el tiempo de alargamiento aumente gradualmente ( p . ej ., por 5
segundos / ciclo) después de 15 ciclos de amplificación, (para más detalles,
consulte el paquete FastStart Taq DNA Polymerase insertar.)
i) La temperatura de recocido óptima depende de la temperatura de fusión de
los cebadores y del sistema utilizado.
j) El tiempo de alargamiento depende de la longitud del fragmento. Use 1 min /
kb para fragmentos de hasta 3 kb.
Protocolo: amplificación de objetivos de hasta 3 kb con PCR Core Kit PLUS
Acerca del kit PCR Core PLUS
El PCR Core Kit PLU S contiene todos los reactivos (excepto agua, cebadores y
plantilla) requerido para protocolos de prevención de arrastre. Incluye Taq DNA
Polymerase *; calor- lábil UNG *; una mezcla especial de nucleótidos de grado PCR
PLUS * (10 mM de dATP, dCTP y dGTP; 30 mM dUTP); dos tampones de reacción
(uno con MgCl 2 , el otro sin) y un Solución madre de MgCl 2 25 mM (para optimizar
Mg 2+ ).
* también disponible como reactivos separados de Roche Applied Science; ver pedidos
Información (en el Apéndice) para más detalles.
Configuracion de la reaccion
1. Descongele todos los reactivos congelados antes de usar. Mezcle todos los
reactivos y centrifugue brevemente antes de comenzar el procedimiento.
2. Prepare dos mezclas maestras separadas en tubos de microfuga estériles de 1,5
ml (en hielo). (Maestro La mezcla 1 contiene dNTP, cebadores y ADN de
plantilla; Master Mix 2 contiene tampón de PCR
y enzimas.)
Para cada mezcla, agregue los componentes en el orden que se detalla a continuación.
Los viales numerados son suministrado en el kit.
Mezcle los reactivos en cada tubo y centrifugue brevemente.
3. Para cada reacción, combine 25 μl de Mix 1 (incluida la plantilla de ADN) y 25
μl de Mix 2 en un tubo de PCR de pared delgada (o bien una microplaca de
PCR) en hielo.
4. Mezcle suavemente las soluciones en cada tubo de PCR (o pozo) para producir
una solución homogénea mezcla de reacción.
5. De acuerdo con las instrucciones suministradas con su instrumento, prepare los
tubos o
microplaca para PCR ( p. ej., superposición de la mezcla de reacción en un tubo
con aceite mineral o sellar el microplaca con lámina adhesiva).
6. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato.
Las mezclas de reacción completadas no deben almacenarse durante períodos
prolongados de hora.
PCR
Después de colocar las muestras en el instrumento de PCR, realice un ciclo de acuerdo
con el perfil térmico. abajo.
Protocolo: amplificación de objetivos de hasta 5 kb con Expand High Sistema
Fidelity PLUS
Sobre el Expand High Fidelity PLUS Sistema
El sistema Expand High Fidelity PLUS contiene una nueva mezcla de Taq DNA
Polymerase
y una proteína de corrección termoestable que carece de actividad polimerasa. a
diferencia de otros Enzimas de PCR o mezclas de enzimas con actividad de corrección
de pruebas, el Expand High La mezcla Fidelity PLUS incorpora fácilmente dUTP en
amplicones. Por lo tanto, el Expand High El sistema Fidelity PLUS amplificará los
objetivos de ADN de hasta 5 kb de largo con un rendimiento sobresaliente y fidelidad, y
también trabajar con UNG para evitar la contaminación por arrastre.
Las proteínas en el sistema Expand High Fidelity PLUS no son las mismas que las
en el sistema Expand High Fidelity. El sistema Expand High Fidelity contiene un
Tipo B ADN polimerasa, que es inhibida por dUTP. Por lo tanto, el Expand High
El sistema Fidelity no debe usarse en protocolos de prevención de arrastre como
aquellos descrito en esta sección.
También se incluyen en el sistema Expand High Fidelity PLUS otros reactivos que
simplifican protocolos de prevención de arrastre. Estos incluyen dos tampones de
reacción (uno con MgCl 2 , el otro sin) y una solución madre de MgCl 2 25 mM (para
optimizar Mg 2+ ).
Configurando la reacción
1. Descongele todos los componentes de reacción congelados antes de usar.
Mezcle todos los reactivos y centrifugue brevemente antes de comenzar el
procedimiento.
2. Prepare dos mezclas maestras separadas en tubos de microfuga estériles de 1,5
ml (en hielo). (Maestro La mezcla 1 contiene dNTP, cebadores y ADN de
plantilla; Master Mix 2 contiene tampón de PCR
y enzimas.)
Para cada mezcla, agregue los componentes en el orden que se detalla a
continuación. Los viales numerados son suministrado en el kit.
3. Mezcle los reactivos en cada tubo y centrifugue brevemente. Para cada reacción,
combine 25 μl de Mix 1 (incluida la plantilla de ADN) y 25 μl de Mix 2 en un
tubo de PCR de pared delgada (o bien una microplaca de PCR) en hielo. Mezcle
suavemente las soluciones en cada tubo de PCR (o pozo) para producir una
solución homogénea mezcla de reacción.
4. Coloque los tubos de PCR (o microplaca) en el instrumento de PCR y comience
la PCR de inmediato.
Las mezclas de reacción completadas no deben almacenarse durante períodos
prolongados de hora.
P CR
Coloque las muestras en el instrumento de PCR, luego realice un ciclo de acuerdo con el
perfil térmico a continuación.
El siguiente perfil térmico se desarrolló para la PCR GeneAmp de Applied Biosystems
Sistema termociclador de bloque 2400. Otros instrumentos de PCR pueden requerir un
diferente perfil.