PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA [Link].

UNSA

PRÁCTICA Nº 5

MEDIOS DE CULTIVO:

I. INTRODUCCIÓN:
Las bacterias necesitan una serie de compuestos para su desarrollo y
crecimiento (fuentes de carbono, nitrógeno, elementos minerales y
factores favorables para su crecimiento).
Los medios de cultivo son sustratos o soluciones de nutrientes en los que
crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio con el objeto
de aislar las diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación
y llevar a cabo una serie de estudios complementarios.

II. OBJETIVOS:
 Preparar medios de cultivo líquidos y sólidos.
 Realizar diferentes formas de preparación e identificación de los
medios de cultivo.
 Plaqueo y reparto de los medios de cultivo.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO:

Constituyentes de los medios de cultivo bacteriológico:
o Fuentes de energía: carbono, nitrógeno.
o Sale minerales: azufre y fósforo.
o Iones metálicos: sodio, potasio, magnesio. A concentraciones más
bajas. Zinc, manganeso, cobre, cobalto, molibdeno.
o Factores de crecimiento: cierto tipo de aminoácidos ejemplo cistina,
sangre suero , extracto de levadura.
o Factores de arranque: sustancias que permiten ala bacteria salir de
fase latente y comenzar con la fase de crecimiento exponencial
ejemplo algún ion que estimula el crecimiento.
o Factores inhibidores: sirve para inhibir el crecimiento de
determinadas especies bacterianas no deseadas ejemplo de
colorantes de anilina (Ej. Verde brillante o eosina), metales
pesados (bismuto) sustancias químicas (azidas, citrato, selenito).
Agentes anti microbianos (por Ej. Neomicina, colistina,
vancomisina, cloranfenicol).

Fuentes de carbono
Están ligados a metabolismo energético, corresponde a los azucares en
forma de monosacáridos y disacáridos: glucosa, lactosa, sacarosa, otras
bacterias utilizan azucares mas complejo para obtener energía como
almidones. Existen bacterias capaces de utilizar sustancias mas
sencillas como el acido acético, citrato de sodio.
Fuentes de nitrógeno
Es una fuente menos energética que la fuente de carbono es necesario
para el metabolismo microbiano produciendo energía, tenemos a las
proteínas, polipéptidos y aminoácidos. Peptonas: corresponde péptidos y
polipéptidos.

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 1

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La caseína es la peptona sometida la proceso de digestión debido a la

digestión acido utilizada en muchos medios de cultivo, sobre todo en
forma de peptona tripsica de caseína.

CONDICIONES PARA UN MEDIO DE CULTIVO:

Temperatura óptima:
La temperatura es una de los factores ambientales que afectan el
crecimiento y la supervivencia microbiana.
Se debe mantener la temperatura apropiada según la especie
bacteriana:
Bacterias psicrófilas: cuando crecen a temperaturas menores de 20º C
Bacterias mesófilas: crecen a temperaturas entre 18ºC y 45ºC
Bacterias termófilas crecen a temperaturas mayores de 45ºC
Las bacterias patógenas para el hombre crecen a temperaturas
óptimas de 37ºC

Presión osmótica:
Se suele trabajar a condiciones isotónicas (300miliosmoles) aunque
existen bacterias que pueden crecer a condiciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy
acuosos e hipotónicos; este hecho es debido a su pared rígida que
permite que el agua no penetre en la bacteria y este se rompa.
Otro caso en bacterias halógenas su crecimiento se produce
especialmente a concentraciones muy altas de cloruro de sodio,
Staphylococcus es capaz de crecer a7.5%ClNa, Enterococcus a 6.5% de
ClNa. Las bacterias no suelen tolerar las grandes concentraciones
salinas de allí que la salazón es un buen método de conservación.

Presencia y ausencia de oxigeno:

Los microorganismos varían en sus necesidades o tolerancia al oxígeno.
Aerobios: son capaces de crecer en presencia de oxígeno,
microaerófilos: necesitan menor proporción de oxígeno. Anaerobios:
crecen con absoluta o relativa ausencia de oxígeno. Anaerobios
obligados solo se desarrollan en ausencia de oxígeno y anaerobios
facultativos crecen en aerobiosis y en anaerobiosis.

pH
Existen sustancias que van a establecer el pH del medio a estas se
conocen como tapones o buffers. Proporcionan al medio un pH
adecuado y establece que facilita el crecimiento bacteriano. El pH óptimo
en la mayoría de casos es cercano a la neutralidad, aunque existen
bacterias que pueden crecer al pH muy bajo próximo a 0 los Thiobacilos,
otros pH alcalino pH 8 Proteos, pH 9 Vibrio.

En los medios de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como

consecuencia del metabolismo que se produce en la degradación de los
nutriente y fermentación glucocida (acidificación del medio), degradación
proteica se alcaniliza el medio por sales de amoniaco.

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 2

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CLASIFICACION:
POR SU ORIGEN:
a) Naturales: donde no hay mucha modificación: por ej. Leche,
papa, etc.
b) Artificiales o sintéticos: Donde ha habido transformación por
medios mecánicos o químicos; por [Link] mayoría de medios
comerciales como agar nutritivo, Agar MacConkey.

POR SU CONSISTENCIA
a) Líquidos: son soluciones acuosas también denominas caldos
por ej. caldo nutritivo, caldo BHI, leche, caldo suero.
b) Sólidos: son los medios líquidos a los que se les ha añadido
ciertas sustancias como Agar-agar, gelatina, silicatos solo con
el objeto de endurecerlos; por Ej., agar nutritivo, agar sangre,
agar sabouraud, etc.
c) Semisólidos: son los medios que se hallan en un estado
entre los dos primeros, sirven para estudios de motilidad
(flagelo), transporte y semianaerobiosis ej. El medio de SIM.

POR SU OBJETIVO
a) Medios de transporte: son aquellos medios que permiten
mantener a los microorganismos viables con una baja
multiplicación y conservarse en buen estado; son mucho
mejores si son semisólidos; por Ej. Cary- Blair, caldo Hajna,
Stuard, etc.
b) Medios de enriquecimiento: sirven para multiplicar bacterias
antes de su siembra, pueden o no llevar inhibidores por Ej.
Caldo Selenito para Salmonella typhi, Caldo Tetrationato para
Salmonellas en general, Caldo Lactosado, etc.
c) Medios enriquecidos o mejorados: constituidos por un
medio base corriente, al que se le añade sustancias ricas en
proteínas, aminoácidos o sustratos de mayor valor nutritivo.
Sirve para aislar y cultivar microorganismos de mas exigencias
en nutrientes: por Ej agar Sangre donde además se aprecian
hemólisis; suelo coagulado, para la producción de toxina
diftérica.
d) Medios de aislamiento: pueden ser:
o No selectivos: corrientes y mejorados.
o Selectivos: poco selectivos, medianamente
selectivos y altamente selectivos.
o Especiales.

MEDIOS DE AISLAMIENTO:
a) Medios de aislamiento no selectivos: medios mejorados
Son aquellos medios que, como su nombre dice, sirven para
aislar o cultivar bacterias, donde la mayoría de ellas
desarrollan porque no llevan inhibidores, y pueden ser: medios
básicos como agar nutritivo que llevan sustancias que tienen
un valor nutritivo; mejorados como agar sangre

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 3

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b) Medios de aislamiento selectivos: o de diagnostico

Estimulan el desarrollo y crecimiento de una especie

microbiana, inhibiendo el desarrollo de otras morfológicamente
semejantes. Mediante la adición de ciertas sustancias como
colorantes, sales biliares
Estos medios presentan el medio base, además llevan un
substrato más indicadores y de manera especial inhibidores,
que pueden ser sales, colorantes, antibacterianos tipo
antibióticos. A medida que sean más complejos o lleven
inhibidores más selectivos, pasan a la categoría de poco,
mediano y altamente selectivos; así entre los poco
selectivos tenemos; Agar Mac-Conkey, Agar EMB, ENDO
Agar, Agar Brolacin en ellos desarrollan todas las
enterobacterias, Enterococos, Pseudomonas, Alcalígenes,
Candidas. Entre los medios selectivos SS Agar; en este
medio desarrollan todas las enterobacterias pero desarrollan
mejor y rápidamente las Salmonellas y Shigellas. Entre los
altamente selectivos, que son más específicos, desarrollan
pocas especies bacterianas, así en el Agar Chapman, Manitol
Salado desarrollan las Micrococáceas; en el sulfito bismuto
Agar, desarrollan Salmonellas, específicamente S. typhi; Agar
verde brillante es propio para Salmonellas.

c) Medios de aislamientos específicos:

Éstos medios son generalmente altamente enriquecidos por el
medio Bordet-Gengou, que es para Bordetella, que contiene
además del medio básico: papa, glicerina y antibióticos; el
medio de Lowwestein que es para el Mycobacterium
tuberculosis éste medio a además del medio básico lleva
huevo, glicerina e inhibidor de verde de malaquita; en éste tipo
de medio los inhibidores tienen relativa importancia, pues su
especificidad está en función a su riqueza, otro Ej. Es el Agar
Saboraud, para hongos.

d) Medios diferenciales o bioquímicos:

Son aquellos medios que llevan un medio corriente, caldo o
Agar nutritivo, al que se le ha añadido un substrato conocido,
además lleva indicador de pH; aquí se estudiarán
desdoblamiento de substratos por acción de enzimas
bacterianas es decir el metabolismo microbiano. Así tenemos;
TSI, SIM, LIA, Urea, Citrato de Sinmons, Caldo MR-VP; que
sirven para pruebas específicas.

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 4

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1. MATERIAL REQUERIDO:
o Matraces de 250ml. 100ml. 50 ml.
o Probetas de 50 ml. 100ml.
o Baguetas.
o Balanza.
o Espátula.
o Agua destilada.
o Placas Petri.
o Tubos de Ensayo.

2. MEDIOS DE CULTIVO:
o Agar Mac- Conkey.
o Agar Nutritivo.
o Agar EMB
o Agar Manitol Salado
o Agar Miuller Hinton

3. OBSERVACIÓN:
Usted encontrará en sus mesones diferentes medios de cultivo que
utilizaremos en la práctica, lea cuidadosamente la composición y
descríbalos según la utilización.

PLAQUEO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

1. Se debe tener el ambiente limpio, fumigado o desinfectado.

2. Se debe tener el material de vidrio esterilizado y frío: Placas Petri,
tubos, frascos, Castañeda, viales, según el caso que se dé.
3. Mecheros con gas.
4. Medios de cultivo esterilizado, licuado y a una temperatura entre
48 y 52ºC.

PROCEDIMIENTO:
Plaqueo o reparto de medios en Placas Petri: colocar todo el equipo
necesario dentro del cubículo sobre la mesa, y:
- Abrir las placas Petri, quitando hilo y papel.
- Abrir el medio a repartir y flamear una ida y vuelta sobre la
llama.
- Con la mano derecha coger el frasco que contiene el medio de
cultivo, agitar suavemente rotando, flamear la boca del frasco y
verter dentro de la placa una cantidad adecuada, más o menos
15 ml.
- Cerrar la placa y dejar sobre la mesa sin que el medio toque la
tapa.
- Proseguir con el resto del medio y placas, flameando con una
ida y vuelta la boca del frasco que contiene el medio de cultivo
que se está repartiendo.
- Una vez acabado de repartir, se debe enjuagar con agua de
caño los frascos.

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 5

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- Una vez enfriado y endurado los medios en las placas se

voltean y rotulan con lápiz de cera.
- Se deja en refrigeradora a 4ºC.

Los medios se deben guardar a 4ºC ; el tiempo de duración es

relativo, por lo general corto, el agar Sangre hasta 72 horas, el
resto de medios hasta una semana; los medios de cultivo no
selectivos que han sido repartidos en placas, tubos o frascos,
deben dejarse 24 horas en estufa a 37ºC para el control de su
esterilidad, que demuestra el éxito cuando no desarrolla ninguna
bacteria u otro microorganismo.
En la preparación de los medios, después de pesado el medio de
cultivo y haber agregado el agua destilada, se debe disolver
calentando, y cuando esté a 40ºC se toma y justa el pH de 7.2 a
7.4.

DESCRIPCIÓN Y PREPARACIÓN:

AGAR NUTRITIVO:

Este agar tiene como materia prima un medio base, que es el

Caldo Corriente cuyos componentes son:
- Peptona 1.0gr.
- Extracto de carne 0.3gr.
- Cloruro de sodio 0.50gr.
- Agua destilada 100ml.
A este medio se le añade Agar-agar 1.5gr. Y se obtiene el agar
nutritivo.
Preparación:
Para su preparación, 100ml. De agar nutritivo se esterilizan a 15
lb de presión, 121 ºC durante 15 min, se deja enfriar Antes de
que se enduren, se reparten en placas Petri y tubos en posición
plano inclinado.

AGAR MAC CONKEY: selectivos.

Se basa en la fermentación de la lactosa, las colonias de
organismos capaces de fermentar lactosa producen una caída
localizada de pH, lo cual, seguido por la absorción del rojo neutro,
imparte un color rojo a la colonia. Las colonias de organismos que
no fermentan lactosa permanecen incoloras y traslúcidas. La
selectividad del medio se debe a la presencia del cristal violeta y
sales biliares que inhiben casi o completamente el crecimiento de
bacterias Gram positivas.
Composición:
- peptona caseína 17.0 gr
- Lactosa 10.0 gr.
- Peptona 3.0 gr.
- Sales biliares 1.5 gr
- Cloruro sódico 5.0 gr.
- Rojo neutro 2.0 gr.

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- Cristal de violeta 0.001 gr.

- Agar-agar 12.5 gr.
- Agua destilada 1000ml.
El medio comercial se disuelve en baño maría, se ajusta el pH a
7.2, se esteriliza a 15 lb de presión, 121 ºC durante 15 min., y se
reparten en las placas petri.
En este medio se buscan enterobacterias, además crecen
estreptococos del grupo entérico, pseudomonas y cándida. Las
bacterias degradan la lactosa haciendo variar el pH, y el indicador
vira del color lila al rosado o grosella y las que no degradan
desarrollan formando colores translucidos:

Interpretación:

COLONIA MICROORGANISMO
Incolora transparentes Salmonella, Shigella
Grande, rojo con halo turbio [Link]
Rosa grande y mucosa Enterobacter, klebsiella
Diminutos, esporadicos, opacos Enterococos, estaphylococos

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)

Desarrollar como el medio anterior.

V. RESULTADOS, DISCUCIÓN, CONCLUSIÓN, REFERENCIAS:

De cada uno de los medios se les dio, identificar cuales son los
requerimientos energético y no energéticos según la composición.
Diferencie que tipo de medios y para que se utiliza con ejemplos.
Medios: medio agar nutritivo, Mac Conkey,agar EMB, Manitol
Salado , Miuller Hinton,, Saboraud.

VI. TRABAJO ENCARGADO

Describir cada uno de los medios de cultivo según su clasificación.

McConkey:

POR SU ORIGEN:
a) Naturales:. Leche
b) Artificiales o sintéticos: Agar MacConkey.

POR SU CONSISTENCIA
d) Líquidos: lactosa
e) Sólidos: cloruro de sodio
f) Semisólidos: Sales biliares

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 7

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Realice un cuadro sinóptico de los medios de cultivo y sus usos.

permite identificar
Agar Conkey: USO bacterias gram

inhibe el crecimiento de
Agar Monitol sal USO ciertas bacterias gram

se utilizado para el aislamiento y

diferenciación de organismos
Agar XLD USO patógenos entéricos Gram
negativos, especialmente del género
Shigella.
Medios de
cultivo Su uso general permite el crecimiento
tanto de microorganismos exigentes
Agar TSA USO como no exigentes, que incluyen
bacterias aerobias y anaerobias.

Es utilizado para el aislamiento

selectivo de pseudomonas
Agar cetrimida USO aeruginosa (una bacteria gram
negativa) y de otras especies del
género. Este medio inhibe a otros

medio de cultivo universal

Agar caso USO sin inhibidores ni
indicadores.

Indica 3 medios de cultivo que no se autoclave y mencionar sus

componentes.

 AGAR MAC CONKEY

 sales biliares
 colorante cristal violeta
 indicador rojo neutro
 lactosa

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 8

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 peptona
 cloruro sódico.

 AGAR NUTRITIVO:

 Peptona
 Extracto de carne
 Cloruro de sodio
 -Agua destilada
 CALDO NUTRITIVO:

 extracto acuoso de carne.

 peptona al 1%.
 cloruro de Sodio al 0.5%

[Link]. María del Carmen Valdez Ortiz 9