[Link] Córdoba 21(3):5569-5576, 2016.

ISSN: 0122-0268

SHORT COMMUNICATION

First phylogenetic analysis of Ehrlichia canis in dogs and

ticks from Mexico. Preliminary study

Primer análisis filogenético de Ehrlichia canis en perros y

garrapatas de México. Estudio preliminar

Carolina G. Sosa-Gutiérrez,1* Ph.D, Teresa Quintero-Martinez,2 Ph.D,

Margarita Vargas-Sandoval,3 Ph.D, Guadalupe Gordillo-Pérez,4 Ph.D.

1Laboratorio Nacional de Genómica y Salud. Texcaltitla, Km 67.5. Singuilucan, Hidalgo.

México. 2Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia. Ciudad Universitaria, S/N. México D.F, México. 3Universidad Michoacana de
San Nicolás de Hidalgo, Facultad de Agrobiología, Departamento de Entomología. Av.
Lázaro Cárdenas S/N, Col. Revolución, C.P. 60150, Uruapan, Michoacán. México. 4Instituto
Mexicano del Seguro Social. Centro Médico Nacional Siglo XXI. Hospital de Pediatría, Unidad
de Investigación de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias. Cuauhtémoc, Nro. 330, Col.
Doctores. México D.F, México. *Correspondence: mcarososagtz@[Link]

Received: March 2015; Accepted: February 2016.

ABSTRACT

Objective. Phylogenetic characterization of Ehrlichia canis in dogs naturally infected and ticks,
diagnosed by PCR and sequencing of 16SrRNA gene; compare different isolates found in American
countries. Materials and methods. Were collected Blood samples from 139 dogs with suggestive
clinical manifestations of this disease and they were infested with ticks; part of 16SrRNA gene was
sequenced and aligned, with 17 sequences reported in American countries. Two phylogenetic trees
were constructed using the Maximum likelihood method, and Maximum parsimony. Results. They
were positive to E. canis 25/139 (18.0%) dogs and 29/139 (20.9%) ticks. The clinical manifestations
presented were fever, fatigue, depression and vomiting. Rhipicephalus sanguineus Dermacentor
variabilis and Haemaphysalis leporis-palustris ticks were positive for E. canis. Phylogenetic analysis
showed that the sequences of dogs and ticks in Mexico form a third group diverging of sequences from
South America and USA. Conclusions. This is the first phylogenetic analysis of E. canis in Mexico.
There are differences in the sequences of Mexico with those reported in South America and USA. This
research lays the foundation for further study of genetic variability.

Keywords: Ehrlichiosis, sequencing, 16SrRNA, genetics, etiology (Source: MeSH).

RESUMEN

Objetivos. Caracterizar filogenéticamente Ehrlichia canis a partir de perros naturalmente infectados

y sus garrapatas, mediante PCR y secuenciación del gene 16SrRNA para compararlos con diferentes
aislados encontrados en el continente Americano. Material y métodos. Se colectaron muestras
sanguíneas de 139 perros con manifestaciones clínicas sugestivas a Ehrlichiosis, y que estuvieran
infestados con garrapatas; una parte del gene 16SrRNA, fue secuenciada y alineada junto con las 17
secuencias reportadas en los países de América. Se construyeron dos árboles filogenéticos utilizando
el método de Máxima verosimilitud compuesta, y Máxima parsimonia. Resultados. Fueron positivos
5569
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a E. canis 25/139 (18.0%) perros y 29/139 (20.9%) garrapatas colectadas sobre los perros. Las
manifestaciones clínicas presentadas fueron fiebre, astenia, depresión y vómito. Las garrapatas
Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor variabilis y Haemaphysalis leporis-palustris fueron positivas
para E. canis. El análisis filogenético mostró que las secuencias 16SrRNA de Ehrlichia canis aisladas
de perros y garrapatas en este estudio forman un tercer grupo que diverge de las secuencias de
Sudamérica y EUA. Conclusiones. Es el primer análisis filogenético de E. canis en México. Hay
diferencias entre las secuencias de este estudio, con las reportadas en otros países de Sudamérica y
en EUA. Esta investigación sienta las bases para profundizar en el estudio de la variabilidad genética.

Palabras clave: Ehrlichiosis, secuenciación, 16SrRNA, genética, etiología (Fuente: MeSH).

INTRODUCTION INTRODUCCIÓN

Ehrlichia canis is an obligate intracellular bacteria, Ehrlichia canis es una bacteria intracelular obligada,
the causative pathogen of Canine monocytic patógeno causal de la Ehrlichiosis Monocítica Canina
ehrlichiosis (CME), which is a potentially zoonotic (CME), una enfermedad transmitida por garrapatas
vector-borne disease (1,2). The vector is y potencialmente zoonótica (1,2). Sus vectores
Rhipicephalus sanguineus ticks. CME distribution son las garrapatas Rhipicephalus sanguineus y
is closely related to the distribution of the vector Dermacentor variabilis. La distribución de CME está
(3). The national seroprevalence of dogs in Mexico estrechamente relacionada con la distribución del
is 33% and 74.5% in the northwest of the country vector (3). En México, la seroprevalencia nacional
(4). The clinical symptoms commonly seen with en perros es de 33%, y 74.5% en el noroeste
this disease in infected dogs are fever, vomiting, del país (4). Las manifestaciones clínicas en los
arthralgia, rash, and diarrhea (5). Diagnosis is perros infectados son: fiebre, vómito, artralgia,
based on visualization of the morula in monocyte rash, y diarrea (5). El diagnóstico se basa en la
and enzymatic-immunoassay (4); however, as visualización de la mórula dentro del monocito e
molecular tools 16SrRNA gene detection by PCR inmunoensayo-enzimático (4); sin embargo, las
and sequencing have been successfully used herramientas moleculares como la detección del
for diagnosis (6,7). In Venezuela, E. canis was gene 16SrRNA mediante PCR y secuenciación han
isolated from blood of an asymptomatic patient, sido utilizadas exitosamente para el diagnóstico
and another study in infected dogs and ticks from (6,7). En Venezuela, se aisló E. canis en sangre de
the same region suggest that it is a zoonotic humano con presentación clínica asintomática; y
pathogen (2.8). posteriormente, otro estudio en perros y garrapatas
infectadas de la misma región geográfica sugiriendo
Because of the high seroprevalence of infection que es un patógeno de comportamiento zoonótico
on dogs from Mexico, is necessary to determine (2,8).
the actual frequency using molecular methods,
and knowing the genetic variability of E. canis in Debido a la alta seroprevalencia de infección en
dogs and ticks reported from American countries. perros de México, es necesario determinar la
According to this, the aim of this study was to frecuencia real mediante técnicas moleculares,
determine the frequency of Ehrlichia canis in conocer la variabilidad genética de E. canis en los
dogs naturally infected, as well as infesting ticks perros infectados y de las garrapatas reportadas
it, comparing the sequences identified in Mexico en América. Acorde a esto, el objetivo de este
with those published in GenBank from American estudio fue determinar la frecuencia de Ehrlichia
countries, and perform phylogenetic analysis canis en perros naturalmente infectados; así
looking for the relation between isolates. como, la frecuencia de las garrapatas que lo están
infestando, comparar las secuencias identificados
en México con aquellas publicadas en el GenBank de
MATERIAL AND METHODS países Americanos y realizar un análisis filogenético
buscando la relación entre los aislados.
Study areas and samples [Link] study
was conducted in Northwestern of Mexico, state MATERIAL Y MÉTODOS
of Sinaloa. The study was approved by Comisión
Nacional de Investigación (R-2013-069, México). Sitio de estudio y recolección de muestras. El
Samples were collected from July 2010 to August estudio se llevó a cabo en el Noroeste de México,
2011. In this study, dogs captured by the pound en el estado de Sinaloa. El estudio fue aprobado
in three cities of North, Central and South, as por la Comisión Nacional de Investigación (R-
2013-785-069; México). Las muestras fueron
 Sosa-Gutiérrez et al - Ehrlichia canis, phylogenetic analysis in Mexico 5571

well as dogs carried to any veterinary of Sinaloa colectadas de Julio del 2010 hasta Agosto del
were included. As well as owners of sick dogs, 2011. Se incluyeron en el estudio los perros
workers of veterinary and kennels to participate capturados por las perreras municipales de tres
in the study, prior informed consent; 88 owners ciudades al Norte, Centro y Sur del estado, así
and kennel workers accepted and we collected como los perros llevados a revisión a alguna de
their blood samples for finding infection (data las clínicas veterinarias de participantes. Se invitó
not shown). 139 dogs with suggestive clinical a los dueños de los perros enfermos, trabajadores
manifestations were taken blood samples, and de las clínicas veterinarias y de las perreras a
two ticks were collected from each dog. participar en el estudio, previo consentimiento
informado; 88 personas aceptaron y se les tomó
Ticks were identified morphologically by muestra sanguínea para la búsqueda de infección
entomologists, using dichotomous keys. DNA (resultados no mostrados). Se les tomó muestra
from 139 blood samples dogs of and ticks was sanguínea a 139 perros con manifestaciones
extracted with QIAamp® DNA Blood kit (Qiagen, clínicas sugestivas, y que estuvieran infestados
CA), and stored at -80 until the processing. con garrapatas. Se colectaron dos garrapatas por
For E. canis and Ehrlichia spp. detection, part cada perro. Las garrapatas fueron identificadas
of 16SrRNA gene was amplified with ECC-ECB morfológicamente por entomólogos, mediante
and HE3-ECA primers, previously described claves dicotómicas.
(2,8) amplified an expected band 389pb; and
sequencing was performed using 15F-842R El ADN de las muestras sanguíneas de los 139
primers, previously described amplifying the perros y las garrapatas fue extraído con el kit
16SrRNA gene, with an expected band of 800bp QIAamp® DNA Blood purificación (Qiagen, CA), y se
(9). In each reaction was included a positive and congeló el ADN a -80ºC, hasta su procesamiento.
negative (distilled water) control. Para la detección de E. canis y Ehrlichia spp., se
amplificó una parte del gene 16SrRNA, utilizando
Sequencing. Positive samples to Ehrlichia canis los iniciadores ECC-ECB y HE3-ECA descrito
were purified by the kit protocol of QIAquick Gel previamente (2,8) amplificando una banda
Extration Minikit (Qiagen, CA). Sequences were esperada de 389pb; la secuenciación se realizó con
analyzed with Chromas 233 program, and the los iniciadores 15F-842R, previamente descritos
search was conducted in GenBank database to amplificando el gene 16SrRNA, con una banda
determine the species and homology. esperada de 400pb (9). En cada reacción se incluyó
un control positivo y negativo (agua destilada).
Phylogenetic analysis. 15-856 region
of the 16SrRNA gene was sequenced and Secuenciación. Las muestras positivas a Ehrlichia
aligned individually with MUSCLE program. canis fueron purificadas mediante el kit comercial
The phylogenetic trees were performed with de QIAquick Gel Extration Minikit. Las secuencias
the program MEGA v.5, using the Maximum fueron analizadas con el programa Chromas 233,
Likelihood Composite (MLC) method, and y se realizó la búsqueda en base de datos de
Maximum Parsimony method, by assembling GenBank, para determinar la especie y homología.
data from bootstrap in 1,000 repetitions. The
Neighbor-Join algorithm was used to obtain the Análisis filogenético. Fue secuenciada una parte
initial tree, with 10 replicas of the sequences ubicada entre la región 15-856 del gene 16SrRNA,
(10,11). y alineada de manera individual con el programa
MUSCLE. Los árboles filogenético se realizaron
mediante el programa MEGA v.5, utilizando el
RESULTS método de Máxima Verosimilitud Compuesta (MLC),
y Máxima Parsimonia, mediante el ensamblaje
Of 139 dogs, were obtained 41 positive dogs with de 1,000 datos en repeticiones aleatorizadas. El
clinical manifestations (Table 1). Ehrlichia spp. algoritmo del vecino más cercano fue utilizado
was found in 41/139 (27.52%) from dogs with para obtener el árbol inicial, con 10 réplicas de las
clinical suspect, where E. canis was detected in secuencias (10,11).
25/139 (18.0%). The tick R. sanguineus was
the most prevalent (92.1%), and were identified RESULTADOS
Ixodes scapularis, H. leporis-palustris and D.
variabilis ticks. Were positive to Ehrlichia spp. De los 139 perros muestreados, se obtuvieron
32/139 (23.2%) ticks and 29/139 (20.86) ticks 41 perros con síntomas clínicos (Tabla 1). Para
to E. canis (Table 2). The dogs risk to be infected Ehrlichia spp., se encontró 41/139(27.52%) de
with E. canis when ticks were positive was 8.24 los perros positivos, de los cuales E. canis fue
OR (IC 3.2-21.9, 95%). detectada en 25/139 (18.0%). La garrapata
R. sanguineus fue la prevalente (92.1%),
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Table 1. Clinical manifestations presented in dogs

además, se identificaron las garrapatas
positive for Ehrlichia infection. Ixodes scapularis, H. leporis-palustris y D.
variabilis. Fueron positivas para Ehrlichia spp.,
Clinical Dogs with
manifestation Ehrlichiosis (%)
P value OR 95% CI 32/139(23.2%) garrapatas y 29/139(20.86) a
Fever 19 (61.0) <0.01 8.04 (2.84-23.02) E. canis (Tabla 2). El riesgo de los perros de
Asthenia 23 (74.2) ≤0.01 12.27 (4.18-37.28) contraer la infección con E. canis cuando las
Depression 6 (25.0) <0.01 5.86 (1.95-16.86)
garrapatas son positivas es de 8.24 OR (CI
Vomiting 13 (42.0) <0.01 4.46 (1.55-13.00)
Nausea 13 (42.0) <0.01 3.82 (1.40-10.56) 3.2-21.9, 95%).
Petechiae 9 (19.4) <0.01 15 (2.05-140.00) *
Anorexia 12 (38.7) NS - De los productos positivos, se secuenciaron
Epistaxis 1 (3.2) NS -*
Mane 2 (6.4) NS -*
6 muestras para E. canis; tres muestras de
* Fisher test. NS: Not significative.
perros de tres diferentes regiones geográficas
y tres muestras de diferentes especies de
garrapatas. Las secuencias amplificadas
Table 2. Identification, developmental stage and del gene 16SrRNA de perros y garrapatas
results of ticks collected. mostraron una homología de 99.8% (GenBank
Stadiums Results
No. KP844657-62) a la secuencia de Ehrlichia
Identification
No. ticks canis cepa Jake, E. canis VHE, E. canis VDE, y
(%) Ehrlichia spp E. canis
♂ ♀ Nymphs E. canis cepa Brazil-COI (Tabla 3).
(%) (%)
128
R. sanguineus 44 58 26 28 (87.5) 27 (93.1)
(92.1)
Se realizaron dos árboles: el primero con el
6
D. variabilis
(4.3)
0 6 0 2 (6.20) 1 (3.45) método de Máxima verosimilitud (Figura 1),
3 en cual muestra el árbol con la probabilidad de
H. leporispalustris 0 2 1 1 (3.15) 0
(2.1) registro más alto (-1074.2304); se construyó
I. scapularis
1
(0.72)
0 1 0 0 0 de forma automática, con la búsqueda
1
heurística mediante la aplicación del algoritmo
Boophilus spp 1 0 0 0 0
(0.72) de vecino más cercano con una matriz de
Total 139 45 67 27 32 29 distancias estimadas por pares, utilizando
♂: Male adult tick. ♀: Female adult tick. el método de MCL; después de seleccionar
la topología con un valor de probabilidad log
We sequenced six positive products for E. canis; superior. El árbol se muestra a escala, con
three dog samples and three tick samples. The longitudes de rama medidos en el número de
16SrRNA gene amplified from dogs and ticks sustituciones por sitio.
(GenBank No. KP844657-62) showed a 99.8%
homology with Ehrlichia canis strain Jake, E. canis
HEV, E. canis VDE and E. canis strain Brazil- COI
sequences (Table 3).

Table 3. Frequency of substitution (%) among isolates of Ehrlichia canis in dogs and ticks isolates found in the
Americas.
Sequences 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

E. canis str. Jake   - - - - - - - - - - - - - - -

E. canis str. Brazil-CO2 0.0000   - - - - - - - - - - - - - -

E. canis str. Brazil-CO1 0.0000 0.0000   - - - - - - - - - - - - -

E. canis M7322680 0.0025 0.0025 0.0025   - - - - - - - - - - - -
E. canis str. Oklahoma 0.0025 0.0025 0.0025 0.0000   - - - - - - - - - - -
E. canis iso. VDE 0.0000 0.0000 0.0000 0.0025 0.0025   - - - - - - - - - -
E. canis iso. VHE 0.0000 0.0000 0.0000 0.0025 0.0025 0.0000   - - - - - - - - -
E. canis DQ91597080 0.0000 0.0000 0.0000 0.0025 0.0025 0.0000 0.0000   - - - - - - - -
E. canis iso. Belem_Ec01 0.0025 0.0025 0.0025 0.0050 0.0050 0.0025 0.0025 0.0025   - - - - - - -
E. canis U2674080 0.0000 0.0000 0.0000 0.0025 0.0025 0.0000 0.0000 0.0000 0.0025   - - - - - -
E. canis AY39446580 0.0025 0.0025 0.0025 0.0050 0.0050 0.0025 0.0025 0.0025 0.0050 0.0025   - - - - -
Sinaloa Tick6g 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0503 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0476 0.0504   - - - -
Sinaloa Tick32g 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0503 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0476 0.0504 0.0050   - - -
Sinaloa Tick18g 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0503 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0476 0.0504 0.0050 0.0050   - -
Sinaloa Dog31p 0.0447 0.0447 0.0447 0.0474 0.0474 0.0447 0.0447 0.0447 0.0474 0.0447 0.0475 0.0616 0.0616 0.0616   -
Sinaloa Dog56p 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0503 0.0476 0.0476 0.0476 0.0503 0.0476 0.0504 0.0706 0.0706 0.0706 0.0364  
Sinaloa Dog75p 0.1089 0.1089 0.1089 0.1118 0.1118 0.1089 0.1089 0.1089 0.1118 0.1089 0.1121 0.1382 0.1350 0.1382 0.0985 0.0961

* Analyses were performed using Maximum Likelihood Composite method.

 Sosa-Gutiérrez et al - Ehrlichia canis, phylogenetic analysis in Mexico 5573

Two trees were performed: the first with El segundo árbol se construyó mediante el
Maximum likelihood method (Figure 1), in which método de Máxima Parsimonia (Figura 2). Se
shows the tree with the highest log likelihood muestra el mejor árbol de los 10 árboles más
(-1074.2304); was constructed automatically, parsimoniosos (longitud=91). El índice de
with the heuristic search by applying Neighbor- consistencia es 0.967033 (0.936170), el índice
Join algorithm with a matrix of pairwise distances de retención fue de 0.972973 (0.972973) y el
estimated, using MCL method; after selecting índice compuesto es 0.940897 (0.910868),
the topology with a value greater likelihood log. para todos los sitios y sitios de parsimonia.
The tree was drawn to scale with branch lengths El árbol se obtuvo utilizando el algoritmo
calculated using the average pathway method subárbol-poda-reinjerto (SPR) con nivel de
and are in the units of the number of changes búsqueda 0 en el que los árboles iniciales se
over the whole sequence. obtuvieron mediante la adición aleatoria de
secuencias (10 repeticiones).
The second tree was constructed by Maximum
Parsimony method (Figure 2). Tree number
1 out of 10 most parsimonious trees (length DISCUSIÓN
= 91) is showed. The consistency index is
0.967033 (0.936170), the retention index is Estos resultados confirman la existencia del
0.972973 (0.972973), and the composite index is ciclo enzoótico de transmisión a E. canis en
0.940897 (0.910868) for all sites and parsimony- Sinaloa, México. El 92.1% de las garrapatas
informative sites. The Maximum parsimony identificadas fueron R. sanguineus, de las
tree was obtained using the Subtree-Pruning- cuales 28 fueron positivas a Ehrlichia spp., y 27
Regrafting (SPR) algorithm with search level 0 positivas a E. canis. Dos garrapatas D. variabilis
in which the initial trees were obtained by the adultas fueron infectadas con Ehrlichia spp.,
random addition of sequences (10 replicates). siendo el primer reporte de esta asociación en
México, aunque ya está demostrado de manera

Figure 1. Phylogenetic analysis of 16SrRNA gene of Ehrlichia canis, constructed with sequences of America
countries by Maximum Likelihood method.
5574 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 21(3) Septiembre - Diciembre 2016

Figure 2. Phylogenetic analysis of 16SrRNA gene of Ehrlichia canis, constructed with sequences of America
countries by Maximum Parsimony method.

DISCUSSION experimental la competitividad de este vector

para transmitir la bacteria (4). Los anticuerpos
These results confirm the existence of enzootic a E. canis pueden permanecer elevados durante
cycle transmission to E. canis in Sinaloa, Mexico. un período de tiempo prologando, provocando
92.1% of the ticks identified were R. sanguineus, falsos positivos en zonas endémicas.
in which 28 were positive for Ehrlichia spp., and
27 positive to E. canis. Two adult D. variabilis ticks Es la primera evidencia de E. canis en las
were infected with Ehrlichia spp. This is the first garrapatas H. leporis-palustris en México.
report of this association in Mexico. It was already Lo que pudiera representar la presencia de
experimentally demonstrated the competitiveness vectores potenciales, capaces de transmitir E.
of this vector to transmit the bacteria (4). canis. Se necesita más información al respecto,
Antibodies an E. canis can remain elevated during para conocer si estos vectores pueden adquirir
a period of time prolonging, causing false positives el papel de vectores competentes; es decir,
in endemic areas. capaces de transmitir este patógeno y causar
la enfermedad.
It is the first evidence of E. canis in H. leporis-
palustris ticks in Mexico. It may represent La presencia de tres grupos principales (I,
the presence of potential vectors, capable of II y III) para E. canis, demuestra que este
transmitting E. canis. More information is needed patógeno presenta pocas variables en el
in order to prove if this vector can take on the role continente Americano, similar a lo encontrado
of competent vectors; ie, capable of transmitting en otro trabajo (6). Aunque los aislados
the pathogen and causing the disease. mexicanos muestran diferencias entre los
grupo I y II, las secuencias encontradas
The presence of three main groups (I, II and III) for presentaron una relación ancestral con las
E. canis, shows that this pathogen has few variables secuencias de Venezuela, Brasil y Estados
in America, similar to that found in other studie Unidos; hipotetizando que es posible encontrar
(6). Although, Mexican isolates show differences la misma variante de E. canis entre los
between the groups I and II; the sequences países de América. Es necesario realizar el
found, presented an ancestral relationship with the análisis filogenético de E. canis entre las
sequences from Venezuela, Brazil and the United secuencias presentes a nivel mundial, así
States; hypothesizing that it is possible to find the como, la búsqueda de otros genes con mayor
same variant of E. canis among American countries. variabilidad y observar el comportamiento.
It is required more phylogenetic analysis of E. canis
 Sosa-Gutiérrez et al - Ehrlichia canis, phylogenetic analysis in Mexico 5575

between worldwide sequences, and search for Este estudio presenta las primeras evidencias
other genes with greater variability and observe moleculares de E. canis en perros y garrapatas
the behavior. de Sinaloa, México. Los resultados muestran un
alto riesgo de infección en perros infestados con
This study presents the first molecular evidence of garrapatas (12). La importancia de entender
E. canis in dogs and ticks from Sinaloa, Mexico. The el ciclo enzoótico de Ehrlichia en garrapatas,
results show a high risk of infection in tick-infested reservorios silvestres y domésticos, puede
dogs. In Mexico, recent study in ticks proves a ayudar a realizar estrategias para prevenir la
high frequency of infection of E. canis, and could infección en los perros (12,13).
play a hight risk in humans and dogs (12). The
importance of understanding the enzootic cycle of E s t a i n v e s t i g a c i ó n s i e n t a l a s p r i m e ra s
Ehrlichia in ticks, wild and domestic reservoirs, can bases para profundizar en el estudio de la
help implement strategies to prevent infection in variabilidad genética, en aislados no sólo de
dogs (12, 13). E. canis, sino del resto de las enfermedades
transmitidas por vector, ayudando a entender
This research provides the assessment for further el comportamiento, y posibles blancos en su
study of genetic variability in isolated not only prevención.
from E. canis, but the rest of vector, helping to
understand the behavior and potential targets in Agradecimientos
preventing diseases.
Los autores quieren agradecer a Abha Grover por
Acknowledgments las correcciones gramaticales y de lenguaje en este
artículo. El proyecto fue financiado por: CONACYT-
The authors wish to thanks Abha Grover for Salud 2008-1 87868 y una beca escolar otorgada
grammar and language revision of this article. This por CONACYT: 252266.
work was supported by CONACYT-Health 2008-1
87,868 and a school scholarship from CONACYT:
252266.

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