ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL

Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción

Ingeniería en Alimentos

Laboratorio de Fermentación y Enzimología Alimentaria 101

Reporte #3
Factores que influencian la cinética enzimática

Integrantes:
- Jorge Centeno
- Jorge Gil
- Sonia Holguín
- Julissa León
- Leonor Moreira

Profesor: Diana Coello Montoya, MSc.

RESUMEN
En el presente trabajo se evaluó el efecto de la temperatura, pH y el uso de inhibidores
en la actividad catalítica de la enzima alfa amilasa utilizando como sustrato el almidón
de maíz, las temperaturas empleadas fueron: ambiente, 37°C y 50°C a pH de 7
mientras que para el análisis de pH se utilizó una temperatura constante de 37°C
variando los pH de 4 a 8 por otra parte para los inhibidores se utilizó una solución de
peróxido de hidrogeno a concentraciones de 0.4, 0.6 y 0.8 a una temperatura
constante de 37°C adicionalmente se hicieron pruebas de azúcares reductores
utilizando DNS, posteriormente se realizaron pruebas de absorbancia que nos
ayudaron a determinar que las condiciones óptimas de esta enzima está cerca de los
37°c y a un pH de 6.

INTRODUCCIÓN
En las enzimas su actividad tanto enzimática como catalítica se ve afectada por
diferentes factores que deben ser optimizados y controlados para obtener resultados
coherentes y reproducibles, entre estos factores se encuentra: la temperatura, presión,
pH, fuerza iónica, concentración de sustratos y la presencia de inhibidores (Koolman y
Rohm, 2005).

Las enzimas poseen diferentes pH óptimo; hay enzimas animales que realizan su
actividad máxima a un pH de 7 que es el pH habitual de la células, pero hay otras
como las proteinasas por ejemplo la pepsina que trabajan a condiciones idóneas a un
pH de 2 en el ácido estomacal sin olvidar las enzimas que trabajan a un pH óptimo
básico superiores a [Link] cambios en la actividad enzimática por pH se debe a las
interacciones existentes entre los residuos de aminoácidos de los centros activos de
las enzimas o de los sustratos con los componentes ionizables del medio alterando su
conformación y estructura(Whitaker, 2003). Con respecto a temperaturas la actividad
enzimática cambia ya que cuando hay un aumento de temperatura se incrementa la

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actividad enzimática al inicio sin embargo a medida que pasa el tiempo la actividad va
decreciendo por desnaturalización (Koolman y Rohm, 2005).

La interferencia de inhibidores en la actividad enzimática es de gran relevancia ya que

estas se unen a la enzima evitando la formación del complejo enzima sustrato o
bloqueando la reacción que lleva la formación del producto. Un inhibidor es
básicamente una molécula que se une con la enzima reversible o irreversiblemente ya
sea por la unión covalente o no covalente de esta molécula a la enzima, en las
reacciones biológicas mayormente se encuentran inhibiciones reversibles ya que es la
misma fuerza no covalente con la que se enlazan los sustratos y productos (Horton,
2008).

El objetivo de esta práctica es analizar la influencia de la temperatura, pH y el uso de

inhibidores en la actividad catalítica de la alfa amilasa utilizando como sustrato el
almidón de maíz en cierto tiempo (Coello, 2018).

MATERIALES Y MÉTODOS

Este experimento se realizó siguiendo la metodología descrita en la guía de laboratorio

de Fermentación y Enzimología Alimentaria, práctica 5. El ensayo de efecto de la
temperatura en la velocidad enzimática solo se realizó a temperatura ambiente y a
37°C.

La muestra utilizada fue: almidón; y la enzima α-amilasa.

RESULTADOS

Tabla 1. Absorbancia a 540nm del micro placa usada para las soluciones de glucosa.

Tabla 2. Absorbancia a 540nm de las diferentes soluciones de glucosa.

Tabla 3. Absorbancia a 540nm del micro placa usada para las soluciones de glucosa
diluida

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Tabla 4. Absorbancia a 540nm de las diferentes soluciones de glucosa diluida

Tabla 5. Tabla de concentraciones de glucosa y absorbancia promedio

Tabla 6. Valores de la concentración de glucosa vs absorbancia

Grafica 1. Curva de calibración

EFECTO DE INHIBIDORES
Tabla 7. Valores de absorbancia de inhibidor

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EFECTO DE LA TEMPERATURA
Tabla 8. Valores de absorbancia media de temperaturas

Tabla 9. Velocidad de reacción

Preguntas

Según el rango de temperatura y pH para la actividad de la enzima ¿Cuál cree

usted sería su origen?

Las α-amilasas tienen uno o dos iones de Ca 2+ intrínsecos, cerca del centro activo
formado por los dos dominios, A y B. El Ca 2+ es necesario para el plegamiento y la
estabilidad de la enzima; los sitios de unión al calcio secundarios son responsables de
la estabilización de la enzima contra la desnaturalización térmica y del surfactante
(Sivaramakrishnan et al., 2006).
El efecto del pH en la enzima se debe a la concentración de iones de hidronio del
medio, esto influye en la estructura tridimesional de la enzima y en la afinidad de la
enzima al sustrato (Badui, 2006). Los valores de pH suelen estar entre 6 y 8, y están

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asociados con las propiedades específicas de la preparación enzimática (Yankov et
al., 1986).

¿Qué otra sustancia puede actuar como inhibidor para la alfa-amilasa?

Se pueden utilizar como inhibidores glicoproteínas con bajo peso molecular que se
encuentran en semillas de leguminosas y gramíneas por ejemplo, la phaseolamin un
inhibidor proveniente del fríjol riñón (Phaseolus vulgaris); también los polifenoles
encontrados en fresas tienen efecto inhibidor. (Padilla et al., 2006).

¿Qué espera observar en las curvas de temperatura, pH y concentración de

inhibidor si se continúan aumentando o disminuyendo los valores en el eje de
las X? Explique.

Özbek & Yüceer (2001) indican que en las curvas de temperatura cuando se
aumenten los valores de pH habrá menor actividad enzimática y un menor grado de
hidrolisis, también pasará lo mismo para la curva de temperatura. Al disminuir los
valores de pH en la curva se encontrará como pH óptimo 6.5 para la enzima; y en la
curva de temperatura la óptima llegaría a 55 °C. En las curvas de inhibidor cuando se
aumenten los valores del eje x, la actividad enzimática disminuirá.

¿Cuál es el principio del método colorimétrico con DNS para la medición de

azúcares reductores?

El principio del método se basa en la disminución del valor en la tinción del complejo
azul de almidón-yodo (Xiao et al., 2006). El ácido dinitrosalicico (DNS), se utiliza para
determinar azúcares reductores, está compuesto por ácido dinitrosalicílico, sal de
Rochelle, fenol, bisulfito de sodio e hidróxido de sodio. La sal de Rochelle se introduce
para evitar que el reactivo disuelva el oxígeno; el fenol, para aumentar la cantidad de
color producido y para equilibrar el efecto del fenol encontrado en la muestra; el
bisulfito, para estabilizar el color obtenido en presencia del fenol; y el álcali para que el
DNS tenga una acción reductora sobre la glucosa (Miller, 1959).

CONCLUSIONES
 Una de las enzimas usadas para la ruptura de los enlaces glucosídicos del
almidón, es la α-amilasa, siendo esta la más usada en la industria de alimentos
en cuanto a la obtención de azúcares reductores, en la que posee propiedades
muy favorables; como estabilidad térmica, alto grado de especificidad en su
punto de unión, estabilidad enzimática gracias al cofactor de Ca.
 Los factores que influyen en la velocidad de reacción de la enzima para
generar productos es la Temperatura y pH. Se determinó que presenta una
temperatura optima correspondió a la del ambiente (25ºC) ya que se puede
observar el nivel de absorbancias es el más alto, debido a que disperso menos

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 luz. La desactivación de la enzima α-amilasa se dio en temperatura superiores
a 37ºC.
 El pH optimo que influye que la enzima pueda degradar al carbohidrato es 6.
La velocidad de reacción sin inhibidor es de 0.011 (g/l )/min y con inhibidor fue
de 0.008 (g/l )/min.

RECOMENDACIONES

En esta práctica se recomienda tomar las precauciones necesarias para evitar la

pérdida de muestras cuando se realiza el baño maría, usando papel parafilm de
manera muy ajustada debido a que al aumentar la temperatura aumenta también la
presión en los tubos eppendorf y por ende perdida de muestra, ocasionando que
pueda dar una lectura errónea en el espectrofotómetro.

BIBLIOGRAFÍA

Badui, S. (2006). Química de los alimentos. México D.F, México: PEARSON

EDUCACIÓN.

Coello, D. (2018). Guía Práctica de Curso - Laboratorio de Fermentación y

Enzimología Alimentaria. Guayaquill: ESPOL.

Horton, H., Morán, L., Scrimgeur, K., Perry, Marc. & Rawn, J. (2008). Principios de
bioquimica. México S.A, México: PEARSON EDUCACIÓN.

Koolman, J. & Rohm, K.(2005).Bioquimica texto y atlas. Madrid, Madrid: MÉDICA

PANAMERICANA.

Miller, G. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing

sugar. Analytical Chemistry, 31, 426–428.

Özbek, B. & Yüceer, S. (2001). α-Amylase inactivation during wheat starch hydrolysis
process. Process Biochemistry, 37, 87–95.

Padilla, B., Acuña, J., Velásquez, C. & Rubio, J. (2006). Inhibidores de α -amilasas de
la broca del café Hypothenemus hampei en diferentes especies vegetales.
Revista Colombiana de Entomología, 32(2), 125-130.

Sivaramakrishnan, S., Gangadharan, D., Nampoothiri, K., Soccol, C. & Pandey, A.

(2006). α-Amylases from Microbial Sources – An Overview on Recent
Developments. Food Technology and Biotechnology, 44 (2), 173–184.

Whitaker, J.R. (2003). Enzyme-catalyzed reactions. En: Handbook of Food

Enzymology (editado por J.R. Whitaker, A.G.J. Voragen & D.W.S. Wong). New
York, USA: Marcel Dekker, Inc.

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Xiao, Z., Storms, R. & Tsang, A. (2006). A quantitative starch-iodine method for
measuring alpha-amylase and glucoamylase activities. Analytical biochemistry,
351, 146-148.

Yankov, D., Dobreva, E., Beschkov, V. & Emanuilova, E. (1986). Study of optimum
conditions and kinetics of starch hydrolysis by means of thermostable α-
amylase. Enzyme and Microbial Technology, 8(11), 665-667.

ANEXOS

Cálculos

Efecto del pH en la velocidad enzimática 

Concentración 

pH 4
X= (2.496-0.074) /15.58 
X=0.155

pH 5
X= (3.070-0.074) /15.58 
X=0.192

pH 6
X= (2.973-0.074) /15.58
X=0.1860

pH 7
X= (2.337-0.074) /15.58
X=0.145

pH 8
X= (2.977-0.074) /15.58
X=0.1863

 
Concentración mM/L
 
pH 4
(0.155 /180) *1000
X=0.864

pH 5
(0.192 /180) *1000
X=1.068

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pH 6
(0.186 /180) *1000
X=1.034

 pH 7
X=(0.145/180) *1000
X=0.807

pH 8
X=(0.1863 /180) *1000
X=1.035

Velocidad 

pH 4
0.864/10=0.086

pH 5
1.068/10=0.107

pH 6
1.034/10=0.103

pH 7
0.807/10=0.081

pH 8
1.035/10=0.104

 
Efecto del pH en la velocidad enzimática 

pH 4
(0.155/180) *1000 =0.864

pH 5
(0.192 /180) *1000 =1.068

pH 6
(0.186/180) *1000=1.034

pH 7
(0.145/180) *1000=0.807

pH 8
(0.1863 /180) *1000 =1.035

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