Informe de Laboratorio No.

Cinética enzimática
Gonzales Leydi, Obando Camilo, (camilobando04@[Link]); Valdés Laura, ([Link]@[Link])
Universidad de Nariño, Programa de Biología
13 de noviembre de 2019

Resumen
Para esta práctica se determinó los parámetros de Michaelis-Menten para la enzima catalasa, como primer ensayo, se
sumergieron papeles filtro en una solución de catalasa homogeneizada con buffer de fosfato 0.1 M, estos se introdujeron
en una probetas con 15 mL de 10 soluciones diferentes de peróxido de hidrogeno (H2O2), en donde se midió el tiempo
que tarda el papel filtro en ascender a la superficie, se realizó por triplicado, obteniendo una Km de o.2175 y una Vmax
de 0.435 correspondiente a la solución de 100 mM de; a medida que disminuía la concentración del peróxido de
hidrogeno el papel filtro demoraba más en ascender por lo cual su velocidad enzimática disminuía. De las 10 soluciones
iniciales, 4 se sometieron a una temperatura de 55°C arrojando un aumento en la velocidad con respeto al primer
ensayo. Como último ensayo se midió la velocidad enzimática de la catalasa en presencia de una solución de MgCl2 el
cual actúa como inhibidor, a diferentes concentraciones aforada con peróxido de hidrógeno, obteniendo que la solución
con 50 mM de MgCl2 tardo menos en ascender el papel filtro con un tiempo de 0.11 seg, analizando que a mayor
concentración de MgCl2 la enzima tarda menos en reaccionar.
Palabras claves: cinética, enzima, catalasa, peróxido de hidrogeno.
INTRODUCCIÓN Y la oxidación de donadores de H, como metanol,
etanol, ácido fórmico, etc. con el consumo de un mol de
La cinética enzimática estudia la velocidad de las peróxido: ROOH + XH2 → H2O + ROH + X
reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan información directa acerca del mecanismo El complejo activo catalasa-H2O2 se forma primero. La
de la reacción catalítica y de la especificad del enzima. descomposición de 2H2O2, en la cual una segunda
La velocidad de una reacción catalizada por un enzima molécula de 2H2O2sirve como donador de H para el
puede medirse con relativa facilidad, la medida se complejo activo, procede de manera rápida (k~107 M-1
realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, s-1), mientras que reacciones peroxidativas ocurren a
temperatura, presencia de cofactores, etc., y se utilizan menor velocidad (k~102 – 103).
concentraciones saturantes de sustrato. En estas
condiciones, la velocidad de reacción observada es la En la ecuación de Michaelis-Menten:Ecuación (1)
velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede
determinarse bien midiendo la aparición de los
productos o la desaparición de los reactivos.
Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de
la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad
inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de METODOLOGÍA
enzima constante. Si representamos V0 frente a [S]0
obtenemos una gráfica como la de la Figura de la Se preparó 500 mL de buffer de fosfato 0.1 M a pH 7.0 y
derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es se mezcló con 20 mL de K2HPO4 1 M, 32 mL de
directamente proporcional a la concentración de KH2PO4 1 M y 448 mL de agua destilada, con un pH 7.0
sustrato, y, por tanto, la reacción es de primer orden. A y frio, del cual se utilizaron 250 mL y en una licuadora se
altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el homogenizo con 4 g de hígado para preparar la solución
sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este diluida de catalasa.
punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es De la solución diluida de catalasa homogenizada cual se
máxima (Vmax). tomó 25 mL y se diluyo a una relación 1:10 con el buffer
de fosfato 0.1 M a pH 7.0 frío. Se cortaron papeles filtro
En esta práctica se utilizó la enzima catalasa (peróxido y se sumergieron en la solución diluida de catalasa.
de hidrógeno oxidorreductasa) es una enzima que Luego se prepararon en conjunto soluciones de H2O2 a
contiene el grupo heme y que está presente en todos los concentraciones de 10%, 7.5%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%,
organismos aeróbicos. 0.5%, 0.25% y 0.1%.De las cuales nuestro grupo
preparo H2O2 al 0.5% y 0.25%, agregando a un matraz
La catalasa tiene dos funciones: la descomposición de
aforado 8.5 mL y 4.25 mL de H2O2 30%
peróxido de hidrógeno, producido por el superóxido
respectivamente y se diluyo con 500 ml de agua.
dismutasa y oxidasas flavino-dependientes, en agua y
oxígeno: 2H2O2 → O2 + 2H2O

1
Además, se prepararon soluciones de inhibidores 5 0,078125
(CH3COOH, CH3OH y MgCl2) a concentraciones de 2.5 0,06238303
5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% en H2O2 1%. 1 0,0435161
De las cuales nos correspondió preparar la de MgCl2 al
1% y 0.1% donde se agregó a un matraz aforado 0.5g y
0.005g de MgCl2 respetivamente y aforando con Se realizo el mismo tratamiento de datos para añadir los
peróxido de hidrogeno al 1%. datos (ecuación 1) de las concentraciones
Para determinar la actividad catalítica de la catalasa, en (10%,4%,1%,0.1%), y con la ecuación 2 el registro de la
una probeta de 25 mL, se añadió 15 mL de las velocidad (s-1), haciendo una variación de la temperatura
anteriores soluciones, se colocó un papel filtro saturado (55°C), el cual resulto la siguiente información (tabla 2).
con solución de catalasa y se medió el tiempo que tarda
el centro de dicho papel en ascender a la superficie, se Tabla 2: Tabla de concentración de peróxido de
realizó por triplicado para asegurar consistencia de los hidrogeno (mM) vs velocidad (s-1) a temperatura de 55°C
resultados y el promedio de dichas medidas. Se usó la
misma solución de H2O2 para cada repetición. Concentración Velocidad
Estos procesos se realizaron con las 10 soluciones (mM) (s-1)
H2O2, y 4 de ellas (10%,4%,1% y 0.1%) se realizaron 100 0.44
calentando la solución a 55°C, también por triplicado. Y
de inhibidores solo se utilizó MgCl2 al 5%, 3%, 1% y 40 0.25
0.1%.
10 0.23
RESULTADOS Y DISCUCIÓN 1 0.13
Ensayo 1
Los resultados que se obtuvieron se registraron en la En el último tratamiento de datos se realizó el
tabla 1, el cual procedió del ensayo con distintas tratamiento de datos (ecuación 1) con las
concentraciones (%) de peróxido de hidrogeno (H2O2) concentraciones (5%,3%,1%,0.1%), y con la ecuación 2
frente a la solución que contenía enzima de catalasa el registro de la velocidad (s-1),de la solución (MgCl2)
(solución de preparación catalasa). que era el inhibidor que le correspondió al grupo de
laboratorio 7.
Para el tratamiento de datos se convirtió la
concentración (%) en mM resultando así: Tabla 3: Tabla de concentración MgCl2 de la solución
(MgCl2 -H2O2 10%) vs Tiempo (s).
10 % 1 mol 1000 mM Ec(2)
× 34 g H 2 O 2→ 3.4 g H 2 O2 × × =100mM de H 2O 2 Tiempo
Concentració
100 34 g 1 mol
n (mM) (s)
Ec(1) 50 0.11
Y el valor de velocidad respecto al tiempo (s) que se 30 0.12
usó, se realizó lo siguiente:
10 0.10
1 1
→ =0.43 s−1 1 0.14
tiempo( s) 2.3
Luego se realizó lo mismo con los demás valores que
estaban en porcentaje (%) y se obtuvo lo siguiente: Análisis de datos:

Tabla 1: tabla de concentraciones (mM) vs tiempo (s) a Para comparar mediante una gráfica cual método es
temperatura ambiente. más preciso entre Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk,
se procesó los datos (tabla 1) de la siguiente manera:
Concentración Velocidad (s-1)
(mM)
100 0,43478261
75 0,28490028
50 0,22988506
40 0,18214936
30 0,18975332
20 0,15384615
10 0,11363636
2
 1 1 1
Concentracion vs velocidad Michaelis- b= →5.124= →Vmax = =0.1951
Vmax Vmax 5.124
Menten s-1
0.5
km km
0.4 m= → 19.869= → km=0.1951 ×19.869=3.877
Velocidad (1/s)

f(x) = 0 x + 0.06 Vmax 0.1951

0.3 R² = 0.97
0.2
0.1
El valor de km de la gráfica 2 es 3.877mM el cual se
0 determinó de acuerdo la gráfica de Lineweaver-Burk, por
0 20 40 60 80 100 120
lo tanto, este método es más preciso porque se toma los
Concentracion (mM) resultados de la pendiente del grafico 2 y por medio de
la ecuación de Lineweaver-Burk se remplaza valores de
Vmax= 0.435 s-1 m y b estableciendo así los valores con mejor exactitud
por aplicar un modelo matemático establecido. Se tiene
Km= 0.2175 en cuenta que existen factores que pueden afectar los
resultados, tanto como los errores sistemáticos que
proceden por la falta de exactitud del observador al
Grafica 1: grafica de Michaelis-Menten con datos (tabla tomar el tiempo, también no cabe la duda que la
1) para el cálculo de velocidad máxima y km. solución preparada de catalasa puede que el papel filtro
El valor de la constante (km) según en la gráfica 1, es de por cuestiones del azar no haya obtenido una cantidad
0.2175 que se obtuvo al determinar el valor de la similar cada vez que se realizaba cada ensayo.
velocidad máxima como el ultimo valor de la lista de Ensayo de cambio de temperatura:
datos porque aún no lograba alcanzar el punto de
equilibrio ( meseta en el gráfico), por lo tanto, resulto el En el laboratorio se realizó el cambio de factores como
valor de km. la temperatura que puede influir en el resultado de
velocidad máxima y km, ya sea aumentando la
velocidad o en su defecto disminuyéndole, los datos
Concentracion vs Velocidad (tabla 2) se evaluaran por la gráfica de Lineweaver-Burk
Lineweaver-Burk (recíprocos de datos 2) de siguiente manera:
25
f(x) = 19.87 x + 5.12
R² = 0.89
20
Concentracion vs velocidad a temperatura
1/velocidad

15
de 55°C
10 10
8
1/velocidad

5 6 f(x) = 4.43 x + 3.32

R² = 0.88
4
0 2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0
1/Concentracion 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
1/Concentracion

Gráfico 2: grafica de Lineweaver-Burk con datos (tabla

1) recíprocos para cálculo de velocidad máxima y km Grafica 3: grafica de Lineweaver-Burk con datos (tabla
2) recíprocos para cálculo de velocidad máxima y km
Por lo tanto, el cálculo de velocidad máxima y km
quedan así: 1 km 1 1
= × +
1 km 1 1 Vo Vmax [S ] Vmax
= × +
Vo Vmax [S ] Vmax

3
 1 1 1 Los resultados de α ∙ y α al tener valores diferentes, es
b= →3.3201= → Vmax= =0.3011
Vmax Vmax 3.3201 un inhibidor tipo mixto del cual el inhibidor ( MgCl 2 ¿se
s-1 unen tanto a (E) como a (ES), pero sus afinidades por
estas dos formas de enzimas son distintas (Ki ≠ Ki'), los
km km pocos datos en los ensayos hacen que la gráfica tenga
m= → 4.434= → km=0.3011× 4.434=1.335 mMuna forma no confiable porque solo cuatro datos no
Vmax 0.3011
pueden definir con exactitud la medición precisa, pero a
El resultado de la velocidad máxima a temperatura rasgos generales si indican la información necesaria
(55°C) fue de 0.3011s que al comparar con el resultado
-1
respecto al valor para entender qué tipo de inhibición
de velocidad máxima a temperatura ambiente 0.1951s -1, presento nuestra solución de (MgCl2), por otro lado,
infiere que la temperatura si altera el resultado, en este unos datos del ensayo no corroboraban la lógica de la
caso causa una mayor velocidad de reacción, por lo cual inhibición porque al velocidad al disminuir la
hablando fisicoquímicamente velocidad en la cual la concentración debía aumentar, lo cual no fue correcto,
enzima llega a su fase estacionaria es más rápida por esto se puede deber a la mala preparación de la
medio de alta temperatura (55°C) que a temperatura solución, puesto que eran medidas muy pequeñas en la
ambiente, por lo que la temperatura es un factor clave disolución que probablemente pueden fallar, esto fue en
para acelerar la reacción de la catalasa. la concentración de 10 mM el cual no fue normal su
registro de dato, causando un pequeño error o diferencia
Ensayo con inhibidor: al momento de graficar y obtener el resultado a analizar.
El inhibidor juega un papel crucial al momento en que
Conclusiones
este interacciona con la enzima por lo cual los datos
(tabla 3) se les realizo el reciproco que exige la gráfica 1. Factores como la temperatura ayudan a que la
de Lineweaver-Burk representan un cambio en reacción ocurra de manera más rápida por lo que
velocidad enzimática que fue comprobado de la
siguiente manera:
se deduce que es un catalizador.
2. Los inhibidores hacen la reacción mas lenta
teniendo como resultado la falta de actividad
Concentracion vs velocidad enzimática

12
10
1/velocidad

8 f(x) = − 2.01 x + 9.22

6 R² = 0.62 Bibliografía
4
1. CRC Handbook of Chemistry and Physics 65a Ed.
2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 [Link]
ades_medida.html
1/Concentracion

Gráfico 4: gráfico de Lineweaver-Burk se aplicó los

recíprocos de los datos (tabla 3) para encontrar el tipo
de inhibición.

1 αkm α∙
= +
Vo Vmax [MgCl 2] Vmax
α∙ α∙
b= →9.2212= →α ∙=9.2212 ×0.1951=1.80
Vmax 0.1951
α km α ( 3.877 ) 0.3011 (−2.0095 )
m= →−2.0095= →α= =−0.156
Vmax 0.3011 3.877