Universidad Autónoma de Baja California
Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería
Biología
Investigación sobre microscopía
Gutierrez Barrientos Alexa Elizabeth Matricula:122539
Profesor: Dra. Rosa Elena Mares Alejandre
Fecha de entrega: 18 de febrero del 2014
Microscopía óptica
El microscopio es el instrumento más utilizado en el estudio de células y tejidos. Se emplea
para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. Hay
diferentes tipos de técnicas, como:
Microscopía de luz transmitida - campo claro
Es el método de microscopía óptica más usual, ya que con su ayuda se pueden observar
sencilla y rápidamente los preparados bien contrastados o teñidos ([Link]. frotis sanguíneos).
Microscopia de luz trasnmitida- campo oscuro
Se utiliza para preparados biológicos no teñidos, tales como bacterias o cultivos celulares
vivos, muy a menudo no o casi no se pueden reconocer en luz transmitida - campo claro debido
a su transparencia. Esto cambia decisivamente al observar tales preparados en luz transmitida
- campo oscuro porque aquí la apertura de la iluminación que se utiliza para iluminar el
preparado es más grande que la del objetivo empleado.
En campo oscuro solamente los rayos de luz difractados y dispersados, que son importantes
para Is formación de la imagen, penetran en el objetivo, mientras que los haces de luz directos,
no influenciados, pasan por delante del objetivo. Entre otras cosas, a esto se debe que hasta
estructuras finas, que en parte están fuera del poder resolutivo del microscopio óptico, pueden
ser resueltas, apareciendo claramente brillantes sobre un fondo oscuro.
Microscopia de luz transmitida- Contraste de fases
El contraste de fases es el método de microscopía ideal para examinar preparados delgados y
no teñidos, tales como cultivos de células. El ojo humano no está en condiciones de percibir las
diferencias de fases; (diferencias de índices de refracción y diferencias de espesores)
existentes entre los diferentes componentes de las células.
El método del contraste de fases utiliza los moduladores ópticos "diafragma anular de fases y
anillo de fases", así como los procedimientos de interferencia en la formación de la imagen
intermedia, para convertir las tenues diferencias de fases en diferencias de intensidad y color
visibles por los ojos.
El canal óptico anular, definido por el diafragma anular de fases y el anillo de fases, sirve para
atenuar las partes de luz intensas y directas, y ocasionar un desplazamiento de fase constante,
Las partes de luz indirectas difractadas en diferentes componentes de las células, por el
contrario, pasan por delante de este canal óptico y son influenciadas en cuanto a sus fases por
las diferencias de los índices de refracción y espesores en el preparado,
Después de experimentar estas diferentes influencias, los rayos parciales se interfieren en el
plano de la imagen intermedia y se intensifican o se atenúan según sean las posiciones de las
fases. El resultado de estas interferencias son contenidos de imagen con diferencias de
intensidad y color que son percibibles por el ojo humano.
Microscopia de luz transmitida-Constraste Diferencial Interferencial (DIC)
El método DIC con luz transmitida es un procedimiento de contraste alternativo a la
polarización y permite la representación de detalles transparentes de los preparados con
contrastes fuertes y en relieve.
La luz polarizada linealmente por un polarizador es desdoblada en dos rayos parciales por un
prisma birrefringente. Estos rayos atraviesan a poca distancia dos detalles adyacentes del
preparado y experimentan allí distintas diferencias de trayectorias a causa de las diferencias en
el índice de refracción y el espesor del preparado. Luego, los dos rayos parciales son unidos en
un segundo prisma birrefringente .y, habiendo atravesado e analizador, tienen la misma
dirección de oscilación. Así, ambos rayos parciales pueden interferir entre si en la imagen
intermedia, siendo convertidas las distintas diferencias de trayectorias en diferentes valores
acromáticos (intensidades). Posteriormente, un compensador λ (placa lambda) convierte los
valores acromáticos en colores.
Microscopia de luz reflejada- Epi-fluorescencia
Gracias a una lámpara especial, generalmente de mercurio, que se coloca en el microscopio y
que actúa emitiendo una luz excitadora de los fluorocromos, con los que se tiñen las muestras
a observar.
El método de la epi-fluorescencia posibilita la representación bien contrastada de estas
sustancias fluorescentes en los colores típicos para la fluorescencia. En el microscopio para
epi-fluorescencia, la luz generada por esta lámpara potente pasa por un filtro antitérmico para
llegar al filtro excitador (pasabanda). La radiación de excitación de ondas cortas filtrada es
reflejada por un separador de rayos dicromático y enfocada por el objetivo al preparado. El
preparado absorbe a radiación de ondas cortas para emitir después una radiación fluorescente
de ondas más largas (principio de Stoke), la cual es abarcada por el objetivo y transmitida por
el separador de rayos dicromático. Finalmente, los rayos pasan por un filtro supresor (paso
largo/pasabanda), el cual permite el paso sólo a la radiación de ondas largas emitida por el
preparado,.
Las características espectrales de los filtros excitador y supresor tienen que adaptarse entre sí
con alta precisión. Se encuentran en un módulo reflector FL P&C junto con el correspondiente
separador de rayos dicromático.
Microscopía Confocal
La microscopía confocal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia convencional, permite
eliminar la señal fluorescente que proviene de una muestra semitranslúcida y que está fuera de
foco, con lo cual se consiguen, de forma no destructiva, secciones ópticas a diferentes planos
de la muestra. Estas secciones pueden ser utilizadas para hacer un análisis tridimensional o
para la observación de una parte interna de la muestra.
La microscopía confocal produce un aumento significativo de la resolución óptica y del
contraste de las imágenes, ventajas que la convierten en una herramienta imprescindible en la
obtención de imágenes de alta resolución y en estudios de colocalización. La microscopía
confocal de reflexión sigue los mismos principios que la anterior, en este caso se recoge la luz
reflejada por la muestra.
Las secciones ópticas obtenidas por microscopía confocal contienen la información para poder
hacer posteriormente un análisis tridimensional: cuantificación volumétrica, distribución de la
fluorescencia, análisis de la colocalización, etc.
El microscopio Electrónico.
La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la
luz visible. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto. Dado que los
electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar
estructuras mucho más pequeñas. La longitud de onda más corta de la luz visible es de
alrededor de 4.000 ángstroms (1 ángstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de
los electrones que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5
ángstroms. Utiliza una fuente de electrones para observar la muestra y se clasifican en dos:
1.-De Transmisión lineal: permite la observación de muestra en cortes ultrafinos. Un TEM
dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones
rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada
del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de
un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa fotográfica o una pantalla fluorescente
detrás del objeto para registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de
transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.
2.-De Barrido Superficial: Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es
necesario cortar el objeto en capas para observarlo con un SEM, sino que puede colocarse en
el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto
por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez. Su
funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de
forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisión. Los
electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparición de electrones
secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un
dispositivo electrónico situado a los lados del espécimen. Cada punto leído de la muestra
corresponde a un píxel en un monitor de televisión. Cuanto mayor sea el número de electrones
contados por el dispositivo, mayor será el brillo del píxel en la pantalla. A medida que el haz de
electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los
microscopios electrónicos de barrido pueden ampliar los objetos 200.000 veces o más. Este
tipo de microscopio es muy útil porque, al contrario que los TEM o los microscopios ópticos,
produce imágenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.
Fraccionamiento celular
El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las células. Las membranas y
organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar
tubos de ensayo. Esto ejerce una fuerza centrífuga en el contenido de los tubos, que sedimenta
las partículas suspendidas en la solución (como los organelos y membranas de células).
Algunas de estas partículas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son
pequeñas vesículas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retículo
Endoplasmático, complejo de Golgi y membrana plasmática.
El fraccionamiento celular permite al investigador preparar componentes celulares en
cantidades masivas para estudiar su composición y funciones.
El proceso sigue el siguiente orden:
Homogeneización
Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un
medio apropiado(una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica). Para mantener la
integridad de los organelos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación , todas las
soluciones y cristalería debe mantenerse frías. La suspensión de células constituyentes se
llama homogenado.
Centrifugación
Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una
fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga
relativa(RCF)en unidades de g. La RCF es una función de velocidad de centrifugación en
revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación.
Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación : RCF =
1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación hasta
el margen de afuera del tubo de centrífuga.
Centrifugación diferencial
En la centrifugación diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas
velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. La centrifugación varía,
dependiendo del sedimento que se quiera obtener.
Referencias:
-Microscopía óptica y electrónica
● Métodos de microscopía electrónica de barrido en Biología. José Ojeda Sahagún.
Univ. de Cantabria. 1997.
● Página web del IPBLN Granada/
[Link]
[Link]
● Blog “Partes del Microscopio” Creado por la Dra. María Guadalupe Vizcarra Martinez /
[Link]
-Fraccionamiento célular
● [Link]
● [Link]
● Biology. Campbell, Neil A., Reece Jane B. Pearson education., Inc, 2005