PROPUESTA DE PRACTICA DE LABORATORIO

FARMACOLOGIA Y TOXICOLOGIA

PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD DE ESTERES DE COLINA A ENZIMAS

COLINESTERASAS EN MUESTRAS DE SANGRE TOTAL

INTRODUCCIÓN

Las colinesterasas son enzimas ubicuas que se encuentran ampliamente distribuidas en todo
el reino animal y vegetal. Forman parte del grupo de esterasas o hidrolasas de los enlaces
tipo éster, es decir, los constituidos por la unión de ácidos orgánicos o inorgánicos con
alcoholes o tioles de naturaleza diferente.

Las colinesterasas hidrolizan a los ésteres de colina de forma más activa que a otros ésteres
que son de este aminoácido; difieren de otras enzimas de su grupo por su marcada afinidad
por sales de amonio cuaternario y sus sustratos más importantes son acetilcolina,
butirilcolina, succinilcolina y benzoilcolina, entre otros.

Se acepta la existencia de dos tipos de colinesterasas en el hombre, la acetilcolinesterasa

(AChE) y la pseudoacetilcolinesterasa (pChE), ambas se encuentran en el cerebro, musculo
y sangre principalmente, aunque difieren específicamente de la distribución en donde son
localizables. En el plasma solo se halla la pChE y en los eritrocitos exclusivamente la
AChE. Las características cinéticas de estas dos enzimas han servido de base para la
clasificación de las enzimas tisulares.

El único sustrato natural de la AChE es la acetilcolina, a la que hidroliza con muchas más
facilidades que a la butirilcolina, aunque también hidroliza a la propionilcolina y a la β-
metilacetilcolina y a los análogos tiocolina de los tres compuestos; a su vez, la
pseudoacetilcolinesterasa (pChE) se separa en la fracción IV del fraccionamiento proteíco
del plasma sanguíneo. Esta enzima no actúa sobre la metilacetilcolina, lo cual nos ayuda a
diferenciarla rápidamente de acetilcolinesterasa. La pChE no solamente hidroliza a la
butirilcolina cuatro veces más rápido que a la acetilcolina, sino que actúa además sobre sus
tioderivados y otros derivados de ésteres de colina y alcohol.

La AChE cuya estructura, mecanismo de acción y determinación es muy constante en todo

el reino animal se encuentra en los mamíferos y en el hombre fundamentalmente en el
sistema nervioso central, en la placa motora, en la membrana del eritrocito, riñón, páncreas,
bazo, hígado, etc. Mientras que pChE se localiza principalmente en el musculo liso, hígado,
adipocitos y plasma sanguíneo. No obstante, en algunos tejidos se pueden encontrar ambas
enzimas y, como ocurre en el riñón, con distribución algo diferente en el glomérulo y el
túbulo, según las especies.

En los primeros trabajos experimentales que se realizaron con colinesterasa plasmática de

humano y caballo se vio que los eritrocitos presentaban también un efecto hidrolizante de la
acetilcolina, por lo que surgió la cuestión de que si la actividad eritrocitaria y plasmática
eran idénticas. El conocimiento de que se trataban de dos enzimas diferentes data de 1940
con Alles y Hawes, estos autores demostraron que la actividad eritrocitaria era mayor a
bajas concentraciones de acetilcolina y se inhibía por un exceso de sustrato natural,
mientras que la plasmática aumentaba con concentraciones crecientes de sustrato y no se
llegaba a inhibir.

Mendel y su grupo corroboraron en 1943 que la enzima eritrocitaria es especifica para

acetilcolina y no hidroliza esteres alifáticos de tributirina y metilbutirato. La enzima sérica
es, por otra parte, capaz de hidrolizar a otros ésteres de la colina además de la acetilcolina.
En 1943, Mendel y Rudney denominaron colinesterasa verdadera y pseudocolinesterasa a
las enzimas eritrocitarias y séricas, respectivamente; aunque se propusieron otras
nomenclaturas, la de Mendel y Rudney fue la generalmente aceptada.

En el siguiente cuadro, se presenta un resumen especifico de las enzimas colinesterasas, sus

sitios, funciones y localizaciones en el organismo:

El conocimiento de la existencia, así como el mecanismo de estas enzimas que se encargan

de la hidrolisis de la acetilcolina y con ello terminan las acciones sinápticas en SNC y
periférico para el control de los mecanismos de atención y memoria, así como de
transmisión neuromuscular de funciones autónomas es crucial para la identificación de
ciertas alteraciones en la funcionalidad de cada una de estas o mecanismos de acción
farmacológica.
OBJETIVO

 Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la actividad

enzimática de colinesterasas en presencia de sus colinesteres en una muestra
biológica.

 Definir cuáles son las posibles asociaciones biológicas del derivado de colina en el
organismo al interactuar con la enzima.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Se mide la actividad de las colinesterasas mediante un método cinético enzimático. Este

método ha sido sin lugar a duda el que ha alcanzado mayor difusión establecido por
Ellman et al. (1961) que consiste en una determinación colorimétrica sencilla y rápida en
la cual se utiliza cualquier derivado de colina como sustrato y se valora la tiocolina liberada
por la intensidad del color amarillo aparecido al reaccionar esta sustancia con
diotiobisnitrobenzoato, formando 5-tionitrobenzoato que presenta un máximo de absorción
de 412 nm. Posee buena sensibilidad y requiere muy pequeña cantidad de muestra (10 µl de
sangre), y existiendo de igual manera la posibilidad de inhibir la pChE con sulfato de
quinidina, iso-OMPA o etopropazina, y de igual manera BW284C51 (dibromuro de 1,5-
bis-(alildimetilamoniofenil)-pentan-3-ona para AChE, aunque alta actividad catalítica de la
enzima en suero, aunado a la alta sensibilidad de la reacción indicadora así como la
demanda de una predilución o un volumen muy pequeño de la muestra generan que el pico
de absorción del tionitrobenzoato coincide con el pico de absorción de la hemoglobina, lo
que presenta un problema al analizar muestras ricas en hemoglobina.

Para evitar estos inconvenientes se usa un método que emplea el ácido 6-6‘-
ditiodinicotínico (DTNA) como sustituto del DTNB, observando el mismo fundamento del
reactivo de Ellman solo con la variante de una nueva lectura de absorción a 340 nm que
permite mayor selectividad y menor interferencia con lecturas asociadas a presencia
elevada de hemoglobina o bilirrubinas de la muestra.

El ejemplo de la reacción se muestra en el siguiente esquema:

PREPARACIÓN

MUESTRA BIOLÓGICA

Suero y plasma heparinizado o con EDTA son muestras adecuadas. No se debe emplear el
fluoruro como preservante ya que inhibe a la colinesterasa. Las células deben separarse del
suero o plasma en las dos horas siguientes a su recolección.

MATERIALES

 Micropipeta de 1 mL
 Micropipeta de 200 μL.
 Piseta con agua desionizada o destilada
 Celdas de plástico de 3 ml
 Tubos de vidrio de 13 X 100 ml
 Puntas para micropipeta.
 Gradilla

EQUIPO

 Espectrofotómetro o colorímetro para mediciones a 340 nm.

 Baño termostático a 37ºC (± 0.1ºC)
 Centrifuga para realizar la separación del plasma o suero de los eritrocitos.

REACTIVOS

 Solución amortiguadora de fosfato, 100 mmol/L, pH 7,6.

Disolver 2,33 g de Na2HPO4 y 0,831 g de KH2PO4 en 800 mL de agua desionizada, ajustar

el pH a 7,6 con NaOH 0,02M y trasvasar a un matraz volumétrico de un litro, aforar hasta
la marca con agua destilada y mezclar.

 Ácido 6-6‘ditiodinicotínico (DTNA), 0,2 mmol/L.

Colocar 61,66 mg de DTNA en un matraz volumétrico de un litro, aforar hasta la marca con
solución amortiguadora de fosfatos (100 mmol/L, pH 7,6) y mezclar. Almacenar en botella
ámbar. Esta solución es estable por lo menos durante 6 meses en refrigeración (4-8ºC).

 Inhibidor de pChE

Para cuantificar AChE en un matraz volumétrico de un litro colocar: 61,66 mg de ácido

6,6‘ditiodinicotínico (DTNA), con 25,8 mg de hidrocloruro de quinidina y 1 mL de Tritón
X-100. Aforar hasta la marca con solución amortiguadora de fosfatos (100 mmol/L, pH 7,6)
y mezclar. Almacenar en botella ámbar. Esta solución es estable por lo menos durante 6
meses en refrigeración (4 - 8ºC).

 Inhibidor de AChE

Para cuantificar AChE en un matraz volumétrico de un litro colocar: 61,66 mg de ácido

6,6‘ditiodinicotínico (DTNA), con 1 mmol/L de BW284c51 en y 10 mL de Tritón X-100.
Aforar hasta la marca con solución amortiguadora de fosfatos (100 mmol/L, pH 7,6) y
mezclar. Almacenar en botella ámbar.

 Sustrato 1, yoduro de acetilcolina, 10,5 mmol/L

Disolver 30,40 mg de yoduro de acetiltiocolina en 10 mL de agua destilada. Esta solución

es estable por lo menos 3 meses en congelación a -20ºC.

 Sustrato 2, clorhidrato de metacolina 125 mmol/L.

Disolver 25,0 mg de clorhidrato de metacolina en 10 mL de agua destilada.

 Sustrato 3, clorhidrato de carbamilcolina

Disolver 385 mg de clorhidrato de carbamilcolina en 10 mL de agua desionizada.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

1. Colocar 2,0 mL de la solución de DTNA con inhibidor de pChE en tres tubos de

vidrio de 13 x 100 ml previamente rotulados con la leyenda AChE y el respectivo
sustrato a analizar.

2. Agregar 5 µL de muestra (sangre total o paquete globular). Mezclar e incubar a

30ºC por dos minutos.

3. Agregar 100 µL de sustrato en su tubo respectivo. Mezclar, esperar 30 segundos y

determinar el cambio de absorbancia por minuto a 340 nm y a 30ºC, ajustando
previamente el cero de absorbancia con agua destilada.

4. En el caso de la muestra de suero o plasma, repetir el procedimiento haciendo el

ajuste pertinente de uso de solución con inhibidor de AChE en los tres tubos
respectivos con el rotulo pertinente tanto de la enzima como del sustrato a analizar.

5. Agregar 5 µL de muestra (suero o plasma). Mezclar e incubar a 30ºC por dos

minutos.

6. Repetir la lectura como el procedimiento anterior.

 7. Analizar los resultados previamente obtenidos.

RESULTADOS ESPERADOS
El único sustrato de la AChE, la acetilcolina, es hidrolizado rápidamente a medida que
interacciona la enzima con él, con lo que se puede observar una mayor susceptibilidad,
aunque también hidroliza a β-metilacetilcolina y a los análogos tiocolina de los tres
compuestos en menor velocidad de a esta; a su vez, la pseudoacetilcolinesterasa (pChE) no
actúa sobre la metilacetilcolina, lo cual nos ayuda a diferenciarla rápidamente de
acetilcolinesterasa, según lo visto en previas investigaciones. En el caso del carbacol es
posible comprobar que no es metabolizado por ninguna de las dos enzimas colinesterasas y
se pueden observar en concentraciones altas incluso después de 4 a 6 horas de acción de la
enzima con dicho sustrato.

DERIVADOS DE COLINA SUSCEPTIBILIDAD AChE SUSCEPTIBILIDAD pChE

ACETILCOLINA +++ +++
METACOLINA + -
CARBACOL - -

REFERENCIAS DE CONSULTA

 Deutsche Gesellschaft fur Klinische Chemie. Proposal of Standard Methods for the
determination of enzyme catalytic concentrations in serum and plasma at 37°C. Il
Cholinesterase (acylcholine acylhydrolase, EC [Link]). [Link]. Biochem
30,163 (1992).

 Jakobs, D.S., Kasten, Jr., B.L., Demmott, W.R., Wolfson, W.L (1999): “Laboratory Test
Handbook”, 2nd Edition. Lexi-Comp and Williams & Wilkins Ed.

 Jiménez-Díaz, M.; Martinez M., V. (2000) Validación de la determinación de colinesterasa

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 Jiménez-Díaz, M.; Martinez M., V. (2000) Validación de la determinación de

acetilcolinesterasa eritrocitaria humana a 340 nm. [Link], 2000,11 (2), 161-168.

 Lepage L, Schiele F, Gueguen R, Siest G. Total cholinesterase in plasma. Biological

variations and reference limits. Clin Chem 1985; 31: 546-550.

 Pappano A (2015): Cholinoceptor-Activating & Cholinesterase-Inhibiting Drugs. (Chapter

7). In: Basic and Clinical Pharmacology. 13th Ed. B Katzung, AJ Trevor (Editors).
McGraw-Hill / Lange.

 Repetto, M., & Camean, A. (1995). Toxicología avanzada (1st ed., pp. 119-146). Madrid:
Díaz de Santos.
 Sánchez Chávez, G., & Salceda, R. (2008). Enzimas polifuncionales: el caso de la
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[Link]

NOMBRE: Itzel Sinaí Portilla Cruz